tip-vermittelte induktion tetrazyklin-abhängiger

TIP-vermittelte Induktion

Tetrazyklin-abhängiger Transregulatoren

in Saccharomyces cerevisiae

und HeLa Zellen

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Christoph Stöckle

aus Oettingen i. Bay.

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2012

Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Rainer Fink

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Yves Muller

Das Studieren lehrt uns die Regel - das Leben die Ausnahmen

Johannes Mario Simmel

Danksagung Ein großer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen, nicht nur für die Überlassung des interessanten Themas, sondern auch für sein Interesse am Fortgang dieser Arbeit, seine Bereitschaft zur Diskussion und die stets konstruktive Kritik. Ich erinnere mich gerne zurück an einen besonderen Menschen und herausragenden Wissenschaftler. Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich besonders herzlich für die reibungslose Übernahme und Fortführung meiner Betreuung sowie der Möglichkeit meine Arbeit zu vollenden. Von ihm erhielt ich ehrliches Interesse und tatkräftige Unterstützung bei meiner Arbeit, was für mich nicht selbstverständlich war und immer noch nicht ist. Prof. Dr. Yves Muller danke ich dafür, dass er, wie schon bei meiner Diplomarbeit, die Zweitkorrektur übernahm. Vielen Dank an Marcus Klotzsche für das Korrekturlesen meiner Arbeit und die vielen interessanten und konstruktiven Diskussionen. Ein großer Dank geht an Chris Berens für die stets offene Tür, die unzähligen wertvollen Antworten auf so viele wissenschaftliche Fragestellungen und sein unerschöpfliches Literaturwissen. Ein weiterer herzlicher Dank geht an Prof. Dr. Christian Koch, der schon in meiner Diplomarbeit viel Zeit darauf verwendet hat, mich in die wunderbare Welt der Hefe einzuführen. Von ihm stammen nicht nur Materialien und Methoden, sondern vor allem viele unbezahlbare Erfahrungswerte. Den Organisatoren der MiBi danke ich für die Vorarbeit, die sie leisten, um unsere Arbeit überhaupt erst möglich zu machen. Besonders zu erwähnen sind hierbei Donata Wehr, Gerald Seidel, Markus Müller, Anja Zabel und Manu Hanuschik. Vielen lieben und herzlichen Dank an alle aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern der MiBi für die vielen schönen Momente und die unzähligen Dinge, die wir uns im Laufe der Jahre geteilt haben: Niveau in allen Höhen- und Tiefenlagen, schlechte Witze, gute Witze, dumme Sprüche, schlaue Sprüche, nützliche und unnütze Materialien und Methoden, nützliches und unnützes Wissen, Backwaren und gesundes Essen, Getränke mit unterschiedlichem Alkoholgehalt, aufmunternde Worte, realistische und unrealistische Ansichten, Vorbild und nicht Vorbild, blaue Müllsäcke und so vieles, vieles mehr!!! Ein besonders großer Dank geht an so viele Leute rund um die Erde, die meine Arbeit auf verschiedenste Weise unterstützt und an vielen Stellen erst ermöglicht haben. Dies betrifft sowohl Materialien wie Plasmide, Stämme, Antikörper, aufgereinigte Proteine als auch vielfältigen wissenschaftlichen Rat. Diese Personen hier aufzuzählen würde sicherlich den Rahmen sprengen und vor allem die Gefahr bergen, jemanden zu vergessen. Allerdings möchte Dr. Peter Palese und Lily Ngai von der Mount Sinai School of Medicine in New York hervorheben, die mir mehrfach auf freundliche, schnelle, kompetente und unkomplizierte Art geholfen haben, ohne mich überhaupt zu kennen. Jorge Cham danke ich für seine völlig an den Haaren herbeigezogenen graphischen Abstraktion des akademischen Alltags. Und nicht zuletzt bedanke ich mich bei meiner Frau Sandra, ohne deren Unterstützung so vieles sicherlich nicht möglich gewesen wäre.

Inhaltsverzeichnis __________________________________________________________________________

I

1 ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 1/3

2 EINLEITUNG 4

2.1 Tetrazykline und die Tetrazyklinresistenz 4

2.2 TetR als Transkriptionsregulator für die konditionale Genexpression 5

2.2.1 Vielfalt von TetR Induktoren 7

2.2.2 TIP-Varianten und ihre Eigenschaften 7

2.2.3 Anwendung der peptidischen Induktion in prokaryontischen Organismen

8

2.2.4 Anwendung der peptidischen Induktion in eukaryontischen Organismen 8

2.3 Der nucleo-cytoplasmatische Transport 8

2.3.1 Die Rolle der Kernporen 8

2.3.2 Zelluläre Mechanismen 9

2.3.2 Methodik zur Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen 11

2.3.3 Bedeutung des nucleo-cytoplasmatischen Transports bei viralen Infektionen

11

2.3.3.1 DNA Viren 11

2.3.3.2 RNA Viren mit DNA Intermediat 12

2.3.3.4 RNA Viren ohne DNA Intermediat 12

2.4 Das Influenza A Virus 12

2.4.1 Genom und virale Proteine 12

2.4.3 Vermehrungszyklus 14

2.4.4 Bedeutung von Influenza A als Pathogen 15

2.4.4.1 Grippepandemien 15

2.4.4.2 Aktuelle Bedrohung durch Influenza A 15

2.4.4.3 Therapie von Influenza A Infektionen 16

2.5 Motivation und Zielsetzung der Arbeit 17

3 ERGEBNISSE 18

3.1 Proteinvermittelte Induktion des Tet-Repressors in S. Cerevisiae 18

3.1.1 Konzeption des Reportersystems 18

3.1.1.1 Reporter 18

3.1.1.2 Regulator 18


II

3.1.1.3 Induktor 19

3.1.2 Funktionsweise des Reportersystems 19

3.1.3 Modifikation des Reportersystems 21

3.1.3.1 Konstruktion des Trägerproteins 21

3.1.3.2 Subzelluläre Lokalisation der Trägerprotein-Varianten 23

3.1.3.3 Einfluss der Trägerprotein-Varianten auf das Wuchsverhalten von S. cerevisiae

26

3.1.3.4 Expression der Trägerprotein-Varianten 27

3.1.4 Aufbau des Reportersystems mit der Trägerprotein-Variante 7 28

3.1.4.1 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + p425Met25 28

3.1.4.2 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7 (mCherry7) 28

3.1.4.3 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7-TIP2 (mCherry7-TIP2) 29

3.4.1 Simultane Messung der GFP+ und mCherry Fluoreszenz 30

3.2 Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports

31

3.2.1 Konzeption 31

3.2.2 Aufbau und Funktionsweise des Reportersystems 31

3.2.3 Auswahl des POI 32

3.2.3.1 Das Matrixprotein M1 33

3.2.3.1.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit M1 und M1Mut 34

3.2.3.1.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von M1-EGFP und M1Mut-EGFP 34

3.2.3.2 Das Nichtstrukturprotein NS1 35

3.2.3.2.1 Mutation der 3‘-Spleißsequenzen des ns1 Gens 35

3.2.3.2.2 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NS4 und NS4Mut 37

3.2.3.2.3 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NS4-EGFP und NS4Mut-EGFP 37

3.2.3.3 Das Nucleoprotein NP 38

3.2.3.3.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NP und NPMut 39

3.2.3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NP-EGFP und NPMut-EGFP 39

3.2.4 Konstruktion der Reporterzelllinien 40

3.2.4.1 Die Zelllinie HLF33 40

3.2.4.2 Chromosomale Integration der tTA Expressionskassette 40

3.2.4.3 Charakterisierung der ALF Zelllinien 42

3.2.4.4 Das Nucleoprotein als POI 43

3.2.4.5 TetR-Induktion durch NP-TIP2 in E. coli 43

3.2.4.5.1 Aufbau und Funktionsweise des E. coli Messsystems 43

3.2.4.5.2 Induktion von TetR durch NP-TIP2 45

3.2.4.6 Chromosomale Integration der NP-TIP2 Expressionskassette 46


III

3.2.4.6.1 Kontrolle der stabilen Integration durch LacZ in situ Färbung 49

3.2.4.6.2 Charakterisierung der ALF2-NP Zelllinien 49

3.2.4.6.3 Auswahl der ALF2-NP Zelllinien für die weiteren Arbeiten 52

3.2.4.6.4 Sequenzierung des NP-TIP2 Locus der Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 52

3.2.5 Validierung der Reporterzelllinien 53

3.2.5.1 Inhibition des NP-TIP2 Kernimports durch Nucleozin 53

3.2.5.1.1 Einfluss von DMSO auf die Expression der Luciferase 53

3.2.5.1.2 Wirkung von Nucleozin auf die Reporterzelllinien 54

3.2.5.1.3 Subzelluläre Lokalisation von NP-EGFP in Gegenwart von Nucleozin 56

3.2.5.2 Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz 57

4 DISKUSSION 61

4.1 Optimierung des Reportersystems für S. cerevisiae 61

4.1.1 Verwendung von TIP2 als Induktorpeptid 61

4.1.2 Konstruktion des Trägerproteins 62

4.1.2.1 Austausch der fluoreszierenden Proteinkomponente 62

4.1.2.2 Steuerung des Expressionsniveaus über Codonadaptation 64

4.1.2.3 Kernimport der Trägerprotein-Varianten 64

4.1.2.3.1 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit einteiliger SV40 NLS 65

4.1.2.3.2 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit zweiteiligen NLSs 66

4.1.2.3.3 Charakteristika der Trägerprotein-Variante 6 mit c-Myc NLS 67

4.1.2.4 Regulation des Expressionsniveaus des neuen Trägerproteins 68

4.1.3 TIP2-vermittelte Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante 68

4.1.4 Weitere Einsatz- und Optimierungsmöglichkeiten für das Reportersystem 69


70

4.2.1 Planung und Konstruktion der Reporterzelllinien 71

4.2.2 Auswahl von geeigneten Influenza A Proteinen 73

4.2.2.1 Relevanz der Virusstämme Influenza A/WSN/1933 und A/Rostock/FPV/1934 73

4.2.2.2 Das Matrixprotein 1 73

4.2.2.3 Das Nichtstrukturprotein 1 75

4.2.2.4 Das Nucleoprotein 76

4.2.2.4.1 Funktionalität der NP-TIP2 Fusion in E. coli 77

4.2.3 Konstruktion der Reporterzelllinien und deren Anwendung auf NP 78

4.2.4 Experimentelle Ansätze zur Validierung der Reporterzelllinien 79

4.2.4.1 Nucleozin 79

4.2.4.1.1 Konzentrationsabhängige Stimulation der Luciferaseexpression 79


IV

durch DMSO

4.2.4.1.2 Interpretation der Experimente mit Nucleozin 80

4.2.4.2 Validierung der Reporterzelllinien über RNA-Interferenz 81

4.2.5 Möglichkeiten zur Optimierung des Reportersystems 82

5 MATERIAL UND METHODEN 83

5.1 Materialien 83

5.1.1 Chemikalien 83

5.1.2 Hilfsmittel und Verbrauchsgüter 85

5.1.3 Verwendete Geräte 86

5.1.4 Kommerziell erhältliche Systeme 87

5.1.5 Enzyme 87

5.1.6 DNA-Größenstandard 87

5.1.7 Verwendete Stämme und Zelllinien 87

5.1.7.1 Verwendete E. coli Stämme 87

5.1.7.2 Verwendeter S: cerevisiae Stamm 88

5.1.7.3 Verwendete Zelllinien 88

5.1.8 Oligonukleotide und Plasmide 88

5.1.8.1 Oligonukleotide 88

5.1.8.1.1 Oligonukleotide für die Konstruktion von Plasmiden 88

5.1.8.1.2 Oligonukleotide für Sequenzierungen 91

5.1.8.1.3 siRNA 92

5.1.8.2 Plasmide 92

5.1.8.2.1 Plasmide, die aus anderen Arbeiten verwendet wurden 92

5.1.8.2.2 Plasmide, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden 94

5.1.9 Medien, Lösungen und Puffer 101

5.1.9.1 Medien 101

5.1.9.1.1 Fakultative Zusätze für Medien 101

5.1.9.1.2 Bakteriennährmedien 101

5.1.9.1.3 Hefenährmedien 102

5.1.9.1.4 Medien für die Zellkultur 102

5.1.9.2 Lösungen und Puffer 103

5.1.9.2.1 Allgemeine Puffer 103

5.1.9.2.2 Lösungen und Puffer für E. coli 103

5.1.9.2.3 Lösungen und Puffer für S. cerevisiae 103

5.1.9.2.4 Lösungen und Puffer für die Zellkultur 104


V

5.2 Methoden 104

5.2.1 Nukleinsäure Methoden 104

5.2.1.1 Plasmidisolierung aus E. coli 104

5.2.1.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA 105

5.2.1.3 Dephosphorylierung von 5’-DNA-Enden 105

5.2.1.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 105

5.2.1.5 Gelelektrophorese 106

5.2.1.6 Präparative Reinigung von DNA Fragmenten 106

5.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten 107

5.2.1.8 Sequenzierung von DNA 107

5.2.1.9 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 107

5.2.2 Arbeiten mit E. coli 107

5.2.2.1 Anzucht von Bakterien 107

5.2.2.2 Herstellung Calciumchlorid-kompetenter E. coli Zellen 108

5.2.2.3 Transformation von E. coli 108

5.2.2.4 Messung der β-Gal-Aktivität in E. coli im 96-Napfplatten-Format 108

5.2.3 Arbeiten mit S. cerevisiae 110

5.2.3.1 Anzucht von S. cerevisiae 110

5.2.3.2 Herstellung Lithiumacetat-kompetenter S. cerevisiae Zellen 110

5.2.3.3 LiAc-Transformation 111

5.2.3.4 DAPI-Färbung 111

5.2.3.5 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von S. cerevisiae 112

5.2.3.6 Erstellung von Wuchskurven 112

5.2.3.7 Fluoreszenzquantifizierung 113

5.2.4 Arbeiten in der Zellkultur 113

5.2.4.1 Kultivierung von HeLa und HEK293 Zellen 114

5.2.4.2 Kryokonservierung und Auftauen von HeLa und HEK293 Zellen 114

5.2.4.3 Zellzählung 114

5.2.4.4 Stabile Transfektion von HeLa Zellen 115

5.2.4.5 Transiente Transfektion von HeLa und HEK293 Zellen 116

5.2.4.6 Höchst-Färbung 117

5.2.4.7 Herstellung von Lebendbeobachtungskammern 117

5.2.4.8 Fluoreszenzmikroskopische Analyse 117

5.2.4.9 Präparation genomischer DNA aus HeLa Zellen 118

5.2.4.10 Messung der Luciferaseaktivität der ALF und ALF-NP Zelllinien 118

5.2.4.11 siRNA Transfektion 119


VI

5.2.4.12 LacZ in situ Färbung 119

5.3 Computerprogramme

120

6 ANHANG 121

6.1 Codongebrauch der mcherry Genvarianten 121

6.1.1 Die „relative adaptiveness“ als Maß für die Codonfrequenz 121

6.1.2 Genvariante mcherry(ha) 121

6.1.3 Genvariante mcherry(ya) 121

7 LITERATURVERZEICHNIS 126

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 142

8.1 Einheiten 142

8.2 Vorsätze 142

8.3 Nomenklatur der Basen und Nukleoside 142

8.4 Aminosäuren-Nomenklatur 142

8.5 Allgemeine Abkürzungen 143

1 Zusammenfassung _____________________________________________________________________________________________________

- 1 -

1 ZUSAMMENFASSUNG

Aufgrund der hohen Affinität und Spezifität gegenüber Operatorsequenz und Induktor wurde

der Tetrazyklin-Repressor (TetR) in verschiedensten Systemen für die konditionale

Genregulation sowohl in Prokaryonten, als auch in Eukaryonten eingesetzt. Obwohl das

Spektrum von möglichen Applikationen durch die Entdeckung der TetR induzierenden

Peptide (TIPs) noch erweitert wurde, war deren Anwendung bisher auf prokaryontische

Organismen limitiert.

Ein Teilprojekt dieser Arbeit befasste sich mit der Modifikation eines bestehenden

Reportersystems für Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Mit diesem System konnte

bereits die Induktion eines auf der TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierenden

Tetrazyklin-abhängigen „Transsilencers“ (tTS) durch das Peptid W-TIP gezeigt werden. Ziel

dieser Arbeit war es die TIP-vermittelte Regulation einer tTS Variante zu zeigen, die auf

TetR(B) Wildtyp (wt), einer der in eukaryontischen Transregulatoren am häufigsten

verwendeten TetR Varianten, basierte. Hierzu wurden ausgehend von mCherry

verschiedene Trägerproteinvarianten für das Induktorpeptid konstruiert, die sich in der

verwendeten Kernlokalisationssequenz, der Linkersequenz zwischen NLS und mCherry

sowie deren Codongebrauch unterschieden. Das Trägerprotein sollte im Zellkern lokalisiert

sein, eine hohes Expressionsniveau aufweisen und einen möglichst geringen Einfluss auf

das Wachstum des Modellorganismus haben. Die Proteinvariante mit der besten

Kombination dieser Eigenschaften enthielt eine N-terminale SV40 NLS mit einer 10 AS

langen „Linkersequenz“ und wurde durch ein an S. cerevisiae adaptiertes mcherry Gen

codiert. Mit einer Fusion dieses Trägerproteins mit dem Induktorpeptid TIP2 konnte

schließlich die konzentrationsabhängige Induktion einer auf TetR(B) wt basierenden tTS

Variante gezeigt werden. Dies stellte den ersten Nachweis TIP-vermittelter Genregulation

eines auf TetR(B) wt basierenden Transregulators in einem eukaryontischen Organismus

dar.

Ein weiteres Teilprojekt der Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung von

Reporterzelllinien zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports von TIP-Fusions-

proteinen. Die Expression aller Komponenten des Reportersystems in den Reporterzelllinien

erfolgte hierbei über unabhängige, stabile Integrationen. Als Reporter diente die Luciferase

aus Photinus pyralis, deren Transkription über einen, auf TetR(B) wt basierenden,

Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (tTA) reguliert wurde. Da eine Induktion der tTA

Variante durch das konstitutiv exprimierte TIP-Fusionsprotein nur dann erfolgen konnte,

wenn sich das TIP-Fusionsprotein im Zellkern befand, wurde die Expression der Luciferase

zum indirekten Indikator für dessen subzelluläre Lokalisation. Für die Anwendung des

Reportersystems wurden drei Proteine aus dem Influenza A Virus auf ihre Eignung hin

überprüft und unter diesen letztlich das Nucleoprotein (NP) ausgewählt. Die Konzentrations-

abhängige Induktion von TetR(B) wt durch eine Fusion bestehend aus NP und TIP2 (NP-

1 Zusammenfassung _____________________________________________________________________________________________________

- 2 -

TIP2) konnte erfolgreich in Escherichia coli gezeigt werden. Die Überprüfung der

Funktionalität der Reporterzelllinien sollte im nächsten Schritt durch eine Reduktion der

nukleären Konzentration von NP-TIP2 erfolgen. Dies sollte zum Einen durch Blockierung des

NP Kernimports mittels des spezifischen Inhibitors Nucleozin und zum Anderen durch

Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz erreicht werden. Mittels Nucleozin

konnte allerdings weder eine Modulation der Luciferaseexpression der Reporterzelllinien,

noch eine Inhibierung des Kernimports einer Fusion bestehend aus NP und dem

fluoreszierenden Protein EGFP beobachtet werden. Für die Validierung der Reporter-

zelllinien über RNA-Interferenz wurden die Reporterzelllinien und deren Ausgangszelllinie mit

spezifischer siRNA für NP-TIP2 bzw. einer unspezifischen Kontroll-RNA transfiziert. Mit

diesem Ansatz konnte ein eindeutiger Hinweis auf die Funktionalität der Reporterzelllinien

erbracht werden.

1 Summary _____________________________________________________________________________________________________

- 3 -

1 SUMMARY

Due to Tet-repressor’s (TetR) high affinity and specificity for its corresponding operator

sequence and its inducers, it has been used in a wide variety of regulatory systems for

inducible gene control in both procaryotes and eucaryotes. Although the variety of possible

applications was further expanded by the discovery of TetR inducing peptides (TIPs), their

application has so far been limited to prokaryotic organisms.

Therefore, one project of this thesis dealt with modifying a reporter system for

Saccharomyces cerevisiae which had already been successfully used to show induction of a

TetR double-mutant (N82A/F86A) based tetracycline-dependent transsilencer by the peptide

W-TIP. The aim of this project was to show TIP-mediated induction of a corresponding tTS

variant based on wildtype (wt) TetR, the most frequently used TetR variant in gene regulation

systems for eucaryotes. Starting from mCherry, seven versions of the TIP scaffold protein

differing in nuclear localization sequence (NLS), linker-sequence between NLS and mCherry

as well as codon usage were compared to determine the optimal variant. Nuclear

accumulation, high expression and little influence on the growth of the model organism were

the selection criteria. The combination with the best overall properties contained an N-

terminal SV40 NLS with a 10 residue linker and a mCherry gene adapted to yeast codon

usage. Combining this scaffold protein with the inducer-peptide TIP2 finally allowed to show

dose-dependent induction of a wt TetR-based tTS variant, demonstrating for the first time

induction of a wt-based tetracycline-dependent transregulator in an eucaryotic organism.

The second project dealt with the construction of reporter cell lines for analyzing nucleo-

cytoplasmic transport of TIP-fused protein which carry all reporter system components stably

integrated into the host genome. Transcription of a luciferase reporter gene was regulated by

a tetracycline-dependent transactivator (tTA). Because the tTA variant is only induced if the

constitutively expressed TIP-fusion localizes to the cell’s nucleus, lucifease expression

serves as an indirect indicator of the TIP-fusion protein’s subcellular localization.

For the application of the reporter system three proteins from the influenza A virus were

tested for their suitability and finally the nucleoprotein (NP) was selected. In a pilot

experiment, dose-dependent induction of tTA by the TIP2-fusion protein NP-TIP2 was

successfully shown in Escherichia coli. In the next step, the reporter cell’s functionality was

tested by reducing the NP-TIP2 nuclear concentration. This should be accomplished on the

one side by nucleozin, a specific inhibitor for the nuclear import of NP and on the other side

through reduction of NP-TIP2 expression by RNA-interference. Nucleozin neither lead to a

change in luciferase expression in the reporter cells, nor to inhibition of nuclear import of a

fusion protein consisting of NP and the green fluorescent protein EGFP. In the RNA-

interference approach, the reporter cell lines were transfected with specific siRNA, a non-

specific siRNA served as control. The increased luciferase activity observed with the specific

siRNA is a clear hint for the functionality of the reporter cell line.

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 4 -

2 EINLEITUNG

2.1 Tetrazykline und die Tetrazyklinresistenz

Tetrazykline sind eine von Streptomyceten produzierte Stoffgruppe von antibiotisch aktiven

Substanzen zu denen mehrere therapeutisch relevante Vertreter wie beispielsweise das

Tetrazyklin (Tc), Doxyzyklin (Dox) und Minozyklin gehören. Sie binden an mehreren Stellen

der 30S Untereinheit des bakteriellen Ribosoms und verhindern so die Anlagerung der

Aminoacyl-tRNA an die Akzeptorstelle. Die daraus resultierende Inhibition der Translation ist

der Grund für ihre bakteriostatische Wirkung (Brodersen et al., 2000; Pioletti et al., 2001).

Durch den intensiven Einsatz von Tetrazyklinen, zum Einen als Therapeutika, und zum

Anderen als Wuchsbeschleuniger in der Tiermast (Chopra et al., 2001), schritt die

Verbreitung von Resistenzen schnell voran. Eine der am weitesten verbreiteten Formen der

Tetrazyklinresistenz stellt hierbei der aktive Export der Tetrazykline aus der Zelle mittels

eines membranständiges Transportproteins dar (Yamaguchi et al., 1990). Die genetischen

Komponenten dieser Resistenz sind innerhalb sogenannter Resistenzdeterminanten kodiert,

von denen aktuell 14 verschiedene Klassen beschrieben sind: Tet A - Tet E, Tet G, Tet H,

Tet J, Tet Z, Tet 30, Tet 31, Tet 33 , Tet 39, Tet 41 (Levy et al., 1989; Levy et al., 1999; Luo

et al., 1999; Agerso et al., 2005; Thompson et al., 2007).

Eine dieser Resistenzdeterminanten, die Determinante des Typs Tet B, findet sich in

Enterobakteriaceaen und ist auf dem Transposon Tn10 kodiert (Abb. 1). Tet B setzt sich aus

den zwei divergent angeordneten Genen tetR und tetA sowie einer Promotorregion zwischen

den beiden Genen zusammen. tetR kodiert für den Transkriptionsregulator TetR, und tetA für

das integrales Membranprotein TetA, das Tetrazyklin aktiv aus der Zelle transportiert. Die

Regulation der Transkription dieser beiden Gene erfolgt über TetR in Abhängigkeit von der

intrazellulären Tetrazyklinkonzentration. TetR liegt in der Zelle als Homodimer vor und bindet

in Abwesenheit von Tetrazyklinen an die zwei, mit den Promotoren für tetR und tetA

überlappenden, Tet-Operatoren tetO1 und tetO2, wodurch die Expression der beiden Gene

reprimiert wird. Tetrazykline können passiv aus der Umgebung in die Zelle diffundieren

(Sigler et al., 2000) und bilden dort Komplexe mit zweiwertigen Metallionen. Diese Komplexe

binden innerhalb der Tc-Bindetasche von TetR und induzieren so eine Konformations-

änderung, die zu einer Reduktion der Affinität von TetR zu den Tet-Operatoren führt. TetR

dissoziiert von der DNA, wodurch die Repression der Transkription von tetR und tetA

aufgehoben wird. In diesem Zustand findet die Expression von TetR und TetA statt wodurch

die zelluläre Tetrazyklinkonzentration zum Einen durch den von TetA vermittelten Export und

zum Anderen durch Bindung an TetR reduziert wird (Hillen et al., 1994; Schnappinger et al.,

1996).

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 5 -

Abb. 1: Regulationsmechanismus und genetische Organisation der Tn10 kodierten Tc-Resistenz

Im oberen Teil der Abbildung sind die Prozesse an der Cytoplasmamembran und im unteren

Teil die genetische Organisation sowie der Regulationsmechanismus der Tn10 kodierten

Tc-Resistenz dargestellt. Hierbei sind Protein-kodierende Bereiche orange, Promotoren blau

und die beiden Tet-Operatoren tetO1 und tetO2 schwarz dargestellt. Tc (gelbe Dreiecke)

gelangt in neutraler Form durch Diffusion über die Cytoplasmamembran in die Zelle und bildet

dort Komplexe mit zweiwertigen Metallkationen (grüne Kreise). Dieser Komplex wird vom

membranständigen Tc-Protonen-Antiporter TetA (mit 12 transmembranen α-Helices in rot

dargestellt) erkannt und ist Induktor des durch tetR kodierten Tet-Repressors TetR. TetR

bildet Homodimere und bindet in Abwesenheit von Tc an die beiden Tet-Operatoren tetO1 und

tetO2, die sich in der Promotorregion zwischen den beiden, divergent angeordneten, Genen

tetA und tetR befinden. In diesem Zustand ist die Transkription von tetA und tetR reprimiert.

Durch die Bindung von Tc an TetR wird eine Konformationsänderung induziert die zur

Dissoziation des Regulators von der DNA führt. Abbildung und Legende modifiziert aus

(Hillen und Berens, 1994).

2.2 TetR als Transkriptionsregulator für die konditionale Genexpression

TetR ist einer der am besten charakterisierten prokaryontischen Transkriptionsregulatoren

(Berens et al., 2004). Aufgrund der hohen Affinität und Spezifität gegenüber

Operatorsequenz und Induktor stellt die TetR-vermittelte Genregulation weiterhin ein

leistungsfähiges Werkzeug für die konditionale Genexpression dar. Der Einsatz beschränkt

sich hierbei nicht nur auf prokaryontische Organismen, sondern erstreckt sich auch auf die

Applikation in den verschiedensten eukaryontischen Modellorganismen wie beispielsweise

Cytoplasmamembran

Tc + Me2+ [Tc--Me2+]+ + H+

H+

Promotorregion

Tc

tetO1 tetAtetR tetO2

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 6 -

Trypanosomen (Wirtz et al., 1995), Bäckerhefe (Dingermann et al., 1992), Tabakpflanze

(Gatz et al., 1991), oder mammalischen Zellen (Gossen et al., 1992). Für die Tetrazyklin-

abhängige, konditionale Genexpression in eukaryontischen Systemen wird der Tet-Operator

zumeist nicht, wie in prokaryontischen Systemen üblich, innerhalb des Promotors, sondern in

Form eines „Tet reponsive element“ (TRE) stromaufwärts des Promotors platziert. Dieses

TRE besteht hierbei vorwiegend aus einer Serie von bis zu sieben tetO2 Operatoren (Gossen

und Bujard, 1992). Da durch die Bindung von TetR an die Tet-Operatoren in einem solchen

System keine Transkriptionsregulation vermittelt wird, werden Translationsfusionen aus TetR

und einer eukaryontischen oder viralen Regulatordomäne eingesetzt. Handelt es sich bei

dieser Regulatordomäne um eine Aktivatordomäne wie beispielsweise VP16 aus dem

Herpes simplex Virus, spricht man bei der Fusion mit TetR von einem Tetrazyklin-

abhängigen Transaktivator (tTA) (Gossen und Bujard, 1992). Wird TetR stattdessen mit einer

Repressordomäne wie der humanen KRAB-Domäne fusioniert, handelt es sich um einen

Tetrazyklin-abhängigen Transsilencer (tTS) (Deuschle et al., 1995). Abbildung 2 zeigt

exemplarisch die durch eine tTA Variante vermittelte Regulation der Transkription.

Abb. 2: tTA-vermittelte konditionale Genexpression

Die Transkription eines beliebigen Gens X (orange) erfolgt über einen

Minimalpromotor (PMin in blau). Stromaufwärts des Minimalpromotors

befindet sich ein TRE Sequenzelement (schwarz), bestehend aus einer

Folge von bis zu sieben tetO2 Operatoren. Die tTA Variante setzt sich aus

dem TetR Dimer (dunkelgrau) mit runder DNA Bindedomäne und ovalem

Proteinkörper sowie einer Aktivatordomäne (hellgrau) zusammen.

A) In Abwesenheit des Induktors Tc bindet die tTA Variante an die Tet-

Operatoren des TRE und aktiviert die Transkription über den

Minimalpromotor.

B) In Anwesenheit von Tc [gelbes Dreieck im Komplex mit zweiwertigen

Metallionen (grüner Kreis)] wird die tTA Variante Induziert, wodurch es zur

Dissoziation der tTA Variante von der DNA kommt. Ohne Aktivierung findet

nur eine schwache Basalexpression über den Minimalpromotor statt.

TRE PMin

Expression

Gen X

TRE Gen XPMin

A

B

-Tc

+Tc

+

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 7 -

2.2.1 Vielfalt von TetR Induktoren

Für die Anwendung von TetR in der konditionalen Genregulation wurden Induktoren benötigt,

die TetR möglichst effektiv induzieren. Im Zuge der Suche nach solchen Induktoren wurden

beispielsweise das Anhydrotetrazyklin (Atc) und Dox gefunden. Atc besitzt von allen bisher

getesteten Tc-Derivaten die höchste Affinität zu TetR und ist im Gegensatz zu Tc sogar in

Abwesenheit von zweiwertigen Metallionen in der Lage, TetR zu induzieren (Scholz et al.,

2000). Allerdings beschränkt sich der Einsatz von Atc aufgrund der hohen Toxizität auf

Bakterien. Im Gegensatz dazu ist die Toxizität von Dox in mammalischen Zellen deutlich

geringer, weshalb es einen der am häufigsten verwendeten Induktoren in der Zellkultur

darstellt (Gossen et al., 2002).

Im Zuge der Suche nach neuen TetR Induktoren wurden nicht nur niedermolekulare

Substanzen, sondern auch Peptidbanken untersucht. Zu diesem Zweck wurden mit Hilfe

eines „Phage Display“-Ansatzes TetR-bindende Peptide isoliert (Klotzsche et al., 2005).

Diese wurden anschließend als C-terminale Fusion mit dem Trägerprotein Thioredoxin A

(TrxA) auf ihre Fähigkeit hin getestet, TetR zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeiten konnte

das erste TetR-induzierende Peptid identifiziert werden, das später den Namen TIP (TetR

induzierendes Peptid) erhielt.

2.2.2 TIP-Varianten und ihre Eigenschaften

TIP ist sowohl als N-, wie auch als C-terminale TrxA Fusion in der Lage, TetR zu induzieren,

wobei die N-terminale Fusion eine deutlich höhere Induktionseffizienz zeigte (Klotzsche et

al., 2005). Durch die Einführung eines einzelnen Tryptophan-Restes an den N-Terminus von

TIP (Bezeichnung W-TIP) konnte die Induktionseffizienz der C-terminalen TIP Fusion

deutlich gesteigert werden (Klotzsche et al., 2007). Eine weitere Optimierung wurde durch

Einführung der zwei Aminosäureaustausche N82A und F86A in TetR(B) erreicht. Da diese

TetR Mutante nicht mehr mit Tc, Atc oder Dox induziert werden konnte, gelang somit die

Konstruktion einer Peptid-spezifischen TetR Variante. In nachfolgenden Experimenten

wurden mit einem „Yeast Two Hybrid“-System 22 weitere TIPs identifiziert. Unter diesen

befand sich auch pre-TIP2, dessen Induktionseffizienz in der C-terminalen Fusion an TrxA

über der von W-TIP lag. Die Effizienz von pre-TIP2 konnte durch den Aminosäureaustausch

L9A noch weiter gesteigert werden. Das resultierende Peptid TIP2 erreichte in Kombination

mit TetR(B) wt in dem verwendeten Messsystem die gleiche Induktionseffizienz wie Dox und

stellt somit den aktuell effizientesten, peptidischen Induktor am C-Terminus von TrxA dar

(Goeke et al., 2011).

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 8 -

2.2.3 Anwendung der peptidischen Induktion in prokaryontischen Organismen

Die erste experimentelle Anwendung von TIP stellte die Expressionsanalyse ausgewählter

Proteine in E. coli dar (Schlicht et al., 2006). Zu diesem Zweck wurde ein TIP basiertes

Insertionselement konstruiert, das ungerichtet in das Genom von E. coli integrierte. Auf diese

Weise wurden TIP Fusionen mit fünf verschiedenen endogenen Proteinen erzeugt, deren

Expression im Anschluss mit Hilfe eines TetR regulierten Reportergens analysiert werden

konnte. Die auf diese Weise generierten Daten deckten sich mit vorhergehenden Studien

und validierten somit die Methode. Aktuelle Projekte beschäftigen sich beispielsweise mit der

Expressionsanalyse Virulenz-assoziierter Proteine in Salmonella enterica in der Wirt-

Pathogen Interaktion.

2.2.4 Anwendung der peptidischen Induktion in eukaryontischen Organismen

Die Anwendung der TIPs war bisher auf prokaryontische Systeme beschränkt. Einzig die

W-TIP vermittelte Induktion einer auf der TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierenden

tTS Variante konnte in S. cerevisiae nachgewiesen werden (Stöckle, 2008). Diese tTS

Variante war jedoch aufgrund ihrer schwachen Repressionseigenschaften für weitere

Anwendungen ungeeignet. Eine auf TetR(B) wt basierende tTS Variante zeigte verbesserte

Repressionseigenschaften, jedoch konnte hier mit W-TIP keine Induktion in dem

S. cerevisiae Reportersystem nachgewiesen werden.

Zudem erfordert die Induktion von TetR in Eukaryonten die Lokalisation des Induktorpeptids

im Zellkern. Dadurch beschränkt sich die Anwendung in der Expressionsanalyse auf solche

Proteine, die sich im Zellkern befinden. Allerdings eröffnet diese Einschränkung auch völlig

neuartige Anwendungsmöglichkeiten wie beispielsweise die Analyse nucleo-cytoplas-

matischer Transportprozesse.

2.3 Der nucleo-cytoplasmatische Transport

2.3.1 Die Rolle der Kernporen

Die Kernmembran der eukaryontischen Organismen umschließt das genetische Material und

trennt es somit vom Cytoplasma ab. Diese Kompartimentierung ermöglicht auf der einen

Seite die Kontrolle der Verteilung zellulärer Bestandteile zwischen Nukleoplasma und

Cytoplasma, erfordert allerdings auf der anderen Seite effiziente Transportmechanismen für

Moleküle unterschiedlichster Art. Für Moleküle, die nicht durch die Kernmembran

diffundieren können, führt der einzige Weg zwischen Zellkern und Cytoplasma durch die

Kernporenkomplexe. Diese bestehen aus den sogenannten Nucleoporinen und umfassen in

Säugetierzellen eine Masse von rund 125 MDa (Reichelt et al., 1990; Schwartz, 2005).

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 9 -

Kleine Moleküle können passiv durch die Kernporen diffundieren, ab einem Molekular-

gewicht von ca. 25 - 40 kDa ist jedoch ein aktiver Transport erforderlich (zusammengefasst

in (Fried et al., 2003)). Aus Versuchen mit Goldpartikeln definierter Größe wurde

geschlossen, dass der Transport von Partikeln bis zu einem maximalen Durchmesser von

39 nm möglich ist (Pante et al., 2002).

2.3.2 Zelluläre Mechanismen

Aufgrund der Vielfalt der nucleo-cytoplasmatischen Transportmechanismen sowie deren

Regulation wird an dieser Stelle nur auf die wohl am besten charakterisierte Form des

aktiven Transports eingegangen (zusammengefasst in (Terry et al., 2007)). Hierbei erfolgt

die Initiation des Transportprozesses durch die Bindung eines Transportrezeptors an

Signalsequenzen der zu transportierenden Proteine (Cargo). Je nach Transportrichtung

handelt es sich hierbei um eine sogenannte Kernlokalisationssequenz (NLS: „nuclear

localization sequence“) (Dingwall et al., 1991) oder eine Kernexportsequenz (NES: „nuclear

export sequence“). Eine einfache, einteilige NLS besteht aus einer Folge von positiv

geladenen Aminosäuren, wie es beispielsweise bei der NLS des large-T Antigens aus dem

SV40 Virus (SV40 NLS: PKKKRKVE) der Fall ist (Kalderon et al., 1984). Findet sich im

Abstand von 10 bis 12 Aminosäuren eine weitere Folge von positiv geladenen Resten,

spricht man von einer zweiteiligen NLS, wie sie im Nucleoplasmin aus Xenopus laevis

(KR-X10-KKKK) vorliegt (Robbins et al., 1991).

Im Falle von NLS-haltigen Proteinen handelt es sich bei den Transportrezeptoren um die

sogenannten α und β Importine (Imamoto et al., 1995). Hierbei binden die β Importine

entweder direkt oder indirekt über die als Adapterproteine fungierende α Importine an die

NLS des Cargos (Goldfarb et al., 2004; Conti et al., 2006). Importin β interagiert mit den

FG-Nucleoporinen der Kernporenkomplexe (Gorlich et al., 1999) und bewerkstelligt

schließlich den Transfer des Transportkomplexes durch die Kernpore in den Zellkern (Radu

1995, Moroianu 1995). Im Kern bindet die GTPase Ran in der GTP gebundenen Form

(Ran-GTP) an den Transportkomplex und bewirkt die Freisetzung des Cargos (Rexach et al.,

1995) (Abb. 3). Importin α und β werden im Anschluss wieder ins Cytoplasma

zurücktransportiert und können dort den nächsten Transportzyklus einleiten.

Der aktive Export aus dem Zellkern wird in vielen Fällen mit Hilfe des Exportrezeptors CRM1

(„chromosome region maintenance factor 1“) bewerkstelligt. CRM1 bindet mit geringer

Spezifität an leucinreiche Kernexportsequenzen (la Cour et al., 2003; Matsuyama et al.,

2006), wobei die Leucine in manchen Fällen durch andere hydrophobe Reste ersetzt werden

können (Hutten et al., 2007). CRM1 bindet an die NES des Cargo und die GTPase Ran in

der GTP gebundenen Form (Ran-GTP) wodurch ein ternärer Transportkomplex gebildet

wird. Der Transport dieses Komplexes ins Cytoplasma durch die Kernporen erfolgt über

einen nicht vollständig aufgeklärten Mechanismus (zusammengefasst in (Hutten und

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 10 -

Kehlenbach, 2007). Ran-GTP wird im Cytoplasma mit Hilfe des Ran GTPase aktivierenden

Proteins (Ran-GAP) hydrolysiert, was zur Dissoziation des Komplexes führt (Hutten und

Kehlenbach, 2007) (Abb. 3).

Abb. 3: Der nucleo-cytoplasmatische Transport über Importin β und CRM1

Die Transportrezeptoren Importin-β bzw. CRM1 (hellgraues bzw. dunkelgraues

Oval) erkennen das Cargo (grüner bzw. gelber Kreis) über Signalsequenzen an

dessen Oberfläche (NLS bzw. NES) und bilden einen Rezeptor-Cargo Komplex (1).

Der Komplex wird durch die Kernpore über die Kernmembran transportiert (2). Auf

der anderen Seite der Kernmembran erfolgt die Dissoziation des Rezeptor-Cargo

Komplexes, wodurch das Cargo freigesetzt wird (3). Im Importin β vermittelten

Kernimport wird die Dissoziation mit der Bindung von Ran-GTP (rotes Rechteck mit

abgerundeten Ecken) an den Rezeptor eingeleitet. Beim CRM1 vermittelten

Kernexport enthält der Rezeptor-Cargo Komplex zusätzlich Ran-GTP. Hier erfolgt

die Dissoziation des Komplexes im Cytoplasma durch Hydrolyse von Ran-GTP zu

Ran-GDP (rotes Rechteck mit abgeschnittenem Eck) mit Hilfe des Ran GTPase

aktivierenden Proteins (Ran-GAP, blaues Rechteck mit abgerundeten Ecken).

Abbildung und Legende modifiziert aus (Terry et al., 2007).

NES

NLS

Kernmembran

Cytoplasma

Nukleoplasma

NLS

Cargo

Importin β

Ran-GTP

CRM1

Ran-GAP

Ran-GTP

Ran-GTP

1

2

3

1

2

3

NLSRan-GTP

NLS

NES

Kernpore

NES

Ran-GTP

NES

Ran-GDP

Cargo

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 11 -

2.3.2 Methodik zur Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen

Für die Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transportes von Proteinen ist es erforderlich,

deren subzelluläre Lokalisation detektieren zu können. Hierfür wird in den meisten Fällen

eines von zwei experimentellen Verfahren angewendet.

Im ersten Verfahren wird eine Translationsfusion aus dem Zielprotein und einem

fluoreszierenden Protein wie beispielsweise dem GFP aus Aequorea victoria hergestellt

(Shimomura et al., 1962). Die Lokalisation dieser Fusion kann anschließend am lebenden

Organismus im Fluoreszenzmikroskop analysiert werden (Gerdes et al., 1996). Ein Nachteil

dieser Methode besteht darin, dass fluoreszierende Proteine eine nicht unerhebliche Größe

besitzen. So umfasst beispielsweise GFP mit 238 AS eine Masse von ca. 27 kDa. Aufgrund

dessen kann bei dieser Methode die natürliche Funktion (Thomas et al., 2000), die

Löslichkeit (Lesley et al., 2002) oder auch die subzelluläre Lokalisation (Lisenbee et al.,

2003) des Zielproteins beeinflusst werden.

Die zweite Möglichkeit stellt die immunologische Detektion des Zielproteins innerhalb der

Zelle dar. Hierzu wird die zu untersuchende Zelle fixiert, permeabilisiert und mit einem

Primärantikörper gegen das Zielprotein behandelt. Dieser Primärantikörper kann im

Anschluss über einen mit Goldpartikeln (Faulk et al., 1979) oder Fluorophoren (Coons et al.,

1941) konjugierten Sekundärantikörper im Elektronen- oder Fluoreszenzmikroskop detektiert

werden. Diese Methode erfordert keine Modifikation des Zielproteins, allerdings kann dieses

Verfahren nicht am lebenden Organismus angewandt werden. Ein weiterer Nachteil dieser

Methode besteht darin, dass durch den Fixiervorgang die subzelluläre Lokalisation des zu

untersuchenden Proteins beeinflusst werden kann (Shibata et al., 2009).

2.3.3 Bedeutung des nucleo-cytoplasmatischen Transports bei viralen Infektionen

Viele Tier- und Pflanzenviren replizieren innerhalb des Zellkerns ihres Wirtes. Dies bietet den

Vorteil, dass die zelluläre DNA-Replikations-, Transkriptions- oder Spleißmaschinerie für die

virale Replikation verwendet werden kann, setzt allerdings den Import des viralen Genoms in

den Zellkern voraus (zusammengefasst in (Whittaker et al., 2000)). In welcher Form das

virale Genom in den Zellkern transportiert wird, entscheidet hierbei oft die Größe des viralen

Kapsids. Dieses ist bei vielen Viren zu groß, um als Ganzes durch die Kernporen zu

gelangen, was ein „Auspacken“ des Genoms vor dem Kernimport erforderlich macht.

2.3.3.1 DNA Viren

Ein Beispiel aus der Gruppe der Viren mit doppelsträngigem DNA Genom stellen die

Herpesviren dar, die zu den größten und komplexesten im Zellkern replizierenden Viren

gehören (zusammengefasst in (Roizman et al., 1996)). Im Falle des Herpes simplex Virus 1,

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 12 -

eines der am besten charakterisierten Vertreter, bindet das Kapsid am Kernporenkomplex

und entlässt die DNA durch die Pore in den Kern (Batterson et al., 1983; Ojala et al., 2000).

Zu den Viren, deren Kapsid dagegen klein genug ist, um durch die Kernporen zu gelangen,

gehört das Hepatitis B Virus (HBV), ebenfalls mit einem Genom aus doppelsträngiger DNA.

Das Kapsid des HBV hat einen Durchmesser von 32 bis 36 nm und liegt somit nahe an der

maximalen Transportgröße der Kernporen von 39 nm (Pante und Kann, 2002; Rabe et al.,

2003). HBV bedient sich hierbei des zellulären Importin α/β Transportweges, wobei sich die

NLS im HBV Kapsidprotein befindet (Kann et al., 1999).

2.3.3.2 RNA Viren mit DNA Intermediat

Neben den DNA Viren finden sich auch unter den RNA Viren Vertreter, deren

Replikationszyklus Stadien innerhalb des Wirtszellkerns beinhaltet. So ist es für viele

Retroviren essentiell eine Kopie ihres eigenen Genoms in das des Wirtes zu integrieren

(Brown, 1997). Aus dem einzelsträngigen RNA Genom der Retroviren wird hierbei im

Cytoplasma der Wirtszelle mittels einer Virus-kodierten reversen Transkriptase eine

DNA-Kopie erstellt. Die Integration dieser DNA Kopie in das Genom des Wirtes setzt bei

Zellen in der Interphase einen Import in den Zellkern voraus. Die Unfähigkeit, die

Kernmembran zu überwinden, limitiert für viele Retroviren, wie beispielsweise dem murinen

Leukämievirus, das Wirtsspektrum auf proliferierende Zellen (Roe et al., 1993). Während der

Mitose findet eine Fragmentierung des Zellkerns statt, wodurch der Zugang der viralen DNA

zum Wirtsgenom möglich wird.

2.3.3.4 RNA Viren ohne DNA Intermediat

Die meisten RNA Viren ohne DNA Intermediat replizieren im Gegensatz zu den unter 2.3.3.2

erwähnten Vertretern im Cytoplasma der Wirtszelle. Ein möglicher Grund hierfür ist das

Fehlen einer RNA abhängigen RNA Polymerase in der Wirtszelle (zusammengefasst in

(Whittaker et al., 1998)). Allerdings finden sich unter diesen Viren auch Vertreter, deren

Genom im Zellkern repliziert wird. Hierzu gehören beispielsweise die Influenza A Viren, auf

die im Folgenden näher eingegangen wird.

2.4 Das Influenza A Virus

2.4.1 Genom und virale Proteine

Die Influenza A Viren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae, zu der auch die

Influenzaviren der Gattungen B und C gehören. Das Genom der Influenza A Viren besteht

aus 8 verschiedenen Segmenten einzelsträngiger RNA mit negativer Polarität. Die beiden

kleinsten Segmente 7 und 8 codieren für jeweils zwei Proteine, deren mRNAs durch

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 13 -

alternatives Spleißen entstehen. Hierbei kodiert das Segment 7 für die Matrixproteine 1 und

2 (M1 und M2), und das Segment 8 für die Nichtstrukturproteine 1 und 2 (NS1 und NS2).

Daneben gehören die beiden Proteine PB1 und PB2 („polymerase basic“), das PA Protein

(„polymerase acidic“), das Nucleoprotein (NP), die Neuraminidase (NA) und das

Hämagglutinin (HA) zu den vom Influenza A Genom kodierten Proteinen (zusammengefasst

in (Modrow et al., 2010)). PB1-F2 („polymerase acidic frame 2“) und das erst kürzlich

entdeckte PB1 N40 entstehen aus der für PB1 codierenden mRNA durch die Verwendung

alternativer Startcodons (Chen et al., 2001; Wise et al., 2009).

Das Virion der Influenza A Viren (Abb. 4) trägt auf seiner Oberfläche die NA und

HA Moleküle, deren Subtyp für die Klassifizierung der Influenza A Viren verwendet wird. Das

Hämagglutinin, von dem bisher 16 verschiedene Varianten bekannt (H1-H16) sind, bindet

während der Infektion an N-Acetyl-Neuraminsäuren auf der Oberfläche der Wirtszelle

(zusammengefasst in (Schulze, 1972; Skehel et al., 2000)). Die Neuraminidase mit neun

bekannten Subtypen (N1-N9) katalysiert die Abspaltung der N-Acetyl-Neuraminsäuren in

Glycoproteinen des Wirtes und fördert hierdurch die Freisetzung reifer Viruspartikel

(Varghese et al., 1992). Die Hülle des Virions besteht aus einer von der Wirtszelle

stammenden Lipiddoppelschicht, deren Innenseite mit M1 Molekülen ausgekleidet ist

(Fujiyoshi et al., 1994). M2 bildet einen Protonenkanal, der die Lipiddoppelschicht des

Virions durchspannt (Pinto et al., 1992). Innerhalb der Hülle befinden sich die Nucleocapside,

bestehend aus je einem Segment viraler RNA und den Proteinen NP, PA, PB1 und PB2

(zusammengefasst in (Portela et al., 1999)). Die RNA ist über die gesamte Länge mit

NP Molekülen assoziiert, wobei jedes NP Molekül 24 Nukleotide bedeckt (Ortega et al.,

2000). Die Proteine PA, PB1 und PB2 stellen die Komponenten der RNA-abhängige RNA-

Polymerase dar (Penhoet et al., 1971) und bilden einen Komplex am 3‘ Ende der RNA (Murti

et al., 1988). Die Nukleokapside sind durch die Interaktion zwischen NP und M1 an der

Virushülle verankert (Schulze, 1972).

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 14 -

Abb. 4: Aufbau des Influenza A Virus

Die acht Segmente des viralen Genoms bestehen aus einzelsträngiger RNA, die im Virion als Nucleocapside

im Komplex mit den Proteinen NP, PA, PB1 und PB2 vorliegen. Die Nucleocapside sind von einer Membran

umgeben, in welche die Oberflächenproteine HA, NA und M2 eingelagert sind. M1 bildet eine Proteinschicht

an der Innenseite der Membran aus. Die Wirkorte der unter 2.4.4.4 beschriebenen Therapeutika gegen

Influenza A sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet. Abbildung und Legende modifiziert aus (Modrow et al.,

2010).

2.4.3 Vermehrungszyklus

Nach der HA-vermittelten Bindung des Virion an die Wirtszelle, wird dieses über

rezeptorvermittelte Endocytose in die Zelle aufgenommen (Steinhauer, 1999). Im Endosom

erfolgt eine Ansäuerung des Virions durch die Aktivität von M2, was zur Depolymerisation

von M1 und zur Ablösung des NP von M1 führt (Bui et al., 1996). Durch die Ansäuerung der

Endosomen kommt es zum Verschmelzen der Endosomenmembran mit der Virusmembran

und infolgedessen zur Freisetzung der Nucleocapside in das Cytoplasma der Wirtszelle

(White et al., 1983). Von dort aus erfolgt der Transport der Nucleocapside über die

Kernporen in den Zellkern wo die Transkriptions- und Replikationsschritte stattfinden (Herz et

al., 1981; Whittaker et al., 1996). Obwohl alle Proteinkomponenten der Nucleocapside

(NP, PA, PB1 und PB2) mindestens eine NLS enthalten, wird der Kernimport der

Nucleocapside nur von den beiden NLSs im NP vermittelt (Nath et al., 1990; Mukaigawa et

al., 1991; Nieto et al., 1994; Neumann et al., 1997; Wang et al., 1997; Weber et al., 1998;

Wu et al., 2009). Die Kernlokalisationssequenzen von NP, PA, PB1 und PB2 werden im

weiteren Verlauf der Virusreplikation benötigt, um die neu synthetisierten Proteine in den

virale RNA

NP

PB2-Protein

PA-Protein

PB1-Protein

NA

M2

HA

M1

Hüllmembran

Nucleocapsid

Rimantadin

Amantadin

Tamiflu®

Relenza®

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 15 -

Zellkern zu transportieren. Dies ist erforderlich, da die Assemblierung neuer Nucleocapside

im Zellkern stattfindet (Lamb et al., 2001). Für den Kernexport der Nucleocapside bindet NP

erneut an M1 (Martin et al., 1991; Bui et al., 2000). Der anschließende CRM1-vermittelte

Export ins Cytoplasma erfolgt mit Hilfe von NS2, das aufgrund seiner Funktion auch als NEP

(„nuclear export protein“) bezeichnet wird (O'Neill et al., 1998; Elton et al., 2001; Ma et al.,

2001; Watanabe et al., 2001). Für die Bildung neuer Viruspartikel lagern sich NA, HA und M2

Moleküle in die Zellmembran des Wirtes ein. Diese stülpt sich mit Hilfe von M1 aus und

umschließt die Nucleocapside (Compans et al., 1975; Dubois-Dalcq et al., 1984; Patterson et

al., 1988). Die Neuraminidase hydrolysiert die N-Acetyl-Neuraminsäure an der

Virusoberfläche und der infizierten Zelle und verhindert somit ein Verkleben der Viruspartikel

sowie eine erneute Adsorption an die bereits infizierte Zelle (Colman, 1989; Huang et al.,

2008).

2.4.4 Bedeutung von Influenza A als Pathogen

2.4.4.1 Grippepandemien

Influenza A Viren sind hochinfektiöse Krankheitserreger, die beim Menschen die Echte

Grippe, auch Influenza genannt, auslösen (zusammengefasst in (Bouvier et al., 2010)).

Obwohl die Echte Grippe auch durch Infektion mit Influenza B Viren verursacht werden kann,

wurden die Grippepandemien der letzten 100 Jahre ausschließlich durch Influenza A

Subtypen verursacht. Die wohl schwerste Grippewelle in dieser Zeit stellte die Spanische

Grippe der Jahre 1918 - 20 dar. Dieser durch einen H1N1 Virus verursachten Erkrankung

fielen bis zu 50 Millionen Menschen zum Opfer (Johnson et al., 2002). Weitere Pandemien

waren die Asiatische Grippe (1957-58), die Hongkong Grippe (1968), die Russische Grippe

(1977) sowie die Neue Grippe im Jahre 2009 (zusammengefasst in (Modrow et al., 2010)).

2.4.4.2 Aktuelle Bedrohung durch Influenza A

Im Gegensatz zu den, in größeren zeitlichen Abständen auftretenden Pandemien treten

Grippeepidemien global betrachtet jährlich auf (zusammengefasst in (Potter, 2001)). Aktuell

zirkulieren humanadaptierte H1N1 und H3N2 Viren, wobei die Sterblichkeit in den saisonalen

Grippewellen bei der H3N2 Variante im Vergleich zur H1N1 Variante deutlich höher ist.

Neben diesen humanadaptierten Viren können allerdings auch Varianten mit anderer

Wirtsspezifität eine Gefahr für den Menschen darstellen. Laut Berichten der

Weltgesundheitsorganisation (WHO) infizierten sich im Zeitraum von 2003 bis Oktober 2011

über 550 Menschen mit einem aviären H5N1 Influenza A Virus, wobei annähernd 60 % der

Infektionen tödlich verliefen (WHO, 2011).

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 16 -

2.4.4.3 Therapie von Influenza A Infektionen

Grippeviren sind einer ständigen Veränderung unterworfen (Bragstad et al., 2008) die

hauptsächlich durch zwei Mechanismen bedingt wird. Zum Einen entstehen durch die

Fehlerrate der virale Polymerase bei der Amplifikation des viralen Genoms Mutationen, was

zu einer ständigen Veränderung der viralen Proteine führt (Aggarwal et al., 2010). Zum

Anderen können durch Reassemblierung von RNA Segmenten bei gleichzeitiger Infektion

einer Zelle mit verschiedenen Viren völlig neue Virustypen entstehen (zusammengefasst in

(Ma et al., 2008)). Durch die resultierende Variabilität der Viren wird die auf wenige

Wirkstoffe beschränkte Therapie von Influenza A Infektionen zusätzlich erschwert. Im

Wesentlichen werden durch die verfügbaren Wirkstoffe zwei Proteine der Influenza A Viren

adressiert (siehe Abb. 4). Amantadin und Rimantadin, beides Derivate des Adamantan,

wirken auf das M2 Protein und interferieren auf diesem Weg mit der Invasion des Virus in die

Wirtszelle, können allerdings bereits im Organismus befindliche Viren nicht inaktivieren

(Belshe et al., 1988; Wang et al., 1993). Aufgrund ihrer Toxizität und der schnellen

Entwicklungen von Resistenzen durch Mutationen im M2 Protein sind die Adamantane

jedoch nur bedingt als Therapeutika geeignet (De Clercq, 2006). Daneben werden die

Neuraminidasehemmer Oseltamivir (Handelsname Tamiflu®) und Zanamivir (Handelsname

Relenza®) als Therapeutika eingesetzt, die die Ausbreitung der Influenzaviren im Körper

verhindern und den Krankheitsverlauf somit abschwächen (Monto et al., 1999; Lew et al.,

2000). Resistenzen gegen die Neuraminidasehemmer entstehen ebenfalls durch Mutationen

(zusammengefasst in (Gubareva, 2004)). Während der Grippewellen in den Jahren 2008/09

waren nahezu 100 % der in den USA zirkulierenden saisonalen H1N1 Viren gegen

Oseltamivir und alle H3N2 Isolate gegen Adamantane resistent (Dharan et al., 2009; Layne

et al., 2009). Daneben finden sich global H1N1 Isolate, die sowohl gegenüber Adamantanen,

als auch gegenüber Neuraminidasehemmern resistent sind (zusammengefasst in (Sheu et

al., 2011)). Aus diesen Beobachtungen wird ersichtlich, dass ein großer Bedarf an neuen

Wirkstoffen zur Therapie von Influenza A Infektionen besteht. Hierbei sind besonders solche

Substanzen interessant, die auf bisher nicht adressierte molekulare Komponenten der Viren

wirken. Einen möglichen Ansatzpunkt hierfür stellt der Import der viralen Proteine in den

Zellkern der Wirtszelle dar. Es konnte gezeigt werden, dass beispielsweise eine Inhibition

des NP Kernimports massive Auswirkungen auf die Effizienz der Infektion durch Influenza A

Viren hat (Cros et al., 2005; Kao et al., 2010).

2 Einleitung _____________________________________________________________________________________________________

- 17 -

2.5 Motivation und Zielsetzung der Arbeit

Teilprojekt 1:

Die Anwendung der peptidischen Induktion von TetR beschränkte sich bisher auf

prokaryontische Organismen. Für eukaryontische Organismen konnte bislang lediglich die

Induktion einer auf der TetR Doppelmutante N82A/F86A basierenden tTS Variante in

S. cerevisiae nachgewiesen werden. Das erste Teilprojekt dieser Arbeit stellte die

Weiterführung dieser Arbeiten dar. Hierbei sollte das Reportersystem so weit modifiziert

werden, dass auch die peptidische Induktion einer auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante

mit im Vergleich zur Doppelmutante besseren Repressionseigenschaften gezeigt werden

kann.

Teilprojekt 2:

Aufbauend auf den Erkenntnissen, die aus dem ersten Teilprojekt gewonnen wurden

befasste sich das zweite Teilprojekt mit der Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse

nucleo-cytoplasmatischer Transportvorgänge. Hierbei sollten humane Zelllinien hergestellt

werden, mit denen die nukleäre Konzentration TIP-fusionierter Proteine über die Induktion

eines Tet-kontrollierten Reportergens analysiert werden kann. Dieses System sollte auf ein

kernlokalisiertes Protein aus dem Influenza A Virus angewendet werden.

Dieses Teilprojekt umfasste die folgenden Arbeitsschritte:

A) Auswahl eines geeigneten Proteins aus dem Influenza A Virus.

B) Auswahl geeigneter Komponenten und Konstruktion der humanen Reporterzelllinien.

C) Anwendung der konstruierten Zelllinien auf das ausgewählte virale Protein und

Validierung des Reportersystems.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 18 -

3 ERGEBNISSE

3.1 Proteinvermittelte Induktion des Tet-Repressors in S. cerevisiae

Ein Teilprojekt dieser Arbeit basierte auf einem Plasmid-kodierten Reportersystem für

S. cerevisiae, das für die Analyse der proteinvermittelten Induktion von TetR entwickelt

wurde (Stöckle, 2008). Mit Hilfe dieses Systems wurde erstmalig die Induktion einer tTS

Variante in einem eukaryontischen System gezeigt. Hierbei handelte es sich um eine auf der

TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierende tTS Variante in Kombination mit der TIP

Variante W-TIP. Da diese tTS Variante allerdings nur schwache Repressionseigenschaften

aufwies, konnte nur innerhalb eines kleinen Messfensters gearbeitet werden. Eine auf

TetR(B) wt basierende tTS Variante zeigte verbesserte Repressionseigenschaften, jedoch

konnte hier mit W-TIP keine Induktion nachgewiesen werden. Ziel der Arbeit war es, dieses

System so weit zu modifizieren, dass die peptidische Induktion von TetR in S. cerevisiae

unter Verwendung der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante gezeigt werden kann.

3.1.1 Konzeption des Reportersystems

Das Reportersystem unterteilte sich in die drei Komponenten Reporter, Regulator und

Induktor. Zusammensetzung, Aufbau und Funktionsweise der Komponenten werden im

Folgenden erläutert und sind in Abbildung 5A und B schematisch dargestellt.

3.1.1.1 Reporter

Als Reporter diente GFP+, eine Variante des GFP aus Aequorea victoria (Shimomura et al.,

1962), das sich durch eine höhere Fluoreszenzausbeute und effektivere Faltung auszeichnet

(Scholz et al., 2000). Das gfp+ Gen stand unter transkriptioneller Kontrolle des adh1

Promotors aus Schizosaccharomyces pombe, der eine konstitutive Expression vermittelte

(Russell et al., 1983). Um eine konditionale Genexpression zu ermöglichen befand sich

stromaufwärts des adh1 Promotors eine TRE Sequenz mit sieben Wiederholungen des Tet

Operators tetO2 (Gossen und Bujard, 1992).

3.1.1.2 Regulator

Die TetR-abhängige Regulation des Reportergens wurde durch eine tTS Variante,

bestehend aus einer Translationsfusion von TetR(B) wt oder der Doppelmutante N82A/F86A

mit der Repressordomäne Ssn6 aus S. cerevisiae (Keleher et al., 1992) erzielt. Die

Expression der entsprechenden tTS Variante erfolgte über einen verkürzten cyc1 Promotor

aus S. cerevisiae der eine schwache konstitutive Expression vermittelte (Mumberg et al.,

1995). Die daraus resultierende, niedrige Konzentration des Regulators erhöhte die

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 19 -

Sensitivität des Reportersystems. Reporter und Regulator wurden zusammen auf einem

„Shuttlevektor“ für S. cerevisiae und E. coli kodiert. Hierbei handelte es sich um die Vektoren

pWHE711-WT (TetR(B) wt) und pWHE711-N82A/F86A (TetR(B) N82A/F86A). In Abbildung

6A ist der Vektor pWHE711-WT stellvertretend für beide Vektoren dargestellt.

3.1.1.3 Induktor

Das TetR-induzierende Peptid W-TIP wurde am C-Terminus eines Trägerproteins exprimiert.

Dieses Trägerprotein bestand aus dem gelb fluoreszierenden mYFP („monomeric yellow

fluorescent protein“) (Zacharias et al., 2002) mit je einer SV40 NLS am N- und am

C-Terminus (mYFP(NLS)2-W-TIP). Die Expression von mYFP(NLS)2-W-TIP stand unter

transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors aus S. cerevisiae, dessen Aktivität durch

Zugabe von Methionin zum Nährmedium stufenlos reprimiert wird (Sangsoda et al., 1985;

Kerjan et al., 1986; Mumberg et al., 1994). Der Induktor wurde auf dem Plasmid pWHE705,

einem zweiten, mit pWHE711-WT bzw. pWHE711-N82A/F86A kompatiblen „Shuttlevektor“,

kodiert (Abb. 6B).

3.1.2 Funktionsweise des Reportersystems

Bei maximaler Repression des met25 Promotors durch entsprechend hohe Methionin-

konzentrationen ist die Konzentration des Induktorpeptids W-TIP minimal. tTS besetzt die

tetO2 Operatoren im TRE und reprimiert den adh1 Promotor des Reportergens. Die Menge

an GFP+ ist daher minimal (Abb. 5A). Befindet sich kein Methionin im Medium, ist die

Aktivität des met25 Promotors und somit auch die Konzentration des Induktorpeptids

W-TIP maximal. W-TIP bindet und induziert tTS, wodurch dieser von der DNA dissoziiert. Die

Repression des adh1 Promotors ist aufgehoben und somit die GFP+ Expression maximal

(Abb. 5B).

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 20 -

Abb. 5: Schematische Darstellung des Reportersystems in S. cerevisiae

Protein-kodierende Bereiche sind orange, eukaryontische Promotoren blau und das TRE, bestehend aus

sieben Wiederholungen des Tet-Operators tetO2, schwarz dargestellt. Die in grau abgebildete tTS Variante

setzt sich aus dem TetR Dimer (wt oder Mutante N82A/F86A, dunkelgrau) mit ovalem Proteinkörper und

runder DNA-Bindedomäne sowie der Ssn6 Repressordomäne (hellgrau) zusammen. mYFP ist als gelbes

Oval mit W-TIP als Anhängsel und GFP+ als grüner Kreis abgebildet. CM = Cytoplasmamembran,

KM = Kernmembran, pWHE711 steht für pWHE711-WT bzw. pWHE711-N82A/F86A.

A) Bei hohen Methioninkonzentrationen ist der met25 Promotor maximal reprimiert und somit die

Konzentration von mYFP(NLS)2-W-TIP minimal. Die tTS Variante besetzt das TRE und übt maximale

Repression auf den Promotor des Reportergens aus.

B) Befindet sich kein Methionin im Medium, ist die Konzentration von mYFP(NLS)2-W-TIP maximal. W-TIP

bindet und induziert TetR, wodurch die tTS Variante von der DNA dissoziiert.

Abb. 6: Schematische Darstellung der Vektoren pWHE711-WT (A) und pWHE705 (B)

Protein-kodierende Bereiche sind orange, Replikationsursprünge grün [2µ, ARSH4/CEN6

(S. cerevisiae), pMB1 (E. coli)], eukaryontische Promotoren blau und das TRE schwarz dargestellt.

Die Positionen von Kernlokalisationssequenzen und Terminatoren sind mittels schwarzer Striche

gekennzeichnet. AmpR kodiert für die Ampicillinresistenz, URA3 (Orotidin-5’-P-Decarboxylase) und

LEU2 (3-Isopropylmalat-Dehydratase) bezeichnen die Selektionsmarker für S. cerevisiae.

pWHE711-WT11396 bp

URA3

AmpR

gfp+

tetR(B) wt

ssn6

TRE

Pcyc1

Padh1

ARSH4CEN6

pMB1

Terminatoren

pWHE7057611 bp AmpR

LEU2

myfp

W-tip

SV40 NLS Pmet25

pMB1

2µ

SV40 NLS

Terminator

A B

-

KM

CM

myfp W-tip

SV40 NLS

Pmet25pWHE705

Padh1TRE gfp+pWHE711

tTS

A

+ Met

-

- Met

+

Kernimport

Expression

GFP+

KM

CM

myfp W-tip

SV40 NLS

Pmet25pWHE705

Padh1TRE gfp+pWHE711

Expression

mYFP(NLS)2-W-TIP

tTS

B

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 21 -

3.1.3 Modifikation des Reportersystems

Abweichend von dem unter 3.1.1 dargestellten Reportersystem wurde in dieser Arbeit ein

anderes Induktorpeptid eingesetzt und das Trägerprotein neu konstruiert. Als peptidischer

Induktor kam TIP2 zum Einsatz, der im bakteriellen Kontext in Kombination mit TetR(B) wt

eine deutlich höhere Induktionseffizienz verglichen mit W-TIP zeigte (Goeke et al., 2011).

Um Überlagerungen zwischen den Anregungs- und Emissionsspektren des Reporter- und

des Trägerproteins zu vermeiden, wurde als fluoreszierende Proteinkomponente des

Trägerproteins mCherry (Shaner et al., 2004) statt mYFP verwendet,. Alle anderen

Komponenten des Reportersystems wurden beibehalten (siehe unter 3.1.1).

3.1.3.1 Konstruktion des Trägerproteins

Das Trägerprotein für TIP2 musste im Wesentlichen zwei Kriterien erfüllen. Zum Einen ist für

eine effiziente Induktion eine hohe Konzentration des Induktorpeptids nötig, das

Trägerprotein sollte daher möglichst hoch exprimiert werden. Zum Anderen muss das

Trägerprotein für die Interaktion zwischen Induktorpeptid und tTS möglichst stark im Zellkern

angereichert sein. Um die optimale Kombination aus Expression und subzellulärer

Lokalisation zu erhalten, wurden im Rahmen dieser Arbeit sieben verschiedene Varianten

des Trägerproteins konstruiert und miteinander verglichen. Der Aufbau der einzelnen

Varianten wird im Folgenden näher erläutert und ist in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tab. 1: Übersicht über den Aufbau der Trägerprotein-Varianten

BP SV40 NLS = (KRTADGSEFESPKKKRKVE), SV40 NLS = (PKKKRKVE), c-Myc NLS = (PAAKRVKLDE),

BP SV40 A6 NLS = (KRTADGSEFESPKKKRAVE), X6 = (ASMTGG), Z10 = (ASGLVPRGSH).

Variante

Nr.

„Leader-

Sequenz“

N-terminale

NLS

„Linker-

Sequenz“

fluoreszierendes Protein

(Codonadaptation des Gens)

C-terminale

NLS

1 – SV40 – mCherry (human) –

2 – SV40 – mCherry (human) SV40

3 X6 BP SV40 Z10 mCherry (human) –

4 – SV40 Z10 mCherry (human) –

5 Serin BP SV40 A6 Z10 mCherry (Hefe) –

6 Serin c-Myc Z10 mCherry (Hefe) –

7 – SV40 Z10 mCherry (Hefe) –

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 22 -

Variante 1

In der Variante 1 wurde die Sequenz der SV40 NLS (Kalderon et al., 1984) direkt an den

N-Terminus von mCherry fusioniert. Das hier verwendete mcherry Gen stammt aus dem

Vektor pE1411 (Danke, 2010) und ist an den humanen Codongebrauch angepasst.

Variante 2

Bei dieser Variante wurde an die Variante 1 zusätzlich eine C-terminale SV40 NLS angefügt.

Da TIP2 ebenfalls an den C-Terminus des Trägerproteins fusioniert wurde, konnte eine

Interferenz von TIP2 mit der Bindung des Kernimportrezeptors an die NLS nicht

ausgeschlossen werden. Um diesen potentiellen Effekt zu adressieren, wurde die

Eigenschaften dieser Variante nicht wie bei den anderen Varianten ohne TIP2, sondern

anhand der TIP2 Fusion untersucht.

Variante 3

Bei der Variante 3 wurde an den N-Terminus von mCherry eine 33 AS lange Sequenz

fusioniert, die aus Hodel et al. übernommen wurde (Hodel et al., 2001). Diese Sequenz

enthält eine zweiteilige SV40 NLS (BP SV40 NLS), die über eine 10 AS lange „Linker-

sequenz“ an mCherry fusioniert wurde. Diese synthetische, 17 AS umfassende NLS enthält

die SV40 NLS mit zwei weiteren, positiv geladenen Resten im Abstand von neun AS.

Weiterhin befindet sich am N-Terminus der BP SV40 NLS noch eine sechs AS lange

„Leadersequenz“ bei der es sich um einen Teil einer ehemaligen „Linkersequenz“ für einen

„Histidin-Tag“ handelt. Diese wurde bei der Deletion des „Histidin-Tag“ nicht vollständig

entfernt. Wie schon bei den Varianten 1 und 2 wurde das humanadaptierte mcherry Gen aus

pE1411 verwendet. Variante 3 exprimierende Zellen zeigten bei Anzucht auf Festmedium ein

stark verzögertes Wachstum. Üblicherweise waren nach Transformation oder Vereinzelung

des verwendeten Hefestamms K699 nach maximal 48 Stunden Einzelkolonien sichtbar. Im

Falle von Variante 3 waren hierfür etwa 72 Stunden Inkubation notwendig. Aufgrund dieser

Beobachtungen wurde zusätzlich zur Expression und subzellulären Lokalisation auch der

Einfluss der einzelnen Varianten auf das Wachstum von S. cerevisiae untersucht (siehe

unter 3.1.3.3).

Variante 4

Die Variante 4 entspricht im Aufbau der Variante 1, allerdings wurde hier die 10 AS lange

„Linkersequenz“ aus Variante 3 zwischen die SV40 NLS und mCherry eingefügt.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 23 -

Variante 5

Für die Variante 5 wurde ein an den Codongebrauch von S. cerevisiae adaptiertes mcherry

Gen aus dem Vektor pSB2K3-BBaE2060 (Nevozhay et al., 2009) verwendet. Die

N-terminale BP SV40 A6 NLS unterscheidet sich von der in Variante 3 verwendeten

BP SV40 NLS nur durch den Aminosäureaustausch K6A1 (Hodel et al., 2001). Weiterhin

wurde im Vergleich zu Variante 3 die N-terminale „Leadersequenz“ entfernt. Um eine positiv

geladene Aminosäure am N-Terminus und die damit verbundene kurze Halbwertszeit zu

vermeiden (siehe unter 4.1.2.3.2), wurde ein einzelnes Serin an den N-Terminus angefügt.

Variante 5 zeigte auf Festmedium den gleichen Wachstumsdefekt wie Variante 3.

Variante 6

Variante 6 leitete sich von Variante 5 durch Austausch der BP SV40 A6 NLS gegen die NLS

des humanen Protoonkogens c-Myc ab (Dang et al., 1988).

Variante 7

Die Variante 7 entspricht im Aufbau der Variante 4. Allerdings wurde hier das hefeadaptierte

mcherry Gen aus dem Vektor pSB2K3-BBaE2060 verwendet.

3.1.3.2 Subzelluläre Lokalisation der Trägerprotein-Varianten

Für die Analyse der subzellulären Lokalisation der einzelnen Trägerprotein-Varianten in

S. cerevisiae wurden fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen durchgeführt. Um hierbei

den Kontrast zwischen Zellkern und Cytoplasma zu erhöhen, wurden die mit den

entsprechenden Plasmiden transformierten Zellen mit dem DNA bindenden Fluoreszenz-

farbstoff DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol) behandelt. DAPI zeigt eine blaue Fluoreszenz

(Emissionsmaximum λem = 453 nm), wenn es mit UV-Licht angeregt wird (Anregungs-

maximum λex = 347 nm). In der DNA-gebundenen Form verschieben sich die Anregungs-

und Emissionsmaxima auf 363 nm und 448 nm und die Fluoreszenzquantenausbeute steigt

mehr als 20-fach an (Kapuscinski, 1995). Eine entsprechende Aufnahme für die Variante 7

findet sich in Abbildung 7. In den hier abgebildeten Zellen ist eine deutliche, subzelluläre

Akkumulation der roten mCherry Fluoreszenz in einem Areal zu erkennen, dass durch die

Färbung mit DAPI als Zellkern identifiziert wird. Eine solche fluoreszenzmikroskopische

Aufnahme zeigt allerdings lediglich einen kleinen Ausschnitt aus der Gesamtpopulation. Für

die fotografische Dokumentation größerer Zellpopulationen muss die Fluoreszenzintensität

der einzelnen Zellen auf einem vergleichbaren Niveau liegen. Aus der Abbildung 7B, die

1 Die Mutation befindet an Position 6 der SV40 NLS, bezogen auf die BP SV40 NLS handelt es sich um die

Position 17.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 24 -

einen größeren Bildausschnitt als die Abbildung 7A zeigt, geht allerdings hervor, dass die

Fluoreszenzintensität der einzelnen Zellen stark voneinander abweicht. Daneben konnte

beobachtet werden, dass die nukleäre Anreicherung in den einzelnen Zellen unterschiedlich

stark ausgeprägt war. Diese Beobachtungen decken sich mit den Erkenntnissen aus

vergleichbaren Untersuchungen (Hodel et al., 2006). Um eine möglichst umfassende

Aussage über die subzelluläre Lokalisation der einzelnen Trägerprotein-Varianten zu

erstellen, wurden alle, für die einzelnen Varianten kodierenden Plasmide sowie der für

mYFP(NLS)2-W-TIP kodierende Vektor pWHE705 (siehe unter 3.1.1.3) parallel in Hefe

transformiert und im Mikroskop analysiert. Die nukleäre Anreicherung der entsprechenden

Proteine wurde miteinander verglichen und für jedes Konstrukt eine der 4 Wertungen 0, +, ++

und +++ vergeben. Bei 0 wurde keine Zelle mit nukleärer Akkumulation gefunden. Die

Anzahl der Pluszeichen beschreibt den Anteil von Zellen der Gesamtpopulation mit nukleärer

Anreicherung. + bedeutet, dass die Akkumulation bei einigen Zellen, ++ bei der

überwiegenden Anzahl von Zellen und +++ bei allen Zellen zu beobachten war. Weiterhin

war bei steigender Anzahl von Zellen mit Akkumulation im Zellkern auch eine generelle

Abnahme der jeweiligen Restfluoreszenz im Cytoplasma zu erkennen. Eine ausschließlich

Lokalisation im Zellkern konnte in dieser Arbeit nicht beobachtet werden. Die Bewertung der

einzelnen Konstrukte findet sich in Tabelle 2. Bei mYFP(NLS)2-W-TIP wurde aus dem

gleichen Grund wie bei der mCherry Variante 2 die TIP Fusion für die Vergleichsanalysen

verwendet (siehe unter 3.1.3.1 Variante 2).

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 25 -

Abb. 7: Subzelluläre Lokalisation der Trägerprotein-Variante 7 in S. cerevisiae

A) Von links: mCherry in rot, Zellkern (DAPI) in blau, Überlagerung mCherry und DAPI,

Hellfeld

B) Größerer Bildausschnitt um die Zellen aus A), diese sind mittels eines weißen

Rechtecks gekennzeichnet.

Tab. 2: Nukleäre Anreicherung der einzelnen Trägerprotein-Varianten in S. cerevisiae

Die Wertungen 0, ++, +++ und +++ beschreiben den Anteil von Zellen an der Gesamtpopulation mit sichtbarer

Anreicherung im Zellkern. 0 ≙ keine Zelle / + ≙ wenige Zellen / ++ ≙ mehr als 50 % der Zellen / +++ ≙ alle Zellen

A

B

Konstrukt Anreicherung

im Zellkern

mCherry Variante 1 0

mCherry Variante 2 +

mCherry Variante 3 +++

mCherry Variante 4 ++

mCherry Variante 5 +++

mCherry Variante 6 +

mCherry Variante 7 ++

mYFP(NLS)2-W-TIP ++

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 26 -

3.1.3.3 Einfluss der Trägerprotein-Varianten auf das Wuchsverhalten von S. cerevisiae

Da die Varianten 3 und 5 ein verlangsamtes Wachstum auf Festmedium zeigten, wurde von

allen Varianten eine Wuchskurve in Minimal-Flüssigmedium für das Wachstum bei 28 °C

erstellt (Abb. 8). Zellen, die mit den für die Varianten 1, 2, 4, 5, 6 oder 7 kodierenden

Plasmiden bzw. dem Leervektor p425Met252 transformiert wurden, zeigten ein vergleich-

bares Wuchsverhalten ohne signifikante Unterschiede in den einzelnen Wuchsphasen. Im

Gegensatz dazu wurde für die Variante 3 ein deutlich abweichendes Wuchsverhalten mit

einem stark verzögerten Übergang von der Anpassungs- in die logarithmische Phase

beobachtet. Während der logarithmischen Phase hingegen wurde bei der Variante 3 eine,

mit den anderen Ansätzen vergleichbare Wachstumsgeschwindigkeit erreicht.

Abb. 8: Einfluss der Trägerprotein-Varianten auf das Wachstum von

S. cerevisiae

Für die Wuchskurven wurden S. cerevisiae Zellen mit den für die

Varianten 1 - 7 kodierenden Plasmiden oder dem Leervektor p425Met25

transformiert. Aus einer stationären Vorkultur dieser Zellen wurden für die

Hauptkultur 100 ml Minimalmedium auf eine oD600 von 0,1 beimpft. In

regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen und die

entsprechende oD600 wurde bestimmt. Die so erhaltenen Werte sind auf

der Ordinate gegen den entsprechenden Zeitpunkt der Probenentnahme

auf der Abszisse aufgetragen. Die Anzucht der Zellen erfolgte bei 28 °C.

2 p425Met25 ist der Ausgangsvektor für die Herstellung der Trägerprotein-Expressionsvektoren.

0,1

1

10

0 200 400 600 800 1.000 1.200

oD

600

t [min]

Variante 1

Variante 2

Variante 3

Variante 4

Variante 5

Variante 6

Variante 7

p425Met25

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 27 -

3.1.3.4 Expression der Trägerprotein-Varianten

Die Expression der Trägerprotein-Varianten 1, 2, 4, 5, 6 und 7 wurde über die Fluoreszenz-

intensität entsprechend transformierter S. cerevisiae Kulturen quantifiziert. Die Variante 3

konnte wegen der starken Wachstumsverzögerung in Flüssigkultur im Rahmen des

angewendeten Messprotokolls nicht zu einer ausreichenden Zelldichte angezogen werden.

Die Messergebnisse sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Varianten 1, 4 und 7 zeigten mit

259 ± 24 × 103 cps, 214 ± 26 × 103 cps und 257 ± 9 × 103 cps ein sehr ähnliches Fluores-

zenzniveau. Die Werte im Fall von Variante 2 waren im Vergleich dazu mit

79 ± 11 × 103 cps deutlich niedriger und im Fall von Variante 6 mit 349 ± 14 × 103 cps

deutlich höher. Die schwächste Fluoreszenz wurde für die Variante 5 mit 6 ± 2,5 × 103 cps

gemessen.

Abb. 9: Vergleich der Expressionsniveaus der Trägerprotein-Varianten

S. cerevisiae wurde mit dem für die entsprechende Variante kodierenden

Plasmid transformiert und bei 28 °C in Minimalmedium angezogen. Die

Quantifizierung der Fluoreszenzintensität erfolgte im Spektralfluorimeter bei

den Anregungs- und Emissionsmaxima für mCherry (λex = 587/ λem = 610 nm).

Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus

zwei unabhängigen Messungen mit zwei technischen Replikaten ermittelt.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Flu

ore

sze

nz

10

4[c

ps

]

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 28 -

3.1.4 Aufbau des Reportersystems mit der Trägerprotein-Variante 7

Die Trägerprotein-Variante 7 hatte keinen negativen Einfluss auf das Wachstum von

S. cerevisiae und zeigte die beste Kombination aus hoher nukleärer Anreicherung und

starker Expression, weshalb sie als neues Trägerprotein für TIP2 eingesetzt wurde. Die

Trägerprotein-Variante 7 wird in den folgenden Ausführungen aus Gründen der Über-

sichtlichkeit als mCherry7 bezeichnet. Das Induktorpeptid TIP2 wurde über eine SGGA

„Linkersequenz“ an den C-Terminus von mCherry7 (mCherry7-TIP2) fusioniert, als Kontrolle

diente mCherry7 ohne TIP2. Für die im Folgenden beschriebenen Messungen wurden jeweils

zwei Plasmide in S. cerevisiae transformiert und die entsprechende GFP+ bzw. mCherry

Fluoreszenz wurde im Spektralfluorimeter vermessen. Das erste Plasmid war in allen Fällen

der Vektor pWHE711-WT, kodierend für tTS und GFP+ (im Folgenden als tTS + Reporter

bezeichnet). Bei dem zweiten Plasmid handelte es sich entweder um das Plasmid

pWHE705/C7 (mCherry7), pWHE705/C7-TIP2 (mCherry7-TIP2) oder um den Leervektor

p425Met25. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Abbildung 10 und in Tabelle 3

zusammengefasst.

3.1.4.1 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + p425Met25

In diesem Ansatz wurde die GFP+ Fluoreszenz in An- und Abwesenheit von Dox vermessen.

Hierbei wurde eine Konzentration von 0,24 µg/ml Dox verwendet, die ausreicht, um die hier

verwendete tTS Variante maximal zu induzieren (Stöckle, 2008). Die GFP+ Fluoreszenz in

Anwesenheit von Dox war im Vergleich zum uninduzierten Zustand um Faktor 2,2 höher

(siehe unter 4.1.3). Sowohl der Regulationsfaktor, als auch die gemessenen Absolutwerte

stimmten mit den Ergebnissen aus vorhergehenden Messungen überein (Stöckle, 2008).

3.1.4.2 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7 (mCherry7)

Hier konnte durch Zugabe von 150 mg/l Methionin (maximale Repression des met25

Promotors) eine 6-fache Repression der mCherry Fluoreszenz erreicht werden. Die für die

Regulation des met25 Promotors eingesetzten Methioninkonzentrationen wurden aus

vorhergehenden Titrationsexperimenten (Mumberg et al., 1994; Stöckle, 2008) übernommen

und an das System angepasst. Die GFP+ Fluoreszenz lag unabhängig von der

entsprechenden mCherry Fluoreszenz auf einem konstanten Niveau, das ca. 13 % über dem

Wert lag, der in Abwesenheit von mCherry7 (siehe unter 3.1.4.1 ohne Dox) gemessen wurde.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 29 -

3.1.4.3 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7-TIP2 (mCherry7-TIP2)

In diesem Ansatz wurde durch Zugabe von Methionin eine 11-fache Repression der mCherry

Fluoreszenz erreicht. Der im Vergleich zu den Messungen ohne TIP2 höhere Faktor

resultierte aus einer geringeren mCherry Fluoreszenz bei maximaler Methioninkonzentration.

Im Gegensatz zu den Messungen mit mCherry7 ohne TIP2 wurde hier ein eindeutiger

Anstieg der GFP+ Fluoreszenz in Abhängigkeit von der mCherry7-TIP2 Expression

gemessen. Bei höchster mCherry7-TIP2 Expression wurde sogar die maximale Induktion des

Systems erreicht (siehe unter 3.1.4.1 mit Dox). Mit abnehmender mCherry7-TIP2 Expression

reduzierte sich die GFP+ Fluoreszenz bis auf ca. 75 % des Maximalwertes (siehe unter

4.1.3).

Abb. 10: Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante durch TIP2 in S. cerevisiae

S. cerevisiae wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert und bei 28 °C in Minimalmedium

angezogen. Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität erfolgte im Spektralfluorimeter bei den Anregungs-

und Emissionsmaxima für GFP+ (λex = 491/ λem = 512 nm) bzw. mCherry (λex = 587/ λem = 610 nm). Die

GFP+ Fluoreszenz ist durch schwarze Balken mit Skalierung auf der linken Ordinate und die mCherry

Fluoreszenz mit grauen Balken und Skalierung auf der rechten Ordinate dargestellt. Direkt aneinander

grenzende Balken stellen die GFP+ und mCherry Fluoreszenz desselben Ansatzes dar. Durch Zugabe von

Methionin zum Kulturmedium wurde das Expressionsniveau von mCherry7 bzw. mCherry7-TIP2 eingestellt.

Dox wurde in einer Konzentration von 0,24 mg/l eingesetzt, w/o bezeichnet einen Ansatz ohne Zugabe von

Dox. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus zwei unabhängigen

Messungen mit zwei technischen Replikaten ermittelt.

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

25.000

35.000

45.000

55.000

65.000

75.000

Methioninkonzentration [mg/l]

Flu

ore

szen

z G

FP

+ [

cp

s]

Flu

ore

szen

z m

Ch

erry

[cp

s]

tTS + Reporter +

mCherry7-TIP2

tTS + Reporter +

mCherry7

tTS +

Reporter

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 30 -

Tab. 3: Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante durch TIP2 in S. cerevisiae

Die Messdaten liegen der in Abbildung 10 gezeigten Messungen zugunde. Die hier dargestellten Mittelwerte

und Standardabweichungen wurden aus zwei unabhängigen Messungen mit zwei technischen Replikaten

ermittelt.

Transformierte Konstrukte

Effektor GFP+ Fluoreszenz

[cps] mCherry Fluoreszenz

[cps]

tTS + Reporter – 29010 ± 640 –

0,24 mg/l Dox 65220 ± 560 –

tTS + Reporter + mCherry7

– 32600 ± 2010 27190 ± 1990

3 mg/l Met 33280 ± 1170 18750 ± 390

10 mg/l Met 32500 ± 140 8750 ± 170

150 mg/l Met 32600 ± 140 4540 ± 140

tTS + Reporter + mCherry7-TIP2

– 65670 ± 120 24350 ± 1630

3 mg/l Met 63700 ± 3400 17680 ± 1680

10 mg/l Met 59430 ± 150 4350 ± 1070

150 mg/l Met 49100 ± 5440 2260 ± 420

3.4.1 Simultane Messung der GFP+ und mCherry Fluoreszenz

Um eine gegenseitige Beeinflussung der fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften von

mCherry und GFP+ auszuschließen, wurden entsprechende Kontrollen durchgeführt. Hierfür

wurde bei Zellen, die jeweils nur eines der beiden fluoreszierenden Proteine in unter-

schiedlicher Stärke exprimierten, auch die Hintergrundfluoreszenz für das nicht exprimierte

Fluoreszenzprotein gemessen. Dabei konnte im Vergleich mit Zellen, die weder GFP+ noch

mCherry exprimierten, keine signifikante Abweichung festgestellt werden. Aufgrund dieser

Ergebnisse wird ersichtlich, dass in dem hier gezeigten Reportersystem eine unabhängige

Messung der GFP+ und mCherry Fluoreszenz bei gleichzeitiger Expression möglich ist.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 31 -


3.2.1 Konzeption

Das Ziel des zweiten Projektes dieser Arbeit war die Konstruktion von humanen

Reporterzelllinen zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports viraler Proteine. Die

zu analysierenden Proteine, im Folgenden als POIs („protein of interest“)3 bezeichnet,

wurden als Fusion mit einer TIP Variante konstitutiv in der Reporterzelllinie exprimiert. Diese

POI-TIP Fusion war in der Lage einen, ebenfalls konstitutiv exprimierten, Tetrazyklin-

abhängigen Transregulator (tTR) zu regulieren. Neben den Expressionskassetten für POI-

TIP und tTR umfasste das System weiterhin ein Reportergen, dessen Transkription durch

tTR kontrolliert wurde. Da die Regulation des tTR-abhängigen Reporters durch die POI-TIP

Fusion nur dann erfolgen konnte, wenn sich diese im Zellkern befand, bestand ein direkter

Zusammenhang zwischen der subzellulären Lokalisation der POI-TIP Fusion und der

Expression des Reportergens. Der Aufbau und die Funktionsweise des Reportersystems

werden im Folgenden erläutert und sind in den Abbildungen 11A und B dargestellt.

3.2.2 Aufbau und Funktionsweise des Reportersystems

Die drei Komponenten des Reportersystems, der Induktor, der Regulator und der Reporter

wurden unabhängig voneinander in das Genom der Reporterzelllinie integriert. Der Reporter

bestand aus dem luc Reportergen4 unter transkriptioneller Kontrolle eines Minimalpromotors.

Der hier verwendete Minimalpromotor stellte eine verkürzte Variante des CMVIE5 Promotors

(Gossen und Bujard, 1992) dar und wird im Folgenden als CMVmin bezeichnet. Die

Tet-abhängige Kontrolle dieses Promotors wurde durch ein stromaufwärts positioniertes

TRE, bestehend aus sieben Kopien des Tet Operators tetO2 erreicht (Gossen und Bujard,

1992). Als tTR Variante wurde ein Tetrazyklin-abhängiger Transaktivator (tTA) gewählt, der

sich aus TetR(B) wt und drei Wiederholungen der F Aktivatordomäne (als FFF bezeichnet)

aus dem VP16 Protein des Herpes simplex Virus zusammensetzte (Baron et al., 1997).

Diese 39 AS umfassende, synthetische Aktivatordomäne wurde an den C-Terminus von

TetR fusioniert (TetR-FFF). Die Expression dieser tTA Variante erfolgte konstitutiv über

einen CMVIE Promotor. Als Induktorkomponente wurde TIP2 (Goeke et al., 2011) an den

C-Terminus des POI fusioniert. Die POI-TIP2 Fusion wurde durch den synthetischen

3 Das für POI kodierende Gen wird als goi („gene of interest“) bezeichnet.

4 luc kodiert für die Luciferase aus Photinus pyralis (McElroy et al., 1969).

5 CMVIE bezeichnet den starken „major immediate early“ Promotor des humanen Cytomegalievirus. (Akrigg et al.,

1985)

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 32 -

hEF1-HTLV6 Promotor (InvivoGen) konstitutiv auf hohem Niveau exprimiert. Befand sich die

POI-TIP2 Fusion im Zellkern, induzierte TIP2 die tTA Variante, die somit nicht mehr an die

Tet-Operatoren des TRE binden konnte. Ohne eine Aktivierung des CMVmin Promotors fand

lediglich eine schwache Basalexpression der Luciferase statt (Abb. 11A). Befand sich die

POI-TIP2 Fusion hingegen im Cytoplasma der Zelle, konnte tTA an die tetO2 Operatoren des

TRE binden und führte, vermittelt durch die FFF-Domäne, zu einer Aktivierung des CMVmin

Promotors, was eine hohen Expression der Luciferase bewirkte (Abb. 11B).

Abb. 11: Schematische Darstellung des Reportersystems zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports

Die hier gezeigten, genetischen Komponenten sind stabil in das Genom der Reporterzelllinie integriert. Protein-

kodierenden Bereiche sind orange, Promotoren blau und das TRE schwarz dargestellt. Der in grau dargestellte

tTA setzt sich aus dem TetR Dimer (dunkelgrau) mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne sowie

der FFF Aktivatordomäne (hellgrau) zusammen. Das Gen für die tTA Variante ist ebenfalls chromosomal

integriert und wird über den hEF1-HTLV Promotor konstitutiv exprimiert. Die Luciferase ist als gelber Kreis und

die POI-TIP2 Fusion als rotes Oval mit TIP2 als Anhängsel dargestellt. CM = Cytoplasmamembran,

KM = Kernmembran, das Reportergen luc kodiert für die Luciferase aus Photinus pyralis.

A) Befindet sich die POI-TIP2 Fusion im Zellkern, kann TIP2 tTA induzieren worauf hin dieser von den

Tet-Operatoren des TRE dissoziiert. Der CMVmin Promotor des luc Gens wird nicht aktiviert und zeigt somit nur

geringe Aktivität (nicht eingezeichnet).

B) Befindet sich die POI-TIP2 Fusion im Cytoplasma, kann tTA an die Tet-Operatoren des TRE binden und den

CMVmin Promotor aktivieren. Es findet eine hohe Expression der Luciferase statt.

3.2.3 Auswahl des POI

Als potentielle POIs wurden drei Proteine aus dem Influenza A Virus ausgewählt. Hierbei

handelte es sich um das Nucleoprotein (NP), das Nichtstrukturprotein 1 (NS1) und das

Matrixprotein 1 (M1) (siehe unter 2.4.1). Alle drei Proteine zeigen bei Expression in nicht

infizierten humanen Zelllinien eine nukleäre Anreicherung. Daneben existieren von allen drei

Proteinen Mutanten, die eine cytoplasmatische Lokalisation aufweisen (Ye et al., 1995; Li et

6 Der hEF1-HTLV Promotor setzt sich aus dem „core“ Promotor des humanen Elongationsfaktors EF-1α (Kim et

al., 1990) sowie dem R Segement und der R-U5‘ Sequenz des humanen T-Zell Leukämievirus (HTLV) (Takebe

et al., 1988) zusammen.

Luciferase

KM

CM

+

B

tip2PCMV IE

POI-TIP2

lucTRE

tTA

Expression

PCMVmin

Expression

goi

KM

CMA

tip2PCMV IE

POI-TIP2

lucTRE

tTA

Expression

PCMVmin

goi

Kernimport

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 33 -

al., 1998; Cros et al., 2005). Diese Mutanten sollten als Kontrollen für die Funktionalität des

Reportersystems dienen.

3.2.3.1 Das Matrixprotein M1

Das M1 Protein verfügt über eine einteilige NLS mit vier positiv geladenen Resten an den

Positionen 101-105 (101RKLKR105) (Ye et al., 1995). Ye et al. konnten zeigen, dass der

Austausch der geladenen gegen ungeladene Reste (101SNLNS105) zu einer cytoplasma-

tischen M1 Variante führt. Diese Experimente basierten auf dem M1 Protein aus Influenza

A/WSN/1933 (H1N1), das für diese Arbeiten nicht zur Verfügung stand. Stattdessen wurde

hier die Variante aus dem Virusstamm Influenza A/FPV/Rostock/1934 (H7N1) verwendet.

Ein Sequenzvergleich der beiden M1 Varianten findet sich in Abbildung 12. Die Amino-

säuresequenzen stimmen zu 96% überein und die NLS ist identisch. Aufgrund dessen

wurden die gleichen Mutationen wie bei Ye et al. beschrieben in das M1 Protein eingeführt,

um auch hier eine cytoplasmatische Lokalisation zu erreichen. Diese mutierte Variante wird

im Folgenden als M1Mut und das entsprechende Gen als m1mut bezeichnet. Das für diese

Arbeit verwendete m1 Gen aus dem Plasmid pHH-M (Thaa et al., 2009) enthielt die bereits

bekannte Punktmutation an der Position 587 (Austausch von Thymin nach Guanin), die zum

Aminosäureaustausch I196S führte. Diese Punktmutation wurde für die Experimente mit M1

entfernt.

Abb. 12: Sequenzvergleich der M1 Proteine aus Influenza A/FPV/Rostock/1934 (H7N1) und Influenza A/WSN/1933 (H1N1)

Die Position der Punktmutation I196S in dem durch pHH-M kodierten M1 Protein (Influenza

A/FPV/Rostock/1934) ist rot und die NLS, deren Mutation in der M1 Variante aus Influenza A/WSN/1933 zu

einer cytoplasmatischen Variante führt (Ye et al., 1995), ist blau gekennzeichnet. Der Sequenzvergleich wurde

mit Hilfe des Blastp Algorithmus (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) erstellt.

A/FPV/Rostock/1934

A/WSN/1933

A/FPV/Rostock/1934

A/WSN/1933

A/FPV/Rostock/1934

A/WSN/1933

A/FPV/Rostock/1934

A/WSN/1933

A/FPV/Rostock/1934

A/WSN/1933

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 34 -

3.2.3.1.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit M1 und M1Mut

Um die subzelluläre Lokalisation von M1 und M1Mut fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu

können, wurden Fusionen der beiden Proteine mit EGFP („enhanced“ GFP (Cormack et al.,

1996)) konstruiert. EGFP leitet sich vom GFP (Shimomura et al., 1962) ab und besitzt durch

Einführung der Mutationen F64L und S65T eine im Vergleich zum wt GFP deutlich erhöhte

Fluoreszenzausbeute. Die Konstruktion der Fusionen erfolgte über Klonierung der

entsprechenden Gene in die multiple Klonierungsstelle (MCS: „multiple cloning site“) des

Vektors pEGFP-N1 (Clontech, Abbildung 13). Dadurch entstanden Translationsfusionen mit

EGFP am C-Terminus von M1 oder M1Mut unter transkriptioneller Kontrolle des CMVIE

Promotors. Die resultierenden Vektoren wurden pM1-EGFP und pM1Mut-EGFP benannt.

Abb. 13: Das Plasmid pEGFP-N1 (Clontech)

Protein-kodierende Bereiche sind orange,

eukaryontische Promotoren blau, der pUC

Replikationsursprung aus E. coli grün, die

MCS rot und Polyadenylierungssignale

schwarz dargestellt. KanR kodiert für die

Kanamycinresistenz.

3.2.3.1.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von M1-EGFP und M1Mut-EGFP

Für die Analyse der subzellulären Lokalisation der M1-EGFP und M1Mut-EGFP Fusionen

wurden HeLa Zellen mit dem Plasmid pM1-GFP bzw. pM1Mut-GFP transient transfiziert. Nach

24 h wurden die Zellen mit dem DNA bindenden Fluoreszenzfarbstoff Höchst 33342

behandelt, um den Kontrast zwischen Zellkern und Cytoplasma zu erhöhen. Dieser Farbstoff

besitzt eine hohe Permeabilität in lebenden Zellen und zeigt im Komplex mit DNA nach

Anregung mit UV-Licht (Anregungsmaximum λex = 355 nm) eine blaue Fluoreszenz

(Emissionsmaximum λem = 465 nm) (Arndt-Jovin et al., 1977). Die anschließende in vivo

Untersuchung der Zellen erfolgte mittels eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops des Typs

Leica SP5. Wie aus entsprechenden Aufnahmen (Abb. 14A und B) hervorgeht, war die

Fluoreszenz sowohl bei M1-EGFP, als auch bei M1Mut-EGFP gleichmäßig in der Zelle

verteilt. Es konnte keine subzelluläre Akkumulation festgestellt werden. Aufgrund dieser

Erkenntnisse wurde das M1 Protein nicht weiter verwendet.

pEGFP-N14733 bp

egfp

KanR

MCS

PolyA Signal

PCMV IEpUC

PolyA Signal

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 35 -

Abb. 14: Lokalisation von M1-EGFP und M1Mut-EGFP in HeLa Zellen

Von links: Hellfeld, Zellkern (Höchst 33342) in blau, EGFP Fluoreszenz in grün, Überlagerung der

drei Aufnahmen. Die Länge des Skalierungsbalkens entspricht 20 µm.

A) M1-EGFP, Zellen transfiziert mit pM1-GFP

B) M1Mut-EGFP, Zellen transfiziert mit pM1Mut-GFP

3.2.3.2 Das Nichtstrukturprotein NS1

NS1 besitzt neben zwei NLSs (Greenspan et al., 1988) auch eine NES. Die Funktion dieser

NES wird bei Expression in uninfizierten Zellen mittels einer angrenzenden Sequenz

inhibiert, weshalb sich NS1 hier größtenteils im Zellkern befindet. Wird diese inhibierende

Sequenz durch die drei Mutationen R148A, E152A und E153A inaktiviert, befindet sich NS1

größtenteils im Cytoplasma (Li et al., 1998). Diese, von Li et al. konstruierte, Mutante

basierte auf der NS1 Variante aus Influenza A/WSN/1933, die auch in dieser Arbeit

verwendet wurde.

3.2.3.2.1 Mutation der 3‘-Spleißsequenzen des ns1 Gens

Die Gene für die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2 sind auf dem Segment 8 (Abb. 15) des

Influenza Genoms kodiert. NS1 wird von einem durchgehenden Leserahmen kodiert, NS2

hingegen besteht aus zwei Exons und einem Intron, wobei die entsprechende Spleißdonor-

und Spleißakzeptorstelle innerhalb des Leserahmens für NS1 liegen. Alonso-Caplen et al.

konnten zeigen, dass bei Expression des ns1 Gens in uninfizierten Zellen ein Teil der für

NS1 kodierenden mRNA in der Spleißmaschinerie gebunden und somit nicht ins Cytosol

transportiert wird (Alonso-Caplen et al., 1991). Dies führt zu einer stark reduzierten NS1

Proteinsynthese, was durch Modifikation der 3‘-Spleißsequenzen innerhalb des ns1 Gens

verhindert werden kann. Alonso-Caplen et al. verwendeten das ns1 Gen aus dem

A

B

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 36 -

Virusstamm Influenza A/Udorn/1972 (H3N2), dessen Sequenz sich an den mutierten

Positionen nicht von dem hier verwendeten Gen aus Influenza A/WSN/1933 unterscheidet.

Um eine effektive Expression des NS1 Proteins zu gewährleisten, wurden in dieser Arbeit die

gleichen Mutationen in die 3‘-Spleißsequenz des ns1 Gens eingeführt (Abb. 15). Es handelt

sich hierbei um drei stille Mutationen in drei aufeinanderfolgenden Tripletts. Die ersten

beiden Austausche von Uracil nach Alanin an den Positionen 495 und 498 stören die

Poly-Pyrimidinsequenz, der dritte Austausch von Alanin nach Cytosin an der Position

501 betrifft die 3‘ Akzeptorstelle. In Alonso-Caplen et al. wurde das ns1 Gen mit mutierter

3‘-Spleißsequenz ns3ss (ss für „splice sites“) benannt. In Anlehnung daran trägt das hier

verwendete Gen mit den entsprechenden Mutationen die Bezeichnung ns4ss. Die Gene ns1

aus Influenza A/WSN/1933 und ns4ss kodieren für Proteine mit identischer Sequenz, das

Produkt des ns4ss Gens wird allerdings aus Gründen der Übersichtlichkeit als NS4

bezeichnet. Entsprechend trägt das Gen für die Variante mit den Mutationen in der

NES-inhibierenden Sequenz den Namen ns4ssmut und das kodierte Protein die Bezeichnung

NS4Mut.

Abb. 15: Mutationen in der 3‘-Spleißsequenz des ns1 Gens aus Influenza A/WSN/1933

Im unteren Teil der Abbildung ist das Segment 8 des Influenza A Genoms

dargestellt. Exons sind in orange und das Intron von ns2 in hellgrau

eingezeichnet. Im oberen Teil der Abbildung sind die Konsensus-Sequenz

für die 3‘-Spleißstelle (Knippers, 2006) sowie die entsprechende Sequenz

des ns1 Gens aus Influenza A/WSN/1933 abgebildet. ns4ss leiten sich

vom ns1 Gen aus Influenza A/WSN/1933 ab und enthält drei

Basenaustausche an den unterstrichenen Positionen. Die Poly-Pyrimidin-

sequenz ist in den Sequenzen in grün und die erste Base des auf die 3‘-

Spleißstelle folgenden Exons in orange eingezeichnet.

Yx = Folge von Pyrimidinbasen (C oder U), N = beliebige Nukleobase

(A, C, G, oder U). Alle Nuklebasensequenzen sind als mRNA-Sequenzen

dargestellt.

CCC UCU CUU CCA GG

CCC UCA CUA CCC GG

ns1

Exon 1 Exon 2

Influenza A/WSN/1933:

ns4ss:

Konsensus-Sequenz : Yx-N-C A G G

Intron

3‘-Spleißstelle ns2

ns2:

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 37 -

3.2.3.2.2 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NS4 und NS4Mut

Analog zum M1 Protein wurden auch für NS4 und NS4Mut Fusionen mit EGFP durch

Klonierung der Gene ns4ss und ns4ssmut in den Vektor pEGFP-N1 hergestellt (siehe unter

3.2.3.1.1). Die aus dieser Klonierung resultierenden Plasmide wurden pNS4-EGFP und

pNS4Mut-EGFP bezeichnet.

3.2.3.2.3 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NS4-EGFP und NS4Mut-EGFP

Die Rolle von NS1 als pro- oder anti-apoptotischer Faktor bei Expression in uninfizierten

Zellen ist seit mehreren Jahren Gegenstand intensiver Forschung. So konnte beispielsweise

gezeigt werden, dass NS1 Varianten aus H5N9 oder H5N1 Influenza A Virusstämmen in

HeLa und MDCK7 Zellen proapoptotisch (Schultz-Cherry et al., 2001), Varianten aus H1N1

und H3N2 Stämmen in MDCK und Vero8 Zellen hingegen anti-apoptotisch wirken (Zhirnov et

al., 2002; Morris et al., 2005). Der Einfluss des hier verwendeten NS1 Proteins aus dem

H1N1 Stamm Influenza A/WSN/1933 auf die Apoptose in HeLa Zellen ist nicht bekannt.

Aufgrund dessen wurden die fluoreszenzmikroskopischen Analysen von NS4-EGFP und

NS4Mut-EGFP zusätzlich mit HEK2939 Zellen durchgeführt, da in diesem Zelltyp die

konstitutive Expression des NS1 Proteins aus Influenza A/WSN/1933 möglich ist (Kok et al.,

2006). Das weitere experimentelle Vorgehen erfolgte in gleicher Weise, wie für M1

beschrieben (siehe unter 3.2.3.1.2). Entsprechende Aufnahmen sind in den Abbildungen

16A, B, C und D dargestellt. NS4-EGFP zeigte sowohl in HeLa als auch in HEK293 Zellen

eine deutliche Akkumulation im Zellkern mit geringer Restfluoreszenz im Cytoplasma.

NS4Mut-EGFP hingegen konnte in beiden Zelltypen hauptsächlich im Cytoplasma detektiert

werden. Wie in Abbildung 16A im Vergleich zu den Abbildungen 16B, sowie 14A und B zu

erkennen ist, zeigen die NS4-EGFP exprimierenden HeLa Zellen eine veränderte

Zellmorphologie mit abgerundeter Form und rauer Oberfläche. Ob dies durch eine Induktion

der Apoptose zu begründen ist, kann aus diesen Experimenten nicht abgeleitet werden. Ein

vermehrtes Zellsterben konnte in den hier durchgeführten Experimenten jedoch nicht

beobachtet werden.

7 MDCK steht für „Madin Darby canine kidney“, es handelt sich hierbei um eine Nierenepithelzelllinie aus dem

Hund (Gaush et al., 1966). 8 Bei Vero-Zellen handelt es sich um eine Nierenepithelzelllinie aus dem Affen (Yasumura et al., 1963).

9 Bei HEK293 („human embryonic kidney“) Zellen handelt es sich um eine immortalisierte, humane

Nierenzelllinie (Graham et al., 1977).

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 38 -

Abb. 16: Lokalisation von NS4-EGFP und NS4Mut-EGFP in HeLa und HEK293 Zellen



A) NS4-EGFP, HeLa Zellen transfiziert mit pNS4-EGFP

B) NS4Mut-EGFP, HeLa Zellen transfiziert mit pNS4Mut-EGFP

C) NS4-EGFP, HEK293 Zellen transfiziert mit pNS4-EGFP

D) NS4Mut-EGFP, HEK293 Zellen transfiziert mit pNS4Mut-EGFP

3.2.3.3 Das Nucleoprotein NP

Das Nucleoprotein enthält zwei NLSs, wovon sich eine innerhalb der ersten 13 AS des

N-Terminus und die andere zwischen den Positionen 198 und 216 befindet (Neumann et al.,

1997; Wang et al., 1997; Weber et al., 1998). Durch Mutation der N-terminalen NLS

(7KR8 7AA8) konnten Cros et al. eine cytoplasmatische NP Variante konstruieren (Cros et

al., 2005). Diese Mutante basierte auf dem NP Protein aus Influenza A/WSN/1933, das auch

in dieser Arbeit verwendet wurde. Die NP Variante mit den Aminosäureaustauschen 7KR8

nach 7AA8 wird im Folgenden NPMut und das hierfür kodierende Gen npmut bezeichnet. Da

A

B

C

D

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 39 -

sich die subzelluläre Lokalisation von NP bei hoher Zelldichte (konfluente Kultur) vom Kern

ins Cytoplasma verschieben kann (Bui et al., 2002), wurden alle Experimente mit NP

ausschließlich bei geringer Zelldichte (keine Konfluenz) durchgeführt.

3.2.3.3.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NP und NPMut

Analog wie für die Proteine M1 und NS4 beschreiben (siehe unter 3.2.3.1.1 bzw. 3.2.3.2.2)

wurden auch für NP und NPMut Fusionen mit EGFP hergestellt. Die entsprechenden

Plasmide wurden pNP-EGFP und pNPMut-EGFP bezeichnet.

3.2.3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NP-EGFP und NPMut-EGFP

Das experimentelle Vorgehen erfolgte in gleicher Weise, wie für M1 beschrieben (siehe unter

3.2.3.1.2). Entsprechende Aufnahmen sind in den Abbildungen 17A und B dargestellt. Im

Falle von NP-EGFP konnte die Fluoreszenz ausschließlich im Zellkern detektiert werden,

wohingegen sich NPMut-EGFP größtenteils im Cytoplasma befand.

Abb. 17: Lokalisation von NP-EGFP und NPMut-EGFP in HeLa Zellen



A) NP-EGFP, Zellen transfiziert mit pNP-EGFP

B) NPMut-EGFP, Zellen transfiziert mit pNPMut-EGFP

A

B

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 40 -

3.2.4 Konstruktion der Reporterzelllinien

3.2.4.1 Die Zelllinie HLF33

Die im Rahmen dieser Arbeit konstruierten Reporterzelllinien wurden ausgehend von der

HeLa Zelllinie HLF33 (HeLa Luciferase Flp-In™) hergestellt (Berens et al., 2006). Diese

verfügt über ein chromosomal integriertes luc Gen unter transkriptioneller Kontrolle des

Minimalpromotors CMVmin (siehe unter 3.2.2). Weiterhin enthält die Zelllinie eine singuläre,

stabil integrierte Kopie des Plasmids pFRT/lacZeo (Invitrogen). Dies ermöglicht eine gezielte

Integration genetischer Komponenten durch eine Flp-Rekombinase katalysierte, homologe

Rekombination (Broach et al., 1980). Im Fall der HLF33 erfolgte die Integration des Plasmids

pFRT/lacZeo in einen chromosomalen Locus, der eine hohe Expression des integrierten

genetischen Elements ermöglicht (Drüppel, 2004).

3.2.4.2 Chromosomale Integration der tTA Expressionskassette

Die Konstruktion der unter 3.2.2 beschriebenen Reporterzelllinie erfolgte in zwei Schritten.

Im ersten Schritt wurde die Expressionskassette für die tTA Variante TetR-FFF unter

transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors (siehe unter 3.2.2) ungerichtet in das

Genom von HLF33 integriert. Zu diesem Zweck wurde die TetR-FFF kodierende Sequenz in

den Vektor pIRESPuro2 (Clontech) kloniert. Eine schematische Darstellung des aus dieser

Klonierung resultierenden Vektors pIPRBF findet sich in Abbildung 18. Über den CMVIE

Promotor erfolgt die Transkription einer polycistronischen mRNA, die stromabwärts der

Sequenz für TetR-FFF zusätzlich für die Puromycin-N-acetyl-Transferase kodiert (de la Luna

et al., 1988). Die Initiation der Translation dieses Resistenz gegenüber Puromycin

vermittelnden Enzyms erfolgt über die interne Ribosomen-Eintrittsstelle IRES

(„internal ribosomal entry site“) aus dem Encephalomyocarditis Virus (ECMV) (Rees et al.,

1996). pIPRBF wurde durch Restriktion mit dem Enzym AhdI linearisiert und in die Zelllinie

HLF33 transfiziert. Die anschließende Selektion erfolgte bei Puromycinkonzentrationen von

0,5 - 2,0 mg/l (0,5; 1,0; 1,5 und 2,0 mg/l). Daneben wurden parallel Selektionsansätze mit

einer Kombination aus den verschiedenen Puromycinkonzentrationen unter Zugabe von

1 mg/l Dox durchgeführt. Dies sollte die physiolgische Belastung der konstitutiven

Luciferase-Expression in den tTA exprimierenden Klonen reduzieren. Die Ergebnisse der

stabilen Transfektion sind in Tabelle 4 dargestellt. Es wurden insgesamt 44 Klone isoliert,

von denen 28 erfolgreich expandiert werden konnten. Hierbei wuchsen bei gleicher

Puromycinkonzentration in Anwesenheit von Dox tendenziell weniger Klone als in

Abwesenheit von Dox. Dieser Effekt ist möglicherweise auf die Toxizität von Dox

zurückzuführen. Die durch die Integration des Vektors pIPRBF in die Zelllinie HLF33 erzeug-

ten Zelllinien erhielten die Bezeichnung ALFX (X = 1 - 44) (Aktivator Luciferase Flp-in™).

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 41 -

Abb. 18: Das Plasmid pIPRBF

Protein-kodierende Bereiche sind orange, der

CMVIE Promotor blau, der ColE1 Replikations-

ursprung aus E. coli grün, die IRES rot und das

Polyadenylierungssignal sowie die Position der

Schnittstelle des Restriktionsenzyms AhdI schwarz

gekennzeichnet. AmpR kodiert für die Ampicillin-

und PuroR für die Puromycinresistenz.

Tab. 4: Ergebnis der stabilen Integration des Plasmids pIPRBF in die Zelllinie HLF33

Die Zugabe von Puromycin und/oder Dox erfolgte 48 h nach Transfektion der Zellen mit dem linearisierten

Vektor pIPRBF. Nach 14 Tagen wurden die resistenten Klone isoliert und in Anwesenheit von 0,5 mg/l

Puromycin ohne Zugabe von Dox expandiert. Die Messung der Luciferaseaktivität erfolgte 21 Tage nach der

Isolation der Klone.

Puromycin [mg/l]

Dox 1 mg/l

Resistente Klone

Expandierte Klone

Luciferase exprimierende

Klone

0,5 – 8 6 ALF12

+ 8 8 ALF2, -4, -6, -7

1,0 – 5 3 ALF39

+ 3 2 –

1,5 – 8 3 –

+ 2 1 –

2,0 – 9 4 –

+ 1 1 –

pIPRBF5952 bp

PuroR

AmpR

tTA

(tetR-fff)

IRESPoly A

Signal

PCMV IE

ColE1

AhdI

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 42 -

3.2.4.3 Charakterisierung der ALF Zelllinien

Alle 28 ALF Zelllinien wurden bezüglich ihrer Luciferaseaktivität in Abwesenheit von Dox

charakterisiert. Hierbei konnte nur bei sechs Zelllinien (ALF2, -4, -6, -7, -12 und -39) eine im

Vergleich zur Ausgangszelllinie HLF33 erhöhte Luciferaseaktivität gemessen werden.

Hierbei ist zu anzumerken, dass bei Puromycinkonzentrationen größer 1 mg/l keine Klone

mit erhöhter Luciferaseaktivität isoliert werden konnten. Durch Zugabe von 1 µg/ml Dox

wurde eine Reduktion der Luciferaseaktivität in allen Zelllinien um das 83- bis 616-fache

erreicht (Abb. 19). Dabei erreichten fünf Zelllinien das Niveau der Ausgangszelllinie HLF33

(< 10 ALU/µg Protein). Lediglich ALF6 zeigte eine schwache Luciferaseaktivität in Anwesen-

heit von Dox. Die Zelllinien ALF2, -4, -6 und -12 waren im Bezug auf ihre Wachstums-

geschwindigkeit vergleichbar mit der Ausgangszelllinie HLF33, die Linien ALF7 und -39

hingegen wuchsen langsamer und zeigten ein vermehrtes Zellsterben (Abb. 19). Aufgrund

des höchsten Regulationsfaktors, der geringen Luciferase-Basalexpression und der Vitalität

wurde die Zelllinie ALF2 für die weiteren Arbeiten ausgewählt.

Abb. 19: Luciferaseaktivität und Vitalität der Zelllinien ALF2, -4, -6, -7, -12, und -39

Die Luciferseaktivität wurde in An- und Abwesenheit von 1 µg/ml Dox gemessen und ist

in absoluten Lichteinheiten pro µg Gesamtprotein im Zelllysat (ALU/µg Protein)

angegeben. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus

drei biologischen Replikaten ermittelt. Die entsprechenden Regulationsfaktoren sowie

die Bewertung der Vitalität der einzelnen Zelllinien sind unterhalb des Diagramms

angegeben.

++ ≙ Wuchsgeschwindigkeit entspricht HLF33

+ ≙ verminderte Wuchsgeschwindigkeit und erhöhtes Zellsterben

1

10

100

1.000

10.000

100.000

ALF2 ALF4 ALF6 ALF7 ALF12 ALF39

AL

U/µ

g

Pro

tein

+ Dox

- Dox

ALF2 ALF4 ALF6 ALF7 ALF12 ALF39

Faktor 616 x 110 x 366 x 547 x 83 x 420 x

Vitalität ++ ++ ++ + ++ +

Lu

cif

era

se

akti

vit

ät

[AL

U/µ

g P

rote

in]

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 43 -

3.2.4.4 Das Nucleoprotein als POI

Da M1 aufgrund der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen (siehe unter 3.2.3.1.2)

nicht als POI in Frage kam, blieben NP und NS1 als potentielle Kandidaten. Die NP-EGFP

Fusion zeigte eine quantitative Anreicherung im Zellkern wohingegen NPMut-EGFP nahezu

vollständig im Cytoplasma lokalisiert war (siehe unter 3.2.3.3.2). Weiterhin stand für NP

Nucleozin als spezifischer Inhibitor des Kernimports (Kao et al., 2010) zur Verfügung und

konnte somit für die Validierung der Reporterzelllinie eingesetzt werden. Aus diesen

Gründen und wegen der nicht vollständig aufgeklärten Rolle des NS1 Proteins in der

Regulation der Apoptose in HeLa Zellen wurde NP für die weiteren Arbeiten ausgewählt. Für

die Herstellung der Fusion aus NP und TIP2 wurde die TIP2-Peptidsequenz über die

4 AS lange „Linkersequenz“ SGGA an den C-Terminus von NP fusioniert. Dieses

Fusionsprotein wird im Folgenden als NP-TIP2 bezeichnet.

3.2.4.5 TetR-Induktion durch NP-TIP2 in E. coli

Um zu überprüfen, ob die peptidische Induktion von TetR(B) wt durch das NP-TIP2

Fusionsprotein grundsätzlich möglich ist, wurden Vorversuche in E. coli durchgeführt. Für

diese Arbeiten wurde ein Reportersystem verwendet, das für die Identifizierung peptidischer

Induktoren konstruiert wurde (Klotzsche et al., 2005). Aufbau und Funktionsweise dieses

Systems werden im Folgenden erläutert und sind in Abbildung 20 dargestellt.

3.2.4.5.1 Aufbau und Funktionsweise des E. coli Messsystems

Das System besteht aus einem E. coli Messstamm mit chromosomaler Integration des lacZ

Reportergens unter Tet-Kontrolle sowie zwei kompatiblen Plasmiden. Die Tet-Kontrolle von

lacZ wird durch einen Tet-Operator in der lacZ Promotorregion bewerkstelligt und ermöglicht

eine Quantifizierung der TetR-Induktion über die Aktivität der β-Galaktosidase. Abweichend

von Klotzsche et al. (Klotzsche et al., 2005) wurde hier nicht der Messstamm DH5α(λtet50),

sondern der analog aufgebaute Stamm WH207(λtet50) (Wissmann et al., 1991) verwendet.

Die Expression von TetR erfolgte konstitutiv auf niedrigem Niveau über das Plasmid

pWH527. Das zweite Plasmid pWH2101/NP-TIP2 kodiert für die NP-TIP2 Fusion unter

transkriptioneller Kontrolle des tac10 Promotors. Als Kontrolle diente NP ohne TIP2, das auf

dem Vektor pWH2101/NP kodiert ist. Der tac Promotor wird durch Bindung des von pWH527

konstitutiv exprimierten lac Repressors (LacI) bis auf ein Basalniveau reprimiert. Somit kann

10

Beim tac Promotor handelt es sich um einen synthetischen Hybridpromotor, der sich aus Teilen der trp und lac

Promotoren zusammensetzt. Der tac Promotor vermittelt eine starke Transkription, die durch Bindung von LacI

an den lac Operator reprimiert wird (de Boer et al., 1983).

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 44 -

die Expression von NP-TIP2 bzw. NP durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid

(IPTG) stufenlos reguliert werden. Hierfür wurde IPTG in Konzentrationen bis 90 µM

eingesetzt, bei höheren Konzentrationen wurde ein reduziertes Wachstum der Zellen

beobachtet.

Abb. 20: Schematische Darstellung des E. coli Reportersystems zur Analyse der peptidischen Induktion von TetR

Protein-kodierende Bereiche sind orange, Promotoren blau, die p15A und pMB1 Replikationsursprünge aus

E. coli grün und tetO2 schwarz dargestellt. AmpR kodiert für die Ampicillin- und Kan

R für die Kanamycin-

resistenz. Das TetR Dimer ist in grau mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne dargestellt. Die

β-Galaktosidase ist als roter Kreis und NP als schwarzes Oval mit TIP2 als Anhängsel abgebildet.

CM = Cytoplasmamembran.

E. coli WH207(λtet50) enthält chromosomal integriert lacZ unter Tet-Kontrolle. TetR wird konstitutiv exprimiert

und bindet an den Tet Operator tetO2 innerhalb der lacZ Promotorregion wodurch die Expression der

β-Galaktosidase reprimiert wird. LacI, ebenfalls konstitutiv exprimiert, verhindert die Transkription des unter

Ptac-Kontrolle stehenden NP-TIP2 Fusionsproteins. Wird IPTG zugegeben dissoziiert LacI von seiner

Bindestelle innerhalb des tac Promotors und es kommt zur Expression von NP-TIP2. Wird TetR induziert,

kann das Reportergen lacZ transkribiert werden. Abbildung und Legende wurden aus (Klotzsche et al., 2005)

entnommen und modifiziert.

pWH2101/NP-TIP25676 bp

pWH5276325 bp

tetR(B) wt

KanR

AmpR

p15A

pMB1

np-tip2

lacI

Ptac

NP-TIP2

Genom β-Galaktosidase

CM

lacZtetO2

Expression

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 45 -

3.2.4.5.2 Induktion von TetR durch NP-TIP2

Für die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität (β-Gal-Aktivität) in Abwesenheit von TetR

wurde E. coli WH207(λtet50) mit den beiden Leervektoren pWH120011 (Wissmann et al.,

1991) und pWH80612 (Altschmied et al., 1988) transformiert. Die in diesem Ansatz

gemessene β-Gal-Aktivität wurde als 100 % definiert. Für die Messung der β-Gal-Aktivität bei

maximaler Repression sowie bei Induktion von TetR wurde E. coli WH207(λtet50) mit den

Plasmiden pWH527 und pWH1200 transformiert. Hierbei konnte eine β-Gal-Aktivität von 7 %

bei Repression (Abwesenheit von Dox) sowie 76 % bei Induktion des Systems

(in Anwesenheit von 0,1 mg/l Dox) erreicht werden. Die Kontrollmessung mit NP ohne TIP2

erfolgte durch Transformation des Messtamms mit den Plasmiden pWH527 und

pWH2101/NP bei IPTG Konzentrationen von 0, 30, 60 und 90 µM. Die β-Gal-Aktivität in

diesen Ansätzen lag, unabhängig von der verwendeten IPTG Konzentration, bei ca. 7 %,

was dem Niveau der maximalen Repression durch TetR entsprach. Die Messung der

Induktion von TetR durch NP-TIP2 erfolgte durch Transfektion des Messtamms mit den

Plasmiden pWHE527 und pWH2101/NP-TIP2, ebenfalls bei IPTG Konzentrationen von

0, 30, 60 und 90 µM. Hier konnte mit steigender IPTG Konzentration eine kontinuierlich

Zunahme der β-Gal-Aktivität gemessen und somit die konzentrationsabhängige,

TIP2-vermittelte Induktion von TetR gezeigt werden. Die NP-TIP2 Fusion ist daher in E. coli

funktional. Eine graphische Darstellung aller Ergebnisse findet sich in Abbildung 21.

11

pWH1200 enthält den p15A Replikationsursprung und kodiert für die Kanamycinresistenz, jedoch nicht für

TetR. 12

pWH806 enthält den pMB1 Replikationsursprung und kodiert für die Ampicillinresistenz, jedoch nicht für die

Expressionskassette unter transkriptioneller Kontrolle des tac Promotors.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 46 -

Abb. 21: Induktion von TetR durch NP-TIP2 in E. coli

Die Messung erfolgte in E. coli WH207(λtet50). Die β-Gal-Aktivität in

Abwesenheit von TetR entspricht 100 %. Dox wurde in einer Konzentration

von 0,1 mg/l zugegeben. Das Expressionsniveau von NP bzw. NP-TIP2

wurde durch Zugabe von IPTG eingestellt. w/o bezeichnet einen Ansatz ohne

Zugabe von Dox oder IPTG. Die hier dargestellten Mittelwerte und

Standardabweichungen wurden aus vier biologischen Replikaten ermittelt.

3.2.4.6 Chromosomale Integration der NP-TIP2 Expressionskassette

Die gezielte Integration der NP-TIP2 Expressionskassette stellte den zweiten Schritt in der

Konstruktion der Reporterzelllinie dar. Das Prinzip und der Ablauf der Integration ist in

Abbildung 22 schematisch dargestellt. Durch die ungerichtete Integration des Vektors

pFRT/lacZeo (Invitrogen) entstehen sogenannte Flp-In™ Zelllinien wie HLF33, die eine

gezielte Integration genetischer Elemente über die FRT Sequenzen („Flp recognition target“)

ermöglichen. Aufgrund der konstitutiven Expression des lacZ-Zeocin™ Gens sind

Flp-In™ Zelllinien resistent gegenüber Zeocin™ und LacZ positiv13. Durch die Integration des

Vektors pcDNA5/FRT in die FRT Sequenz wird die Expression des lacZ-Zeocin™ Gens

terminiert und die pcDNA5/FRT kodierte Resistenz gegenüber Hygromycin exprimiert. Somit

kann der Erfolg der Integration durch Resistenz gegenüber Hygromycin, Sensibilität

gegenüber Zeocin™ und die LacZ in situ Färbung kontrolliert werden. Die Integration eines

13

LacZ positive Zelllinien färben sich bei der LacZ in situ Färbung blau (siehe unter 3.2.4.6.1).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

β-G

al-

Ak

tivit

ät

[%]

IPTG Konzentration [µM]

TetR + NP-TIP2TetR + NPTetR

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 47 -

geeigneten Konstruktes in die FRT Sequenz einer Flip-In™ Zelllinie erfolgt über gleichzeitige

Transfektion der Zellen mit dem zu integrierenden Konstrukt und dem Vektor

pOG44 (Invitrogen). pOG44 kodiert für eine Variante der Flp-Rekombinase, die durch den

Aminosäureaustausch F70L im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte Instabilität bei 37 °C

aufweist (Buchholz et al., 1996). Die Flp-Rekombinase Reaktion erfolgt deshalb bei 30 °C

und wird durch Erhöhung der Temperatur auf 37 °C terminiert. Der Integrationsvektor

pcDNA5/FRT enthält eine Expressionskassette unter transkriptioneller Kontrolle des CMVIE

Promotors, der in den ALF Zelllinien bereits in der tTA Expressionskassette vewendet wurde.

Da bei gleichzeitiger Expression zweier Gene über den CMVIE Promotor eine reduzierte

Expression eines oder beider Gene beobachtet wurde (persönliche Mitteilung Dr. C. Berens),

wurde für die Expression von NP-TIP2 ein alternativer Promotor verwendet. Zu diesem

Zweck wurde der CMVIE Promotor in pcDNA/FRT gegen den starken, synthetischen

hEF1-HTLV Promotor ausgetauscht. Das resultierende Konstrukt wurde als pEF1-HTLV/FRT

bezeichnet. Aus der Klonierung des für NP-TIP2 kodierenden Gens in pEF1-HTLV/FRT

resultierte der Integrationsvektor pEF1-HTLV/NP-TIP2, der in Abbildung 22 dargestellt ist.

Nach Transfektion der Zelllinie ALF2 mit den Vektoren pEF1-HTLV/NP-TIP2 und pOG44

wurden die Zellen für 72 Stunden bei 30 °C ohne Selektion und anschließend bei 37 °C in

Gegenwart von 250 mg/l Hygromycin kultiviert. Nach zwei Wochen wurden insgesamt 34

resistente Klone isoliert, von denen 28 erfolgreich expandiert werden konnten. Die durch die

Integration von pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die Zelllinie ALF2 erzeugten Zelllinien erhielten die

Bezeichnung ALF2-NPX (X = 1-34).

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 48 -

Abb. 22: Stabile Integration von pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die Zelllinie ALF2

Protein-kodierende Bereiche sind orange, Promotoren blau, die pUC Replikationsursprünge aus E. coli

grün und die Position von Polyadenylierungssignalen schwarz dargestellt. Die Positionen der beiden

Oligonukleotide EF1seq1 und HK64, die für die unter 3.2.4.6.4 beschriebenen Amplifikation der NP-

TIP2 Expressionskassette verwendet wurden, sind in rot eingezeichnet.

Die stabile Integration des Vektors pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die FRT Sequenz der Zelllinie ALF2 erfolgte

über Flp-Rekombinase-vermittelte, homologe Rekombination. Im oberen Teil der Abbildung ist der

Locus der Integration von pFRT/lacZeo in der Zellinie ALF2 abgebildet. Durch die Expression des lacZ-

Zeocin™

Gens ist die Zelllinie ALF2 Zeocin™

resistent und LacZ positiv. Die ortsspezifische Integration

des Vektors über das Flp-In™

System erfolgte durch gleichzeitige Transfektion der Zellen mit den

Plasmiden pEF1-HTLV/NP-TIP2 und pOG44. Hierbei katalysiert die auf pOG44 kodierte Flp-

Rekombinase die homologe Rekombination zwischen der FRT Sequenz der Zelllinie ALF2 und dem

Integrationsvektor pEF1-HTLV/NP-TIP2. Die aus der Reaktion resultierende Zelllinie ALF2-NP

exprimiert NP-TIP2 sowie die Hygromycin Resistenz, jedoch nicht das lacZ-Zeocin™

Gen. Somit ist

ALF2-NP resistent gegenüber Hygromycin, sensitiv gegenüber Zeocin™

und LacZ negativ.

Flp-Rekombinase

PolyA Signal

pEF1-HTLV/NP-TIP26228 bp

HygR

np-tip2

PhEF1-HTLV

pUC

AmpR

pUC

PolyA Signal

PhEF1-HTLV

PolyA Signal

pUCPSV40

FRT

FRT

PSV40 pUC

PolyA Signal

lacZ-Zeocin™

lacZ-Zeocin™FRT

np-tip2 AmpRHygR AmpR

AmpR

EF1seq1 HK64

FRT

Expression Expression

Expression

ALF2

PolyA Signal

ALF2-NP

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 49 -

3.2.4.6.1 Kontrolle der stabilen Integration durch LacZ in situ Färbung

Nach Integration des Vektors pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die FRT Sequenz der ALF2 Zelllinie

exprimiert die resultierende Zelllinie im Gegensatz zur Ausgangszelllinie ALF2 keine

β-Galaktosidase mehr, was zur Kontrolle der erfolgreichen Integration verwendet wurde. Die

Visualisierung der β-Galaktosidase Expression erfolgte über eine LacZ in situ Färbung mit

dem Farbstoff X-Gal. Dieser ist im Ausgangszustand gelb und wird durch die

β-Galaktosidase in ein blaues Produkt umgesetzt. Somit färben sich β-Galaktosidase

exprimierende Zellen in der LacZ in situ Färbung blau, wohingegen Zellen ohne Expression

der β-Galaktosidase farblos bleiben. Um die korrekte Integration des Vektors

pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die FRT Sequenz der ALF2 Zelllinie zu überprüfen wurde die

β-Galaktosidase Expression aller 28 erfolgreich expandierten ALF2-NP Zelllinien charak-

terisiert. Hierbei zeigten 24 dieser Zelllinien ausschließlich farblose Zellen und wurden

deshalb für die weiteren Arbeiten verwendet. Bei der Zelllnie ALF2, die zu Kontrollzwecken

mitgeführt wurde, färbten sich nahezu alle Zellen blau. Die Ursache für das Aufteten

farbloser Zellen bei der Zelllinie ALF2 wurde nicht weiter untersucht. In den Abbildungen 23A

und B sind beispielhaft mikroskopische Aufnahmen einer LacZ positiven und einer LacZ

negativen Zellline abgebildet.

Abb. 23: LacZ in situ Färbung

Die Abbildung zeigt beispielhaft eine LacZ positive Zelllinie ALF2 (A), bei der sich die Zellen in der

LacZ in situ Färbung blau einfärben wohingegen die Zellen einer LacZ negativen Linie wie

ALF2-NP19 (B) farblos bleiben.

3.2.4.6.2 Charakterisierung der ALF2-NP Zelllinien

Die ALF2-NP Zelllinien enthalten alle Komponenten des unter 3.2.2 beschriebenen

Reportersystems. Demnach befindet sich das konstitutiv exprimierte Fusionsprotein NP-TIP2

im Zellkern und kann dort die tTA Variante induzieren. Daher sollte das Niveau der

Luciferaseexpression in den ALF2-NP Zelllinien unter dem Niveau der Ausgangszelllinie

A B

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 50 -

ALF2 liegen. Wird die Expression der Luciferase aufgrund einer unvollständigen Induktion

der tTA Variante durch NP-TIP2 nicht auf das Niveau der Zelllinie HLF33 reduziert, kann dies

durch Zugabe von Dox erreicht werden. Um dies zu überprüfen, wurde die Luciferaseaktivität

aller 24 LacZ negativen ALF-NP Zellinien in An- und Abwesenheit von 1 mg/l Dox vermessen

(Abb. 24). Das Ergebnis dieser Messungen erwies sich, trotz der zielgerichteten,

einheitlichen Integration der NP-TIP2 Expressionskassette in die FRT Sequenz, als

heterogen. Die Luciferaseaktivität lag bei sieben Zelllinien über 1.000 ALU/µg Protein, bei

13 Zelllinien zwischen 100 und 1.000 ALU/µg Protein und bei vier Zelllinien zwischen 10 und

100 ALU/µg Protein. Durch Zugabe von 1 mg/l Dox konnte die Luciferaseaktivität bei allen

Zelllinien gesenkt werden. Hierbei wurde bei 16 Zelllinien ein Wert kleiner 10 ALU/µg Protein

erreicht, was dem Niveau der Ausgangszelllinie HLF33 entsprach. Die heterogene

Luciferaseaktivität der ALF2-NP Zelllinien wurde auf Unterschiede in der NP-TIP2

Expression zurückgeführt. Die ursprüngliche, experimentelle Planung beinhaltete die Kon-

struktion einer Zelllinie, die eine cytoplasmatische Variante des NP exprimiert (siehe unter

3.2.3). Hierbei sollte TIP2 als Fusion mit der cytoplasmatischen Mutante (NPMut-TIP2) statt

der nukleären NP wt Variante stabil integriert werden. Der Vergleich der Luciferaseaktivität

dieser beiden Zelllinien sollte Rückschlüsse auf die Funktionalität des Systems ermöglichen.

Um anhand dieses Kontrollansatzes zuverlässige Aussagen treffen zu können, ist allerdings

eine vergleichbare Expression von NPMut-TIP2 und NP-TIP2 erforderlich, die durch

Integration in die FRT Sequenz gewährleistet werden sollte. Jedoch wurde aus der

Heterogenität der Luciferaseexpression der ALF2-NP Zelllinien geschlossen, dass trotz der

ortsspezifischen Integration nicht von einem gleichmäßigen Expressionsniveau

ausgegangen werden kann. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde von diesem Kontrollansatz

abgesehen.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 51 -

1

10

10

0

1.0

00

10

.00

0

12

45

67

81

01

51

61

71

81

92

02

12

22

62

72

82

93

03

13

23

4A

LF

2

Luciferaseaktivität[ALU/µg Protein]

-D

ox

+ D

ox

AL

F2

-NP

Ab

b.

24

: R

eg

ula

tio

n d

er

Lu

cif

era

se

ak

tiv

ität

de

r A

LF

2-N

P Z

ell

lin

ien

Die

Lucife

rse

aktivitä

t w

urd

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An

- u

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Ab

wesen

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on

1 m

g/l D

ox g

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bso

lute

n L

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tein

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pro

µg G

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U/µ

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rote

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hun

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wu

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us d

rei bio

log

ischen

Re

plik

ate

n e

rmitte

lt.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 52 -

3.2.4.6.3 Auswahl der ALF2-NP Zelllinien für die weiteren Arbeiten

Für die weiteren Arbeiten wurden die vier Zelllinien ALF2-NP19, -NP20, -NP22 und -NP31,

die eine Luciferaseaktivität kleiner 100 ALU/µg Protein aufwiesen, ausgewählt. Bei der

weiteren Kultivierung der Zelllinien wurde bei ALF2-NP20 verlangsamtes Wachstum sowie

eine erhöhte Zellsterblichkeit beobachtet, weshalb die Zelllinie nicht weiter verwendet wurde.

Bei den restlichen Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 wurde eine 14-tägige

Nachselektion mit 250 mg/l Hygromycin in Kombination mit 0,5 mg/l Puromycin durchgeführt,

um eine homogene Zellpopulation zu gewährleisten.

3.2.4.6.4 Sequenzierung des NP-TIP2 Locus der Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31

Im nächsten Schritt sollte die Sequenz der NP-TIP2 Expressionskassette in den Zelllinien

ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 verifiziert werden. Hierzu wurde ein 2261 bp großes

Fragment, das den hEF1-HTLV Promotor und die für NP-TIP2 kodierende Sequenz

umfasste, mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) aus gereinigter, chromosomaler DNA

amplifiziert. Die Positionen der für diese Reaktion verwendeten Oligonukleotide EFseq1 und

HK64 sind in Abbildung 22 eingezeichnet. Als Kontrolle wurde die PCR auch mit dem

Integrationsvektor pEF1-HTLV/NP-TIP2 und mit chromosomaler DNA aus der Zelllinie ALF2

durchgeführt. Die Kontrolle der Fragmentgröße erfolgte mittels DNA Gelelektrophorese

wobei die Amplifikate aus den Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 und dem Vektor

pEF1-HTLV/NP-TIP2 die gleiche Mobilität im Agarosegel zeigten und sich im erwarteten

Größenbereich bewegten (Abb. 25). Da das amplifizierte Sequenzelement im Genom der

Zelllinie ALF2 nicht enthalten ist, konnte folglich in der PCR kein Produkt erzeugt werden.

Anschließend wurde die Nukleotidsequenz des Amplifikats bestimmt und mit der des

Integrationsplasmids pEF1-HTLV/NP-TIP2 verglichen. Die erhaltene Sequenz stimmte bei

allen drei Zelllinien mit der erwarteten Sequenz überein.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 53 -

Abb. 25: Kontrolle der PCR Amplifikate aus ALF2-NP19, -NP22 und -NP31

Die Größe des 2261 bp umfassenden Fragments wurde auf einem

1 % Agarosegel kontrolliert.

Von links: Längenstandard (Spur 1), Amplifikate aus: ALF2-NP19

(Spur 2), ALF2-NP22 (Spur 3), ALF2-NP31 (Spur 4), ALF2

(Spur 5, Negativkontrolle) und pEF1-HTLV/NP-TIP2 (Spur 6,

Positivkontrolle).

3.2.5 Validierung der Reporterzelllinien

Die hier konstruierten Zelllinien sollten durch einen Anstieg der Luciferaseexpression bei

sinkender NP-TIP2 Konzentration im Zellkern charakterisiert sein (siehe unter 3.2.2). Um die

Zelllinien auf dieses Kriterium hin zu testen, wurden zwei unterschiedliche experimimentelle

Ansätze verfolgt. Im ersten Ansatz sollte die nukleäre Konzentration von NP-TIP2 durch

Nucleozin, einen Inhibitor des NP Kernimports, reduziert werden (Kao et al., 2010). Hierbei

verschiebt sich bei konstanter zellulärer Konzentration von NP-TIP2 die Verteilung zwischen

Zellkern und Cytoplasma. Der zweite Ansatz basierte auf einer Reduktion der NP-TIP2

Expression mittels RNA-Interferenz (Fire et al., 1998). Hierdurch sollte bei konstanter

subzellulärer Verteilung von NP-TIP2 sowohl die Konzentration im Cytoplasma, als auch im

Zellkern verringert werden. In beiden Fällen sollte folglich ein Anstieg der Luciferase-

expression durch die verringerte NP-TIP2 Konzentration im Zellkern erfolgen.

3.2.5.1 Inhibition des NP-TIP2 Kernimports durch Nucleozin

3.2.5.1.1 Einfluss von DMSO auf die Expression der Luciferase

Die Löslichkeitseigenschaften von Nucleozin wurden bisher ausschließlich für das

Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) publiziert ((Kao et al., 2010) und Hersteller Sigma,

München (DE)). Für DMSO wurden allerdings unspezifische Effekte unter anderem auch auf

die Expression verschiedener Gene beschrieben (siehe unter 3.2.5.1.1) (Chang et al., 2001;

Su et al., 2004; Wang et al., 2007). Aufgrund dessen wurden Titrationsexperimente mit der

Zelllinie ALF2 durchgeführt, um den Einfluss von DMSO auf deren Luciferaseexpression zu

1 2 3 4 5 6Spur:

10.000

8.000

6.000

5.000

4.000

3.500

3.000

2.500

2.000

1.500

1.200

1.000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

Größe [bp]

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 54 -

überprüfen. Hierbei wurde DMSO in Konzentrationen von 0,1 bis 1 % zum Zellkulturmedium

zugegeben und die jeweilige Luiferaseaktivität nach 24 h bestimmt. Wie aus den in

Abbildung 26 dargestellten Messwerten hervorgeht, stieg die Luciferaseaktivität bei

zunehmender DMSO Konzentration kontinuierlich an. In Gegenwart von 1 % DMSO war die

gemessene Luciferaseaktivität mehr als doppelt so hoch wie in Abwesenheit von DMSO.

Wurde zum Ansatz mit 1 % DMSO zusätzlich Dox in einer Konzentration von 1 mg/l

zugegeben, sank die Luciferaseaktivität auf den gleichen Wert wie in einem Ansatz mit Dox

ohne Zugabe von DMSO.

Abb. 26: Einfluss von DMSO auf die Expression der Luciferase in der HeLa Zelllinie ALF2

Die Luziferseaktivität wurde bei verschie-

denen DMSO Konzentrationen in An- und

Abwesenheit von 1 mg/l Dox gemessen und

ist in absoluten Lichteinheiten pro µg

Gesamtprotein des Zelllysats (ALU/µg

Protein) angegeben. Die jeweilige DMSO

Konzentration ist unter dem Diagramm

angegeben. Die hier dargestellten Mittel-

werte und Standardabweichungen wurden

aus drei biologischen Replikaten ermittelt.

3.2.5.1.2 Wirkung von Nucleozin auf die Reporterzelllinien

Da die cytotoxische Wirkung von Nucleozin auf HeLa Zellen nicht bekannt ist, wurden die

Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 sowie ALF2 in Gegenwart von Nucleozin bis zu

einer Konzentration von 100 µM kultiviert und nach 24 h im Mikroskop untersucht. Hierbei

wurde bei Nucleozinkonzentrationen größer 30 µM eine starke Zunahme an abgestorbenen

Zellen beobachtet. Bei Konzentrationen größer 50 µM bildeten sich Nucleozin-Präzipitate im

Zellkulturmedium. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde Nucleozin in den nachfolgenden

Experimenten nur bis zu einer Konzentration von 30 µM eingesetzt. Im nächsten Schritt

erfolgte die Messung der Luciferaseaktivität in Abhängigkeit von der Nucleozinkonzentration.

Hierzu wurden die Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 sowie ALF2 für 24 h in

Gegenwart von 0 bis 30 µM Nucleozin inkubiert. Bei hohen Nucleozinkonzentrationen zeigte

sich in der anschließenden Luciferasemessung eine Abnahme der Konzentration an

Gesamtprotein in den hierfür hergestellten Zellysaten (Abb. 27). Da für den Konzentrations-

DMSO Konzentration

0

5

10

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

AL

U/µ

g P

rote

in

+ Dox

- Dox

Lu

cif

era

seakti

vit

ät

[AL

U/µ

g P

rote

in]

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 55 -

bereich bis 30 µM Nucleozin keine erhöhtes Zellsterben beobachtet wurde, kann dies als

Grund für diese Beobachtung ausgeschlossen werden. Eine mögliche Erklärungen stellt eine

nucleozinabhängige Verzögerung des Zellwachstums dar. Betrachtet man hingegen die

entsprechenden Luciferaseaktivitäten konnte kein Zusammenhang zwischen Luciferase-

aktivität und Nucleozinkonzentration gefunden werden (Abb. 28). Die Zugabe von

0,5 % DMSO bewirkte bei den ALF2-NP Zelllinien, wie schon bei ALF2 beobachtet eine

ca. 1,5-fache Erhöhung der Luciferaseaktivität (siehe unter 3.2.5.1.1).

Abb. 27: Einfluss von Nucleozin auf die Proteinkonzentration der Zelllysate

Die hier gezeigten Daten liegen den Berechnungen der Luciferaseaktivität in Abbildung 28 zugrunde. Die

jeweilige Nucleozinkonzentration ist auf der Abszisse angegeben. Alle mit 0 bis 30 µM bezeichnten Ansätze

enthielten 0,5 % DMSO, w/o enthielt weder DMSO noch Nucleozin. Die Quantifizierung der Protein-

konzentration erfolgte photometrisch nach der Methode von Bradford (Bradford, 1976). Die hier dargestellten

Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt.

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

w/o 0 5 10 15 20 25 30

µg

Pro

tein

/µl

Konzentration Nucleozin [µM]

ALF2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

w/o 0 5 10 15 20 25 30

µg

Pro

tein

/µl


ALF2-NP19

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

w/o 0 5 10 15 20 25 30

µg

Pro

tein

/µl


ALF2-NP22

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

w/o 0 5 10 15 20 25 30

µg

Pro

tein

/µl


ALF2-NP31

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 56 -

Abb. 28: Einfluss von Nucleozin auf die Luciferaseexpression der Reporterzelllinien

Die Luziferseaktivität wurde bei steigenden Nucleozinkonzentrationen gemessen

und ist in absoluten Lichteinheiten pro µg Gesamtprotein des Zelllysats (ALU/µg

Protein) angegeben. Die jeweilige Nucleozinkonzentration ist unter dem

Diagramm angegeben. Alle mit 0 bis 30 µM Nucleozin bezeichneten Ansätze

enthielten 0,5 % DMSO, w/o enthielt weder DMSO noch Nucleozin. Die hier

dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei

biologischen Replikaten ermittelt.

3.2.5.1.3 Subzelluläre Lokalisation von NP-EGFP in Gegenwart von Nucleozin

Da bei den Reporterzelllinien keine erhöhte Luciferaseexpression nach Zugabe von

Nucleozin beobachtet werden konnte (siehe 3.2.5.1.2), wurde die subzelluläre Lokalisation

der NP-EGFP Fusion in Gegenwart von 1, 5 und 10 µM Nucleozin fluoreszenzmikroskopisch

untersucht. In diesem Konzentrationsbereich wurde bei keiner der getesteten Zelllinien eine

nennenswerte Reduktion des Proteingehalts in den Zelllysaten festgestellt. Die Zugabe von

Nucleozin zum Zellkulturmedium erfolgte im Anschluss an die Transfektion der Zellen mit

dem für NP-EGFP kodierenden Plasmid pNP-EGFP. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse

wurde 24 h nach der Zugabe von Nucleozin durchgeführt (experimentelles Vorgehen siehe

unter 3.2.3.3.2 bzw. 3.2.3.1.2). Unabhängig von der eingesetzten Nucleozinkonzentration

konnte die Fluoreszenz von NP-EGFP ausschließlich im Zellkern detektiert werden. In

Abbildung 29 ist beispielhaft eine Aufnahme mit 10 µM Nucleozin gezeigt. Demnach hatte

Nucleozin in den hier angeführten Experimenten keinen Einfluss auf die subzelluläre

Lokalisation von NP.

1

10

100

1.000

10.000

w/o 0 5 10 15 20 25 30

Lu

cif

era

se

ak

tivit

ät

[AL

U/µ

g P

rote

in]

ALF2-NP19

ALF2-NP22

ALF2-NP31

ALF2


3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 57 -

Abb. 29: Subzelluläre Lokalisation von NP-EGFP in Gegenwart von Nucleozin

HeLa Zellen wurden mit dem für NP-EGFP kodierenden Plasmid pNP-EGFP transfiziert und für

24 h in Gegenwart von 10 µM Nucleozin kultiviert. Die Länge des Skalierungsbalkens entspricht

20 µm. Von links: Hellfeld, DNA Färbung (Höchst 33342) in blau, EGFP Fluoreszenz in grün,

Überlagerung der drei Aufnahmen.

3.2.5.2 Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz

Durch die Transfektion einer humanen Zelle mit sogenannter siRNA („small interfering“ RNA)

kann die Degradation einer spezifischen mRNA induziert und somit die Expression des

entsprechenden Proteins reduziert werden (Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., 2001).

Dieses Prinzip wurde in der hier vorliegenden Arbeit verwendet, um die Expression und

somit auch die nukleäre Konzentration von NP-TIP2 zu reduzieren. Hierfür wurden zwei

jeweils 21 Nukleotide umfassende siRNAs verwendet. Diese wurden mit dem Programm

siMAX Design (MWG) ausgewählt und als siNP-1 und siNP-2 bezeichnet. Als Kontrolle

diente zum Einen eine unspezifische siRNA (uspRNA) ohne Zielsequenz in den ALF oder

ALF-NP Zelllinien, zum Anderen so genannte Leertransfektionen (LTF) ohne Zugabe von

RNA. Für die Transfektionen wurden die Zelllinien ALF2, ALF2-NP19, -NP22 und -NP31

verwendet und die Luciferaseaktivität wurde nach 24, 48 und 72 h vermessen. Die

Ergebnisse der Messungen finden sich in Abbildung 30 und in Tabelle 5. Die bei der LTF

ermittelte Luciferaseaktivität entsprach bei allen Zelllinien und zu allen Messzeitpunkten

einem konstanten Niveau, das mit den Werten aus vorhergehenden Messungen vergleichbar

war (siehe unter 3.2.4.3, 3.2.4.6.2, 3.2.5.1.1 bzw. 3.2.5.1.2). In der Messung nach 24 h

wurde unabhängig von der transfizierten RNA kein Einfluss auf die Luciferaseaktivität der

analysierten Zelllinien gefunden. Aufgrund dessen beschränken sich die folgenden

Ausführungen auf die Messung nach 48 bzw. 72 h. Hierbei war die Luciferaseaktivität in allen

LTF und siNP-2 Ansätzen kleiner oder gleich dem ermittelten Wert für den uspRNA Ansatz.

Die höchste Luciferaseaktivität wurde jeweils in den Transfektionsansätzen mit siNP-1

gemessen. Dies traf allerdings auch für die Transfektionen der Ausgangszellline ALF2 zu,

die keine Zielsequenz für siNP-1 und siNP-2 enthielt. Aus diesen Beobachtungen kann man

schließen, dass alle hier verwendeten RNAs einen unspezifischen Effekt in den getesteten

Zelllinien hervorrufen. Daher beschränken sich die folgenden Ausführungen ausschließlich

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 58 -

auf den Vergleich der mit uspRNA und siNP-1 ermittelten Messwerte. Vergleicht man hierbei

die Luciferaseaktivität nach 48 h, so ist der jeweilige Wert für die mit siNP-1 transfizierten

Ansätze im Falle von ALF2 bzw. ALF2-NP31 um Faktor 3 und im Falle von ALF2-NP19 bzw.

ALF2-NP22 um Faktor 8 höher als der entsprechende Wert für die mit uspRNA transfizierten

Ansätze. In der Messung nach 72 h ergab sich bei ALF2 erneut ein 3-fach, bei ALF2-NP19

ein 16-fach, bei ALF2-NP22 ein 33-fach und bei ALF2-NP31 ein 38-fach höherer Wert. Somit

war der Anstieg der Luciferaseexpression bei den Transfektionen mit siNP-1 nach 48 h für

ALF2-NP19 und -NP22 und nach 72 h für alle getesteten ALNF-NP Zelllinien im Vergleich

zur Ausgangszelllinie ALF2 deutlich höher. Demnach hat siNP-1 neben einem

unspezifischen Effekt auch eine spezifische Wirkung auf die ALF2-NP Zellinien. Somit kann

die beobachtete Zunahme der Luciferaseexpression in den ALF2-NP Zelllinien zumindest

teilweise durch eine Reduktion der Expression von NP-TIP2 erklärt werden.

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 59 -

Ab

b.

30

: T

ran

sfe

kti

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10

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10

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Luciferaseaktivität[ALU/µg Protein]

siN

P-1

siN

P-2

usp

RN

A

LT

F

24

h4

8h

72

h

3x

3x

8x

8x

3x

16

x

33

x3

8x

3 Ergebnisse _____________________________________________________________________________________________________

- 60 -

Tab. 5: Transfektion der Zelllinien ALF2, ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 mit den siRNAs siNP-1 und siNP-2

Die Daten liegen der in Abb. 30 gezeigten Messung zugrunde. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standard-

abweichungen wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt.

Luciferaseaktivität [ALU/µg Protein]

t Zelllinie siNP-1 siNP-2 uspRNA LTF

h ‏‏24

ALF2 2102 ± 255

1353 ± 254

2780 ± 586

1771 ± 333

ALF2-NP19 37 ± 9 30 ± 5 35 ± 6 21 ± 3

ALF2-NP22 50 ± 21 30 ± 3 61 ± 20 23 ± 3

ALF2-NP31

74 ± 12 64

± 5 80

±

9 54

± 19

48 h

ALF2 9821 ± 1653 699 ± 102 3903 ± 194 1963 ± 237

ALF2-NP19 3267 ± 549 220 ± 35 426 ± 134 46 ± 8

ALF2-NP22 2600 ± 363 133 ± 41 321 ± 33 31 ± 15

ALF2-NP31

815 ± 289 57

± 27 304 ± 87 33 ± 9

72 h

ALF2 19645 ± 1049 504 ± 105 7797 ± 971 1732 ± 43

ALF2-NP19 11154 ± 1606 486 ± 136 684 ± 125 34 ± 2

ALF2-NP22 24924 ± 2554 895 ± 534 752 ± 86 24 ± 6

ALF2-NP31 14458 ± 754 93 ± 41 381 ± 84 30 ± 2

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 61 -

4 DISKUSSION

Die Möglichkeit die TetR-regulierte Genexpression nicht nur über niedermolekulare

Substanzen, sondern auch über Interaktionen mit anderen Proteinen zu steuern, eröffnet ein

neuartiges Spektrum von Applikationen. Dies beinhaltet beispielsweise die Expressions-

analyse von TIP-fusionierten Proteinen in Prokaryonten (Schlicht et al., 2006) oder auch

einen Ansatz für die Konstruktion von Reportersystemen zur Analyse des nucleo-

cytoplasmatischen Transports in Eukaryonten (siehe unter 2.2.4). Da die TetR-vermittelte

Genregulation schon in unterschiedlichsten Systemen eingesetzt wurde, kann hierbei zum

Einen auf einen enormen Erfahrungsschatz und zum Anderen auf bestehende

Systemkomponenten mit gut charakterisierten Eigenschaften zurückgegriffen werden. Auch

für die peptidische Induktion stehen mittlerweile eine Reihe von Peptiden mit unter-

schiedlicher Induktionseffizienz gegenüber einer Reihe von TetR Varianten zur Verfügung.

Dennoch beschränkte sich die Anwendung der peptidischen Induktion von TetR bisher auf

prokaryontische Organismen.

4.1 Optimierung des Reportersystems für S. cerevisiae

Um die Funktionalität der peptidischen Induktion von TetR in einem eukaryontischen

Organismus zu überprüfen, wurde in einer vorhergehenden Arbeit ein Plasmid-kodiertes

Reportersystem für den Einsatz in der Bäckerhefe konstruiert (Stöckle, 2008) (siehe unter

3.1). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das bestehende Reportersystem so weit zu

modifizieren, dass die peptidvermittelte Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS

Variante gezeigt werden konnte. Hierdurch sollte der Einsatz der bereits etablierten, auf

TetR(B) wt basierenden tTS und tTA Varianten für die Anwendung der TIPs in Eukaryonten

ermöglicht werden.

4.1.1 Verwendung von TIP2 als Induktorpeptid

Die erste Modifikation des Reportersystems betraf das Induktorpeptid W-TIP. Da TIP2 in

E. coli das mittlerweile effizienteste Induktorpeptid in Kombination mit TetR(B) wt darstellte,

wurde dieses statt W-TIP verwendet. In Abbildung 31A findet sich eine Vergleichsmessung

der vier TetR induzierenden Peptide TIP, W-TIP, pre-TIP2 und TIP2 in E. coli (Goeke et al.,

2011). Diese Messung wurde von Goeke et al. mit dem gleichen Messsystem erstellt, das

auch in dieser Arbeit verwendet wurde (siehe unter 3.2.4.5.1). Die Expression der Peptide

erfolgte als C-terminale Fusionen an das Trägerprotein TrxA in An- und Abwesenheit von

60 µM IPTG. Aus dieser Vergleichsmessung werden die Unterschiede in der Induktions-

effizienz der beiden in S. cerevisiae eingesetzten Peptide W-TIP und TIP2, sowie deren

Vorläufer TIP und pre-TIP2 in Kombination mit TetR(B) wt ersichtlich. Mit TIP2 konnte in

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 62 -

diesem Messsystem sogar die Induktionseffizienz von Dox erreicht werden. Die

Aminosäuresequenzen der einzelnen Peptide sind in Abbildung 31B dargestellt.

Abb. 31: Die TIP Varianten TIP, W-TIP,

pre-TIP2 und TIP2

A) Induktionseffizienz der einzelnen TIP

Varianten gegenüber TetR(B) wt.

Die β-Gal-Aktivität in Abwesenheit von

TetR entspricht 100 %. Dox wurde in einer

Konzentration von 0,1 mg/l zugegeben.

Die Peptide wurden über eine SGGA

„Linker-sequenz“ mit dem C-Terminus von

TrxA verbunden. Die Induktion von TetR

durch die Peptide wurde bei der

Basalexpression in Abwesenheit von IPTG

und bei Induktion durch 60 µM IPTG

gemessen. w/o bezeichnet einen Ansatz

ohne Zugabe von Dox oder IPTG.

B) Aminosäuresequenz der einzelnen TIP

Varianten im 1-Buchstaben Kode. W-TIP

leitet sich von TIP durch ein zusätzliches

Tryptophan am N-Terminus und TIP2 von

pre-TIP2 durch den Aminosäureaustausch

L9A ab (Positionen jeweils fett gedruckt

und unterstrichen).

Die Abbildung 31A wurde aus (Goeke et

al., 2011) entnommen und modifiziert.

4.1.2 Konstruktion des Trägerproteins

4.1.2.1 Austausch der fluoreszierenden Proteinkomponente

Im ursprünglichen Reportersystem wurde mYFP als fluoreszierende Proteinkomponente des

Trägerproteins verwendet, dessen Anregungs- und Emissionsspektren stark mit denen des

Reporterproteins GFP+ überlappten. Aufgrund dessen war es nicht möglich die reale

Fluoreszenz von GFP+ bei paralleler Expression mit dem Trägerprotein zu messen. Diese

musste durch Abzug eines aus der entsprechenden mYFP Fluoreszenz errechneten

Korrekturwertes von der gemessenen GFP+ Fluoreszenz ermittelt werden. Aus diesem

Grund sollte hier ein alternatives fluoreszierendes Protein verwendet werden, dessen

Absorptions- und Emissionsspektren im Vergleich zu denen von mYFP im langwelligeren

Bereich liegen. Die damit verbundene, geringere Überschneidung mit den Spektren von

GFP+ sollte die direkte Messung der GFP+ Fluoreszenz bei gleichzeitiger Expression des

Trägerproteins ermöglichen. Die Wahl fiel hierbei auf das rot fluoreszierende Protein

mCherry, das sich vom dsRed aus Discosoma sp. ableitet (Shaner et al., 2004). Dieses faltet

TIP

W-TIP

pre-TIP2

TIP2

W-T-W-N-A-Y-A-F-A-A-P-S-G-G-G-S

W-W-T-W-N-A-Y-A-F-A-A-P-S-G-G-G-S

D-D-S-V-L-A-A-R-L-R-M-W-M-W-H-W

D-D-S-V-L-A-A-R-A-R-M-W-M-W-H-W

A

B

w/o + Dox + IPTG

0

20

40

60

80

100

β-G

al-

Ak

tivit

ät

[%]

Translationfusionen mit TrxA

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 63 -

sich im Vergleich zu dsRed ca. 40-fach schneller und die Absorptions- und

Emissionsmaxima von mCherry liegen mit λex = 587 und λem = 610 nm noch weiter im

langwelligen Bereich als die von dsRed mit λex = 558 und λem = 583 nm. Daneben liegt

mCherry im Gegensatz zum tetrameren dsRed als Monomer in der Zelle vor. Es wurde

davon ausgegangen, dass für die Bindung von TIP2 an TetR im Falle eines monomeren

Trägerproteins geringere sterische Hindernisse zu erwarten sind, als für eine oligomere

Variante. Zusätzlich sollte der für die Induktion von TetR erforderliche Transport durch die

Kernporen bei der kleineren monomeren Variante effizienter ablaufen. Diese Gründe waren

auch im ursprünglichen Reportersystem für die Wahl der monomerisierten Variante von YFP

ausschlaggebend. Eine weitere Anforderung an das Trägerprotein für TIP2 stellte die

Exposition des N- und C-Terminus an der Oberfläche des fluoreszierenden Proteins dar. An

diesen Positionen befanden sich in der Trägerprotein-TIP2 Fusion die NLS bzw. die Sequenz

von TIP2, die für die Interaktion mit dem Kernimportrezeptor bzw. TetR zugänglich sein

mussten. Dieses Kriterium wurde anhand der Kristallstruktur von mCherry überprüft, die in

der Abbildung 32 dargestellt ist. Hier ist eine deutliche Exposition sowohl des N-, als auch

des C-Terminus an der Oberfläche von mCherry zu erkennen.

Abb. 32: Kristallstruktur von mCherry

Bänder in Pfeilform kennzeichnen Sekundärstrukturmotive.

Leicht gebogene Pfeilbänder stellen β-Faltblätter und

gewendelte Pfeilbänder stellen α-Helices dar. Die restliche,

nicht in Sekundärstrukturmotiven organisierte, Aminosäure-

kette ist als dicke Schnur eingezeichnet. Die Farben der

Aminosäurekette beginnen mit Blau am N-Terminus und

ändern sich nach Vorgabe des Farbspektrums von lang- zu

kurzwelligem Licht bis zum C-Terminus (Rot). Die Abbildung

wurde mit dem Programm „RCSB - Protein Workshop

Viewer“ (www.pdb.org) aus der Kristallstruktur von mCherry

(Zugangsnummer 2H5Q) erstellt (Shu et al., 2006).

N-Terminus

C-Terminus

http://www.pdb.org/

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 64 -

4.1.2.2 Steuerung des Expressionsniveaus über Codonadaptation

Um eine vollständige Induktion der tTS Variante zu erreichen, sollte die Fusion aus TIP2 und

dem Trägerprotein auf hohem Niveau exprimiert werden. Aufgrund dessen wurde die

Expressionskassette für das Trägerprotein bereits in der ursprünglichen Variante des

Reportersystems für eine möglichst hohe Expression konstruiert. Jedoch hat auch die

Codonverteilung innerhalb eines Gens Einfluss auf die Expressionsrate des entsprechenden

Proteins (zusammengefasst in (Gustafsson et al., 2004)). So konnten beispielsweise

Hoekema et al. für die Phosphoglyceratkinase aus S. cerevisiae zeigen, dass der

systematische Austausch von Codons mit hoher Frequenz im Modellorganismus gegen

solche mit geringer Frequenz eine deutliche Reduktion des Expressionsniveaus zur Folge

haben kann (Hoekema et al., 1987). Dies gilt sowohl für die Expressionsrate eines

endogenen Proteins, als auch für die heterologe Expression von Proteinen. Um eine

möglichst effiziente Expression zu gewährleisten, wurden in dieser Arbeit zwei verschiedene

mcherry Gene verwendet, die sich im Codongebrauch unterschieden. Die Varianten 1 - 4

basierten auf einer humanadaptierten mcherry Genvariante und die Varianten 5 - 7 auf einer

für S. cerevisiae adaptierten Variante. Diese Genvarianten werden im Folgenden als

mcherry(ha) (humanadaptiert) und mcherry(ya) („yeast adapted“) bezeichnet. Eine

ausführliche Beschreibung der Adaptation der beiden Genvarianten findet sich unter 6.1.

Ein Vergleich der Expressionsraten für mcherry(ha) und mcherry(ya) ist anhand der für die

Varianten 4 und 7 gemessen Fluoreszenzintensität möglich. Diese beiden Varianten sind

analog aufgebaut und unterscheiden sich lediglich im Codongebrauch. Wie in der Abbildung

9 unter 3.1.3.4 zu sehen ist, lag die Fluoreszenzintensität im Falle der Variante 7

(mcherry(ya)) ca. 18 % über dem, für Variante 4 (mcherry(ha)) gemessenen Wert. Somit

hatte die Adaptation des mcherry Gens an den Codongebrauch von S. cerevisiae einen nur

geringen Effekt auf die Expressionsrate.

4.1.2.3 Kernimport der Trägerprotein-Varianten

Um eine möglichst hohe Konzentration des Trägerproteins im Zellkern zu erreichen, wurden

vier verschiedene NLSs, an den N-Terminus von mCherry fusioniert. Hierbei handelte es

sich um zwei natürlich vorkommende, einteilige NLSs aus dem Large-T Antigen des

Simianen Virus 40 (SV40 NLS) (Kalderon et al., 1984) und aus dem humanen c-Myc Protein

(c-Myc NLS) (Dang und Lee, 1988) sowie zwei synthetische zweiteilige NLSs (Hodel et al.,

2001). Die beiden zweiteiligen Varianten BP SV40 NLS und BP SV40 A6 NLS wurden von

Hodel et al. ausgehend von der SV40 NLS konstruiert und besitzen eine enorm hohe Affinität

zum Importin α, was mit einer starken Anreicherung im Zellkern korreliert. Die Dissoziations-

konstanten mit Importin α liegen bei beiden NLSs im nanomolaren Bereich, wobei die der

BP SV40 NLS im Vergleich zur BP SV40 A6 NLS ca. 30-fach kleiner ist. Die Dissoziations-

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 65 -

konstante der einteiligen SV40 NLS mit Importin α ist dagegen ca. 300-fach größer als die

der BP SV40 NLS. Im Zuge dieser Messungen untersuchten Hodel et al. auch den Einfluss

verschiedener NLSs auf die Verteilung von Proteinen zwischen Zellkern und Cytoplasma.

Hierzu wurden GFP-Tandem Konstrukte (GFP-GFP) mit der entsprechenden NLSs am N-

Terminus konstruiert. Im Falle der beiden zweiteiligen Sequenzen wurde eine deutlich

stärkere Akkumulation im Zellkern gemessen als bei der einteiligen SV40 NLS. Hierbei

zeigte die BP SV40 A6 Variante trotz der geringeren Affinität zum Importin α eine im

Vergleich zur BP SV40 Variante minimal höhere Anreicherung im Zellkern.

4.1.2.3.1 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit einteiliger SV40 NLS

Die Varianten 1, 2, 4 und 7 trugen jeweils eine SV40 NLS am N-Terminus von mCherry. Bei

der Variante 2 wurde eine weitere SV40 NLS am N-Terminus zwischen mCherry und TIP2

eingefügt. Die Variante 2 entsprach somit im Aufbau dem mYFP(NLS)2 Trägerprotein in der

ursprünglichen Variante des Reportersystems. Allerdings zeigte die TIP2 Fusion der Variante

2 im Vergleich zu mYFP(NLS)2-W-TIP eine geringere Anreicherung im Zellkern (siehe unter

3.1.3.2). Eine mögliche Ursache für diese Beobachtung könnten Unterschiede in der

Zugänglichkeit der NLSs für die Transportrezeptoren der Zelle sein. Der direkte Vergleich

wird jedoch durch die beiden unterschiedlichen Peptidsequenzen für W-TIP und TIP2 am

C-Terminus der mYFP und mCherry Trägerproteine erschwert. Ein Einfluss der jeweiligen

TIP-Sequenz auf die benachbarte, C-terminale SV40 NLS kann hierbei nicht ausgeschlossen

werden. Ein direkter Vergleich ist dagegen zwischen der Variante 1 und 4 möglich, da diese

sich nur durch eine 10 AS lange „Linkersequenz“ zwischen mCherry und der SV40 NLS

unterscheiden. Die Einführung dieser „Linkersequenz“ führte zu einer deutlichen Steigerung

der Akkumulation im Zellkern. Die „Linkersequenz“ sollte den Abstand zwischen mCherry

und der NLS erhöhen und dadurch deren Exposition verbessern. Die stärkere Akkumulation

im Zellkern im Falle der Variante 4 könnte somit auf eine verbesserte Interaktion der NLS mit

den Transportrezeptoren zurückzuführen sein.

Die Expression der Varianten mit SV40 NLS hatte keinen Einfluss auf das Wachstum von

S. cerevisiae (siehe unter 3.1.3.3). Auch die Fluoreszenzintensität der Varianten 1, 4 und 7

mit jeweils einer SV40 NLS unterschied sich nur geringfügig (siehe unter 3.1.3.4). Nur für die

TIP2-Fusion der Variante 2 wurde eine geringere Fluoreszenzintensität gemessen (siehe

unter 3.1.3.4). Ein möglicher Grund für diese Beobachtung könnte die 28 AS lange,

synthetische Sequenz bestehend aus der NLS und TIP2 am C-Terminus von mCherry

darstellen. Diese Sequenz könnte sich beispielsweise negativ auf die Stabilität oder Faltung

des Proteins auswirken.

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 66 -

4.1.2.3.2 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit zweiteiligen NLSs

Die Varianten 3 und 5 trugen am N-Terminus jeweils eine zweiteilige NLS mit der gleichen

10 AS „Linkersequenz“, die in Variante 4 verwendet wurde. Hierbei enthielt die Variante 3 die

BP SV40 NLS und die Variante 5 die BP SV40 A6 NLS. Am N-Terminus der NLS befand

sich in der Variante 3 eine Folge von sechs AS (ASMTGG), die bei der Variante 5 gegen ein

einzelnes Serin ausgetauscht wurde. In beiden Fällen dienten diese Reste in erster Linie der

Stabilisierung des Proteins. Würde die Proteinsequenz direkt mit der BP SV40 NLS oder der

BP SV40 A6 NLS beginnen, wäre die erste AS am N-Terminus jeweils ein Lysin. Proteine

mit einem am N-terminalen Lysin besitzen nach der „N-end rule“ eine geringe Halbwertszeit,

da sie schnell der Degradation über den Ubiquitin-Weg zugeführt werden (Varshavsky,

1996). Die N-terminalen Reste der Varianten 3 (Alanin) und 5 (Serin) werden hingegen als

stabilisierende Reste eingeordnet, was eine lange Halbwertszeit und somit eine höhere

zelluläre Konzentration zur Folge hat. Es wurde davon ausgegangen, dass diese Sequenzen

aufgrund ihrer geringen Größe und Zusammensetzung keinen Einfluss auf die Effizienz der

jeweiligen NLS haben. Wie die mikroskopische Analyse zeigte, vermittelten beide

Sequenzen eine starke Anreicherung im Zellkern mit geringer Restfluoreszenz im

Cytoplasma (siehe unter 3.1.3.2), was mit den Ergebnissen von Hodel et al. übereinstimmte

(Hodel et al., 2006).

Sowohl die Expression der Variante 3 als auch der Variante 5 verursachte ein verzögertes

Wachstum von S. cerevisiae auf Festmedium. Eine mögliche Erklärung hierfür stellt die

Affinität der jeweiligen NLS zu Importin α dar. Die Höhe dieser Affinität hat nicht nur

Auswirkungen auf die Effizienz der Bindung der Interaktionspartner im Cytoplasma und somit

den Kernimport des entsprechenden Proteins, sondern auch auf die Dissoziation des

Transportkomplexes im Zellkern. Solange das transportierte Protein nicht von Importin α

abgelöst wird, kann dieses nicht an seinen Exportfaktor CseI binden um wieder in das

Cytoplasma transportiert zu werden (Solsbacher et al., 1998; Gilchrist et al., 2002; Matsuura

et al., 2004). Wird die Dissoziation des Transportkomplexes im Zellkern aufgrund der hohen

Affinität einer NLS zu Importin α erschwert, kann dies die Menge an Importin α im

Cytoplasma reduzieren und zu verzögertem Wachstum führen (Hodel et al., 2006). Die hier

beobachteten Wachstumsverzögerungen traten bei Variante 3 und 5 auf Festmedium und

bei Variante 3 auch in Flüssigmedium auf. In Flüssigmedium sind die Zufuhr von Nähstoffen,

sowie der Abtransport von Stoffwechselprodukten im Vergleich zu Festmedium deutlich

erleichtert. Möglicherweise hat die BP SV40 A6 NLS einen geringeren Einfluss auf die

Physiologie der Zelle als die BP SV40 NLS, der unter optimalen Bedingungen im

Flüssigmedium, nicht aber auf Festmedium ausgeglichen werden kann. Eine mögliche

Begründung hierfür stellt die im Vergleich zur BP SV40 NLS niedrigere Affinität der

BP SV40 A6 NLS zu Importin α dar. Der Einfluss der BP SV40 NLS auf das Wachstum von

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 67 -

S. cerevisiae auf Festmedium wurde auch in den Arbeiten von Hodel et al. untersucht. Hier

wurde neben dem S. cerevisiae Laborstamm ACY192 auch mit einem Stamm gearbeitet, der

sich durch eine reduzierte Fähigkeit zur Dissoziation des Importin α-NLS Komplexes im

Zellkern auszeichnete. Eine Wachstumsverzögerung konnte in diesen Untersuchungen zwar

für die Mutante, nicht aber für den Stamm ACY192 beobachtet werden. Der Einfluss der

BP SV40 A6 NLS wurde in diesen Experimenten nicht getestet. Die abweichenden Beobach-

tungen in der hier vorliegenden Arbeit könnten durch die Verwendung eines anderen Hefe-

stamms (K699 statt AYC192) und eine abweichende Anzuchttemperatur (28 °C statt 25 °C)

begründet sein. Interessanterweise wich die Wuchsgeschwindigkeit der Variante 3 in

Flüssigmedium während der logarithmischen Phase nicht signifikant von dem für die anderen

Varianten ermittelten Wert ab. Möglicherweise hat ein Eingriff in das Regulationsnetzwerk

des nucleo-cytoplasmatischen Transportes während der Anpassungsphase drastischere

Folgen für die Wachstumsgeschwindigkeit, als es während der logarithmischen Phase der

Fall ist.

Die für die Variante 3 gemessene Fluoreszenzintensität lag deutlich unter dem Niveau der

anderen Varianten (siehe unter 3.1.3.4). Ein möglicher Grund hierfür könnte ein negativer

Einfluss der 30 AS langen, N-terminalen Sequenz, auf Stabilität oder Faltungseffizienz des

Proteins sein.

4.1.2.3.3 Charakteristika der Trägerprotein-Variante 6 mit c-Myc NLS

Die Variante 6 enthielt als einzige Trägerprotein-Variante weder eine SV40 NLS, noch eine

Sequenz, die aus dieser abgeleitet wurde. Stattdessen wurde die c-Myc NLS verwendet, die

nicht wie die SV40 NLS fünf, sondern lediglich drei positiv geladene Reste enthält. Zwischen

NLS und mCherry befand sich wie in den Varianten 3, 4, 5 und 7 eine 10 AS lange

„Linkersequenz“ und am N-Terminus analog zu Variante 5 ein einzelnes Serin. Die SV40

NLS und die c-Myc NLS zeigten in den Experimenten von Hodel et al. eine vergleichbare

Affinität zu Importin α, jedoch vermittelte die SV40 NLS am N-Terminus des GFP-Tandem

Konstrukts (siehe unter 4.1.2.3) im Vergleich zur c-Myc NLS eine stärkere Akkumulation im

Zellkern. In den Expressionsanalysen wurde von allen getesteten Varianten im Falle der

Variante 6 die höchste Fluoreszenzintensität erreicht (siehe unter 3.1.3.4). Die Begründung

hierfür liegt möglicherweise in der stabilisierenden Wirkung N-terminalen Serin Restes (siehe

unter 4.1.2.3.2). Die Anreicherung der Variante 6 im Zellkern von S. cerevisiae war hingegen

schwächer als bei den analog aufgebauten Varianten 4 und 7 mit SV40 NLS, was mit den

Beobachtungen von Hodel et al. übereinstimmte.

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 68 -

4.1.2.4 Regulation des Expressionsniveaus des neuen Trägerproteins

Die Variante 7 (mCherry7) stellte die beste Kombination aus hoher Expression und nukleärer

Anreicherung dar und hatte keinen negativen Einfluss auf das Wachstum von S. cerevisiae,

weshalb sie als Trägerprotein für TIP2 eingesetzt wurde. Wie auch im ursprünglichen

Reportersystem erfolgte die Expression von mCherry7 bzw. des Fusionsproteins aus

mCherry7 und TIP2 (mCherry7-TIP2) über den Methionin-abhängigen met25 Promotors aus

S. cerevisiae. Mumberg et al. beobachteten in ihren Experimenten mit dem met25 Promotor

eine Methionin-vermittelte Repression der Proteinexpression um Faktor 10 - 100 in

Abhängigkeit von der Halbwertszeit des exprimierten Proteins. In den hier durchgeführten

Experimenten konnte eine Methionin-abhängige Reduktion der mCherry Fluoreszenz um

Faktor 6 für mCherry7 und um Faktor 11 für mCherry7-TIP2 gemessen werden. Ob der

Unterschied der Regulationsfaktoren durch abweichende Halbwertszeiten begründet wird, ist

aus diesen Experimenten nicht ersichtlich. Jedoch enthielt mCherry7-TIP2 im Gegensatz zu

mCherry7 eine 20 AS umfassende Sequenz bestehend aus TIP2 und der SGGA

„Linkersequenz“ am C-Terminus, die sich durchaus auf die die Halbwertszeit des Proteins

auswirken könnte.

4.1.3 TIP2-vermittelte Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante

Obwohl die auf TetR(B) wt basierende tTS Variante im Vergleich zu der auf der

Doppelmutante basierenden tTS Variante bessere Repressionseigenschaften aufwies,

konnte die GFP+ Expression nur um Faktor 2,2 reprimiert werden. Ein möglicher Grund für

diesen geringen Regulationsfaktor stellt das niedrige Expressionsniveau der tTS Variante

dar. Von einer Steigerung der tTS Expression zur Vergrößerung des Messfensters wurde

abgesehen um die Sensitivität des Systems zu erhalten. Es wurde davon ausgegangen,

dass aufgrund der Reproduzierbarkeit der Messwerte auch mit diesem kleinen

Regulationsfaktor zuverlässige Messungen möglich sind. In den Kontrollmessungen mit

mCherry7 lag die GFP+ Fluoreszenz konstant ca. 13 % über dem Wert, der in Abwesenheit

des Trägerproteins gemessen wurde. Der Grund für diesen erhöhten Wert ist nicht bekannt.

Da kein Zusammenhang zwischen erhöhtem Hintergrund und der entsprechenden mCherry

Fluoreszenz bestand, wurde davon ausgegangen, dass die mit dem Reportersystem

gewonnenen Daten hierdurch nicht beeinflusst wurden. Bei der höchsten mCherry7-TIP2

Expression in Abwesenheit von Methionin konnte die maximale Expression von GFP+

erreicht werden. Wurde die Expression von mCherry7-TIP2 durch Zugabe von Methionin

verringert, sank die GFP+ Fluoreszenz auf ca. 75 % des Maximalwertes ab. Eine Absenkung

der GFP+ Expression auf das Niveau der Messungen mit mCherry7 war nicht möglich. Es

wird davon ausgegangen, dass hierfür eine weitere Reduktion der mCherry7-TIP2

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 69 -

Expression erforderlich gewesen wäre. Dies könnte beispielsweise durch Modifikation der

Sequenzumgebung des Startcodons, destabilisierende Reste am N-Terminus oder auch

durch Veränderung des Codongebrauchs erreicht werden (Hamilton et al., 1987; Hoekema

et al., 1987; Varshavsky, 1996).

Unabhängig davon konnte hier eine zunehmende Induktion des tTS durch steigende

Expression von mCherry7-TIP2 gezeigt werden, die in diesem System sogar das Niveau der

Induktion durch Dox erreichte. Im Gegensatz dazu bestand kein Zusammenhang zwischen

dem Expressionsniveau des Trägerproteins mCherry7 und der GFP+ Expression. Somit

wurde das Ziel dieses Teilprojektes, der Nachweis der peptidischen Induktion einer auf

TetR(B) wt basierenden tTS Variante in S. cerevisiae, erreicht.

4.1.4 Weitere Einsatz- und Optimierungsmöglichkeiten für das Reportersystem

Das hier beschriebene Reportersystem wurde in erster Linie für den prinzipiellen Nachweis

der peptidischen Induktion von tTS Varianten konstruiert. Ein weiterer, möglicher

Einsatzbereich des Systems stellt beispielsweise die Expressionsanalyse TIP-fusionierter

Proteine dar, die entweder konstitutiv im Zellkern lokalisiert sind oder frei durch die

Kernporen diffundieren können. Um die Aussagekraft der Daten zu erhöhen, wäre hierfür

allerdings eine Vergrößerung des Messfensters erforderlich. Dies könnte wie schon unter

4.1.3 erwähnt durch eine Erhöhung des Expressionsniveaus der tTS Variante beispielsweise

durch Verwendung eines stärkeren Promotors erfolgen. Um die Sensitivität des

Reportersystems zu erhalten müsste allerdings im Zuge dessen auch die

Reportergenkassette modifiziert werden. Eine verbesserte Regulation könnte hier

möglicherweise über alternative Promotoren in Kombination mit anderen TRE Varianten

erzielt werden.

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 70 -


In eukaryontischen Organismen erfordert die Regulation TetR-kontrollierter Genexpression

die Lokalisation des Effektors im Zellkern. Da niedermolekulare Effektoren wie Tetrazykline

passiv durch Membranen diffundieren können (Sigler et al., 2000) stellt die Kernmembran für

solche Effektoren höchstwahrscheinlich kein Hindernis dar. Im Gegensatz dazu führt der

einzige Weg für eine Trägerprotein-TIP Fusion in den Zellkern durch die Kernporen, wodurch

die TetR-kontrollierte Genexpression zum Indikator dieses Transportvorgangs wird. Daraus

ergibt sich die Möglichkeit der Konstruktion von Reportersystemen zur Analyse des nucleo-

cytoplasmatischen Transports ausgewählter Proteine. Die Bedeutung solcher Reporter-

systeme wird aus der Vielzahl von Erkrankungen ersichtlich, die mit einer gestörten nucleo-

cytoplasmatischen Verteilung verschiedener Proteine assoziiert sind (zusammen-gefasst in

(Chahine et al., 2009)). So konnte beispielsweise eine Fehllokalisation der Transkriptions-

faktoren NF-κB („nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells“), HIF1-α

(„hypoxia-inducible factor 1“) oder auch NFAT („nuclear factor of activated T-cells”) mit der

Entstehung von Krebserkrankungen in Zusammenhang gebracht werden. Jedoch spielt der

nucleo-cytoplasmatische Transport nicht nur bei der Entstehung von Krebserkrankungen,

sondern auch bei der Infektion durch verschiedene Viren eine wichtige Rolle (siehe unter

2.3.3). Wie am Beispiel des NP aus dem Influenza A Virus gezeigt wurde, stellt die Inhibition

des Kerntransports viraler Proteine einen vielversprechenden Ansatzpunkt für die

Identifizierung neuer Therapeutika dar (Cros et al., 2005; Kao et al., 2010). Für die Suche

nach entsprechenden Wirkstoffen werden allerdings leistungsfähige Reportersysteme

benötigt, welche die Analyse großer Substanzenbanken im Hochdurchsatzverfahren (HTS-

Verfahren „high throughput screening“) erlauben. Die verfügbare Methodik zur Analyse des

nucleo-cytoplasmatischen Transports ausgewählter Proteine ist gut etabliert und wurde

ständig verbessert (siehe unter 2.3.2). In den beiden gängigsten Methoden wird die

subzelluläre Lokalisation des zu untersuchenden Proteins anhand von Translationsfusionen

mit fluoreszierenden Proteinen oder durch Immunolokalisation untersucht. Allerdings

unterliegen diese Methoden klaren Limitationen und eignen sich nicht für den Einsatz in

HTS-Verfahren. Das hier vorgestellte System vereint die Vorteile dieser beiden Systeme

ohne den gleichen Einschränkungen zu unterliegen. Im Vergleich zu dem experimentellen

Ansatz, der auf der Fusion des zu untersuchenden Zielproteins mit einem fluoreszierenden

Proteins basiert, wird hier nur eine kurze Sequenz an das zu untersuchende Protein

angefügt. So umfasst beispielsweise das Induktorpeptid TIP2 inklusive der SGGA

„Linkersequenz“ lediglich 20 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 2,3 kDa. Es ist

davon auszugehen, dass die Eigenschaften des zu untersuchenden Proteins durch die

Fusion mit TIP2 in geringerem Maße beeinflusst werden, als durch die Fusion mit einem, im

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 71 -

Falle von GFP 238 AS und 27 kDa umfassenden Protein. Durch die Verwendung eines

entsprechenden Reporters wie beispielsweise der Luciferase aus Photinus pyralis kann die

Quantifizierung der Reportergenaktivität sowohl in vitro aus Zelllysaten, als auch in vivo

erfolgen (zusammengefasst in (Greer et al., 2002)). Dies erlaubt die Untersuchung einer

einzelnen Zelle oder einer Zellpopulation über einen längeren Zeitraum und unter

wechselnden Bedingungen. Die Detektion der subzellulären Lokalisation des Zielproteins

erfolgt im hier vorgestellten System nicht wie in den gängigen Systemen über die visuelle

Erfassung eines Fluoreszenzsignals im Mikroskop, sondern über die Quantifizierung der

Reportergenaktivität. Diese Form der Detektion erlaubt die Automatisierung der Messung,

wodurch die Anwendung in HTS-Verfahren ermöglicht wird.

4.2.1 Planung und Konstruktion der Reporterzelllinien

Die hier konstruierten Reporterzelllinien stellen die erste Version eines auf der peptidischen

Induktion von TetR basierenden Reportersystems zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen

Transports viraler Proteine dar. Die Konzeption der Reporterzelllinien (siehe unter 3.2.2) sah

hierbei eine stabile Integration aller Komponenten des Reportersystems vor. Hierdurch sollte

eine höhere Reproduzierbarkeit der Daten erreicht werden als dies bei transienten

Transfektionen einer oder mehrerer Komponenten der Fall wäre. Die stabile Integration

erleichtert weiterhin den Einsatz der Zelllinien in HTS-Verfahren, da der zeitliche und

finanzielle Aufwand bei transienten Ansätzen deutlich größer wäre. Die Reporterzelllinien

sollten auf virale Proteine angewendet werden, die während der Virusreplikation im Zellkern

lokalisiert sind. Aufgrund dessen wurde das Reportersystem so konzipiert, dass bei

nukleärer Lokalisation der POI-TIP2 Fusion keine oder nur geringe Expression des

Reportergens erfolgt. Die Reduktion der nukleären Konzentration der POI-TIP2 Fusion

hingegen sollte in einem Anstieg der Reportergenexpression resultieren. Dieser Ansatz

wurde gewählt, um die Reporterzelllinien im Ausgangszustand nicht durch eine hohe

konstitutive Expression des Reportergens zu belasten. Für den Aufbau eines solchen unter

Tet-Kontrolle befindlichen Systems sind zwei verschiedene Konstruktionsansätze möglich,

die in Abbildung 33 dargestellt sind. Die erste Version (Abb. 33A) entspricht dem hier

konstruierten System und besteht aus einem Tet-kontrollierten Minimalpromotor in

Kombination mit einer tTA Variante. In der zweiten Version (Abb. 33B) erfolgt die Regulation

des Reportergens über einen starken Tet-kontrollierten Promotor in Kombination mit einer

sogenannten reversen tTS (rtTS) Variante (Hayakawa et al., 2006). rtTS Varianten basieren

auf reversen TetR Mutanten (revTetR), die im Gegensatz zu TetR wt nicht in Ab-, sondern

nur in Anwesenheit eines Induktors an DNA binden können (Kamionka et al., 2004; Scholz et

al., 2004). Bisher konnte allerdings kein Peptid mit der Fähigkeit zur Korepression einer rtTS

Variante in Eukaryonten isoliert werden, weshalb hier nur die erste Version konstruiert

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 72 -

wurde. Aufgrund der Ergebnisse des ersten Teilprojektes dieser Arbeit konnte hierfür die tTA

Variante bestehend aus TetR(B) wt und der FFF Aktivatordomäne verwendet werden (Baron

et al., 1997). Die Kombination aus dieser tTA Variante, einem CMVmin Minimalpromotor und

einem TRE bestehend aus sieben Wiederholungen von tetO2 zeichnet sich durch eine

geringe Hintergrundaktivität sowie ein großes Messfenster aus (Baron et al., 1997). Um eine

hohe Reportergenexpression im induzierten Zustand und somit ein großes Messfenster zu

erreichen, erfolgte die tTA Expression auf hohem Niveau über einen CMVIE Promotor. Für

eine möglichst vollständige Induktion der tTA Variante durch TIP2 erfolgte die Expression der

POI-TIP2 Fusion ebenfalls auf hohem Niveau unter transkriptioneller Kontrolle des

hEF1-HTLV Promotors.

Abb. 33: Reportersystemvarianten für konstitutiv kernlokalisierte POIs

Protein-kodierende Bereiche sind orange und eukaryontische Promotoren blau dargestellt. Stromaufwärts der

Promotoren befindet sich jeweils ein TRE, bestehend aus mehreren Wiederholungen des Tet-Operators tetO2. Es

ist jeweils der Ausgangszustand des Reportersystems für kernlokalisierte POI-TIP Fusionen dargestellt.

A) Ein Reportergen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines Minimalpromotors, dessen Aktivität durch eine

tTA Variante gesteuert wird. Die tTA Variante ist in grau dargestellt und setzt sich aus dem TetR Dimer

(dunkelgrau) mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne sowie einer Aktivatordomäne (hellgrau)

zusammen. Im Ausgangszustand des Reportersystems wird die tTA Variante durch die POI-TIP Fusion induziert

und kann somit nicht an die Tet-Operatoren des TRE binden. Es erfolgt keine oder nur geringe Basalexpression

des Reportergens.

B) Ein Reportergen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines starken Promotors, dessen Aktivität durch eine

rtTS Variante gesteuert wird. Die rtTS Variante ist in grün dargestellt und setzt sich aus dem revTetR Dimer

(hellgrün) mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne sowie einer Aktivatordomäne (dunkelgrün)

zusammen. Im Ausgangszustand des Reportersystems wird die rtTS Variante durch die POI-TIP Fusion

koreprimiert und bindet dadurch an die Tet-Operatoren des TRE. Somit erfolgt keine oder nur geringe Expression

des Reportergens.

TREPMin Reportergen ReportergenPStark

-TRE TRE

tTA rtTS

A B

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 73 -

4.2.2 Auswahl von geeigneten Influenza A Proteinen

Wie aus dem jährlichen Auftreten von Grippeepidemien sowie einer Pandemie im Jahre

2009 hervorgeht, stellt das Influenza A Virus ein ernst zu nehmendes gesundheitspolitisches

Problem dar. Die therapeutischen Möglichkeiten für die Behandlung von Influenza A

Infektionen sind dagegen begrenzt und Resistenzen gegenüber den verfügbaren Wirkstoffen

weit verbreitet (siehe unter 2.4.4.3). Aus diesen Gründen wurden Proteine aus dem Influenza

A Virus für die Anwendung des hier konstruierten Reportersystems gewählt. Da die

Expression dieser Proteine in uninfizierten Zellen erfolgen sollte wurden Proteine

ausgewählt, die nicht nur während der Infektion, sondern auch bei heterologer Expression im

Zellkern lokalisiert sind. Hierbei sollte die natürliche Physiologie der Zelle durch die

Expression der Proteine nach Möglichkeit nicht beeinträchtigt sein. Ein weiteres Kriterium für

die Auswahl des POI war die Verfügbarkeit von im Cytoplasma lokalisierten Varianten, da

diese als Kontrollen eingesetzt werden sollten. Aufgrund dieser Auswahlkriterien wurden die

Influenza A Proteine NP, M1 und NS1 als potentielle POIs ausgewählt.

4.2.2.1 Relevanz der Virusstämme Influenza A/WSN/1933 und A/Rostock/FPV/1934

In dieser Arbeit wurden die Varianten der Proteine NS1 und NP aus dem Virusstamm

Influenza A/WSN/1933 (H1N1) sowie das M1 Protein aus Influenza A/FPV/Rostock/1934

(H7N1) verwendet. Bei Influenza A/WSN/1933 handelt es sich um einen der in der

Forschung am häufigsten verwendeten Influenza A Virusstämme (Bouvier und Lowen,

2010). Der Stamm leitet sich vom ersten, im Jahre 1933 isolierten Virusstamm A/WS/1933

ab und unterscheidet sich von diesem durch sechs Mutationen im ns Gen (Ward et al.,

1993). Influenza A/WSN/1933 ist weiterhin einer der wenigen, in Mausmodell neurovirulenten

Influenza A Stämme (Francis et al., 1940). Hierbei sind die meisten Zuchtstämme

hochgradig suszeptibel, wohingegen Wildstämme auch gegenüber hohen Dosen resistent

sind (Bouvier und Lowen, 2010). Daneben dienten die einzelnen Komponenten von Influenza

A/WSN/1933 in einer Vielzahl Studien als Modell für die Erforschung der molekularen

Mechanismen der Influenza A Viren. Influenza A/FPV/Rostock/1934 stellt ein aviäres Isolat

dar, aus dem beispielsweise M1 und NP als Modellproteine für aviäre Influenzaviren dienten

(Mandler et al., 1989; Thaa et al., 2009).

4.2.2.2 Das Matrixprotein 1

Das Protein M1 aus dem Influenza A Virus besteht aus 252 Aminosäuren und hat eine

molekulare Masse von ca. 28 kDa (Modrow et al., 2010). M1 ist mit etwa 3.000 Kopien das

häufigste Protein im Virion und erfüllt hier vor allem strukturelle Aufgaben in der

Aufrechterhaltung der Virusarchitektur (Lamb, 1989). Daneben besitzt M1 verschiedene

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 74 -

Funktionen während der Virusreplikation, wobei für mindestens zwei dieser Aufgaben eine

nukleäre Lokalisation erforderlich ist. So ist M1 ist zum Einen an der Regulation der

Transkription viraler RNA beteiligt und stellt zum Anderen einen essentiellen Faktor für den

Export neu synthetisierter Nucleocapside dar (Hankins et al., 1990; Watanabe et al., 1996;

Bui et al., 2000). Der Kernimport von M1 erfolgt mittels einer einteiligen, palindromischen

NLS bestehend aus den Resten 101 bis 105 (101RKLKR105). Ye et al. untersuchten den

Einfluss von Mutationen innerhalb dieser NLS auf die subzelluläre Lokalisation von M1 (Ye et

al., 1995). Hierzu exprimierten sie das M1 Protein aus Influenza A/WSN/1933 sowie

verschiedene Mutanten in uninfizierten CV114 Zellen und detektierten deren subzelluläre

Lokalisation mit immunologischen Methoden. Die wt Variante war im Zellkern lokalisiert,

wohingegen der Austausch der vier positiv geladenen Reste der NLS gegen ungeladene

Reste (101SNLNS105) zur Lokalisation im Cytoplasma führte. Die nukleäre Lokalisation von

M1 wurde auch von Thaa et al. beobachtet, die mit YFP Fusionen am N-Terminus des M1

Proteins aus Influenza A/FPV/Rostock/1934 in uninfizierten CHO-K115 Zellen arbeiteten

(Thaa et al., 2009). Im Gegensatz dazu zeigten Bui et al. eine gleichmäßige Verteilung des

M1 Proteins aus Influenza A/WSN/1933 in CHO Zellen bei immunologischer Detektion (Bui

et al., 1996). Das gleiche wurde von Sato et al. mit einer EGFP Fusion am N-Terminus des

M1 Proteins (EGFP-M1) aus Influenza A/PR/8/34 in uninfizierten MDCK und HeLa Zellen

beobachtet (Sato et al., 2003). Wurden diese EGFP-M1 exprimierenden Zellen allerdings mit

dem Influenza A/PR/8/34 Virus infiziert, konzentrierte sich die Fluoreszenz im Zellkern. Die in

der vorliegenden Arbeit beobachtete, gleichmäßige Verteilung von M1-EGFP innerhalb der

Zelle stimmten sich mit den Ergebnissen von Sato et al überein, wobei zu beachten ist, dass

es sich hier um eine EGFP Fusion am C-Terminus, und nicht wie bei Sato et al. am

N-Terminus des M1 Proteins handelte. Des Weiteren arbeiteten Sato et al. mit einer M1

Variante aus einem anderen Virusstamm. Bei Thaa et al. handelte es sich zwar um die

gleichen M1 Variante wie in der vorliegenden Arbeit, allerdings wurde mit einer N-terminalen

YFP Fusion sowie einem anderen Zelltyp gearbeitet. Ein Einfluss der Punktmutation (siehe

unter 3.2.3.1) im von Thaa et al. verwendeten M1 Protein auf dessen subzelluläre

Lokalisation ist nicht bekannt. Die subzelluläre Lokalisation des POI bei Expression in

uninfizierten Zellen stellte ein wichtiges Kriterium für die Anwendung in den Reporterzelllinien

dar, da auch hier mit uninfizierten Zellen gearbeitet werden sollte. Da die M1-EGFP Fusion in

den hier durchgeführten Experimenten keine Anreicherung im Zellkern zeigte, wurde M1

nicht weiter verwendet.

14

Bei CV1 Zellen handelt es sich um eine Nierenzelllinie aus dem Affen (Jensen et al., 1964). 15

CHO-K1 Zellen wurden durch Subklonierung aus CHO Zellen („chinese hamster ovary“) abgeleitet, bei denen

es sich um eine Ovarzelllinie aus dem Hamster handelt (Puck et al., 1958; Tjio et al., 1958).

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 75 -

4.2.2.3 Das Nichtstrukturprotein 1

NS1 aus Influenza A hat je nach Virusstamm eine Länge von 230 - 237 AS und eine moleku-

lare Masse von ca. 26 kDa (Palese et al., 2007). Bei NS1 handelt es sich um einen

Virulenzfaktor, der die Immunantwort des Wirtes auf mehreren Wegen beeinflusst

(zusammengefasst in (Modrow et al., 2010)). So reduziert NS1 beispielweise die Expression

der Interferon Gene durch Bindung an den Transkriptionsfaktor NF-κB (Wang et al., 2000).

Daneben interagiert NS1 mit CPSF („cleavage and polyadenylation factor“) wodurch die

Reifung der mRNAs des Wirtes, darunter auch die für Interferon-β (IFN-β) blockiert wird

(Nemeroff et al., 1998; Krug et al., 2003; Noah et al., 2003). Die Ausübung der hier

genannten Funktionen erfordert eine nukleäre Lokalisation des NS1 Proteins. In

verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass im Falle von cytoplasmatischen NS1

Varianten eine erhöhte IFN-β Produktion stattfindet, was zu mindestens teilweise auf die

subzelluläre Lokalisation von NS1 zurückzuführen war (Ludwig et al., 2002; Donelan et al.,

2003; Min et al., 2006). Allerdings bleibt zu erwähnen, dass NS1 in infizierten Zellen auch im

Cytoplasma zu finden ist, wo es beispielsweise in der selektiven Translation viraler mRNAs

mitwirkt (de la Luna et al., 1995). Für die Steuerung der subzellulären Lokalisation enthält

NS1 je eine NLS in der Nähe des N- und des C-Terminus (35RLRR38 und 216PKQKRK221)16

sowie eine leucinreiche Kernexportsequenz (138FDRLETLILL147)16 (Greenspan et al., 1988; Li

et al., 1998). Bei Expression von NS1 in uninfizierten Zellen wird die Funktion der NES durch

eine angrenzende Sequenz inhibiert, weshalb NS1 hier im Zellkern akkumuliert. Li et al.

konnten zeigen, dass durch drei Aminosäureaustausche (R148A, E152A und E153A)

innerhalb dieser inhibierenden Sequenz eine cytoplasmatische Variante entsteht (Li et al.,

1998).

In einer Reihe von Zelltypen konnte eine NS1-vermittelte Induktion der Apoptose beobachtet

werden (zusammengefasst in (Schultz-Cherry et al., 2001)). Hierbei handelt es sich sowohl

um permissive Zelltypen wie Makrophagen, MDCK und Mv1Lu17 Zellen, als auch um nicht

permissive Zelltypen wie HeLa oder Lymphozyten. In Lymphozyten und HeLa Zellen wurde

gezeigt, dass bereits die Expression von NS1 für die Induktion der Apoptose ausreicht. In

den hier durchgeführten Experimenten führte die transienten Expression der NS1-EGFP

Fusion über 24 h nicht zu einem vermehrten Zellsterben, längere Zeiträume wurden nicht

getestet. Die in diesen Experimenten beobachtete, nukleäre Lokalisation von NS1-EGFP

stimmte mit den Beobachtungen von Kok at al. überein, die ebenfalls die subzelluläre

Lokalisation des NS1 Proteins aus Influenza A/WSN/1933 in HeLa Zellen, allerdings mittels

immunologischer Methoden untersuchten (Kok und Jin, 2006). Das hier konstruierte System

16

Die Positionen beziehen sich auf das NS1 Protein aus A/WSN/1933 mit 231 AS. 17

Bei Mv1Lu Zellen („mink lung epithelial“) handelt es sich um eine Lungenepithelzelllinie aus dem Nerz

(Henderson et al., 1974).

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 76 -

sah eine konstitutive Expression der POI-TIP2 Fusion vor, weshalb NS1 nur in Zelltypen

ohne NS1-vermittelte Induktion der Apoptose eingesetzt werden könnte. Eine solche Linie

stellt die HEK293 Linie dar, die bereits erfolgreich für die Herstellung einer stabilen, NS1-

exprmierenden Zelllinie verwendet wurde (Kok und Jin, 2006). Da das hier konstruierte

System allerdings auf HeLa Zellen basierte, wurde NS1 nicht als POI ausgewählt. Aufgrund

der Korrelation zwischen der IFN-β Produktion und der subzellulären Lokalisation von NS1

stellt dieses Protein dennoch ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer

antiviraler Wirkstoffe dar. Der nucleo-cytoplasmatische Transport von NS1 könnte hierfür

beispielsweise in einem analogen, auf HEK293 Zellen basierenden Reportersystem

untersucht werden. Aus diesem Grund wurden hier auch die subzelluläre Lokalisation des

NS1-EGFP Fusionsproteins in HEK293 Zellen untersucht.

4.2.2.4 Das Nucleoprotein

Alle Viren mit einem Genom bestehend aus einzelsträngiger RNA mit negativer Polarität

besitzen ein RNA-bindendes Protein, das oft als NP bezeichnet wird (Tordo et al., 1992).

Gemeinsame Aufgabe dieser RNA bindenden Proteine ist die Funktion als Strukturproteine

bei der Verpackung des viralen Genoms. Das 498 AS und 56 kDa umfassende NP der

Influenza A Viren steuert zudem den Import der Nucleocapside in den Zellkern sowie deren

Export aus dem Zellkern. Des weiteren ist NP an der Umschaltung von der Synthese viraler

mRNAs zur Replikation der genomischen RNA beteiligt (Krug, 1989).

In NP aus Influenza A konnten zwei NLSs identifiziert werden, davon eine sogenannte

unkonventionelle NLS innerhalb der ersten 13 AS des N-Terminus und eine klassische

zweiteilige zwischen den Positionen 198 und 216 (Neumann et al., 1997; Wang et al., 1997;

Weber et al., 1998). Die N-terminale NLS trägt die Bezeichnung unkonventionell, da sie sich

mit nur zwei positiv geladenen Resten (7KR8) im Aufbau von den klassischen ein- oder

zweiteiligen NLSs unterscheidet. Der Kernimport der Nucleocapside hängt von beiden NLSs

ab, wobei die unkonventionelle NLS den größeren Beitrag leistet (Wu et al., 2007; Wu und

Pante, 2009). Diese Aussage wird durch die Experimente von Cros et al. bestärkt, deren

cytoplasmatische NP Variante nur durch Mutationen in der unkonventionellen NLS entstand

(Cros et al., 2005). Die klassische NLS musste hierfür nicht verändert werden. Während der

Infektion einer Zelle ist NP im frühen Stadium der Virusreplikation im Zellkern und im späten

Stadium, während der Assemblierung und Reifung neuer Viren, im Cytoplasma lokalisiert

(Wu und Pante, 2009). Wu und Pante konnten weiterhin zeigen, dass diese Umverteilung

durch selektive Exposition der NLSs erreicht wird. Bei Expression in uninfizierten Zellen ist

NP hingegen größtenteils im Zellkern lokalisiert (Cros et al., 2005), was auch in den

mikroskopischen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit beobachtet wurde (siehe unter

3.2.3.3.2).

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 77 -

Der Kernimport von NP stellt einen entscheidenden Prozess für die Infektion einer Zelle dar.

Dies wurde in verschiedenen Studien deutlich, in denen der nucleo-cytoplasmatische

Transport von NP gezielt inhibiert wurde. Cros et al. konnten zeigen, dass die Kompetition

zwischen NP und einem membranpermeablen Peptid mit der unkonventionelle NLS um die

Bindung an Importin α die virale Replikation reduziert (Cros et al., 2005). In einer anderen

Studie isolierten Kao et al. die niedermolekulare Substanz Nucleozin (Abb. 34), die den

Kernimport von NP verhindert (siehe unter 4.2.4.1.2) (Kao et al., 2010). Eine Nucleozin-

vermittelte Reduktion der Virusreplikation konnte sowohl in MDCK Zellen, als auch im

Mausmodell gezeigt werden. Hierbei erhöhte die Verabreichung von Nucleozin die

Überlebensrate von Mäusen, die mit letalen Dosen des aviären Influenza A/Vietnam/1194/04

(H5N1) Virus infiziert wurden auf 50 %. Sowohl die Effekte in MDCK Zellen, als auch im

Mausmodell wurden hierbei bereits mit nanomolaren Nucleozinkonzentrationen erreicht.

Allerdings vermittelt bereits ein einziger Aminosäureaustausch (Y289H) in NP Resistenz

gegenüber Nucleozin. Diese Mutation fand sich auch in natürlich vorkommenden

Virusisolaten, die hauptsächlich aus Schweinen stammten.

Da der Kernimport von NP einen interessanten Angriffspunkt für die Entwicklung neuer

Therapeutika gegen Influenza A Infektionen darstellt und das NP weiterhin alle Kriterien für

die Anwendung in dem zu konstruierenden Reportersystem erfüllte, wurde NP als POI

ausgewählt.

Abb. 34: Chemische Struktur von Nucleozin

Die Struktur wurde aus (Kao et al., 2010) entnommen.

4.2.2.4.1 Funktionalität der NP-TIP2 Fusion in E. coli

Für die Herstellung der NP-TIP2 Fusion wurde die TIP2 Sequenz wie auch im ersten

Teilprojekt der Arbeit über eine 4 AS lange „Linkersequenz“ (SGGA) mit dem C-Terminus

von NP verbunden. Aus den von Ye et al. durchgeführten Experimenten zur Analyse der

Struktur von NP ging hervor, dass NP nicht ausschließlich als Monomer vorliegt, sondern

auch oligomere Komplexe bildet. Die im Zuge dieser Arbeiten erstellte Kristallstruktur der NP

Variante aus Influenza A/WSN/1933 zeigte einen trimeren Komplex. Um eine Beeinflussung

der Interaktion von NP-TIP2 mit TetR durch die Oligomerisierung auszuschließen, wurden

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 78 -

Vorversuche in E. coli durchgeführt (siehe unter 3.2.4.5). Hierbei sollte neben der

grundsätzlichen Funktionalität der NP-TIP2 Fusion auch die Induktion von TetR bei

unterschiedlichen Expressionsniveaus von NP-TIP2 überprüft werden. Dadurch sollte ein

Einfluss der Konzentration von NP-TIP2 auf dessen Aktivität ausgeschlossen werden, was

beispielsweise durch eine verstärkte Oligomerisierung bei höherer Konzentration bedingt

sein könnte. Da in dem hier konstruierten Reportersystem Änderungen in der nukleären

Konzentration von NP-TIP2 detektiert werden sollten, war die konzentrationsabhängige

Induktion von TetR eine wichtige Voraussetzung für die Anwendung von NP-TIP2 in den

Reporterzelllinien. Aus den Experimenten in E. coli geht allerdings eindeutig hervor, dass die

Tet-kontrollierte Reportergenexpression bei zunehmender NP-TIP2 Expression kontinuierlich

ansteigt (siehe unter 3.2.4.5.2). Vergleicht man das hier gemessene Induktionsniveau mit

den Ergebnissen aus Goeke et al. (siehe unter 4.1.1), erreichte NP-TIP2 selbst bei

maximaler Expression in Gegenwart von 90 µM IPTG nicht das Niveau, das mit TrxA-TIP2

bereits durch dessen Basalexpression erreicht wurde. Ein möglicher Grund hierfür könnte

eine geringere Konzentration von „funktionalem“ NP-TIP2 im Vergleich zu TrxA-TIP2 sein.

Bei NP handelt es sich um ein natürlicherweise ausschließlich in Eukaryonten exprimiertes

Protein, weshalb bei heterologer Expression in E. coli die Menge an aktivem Protein durch

eine Reihe von Faktoren reduziert sein könnte. Hierzu zählen beispielsweise Abweichungen

im Codongebrauch, verminderte Faltungseffizienz, geringere Halbwertszeit oder die Bildung

von Proteinaggregaten (zusammengefasst in (Baneyx, 1999)). Bei TrxA handelt es sich

hingegen um ein endogenes Protein, das aufgrund seiner guten Löslichkeit in E. coli in auf

hohem Niveau exprimiert werden kann (LaVallie et al., 1993).

4.2.3 Konstruktion der Reporterzelllinien und deren Anwendung auf NP

Die Zelllinie HLF33 enthält bereits eine stabile Integration der geplanten Reportergen-

kassette sowie eine FRT Sequenz und stellte somit die ideale Ausgangszelllinie für die

Herstellung der Reporterzelllinien dar (siehe unter 3.2.4.1). Die Konstruktion der Reporter-

zellinien wurde deshalb mit der ungerichteten Integration der tTA Expressionskassette in die

Zelllinie HLF33 begonnen (siehe unter 3.2.4.2). Hieraus resultierten die ALF Zelllinien, von

denen die Zelllinie ALF2 aufgrund ihrer Regulationseigenschaften und Vitalität für die

weiteren Arbeiten verwendet wurde (siehe unter 3.2.4.3). Im nächsten Schritt erfolgte die

zielgerichtete Integration der NP-TIP2 Expressionskassette in die Zelllinie ALF2 über das

Flp-In™ System (siehe unter 3.2.4.6). Durch die ortsspezifische Integration wurde mit einer

gleichmäßigen Expression von NP-TIP2 und in Folge dessen auch mit einer vergleichbaren

Expression der Luciferase gerechnet. Die resultierenden ALF2-NP Zelllinien zeigten jedoch

wider Erwarten ein heterogenes Expressionsniveau der Luciferase. Diese Beobachtung

wurde auf Unterschiede in der Expression der NP-TIP2 Fusion in den einzelnen ALF2-NP

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 79 -

Zelllinien zurückgeführt. Dies könnte beispielsweise durch eine oder mehrere ungerichtete

Integrationsereignisse neben der ortsspezifischen, Flp-vermittelten Integration des Vektors

pEF1-HTLV/NP-TIP2 bedingt sein, was eine erhöhte Expression von NP-TIP2 zur Folge

hätte. Eine weitere Erklärung stellen Unterschiede in der Expression der tTA Variante dar. In

verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass sich das Expressionsniveau integrierter

Komponenten in mammalischen Zellen während der Kultivierung aufgrund epigenetischer

Veränderungen variieren kann (zusammengefasst in (Kaufman et al., 2008)). Somit könnte

sich die Expression der tTA Variante innerhalb der einzelnen ALF2-NP Klone während des

Selektionsprozesses für die Flp-vermittelte Integration reduziert haben. Allerdings wurde

mittels der Nachselektion der Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 mit Puromycin keine

Erhöhung der Luciferaseexpression in den einzelnen Zelllinien beobachtet. Aufgrund der

Translationskopplung der tTA Variante und der Puromycin-N-acetyl-Transferase wäre hierbei

im Falle schwankender tTA Expression ein Anstieg der Luciferaseexpression oder ein

vollständiges Absterben der Zelllinie zu erwarten gewesen. Da dies nicht zu beobachten war,

wird davon ausgegangen, dass die Heterogenität der ALF2-NP Zelllinien mit hoher

Wahrscheinlichkeit durch Variationen in der NP-TIP2 Expression zu begründen ist.

4.2.4 Experimentelle Ansätze zur Validierung der Reporterzelllinien

Um die Funktionalität der Reporterzelllinien zu testen, sollte die nukleäre Konzentration von

NP-TIP2 in den drei Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 durch Nucleozin bzw. RNA-

Interferenz gezielt reduziert werden (siehe unter 3.2.5). Dies sollte im Falle eines

funktionsfähigen Reportersystems zu einem Anstieg der Luciferaseexpression führen.

4.2.4.1 Nucleozin

4.2.4.1.1 Konzentrationsabhängige Stimulation der Luciferaseexpression durch DMSO

Bei DMSO handelt es sich um eine in der Zellkultur häufig eingesetzte Substanz, die vor

allem für die Kryokonservierung und als Lösungsmittel für wasserunlösliche Substanzen

eingesetzt wird. Allerdings wurde für DMSO in verschiedenen Studien eine Reihe von

unspezifischen Effekten auf Differenzierung, Zellzyklus und Genexpression in

unterschiedlichen Zelltypen beschrieben (Takase et al., 1992; Su und Waxman, 2004; Wang

et al., 2007). Weiterhin konnte in CHO Zellen auch eine konzentrationsabhängige Stimulation

der Expression heterolog exprimierter Gene durch DMSO gezeigt werden (Liu et al., 2001).

Der kontinuierliche Anstieg der Luciferaseexpression der Zelllinie ALF2 bei zunehmender

DMSO Konzentration (siehe 3.2.5.1.1) stimmte mit den Beobachtungen von Liu et al.

überein. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde bei allen Messungen im Rahmen der

Arbeiten mit Nucleozin eine konstante DMSO Konzentration von 0,5 % eingesetzt. Dies

entsprach auch dem experimentellen Vorgehen in Kao et al. (Kao et al., 2010).

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 80 -

4.2.4.1.2 Interpretation der Experimente mit Nucleozin

In den hier durchgeführten Experimenten konnte kein Anstieg der Luciferaseaktivität durch

die Behandlung der Reporterzelllinien mit Nucleozinkonzentrationen bis 30 µM festgestellt

werden. Aus der Abnahme der Gesamtproteinkonzentration der Zelllysate bei Nucleozin-

konzentrationen größer 10 µM (ALF2, ALF2-NP22 und -NP31) bzw. 20 µM (ALF2-NP19)

geht hervor, dass Nucleozin bei höheren Konzentrationen Auswirkungen auf die Physiologie

der Zelle hat. Somit konnten nur im Konzentrationsbereich bis 10 µM zuverlässige Aussagen

getroffen werden. Der Grund für die höhere Toleranz der Zelllinie ALF2-NP19 gegenüber

Nucleozin wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Die Ergebnisse aus den

Luciferaseaktivitätsmessungen deckten sich mit den Erkenntnissen aus den mikros-

kopischen Analysen (siehe unter 3.2.5.1.3). Hier hatte Nucleozin im Konzentrationsbereich

von 1 - 10 µM keine Auswirkungen auf die subzelluläre Lokalisation der NP-EGFP Fusion.

Der Einfluss von Nucleozin auf die subzelluläre Lokalisation der NP Variante aus Influenza

A/WSN/1933 wurde auch in den Experimenten von Kao et al. untersucht. Allerdings wurde

hierbei mit virusinfizierten A54918 Zellen gearbeitet und die Detektion von NP erfolgte mit

immunologischen Methoden. Im Gegensatz zu den Beobachtungen in der vorliegenden

Arbeit wurde von Kao et al. bereits bei einer Nucleozinkonzentration von 1 µM eine

vollständige Inhibition des NP Kernimports festgestellt (Abb. 35). Ein direkter Vergleich der

Experimente ist allerdings aufgrund der Unterschiede in den Versuchsansätzen nicht

möglich. Möglicherweise war die Nucleozinkonzentration nicht ausreichend, um den

Kernimport der jeweils auf hohem Niveau exprimierten NP-TIP2 bzw. NP-EGFP Fusionen zu

inhibieren. Als weiterer Grund wären Zelltyp-spezifische Unterschiede zwischen A594 und

HeLa Zellen zu nennen. Kao et al. postulierten aus in silico Analysen drei potentielle

Bindestellen für Nucleozin an NP, die nicht in der Nähe des C-Terminus liegen. Aufgrund

dessen erscheint ein Einfluss von TIP2 bzw. EGFP auf die Interaktion zwischen Nucleozin

und NP eher unwahrscheinlich. Jedoch wäre eine Beeinträchtigung der Nucleozin-

vermittelten NP Aggregation durch die TIP2 bzw. EGFP Sequenz denkbar.

18

Bei A549 handelt es sich um humane Lungenepithelzellen (Giard et al., 1973).

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 81 -

Abb. 35: Inhibition des NP Kernimports in virusinfizierten A549 Zellen durch Nucleozin

A594 Zellen wurden in Ab- (A) und Anwesenheit (B) von Nucleozin mit dem Influenza

A/WSN/1933 Virus infiziert. Drei Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und die

subzelluläre Lokalisation von NP wurde mit immunologischen Methoden untersucht. Um den

Zellkern anzufärben, wurden die Zellen mit DAPI behandelt.

Jeweils von links: Lokalisation von NP, Überlagerung der Lokalisation von NP mit der DAPI

Färbung.

A) NP befindet sich im frühen Stadium der Infektion im Zellkern.

B) In Gegenwart von Nucleozin akkumuliert NP im Cytoplasma.

Abbildung und Legende wurden aus (Kao et al., 2010) entnommen und modifiziert.

4.2.4.2 Validierung der Reporterzelllinien über RNA-Interferenz

Das sogenannte „gene silencing“ über RNA-Interferenz wurde in einer Vielzahl von Studien

genutzt, um die Expression einzelner Gene spezifisch zu reduzieren (zusammengefasst in

(Dykxhoorn et al., 2005) und (Dykxhoorn et al., 2003)). In mammalischen Zellen kann die

RNA-Interferenz hierbei über die Transfektion einer Zelle mit 21 Nukleotiden umfassenden,

doppelsträngigen siRNA Fragmenten induziert werden (Elbashir et al., 2001). Dieser Ansatz

wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet um die Expression von NP-TIP2 und somit

dessen nukleäre Konzentration zu reduzieren. Wie aus den Ergebnissen dieser Messung

(siehe unter 3.2.5.2) hervorgeht, hatten alle hier verwendeten siRNAs einen unspezifischen

Effekt auf die Luciferaseexpression der getesteten Zelllinien. Diese Beobachtungen sind

möglicherweise auf eine unspezifische Wirkung der siRNAs auf die Expression der einzelnen

Komponenten des Reportersystems zurückzuführen. Persengiev et al. konnten in HeLa

Zellen eine unspezifische Stimulation bzw. Repression der Expression von über 1.000

verschiedenen Genen durch Transfektion mit siRNA zeigen (Persengiev et al., 2004). Die

durch diese Gene codierten Proteine waren in verschiedenste zelluläre Prozesse wie

beispielsweise den Metabolismus, Signalübertragung und auch die Genexpression involviert.

Für ausgewählte Gene wurde zudem gezeigt, dass diese Effekte mit steigender siRNA

Konzentration zunehmen. Persengiev et al. untersuchten hierbei siRNA Konzentrationen bis

200 nM, ein Bereich in dem typischerweise in mammalischen Zellen gearbeitet wird. Für

einzelne Gene wurden allerdings bereits bei einer Konzentration von 25 nM Veränderungen

im Expressionsniveau beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde mit einer Konzentration

von 50 nM gearbeitet, was der Hälfte der vom Hersteller des Transfektionsreagenz

w/o 1 µM Nucleozin A B

4 Diskussion _____________________________________________________________________________________________________

- 82 -

empfohlenen Konzentration entsprach. Aus den Ergebnissen von Persengiev et al. geht

hervor, dass bei dieser Konzentration durchaus unspezifische Effekte auftreten können.

Jedoch ist ein direkter Vergleich der beobachteten Effekte mit den Ergebnissen von

Persengiev et al. aufgrund abweichender Versuchsbedingungen bezüglich des Trans-

fektionsreagenz und der verwendeten siRNA nicht möglich. Desweiteren wurde hier die

heterologe Expression und nicht wie bei Persengiev et al. die Expression endogener Gene

untersucht. Ein Einfluss des Transfektionsreagenz auf die Genexpression einer Zelle, wie sie

beispielsweise von Merkel et al. beschrieben wurde, konnte in der hier vorliegenden Arbeit

durch entsprechende Kontrollen ausgeschlossen werden (Merkel et al., 2011). Durch den

Vergleich der Luciferaseaktivität in den Transfektionen der spezifischen siRNA NP-1 und der

unspezifischen RNA uspRNA ergab sich trotz der angesprochenen, unspezifischen Effekte

ein klarer Hinweis auf die Funktionalität der Reporterzelllinien. Dies wurde aus dem

stärkeren Anstieg der Luciferaseexpression in den drei getesteten Reporterzelllinien im

Vergleich zur Ausgangszelllinie geschlossen (siehe unter 3.2.5.2). Der endgültige Beweis

konnte mit den hier verwendeten Methoden allerdings nicht erbracht werden. Hierzu wäre ein

Ansatz erforderlich, der eine Reduktion der nukleären Konzentration von NP-TIP2 ohne

unspezifische Nebeneffekte ermöglicht.

4.2.5 Möglichkeiten zur Optimierung des Reportersystems

Ein Nachteil des hier konstruierten Reportersystems liegt vermutlich in der hohen Expression

der tTA Variante sowie der NP-TIP2 Fusion. Das hohe Expressionsniveau der tTA Variante

wurde gewählt, um ein großes Messfenster zur erzielen. Dies erforderte jedoch auch die

Expression von NP-TIP2 auf entsprechendem Niveau um eine möglichst vollständige

Induktion der tTA Variante zu erreichen. Durch die hohe zelluläre Konzentration der

heterolog exprimierten Proteine kann zum Einen die natürliche Physiologie der Zelle in

einem nicht kalkulierbaren Maß beeinflusst werden und zum Anderen reduziert sich

hierdurch die Sensitivität des Reportersystems. Folglich wäre eine Optimierung des

Reportersystem durch Reduktion der Expressionsniveaus der POI-TIP2 Fusion bzw. der tTA

Variante denkbar. Dazu sind allerdings konditionale Genregulationssysteme erforderlich, die

auch bei niedriger Expression der tTA Variante ein großes Messfenster ermöglichen. Der

grundsätzliche Aufbau der Reporterzelllinien stellt hierbei sicherlich einen guten

Ausgangspunkt für Optimierung des Systems über die Verwendung alternativer

Komponenten dar.

5 Material und Methoden __________________________________________________________________________

- 83 -

5 MATERIAL UND METHODEN

5.1 Materialien

5.1.1 Chemikalien

Im Folgenden sind die wichtigsten, in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien aufgeführt. Alle

hier nicht aufgelisteten Chemikalien wurden in p.A. Qualität von Merck (Darmstadt (DE)),

Roth (Karlsruhe (DE)) oder Sigma (München (DE)) bezogen.

Substanz Bezugsquelle

Aceton Roth, Karlsruhe (DE)

Adenin Sigma, München (DE)

Agar Oxoid, Heidelberg (DE)

Agarose PeqLab, Erlangen (DE)

Ammoniumsulfat Merck, Darmstadt (DE)

Ampicillin Sigma, München (DE)

Arginin Sigma, München (DE)

Bromphenolblau Roth, Karlsruhe (DE)

Calciumchlorid Merck, Darmstadt (DE)

DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) Roth, Karlsruhe (DE)

Dinatriumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe (DE)

D-Luziferin P.J.K., Kleinblittersdorf (DE)

DMEM (“Dulbecco's Modified Eagle's Medium”),

4,5 g/l Glucose mit L-Glutamin PAA, Cölbe (DE)

DMSO (Dimethylsulfoxid) Roth, Karlsruhe (DE)

dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate) PeqLab, Erlangen (DE)

Doxyzyklin (Dox) Sigma, München (DE)

DTT (Dithiothreitol) Roth, Karlsruhe (DE)

EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Roth, Karlsruhe (DE)

Ethanol, p.A. Roth, Karlsruhe (DE)

Ethanol, technisch Roth, Karlsruhe (DE)

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe (DE)

FKS (Fötales Kälberserum), Fetal Bovine Serum Gold PAA, Cölbe (DE)

Glucose Roth, Karlsruhe (DE)

Glutaraldehyd, 8 % wässrige Lösung Sigma, München (DE)

Glycerin Roth, Karlsruhe (DE)

Hefeextrakt Oxoid, Heidelberg (DE)

Heringssperma-DNA Sigma, München (DE)

Histidin Sigma, München (DE)

Höchst 33342 Sigma, München (DE)

Hygromycin B Invitrogen, Karlsruhe (DE)


- 84 -

IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid) Roth, Karlsruhe (DE)

Isoleucin Sigma, München (DE)

Isopropanol Roth, Karlsruhe (DE)

Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat Merck, Darmstadt (DE)

Kaliumhexacyanoferrat(III) Merck, Darmstadt (DE)

Kanamycin Sigma, München (DE)

Leucin Sigma, München (DE)

Lipofectamine™

Transfektionsreagenz Invitrogen, Karlsruhe (DE)

Lithiumacetat Roth, Karlsruhe (DE)

Lysin Sigma, München (DE)

METAFECTENE® SI Transfektionreagenz Biontex, Martinsried (DE)

Methionin Sigma, München (DE)

Natriumacetat Merck, Darmstadt (DE)

Natriumcarbonat Merck, Darmstadt (DE)

Natriumchlorid Roth, Karlsruhe (DE)

Natriumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe (DE)

Natronlauge Roth, Karlsruhe (DE)

NONIDET® NP40 Sigma, München (DE)

Nucleozin Sigma, München (DE)

ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid) Sigma, München (DE)

OPTI-MEM® Invitrogen, Karlsruhe (DE)

PEG 3350 (Polyethylenglykol 3350) Sigma, München (DE)

Penicillin/Streptomycin 100x PAA, Cölbe (DE)

Pepton aus Fleisch Roth, Karlsruhe (DE)

Phenylalanin Sigma, München (DE)

Puromycin Cayla-InvivoGen, Toulouse (FR)

Salzsäure Roth, Karlsruhe (DE)

Silikonpaste, Baysilone mittelviskos Bayer, Leverkusen (DE)

Stickstoff Linde, München (DE)

Trichlormethan (Chloroform) Roth, Karlsruhe (DE)

Tris (Tris (hydroxymethyl)-aminomethan) Roth, Karlsruhe (DE)

Trypsin/EDTA (0,05 %)/(0,02 %) PAA, Cölbe (DE)

Trypton (tryptisch verdautes Casein) Oxoid, Heidelberg (DE)

Tryptophan Merck, Darmstadt (DE)

Tyrosin Merck, Darmstadt (DE)

Uracil Sigma, München (DE)

X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galaktopyranosid) PeqLab, Erlangen (DE)

Xylencyanol Roth, Karlsruhe (DE)

Yeast Nitrogen Base ohne AS und Ammoniumsulfat BD, Sparks, (US)

β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt (DE)


- 85 -

5.1.2 Hilfsmittel und Verbrauchsgüter

Bezeichnung Bezugsquelle

24-Napfplatte Nalge Nunc, Rochester (US)

8-Kanalpipette, „Research pro“ Eppendorf, Hamburg (DE)

96-, 48-, 12-, 6-Napfplatten Greiner, Nürtingen (DE)

96-Napf-Flachbodenplatte Greiner, Nürtingen (DE)

96-Tiefnapfplatte (1,2 und 2,2 ml) PeqLab, Erlangen (DE)

Abdeckfolie, wasserdicht und atmungsaktiv, „Breathseal“ für 96-Napfplatte

Greiner, Nürtingen (DE)

Becher, Glas (50, 250 ml) Schott Duran, Jena (DE)

Becher, Kunststoff (0,5; 1,0 und 2;5 l) Brand, Wertheim (DE)

Kryoröhrchen, „Cryo tube™“

Nalge Nunc, Rochester (US)

Dispenser, elektrisch Eppendorf, Hamburg (DE)

Einmalpipetten, Kunststoff (5, 10 und 25 ml) Greiner, Nürtingen (DE)

Einmalspritzen (25, 50 ml) BD, Franklin Lakes (US)

Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5 und 2 ml) Eppendorf, Hamburg (DE)

Filterspitzen, für die Zellkultur Greiner, Nürtingen (DE)

Gewebekulturschalen, Kunststoff (rund 10 und 15 cm) TPP, Trasadingen (CH)

Glaspipetten (5, 10, 25 ml) Brand, Wertheim (DE)

Halbmikroküvette, Kunststoff (10 x 10 x 45 mm) Greiner, Nürtingen (DE)

Küvette für Fluorimeter, Acryl (10 x 10 x 48 mm) Sarstedt, Nümbrecht (DE)

LIA 96-Napfplatte Greiner, Nürtingen (DE)

Macro-Pipettierhelfer Brand, Wertheim (DE)

Magnetrührstäbe (verschiedene Größen) VWR, Darmstadt (DE)

Messzylinder, Kunststoff (50, 250, 1000 und 2000 ml) Brand, Wertheim (DE)

Kryocontainer, “Nalgene™

Cryo 1 °C” Nalge Nunc, Rochester (US)

Noppenfolie für 96-Napfplatten PeqLab, Erlangen (DE)

PCR-Reaktionsgefäß (0,2 ml) PeqLab, Erlangen (DE)

Petrischale, Kunststoff (rund 100 mm) Greiner, Nürtingen (DE)

Pipettierhelfer elektrisch, „PIPETBOY acu“ Integra, Fernwald (DE)

Mikroliterpipetten, „Pipetman“ (20, 200 und 1000 µl) Gilson, Limburg-Offheim (DE)

Pipettenspitzen, Kunststoff (200 und 1000 µl) Greiner, Nürtingen (DE)

Polyethylenröhrchen (PET-Röhrchen), (15 und 50 ml) Greiner, Nürtingen (DE)

Reagenzglas Pall, Port Washington (US)

Schikanekolben (100 und 300 ml) Schott Duran, Jena (DE)

Schraubflaschen (50, 250, 500 und 1000 ml) Schott Duran, Jena (DE)

Sterilfilter, „Filtropur S 0,2“ (0,2 µm) Sarstedt, Nümbrecht (DE)

Tablettenmagnetrührstab VWR, Darmstadt (DE)


- 86 -

5.1.3 Verwendete Geräte

Gerät Bezugsquelle

Autoklav, “Systec 5075 EL” Systec, Wettenberg (DE)

Brutschrank, 5042 und BBD 6220 Heraeus Christ, Osterode (DE)

Bunsenbrenner Bochem, Weilburg (DE)

Eismaschine, „Ziegra“ Kurt Hilbinger, Hessdorf (DE)

Elektrophoreseapparaturen, horizontal für Agarose-Gele Eigenbau Universität Erlangen (DE)

Feinwaage, “Sartorius Analytic” Sartorius, Göttingen (DE)

Fluoreszenzmikroskop, „Zeiss Axioscope A1“ Zeiss, Oberkochen, (DE)

Geldokumentation, „Video-Geldoku-System Mod. 215“ PeqLab, Erlangen (DE)

Heizblock, „Thermomixer comfort“ Eppendorf, Hamburg (DE)

Inkubator für 96-Napfplatten, TH15 EB Labortechnik, Hechingen (DE)

Konfokales Fluoreszenzmikroskop, SP5 Leica Microsystems, Wetzlar (DE)

Konstanträume (4 °C, 28 °C und 37 °C) Zimmermann, Nürnberg (DE)

Kühlschrank mit Gefrierfächern (+4 °C/-20 °C) Liebherr, Schweiz (DE)

Kulturschüttler, G10 New Brunswick, Edison (US)

Magnetrührer/Heizrührer IKA-Labortechnik, Staufen (DE)

Mikrowelle AEG, Nürnberg (DE)

pH-Meter, „766 Calimatic“ Knick, Berlin (DE)

Plattenlesegerät, „TECAN Infinite F200 Pro“ TECAN, Männedorf (CH)

Plattenluminometer, „Orion II“ Berthold, Pforzheim (DE)

Reaktionsgefäßeschüttler Eppendorf, Hamburg (DE)

Rollinkubator Eigenbau Universität Erlangen (DE)

Spannungsnetzgerät, TN 300-120 Heinzinger, Rosenheim (DE)

Spektralfluorimeter, “Fluorolog 3” HORIBA Jobin Yvon, Longjumeau (FR)

Spektralphotometer, „NanoDrop® ND-1000“ PeqLab, Erlangen (DE)

Spektralphotometer,” Ultrospec 2100” Amersham, Amersham (UK)

Sterilbank, “Clan LAF VFR 1206” Clan LAF, Humlebaek (DK)

Stickstofftank Apollo Messer, Griesheim (DE)

Thermocycler „Primus 96“ PeqLab, Erlangen (DE)

Tiefkühltruhe (-80 °C) New Brunswick, Edison (US)

UV Schirm 254 nm und 366 nm Vetter, Wiesloch (DE)

Vortexer, VF2 IKA Labortechnik, Staufen (DE)

Waage, „Sartorius universal“ Sartorius, Göttingen (DE)

Wasserbad, 5M und „Eco-PA/ÜK“ Julabo, Seelbach (DE)

Wasservollentsalzungsanlage Millipore, Billerica (US)

Zellzähler, Z2 Beckman Coulter, Brea (US)

Zentrifugen, “Biofuge A (pico, fresco, primo R),

Megafuge 1.0R” Heraeus Christ, Osterode (DE)


- 87 -

5.1.4 Kommerziell erhältliche Systeme

System Bezugsquelle Anwendung

NucleoSpin® Extract II Macherey-Nagel, Düren (DE)

DNA-Elution aus Agarosegelen,

Reinigung von PCR-Produkten

NucleoSpin® Plasmid Macherey-Nagel, Düren (DE) Plasmidpräparation

QIAamp® DNA Mini Kit Quiagen, Hilden (DE) Präparation chromosomaler DNA aus

HeLa Zellen

Nucleobond® Xtra Midi Macherey-Nagel, Düren (DE) Plasmidpräparation

Roti®-Quant Roth, Karlsruhe (DE) Proteinquantifizierung nach Bradford

5.1.5 Enzyme

Enzym Bezugsquelle

DNA-Ligase T4 NEB, Frankfurt a. M. (DE)

DNA-Polymerase Phusion® NEB, Frankfurt a. M. (DE)

DNA-Polymerase rTaq NEB, Frankfurt a. M. (DE)

Phosphatase Antarctic NEB, Frankfurt a. M. (DE)

Restriktionsendonucleasen NEB, Frankfurt a. M. (DE)

RNAse A (Ribonuclease A) Serva, Heidelberg (DE)

5.1.6 DNA-Größenstandard

peqGOLD® DNA-Leiter (PeqLab, Erlangen (DE)) mit den Bandengrößen in bp:

10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500, 1.200,1.031, 900,

800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100

5.1.7 Verwendete Stämme und Zelllinien

5.1.7.1 Verwendete E. coli Stämme

Stamm Genetische Marker Referenz

DH5α

recA1, endA1, gyrA96, thi, relA1, hsdR17(rK-, mK

+),

supE44, Φ80dlacZΔ, ΔlacU169

(Hanahan, 1983)

RB791 IN[rrnD-rrnE]1, lacIqL8 (Brent et al., 1981)

WH207(λtet50) galK, rpsL, thi, ΔlacX74, recA13, Tn10,

tetA-lacZ-Transkriptionsfusion, bet+, gam

+, cIII

+, cI

+, lacZ

+

(Wissmann et al.,

1991)


- 88 -

5.1.7.2 Verwendeter S. cerevisiae Stamm

Name Genotyp Referenz

K699 MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3, 112, his3-11, 15,

ura3, GAL, psi+

(Schwob et al., 1994)

5.1.7.3 Verwendete Zelllinien

Stamm Stabil in das Genom integrierte Komponenten, Selektionsmarker

Referenz

HeLa ATCC*

HEK293 ATCC

HLF33 HeLa, zusätzlich:

pFRT/lacZeo (Invitrogen), pUHC13-2,

pWHE260 (Gossen und Bujard, 1992),

Zeocin™R

, NeoR

(Berens et al., 2006)

ALFX (X= 2, 4, 6, 7, 12, 39) HLF33, zusätzlich:

pIPRBF, PuroR

Diese Arbeit

ALF2-NPX (X = 1, 2, 4, 5,

6, 7, 8, 10, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 34)

ALF2, zusätzlich:

pEF1-HTLV/NP-TIP, HygR

Diese Arbeit

*ATCC: American Type Culture Collection, Rockville (US)

5.1.8 Oligonukleotide und Plasmide

5.1.8.1 Oligonukleotide

Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Eurofins MWG (Ebersberg (DE))

bezogen und in deionisiertem Wasser zu einer Konzentration von 100 pmol/µl gelöst.

5.1.8.1.1 Oligonukleotide für die Konstruktion von Plasmiden

Eingeführte Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen.

Name Sequenz von 5‘ nach 3‘ Konstruktion von

CMVForward CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG pEF1-HTLV/NP-TIP2

EF1a-HTLV-fwd ATGATGAGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCG pEF1-HTLV/FRT

EF1a-HTLV-rev ATGATGGCTAGCTAGGCGCCGGTCACAGCTTG pEF1-HTLV/FRT

IRESPseq GAGAGGGAGTACTCACCCC pEF1-HTLV/NP-TIP2

M1-EcoRI-rev CCGTCGACTGCAGAATTCCCTTGAATCGTTGCATCTGC pM1-EGFP,

pM1Mut-EGFP


- 89 -

M1-GT-fwd GAGCAAATGGCTGGGTCAATTGAACAGGCAGCGGAGG pM1-EGFP,

pM1Mut-EGFP

M1-GT-rev CCTCCGCTGCCTGTTCAATTGACCCAGCCATTTGCTC pM1-EGFP,

pM1Mut-EGFP

M1-Mut-fwd GCCGTCAAACTATACAGCAACCTGAACAGCGAGATAACA

TTCTATGGAGC

pM1Mut-EGFP

M1-Mut-rev TAGAATGTTATCTCGCTGTTCAGGTTGCTGTATAGTTTGA

CGGCTTTATC

pM1Mut-EGFP

M1-XhoI-fwd ACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGAGTCTTCTAACCGA

GG

pM1-EGFP,

pM1Mut-EGFP

NP-EcoRI-rev TCGACTGCAGAATTCCATTGTCGTACTCCTCTGC pNP-EGFP,

pNPMut-EGFP

NP-MfeI-rev CATCATCAATTGTTAATTGTCGTACTCCTCTG pWHE2101/NP

NPMut-fwd1 CCACCATGGCGACCAAAGGCACCGCCGCCTCTTACGAA

CAGATGGAGAC

pNPMut-EGFP

NP-Mut-fwd2 GACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCGACCAAAG pNPMut-EGFP

NP-Nhe-fwd GGCCTAGCTAGCCGCCACCATGGCGACCAAAGGC pIP/NP-TIP2

NP-P5-1 GCTCTGGCGGCCAGCACGCTGTCGTCGGCGCCGCCGC

TATTGTCGTACTCCTCTGCATTG

pIP/NP-TIP2

NP-P5-2 GGATCCGAATTCTTACCAGTGCCACATCCACATTCTGGC

TCTGGCGGCCAGCAC

pIP/NP-TIP2

NPP5-MfeI-rev CATCATCAATTGTTACCAGTGCCACATCCAC pWHE2101/NP-TIP2

NP-XhoI-fwd GACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCGACCAAAGGCA

CC

pNP-EGFP

NP-XhoI-fwd2 CTCTAGCTCGAGAAGCTTAACAAAAATTAGGAATTAATG

GCGACCAAAGGCACC

pWHE2101/NP,

pWHE2101/NP-TIP2

NS1-EcoRI-rev ACCGTCGACTGCAGAATTCCAACTTCTGACCTAATTGTT

CC

pNS4-EGFP,

pNS4Mut-EGFP

NS1Mut-fwd TAATATTACTAGCCGCCTTCACCGCTGCCGGGACAATTG

TTGGCGAAATT

pNS4Mut-EGFP

NS1Mut-rev CAATTGTCCCGGCAGCGGTGAAGGCGGCTAGTAATATT

AGAGTCTCCAGC

pNS4Mut-EGFP

NS1-XhoI-fwd CCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGATCCAAACA

CTGTGTC

pNS4-EGFP,

pNS4Mut-EGFP

NS3ss-fwd CACTACCCGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAATGCAG

TTGGGGTCCTC

pNS4-EGFP,

pNS4Mut-EGFP

NS3ss-rev TTGACATCCTCATCAGTATGTCCGGGTAGTGAGGGCAG

TGGTGAAATTTC

pNS4-EGFP,

pNS4Mut-EGFP

R2P5_rev1 CACCCGAACCAACCTTTCTCTTTTTCTTTGGCTTGTACAG

CTCGTCCATG

pWHE705/C2-TIP2


- 90 -

R2P5_rev2 GCCCTAGCCGCCAGAACCGAATCATCAGCTCCACCCGA

ACCAACCTTTCT

pWHE705/C2-TIP2

R2P5_rev3 CGATAAGCTTACCAATGCCACATCCACATCCTCGCCCTA

GCCGCCAGAAC

pWHE705/C2-TIP2

R3-fwd1_2 AAGCATCGGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGT

GAGCAAGGGCGAG

pWHE705/C3

R3-fwd2_2 AATTCGAGTCCCCGAAGAAAAAGCGGAAAGTTGAAGCA

TCGGGCCTGGTG

pWHE705/C3

R3-fwd3 CTGGTGGAAAACGGACGGCAGACGGATCCGAATTCGAG

TCCCCGAAGAAA

pWHE705/C3

R3-fwd4 CTCTAGAACTAGTTACACAATGGCTAGCATGACTGGTGG

AAAACGGACGG

pWHE705/C3

R4-fwd1 AAGCATCTGGTTTGGTTCCAAGAGGTTCTCATATGGTGA

GCAAGGGCGAG

pWHE705/C4

R4-fwd2 CCAAAGAAAAAGAGAAAGGTTGAAGCATCTGGTTTGGTT

CCAA

pWHE705/C4,

pWHE705/C7,

pWHE705/C7-TIP2

R4-fwd3 TCTAGAACTAGTTACACAATGCCAAAGAAAAAGAGAAAG

GTTG

pWHE705/C4,

pWHE705/C7,

pWHE705/C7-TIP2

R5delta_rev ATCGATAAGCTTTTATTATGCGGTACCAGAACC pWHE705/C5,

pWHE705/C7

R5fwd1 AGCATCTGGTTTGGTTCCAAGAGGTTCACATATGGCAAC

TAGCGGCATGG

pWHE705/C5,

pWHE705/C6

R5fwd2 GAAAGTCCTAAGAAGAAAAGGGCTGTCGAAGCATCTGG

TTTGGTTCCAAG

pWHE705/C5

R5fwd3 TAAAAGAACTGCCGATGGTTCTGAATTTGAAAGTCCTAA

GAAGAAAAGG

pWHE705/C5

R5fwd4 TCTAGAACTAGTTACACAATGTCTAAAAGAACTGCCGAT

GGTTC

pWHE705/C5

R6fwd1 AGCTGCTAAAAGAGTTAAATTGGATGAAGCATCTGGTTT

GGTTCCAAG

pWHE705/C6

R6fwd2 TCTAGAACTAGTTACACAATGTCTCCAGCTGCTAAAAGA

GTTAAATTGG

pWHE705/C6

R7fwd1 AAGCATCTGGTTTGGTTCCAAGAGGTTCTCATATGGTTA

GTAAAGGAGAAGAAAA

pWHE705/C7,

pWHE705/C7-TIP2

R7P5_rev1 CAGCCAAAACAGAATCATCAGCACCACCAGATGCGGTA

CCAGAACCTTTG

pWHE705/C7-TIP2

R7P5_rev2 CCAATGCCACATCCACATTCTAGCTCTAGCAGCCAAAAC

AGAATCATCAG

pWHE705/C7-TIP2


- 91 -

R7P5_rev3 ATCGATAAGCTTACCAATGCCACATCCACATTC pWHE705/C7-TIP2

RBFFF-rev CATCATGAATTCTTACCCGGGGAGCATGTC pIPRBF

RB-fwd ATGATGGAATTCCGCCACCATGTCTAGATTAGATAAAAG pIPRBF

Red_delta_rev ATCGATAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG pWHE705/C1,

pWHE705/C3,

pWHE705/C4

Red_NLS_fwd AAAGAAAAAGAGAAAGGTTGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAG

pWHE705/C1,

pWHE705/C2-TIP2

YFP_NLS2_fwd2 ATGCACTAGTTACACAATGCCAAAGAAAAAGAGAAAGGT

TGG

pWHE705/C2-TIP2

5.1.8.1.2 Oligonukleotide für Sequenzierungen

Name Sequenz von 5‘ nach 3‘

190PU AATGTAAGCGTGACATAAC

CMVForward CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

EF1seq1 GTTATTGTCTCATGAGCGG

HK64 ACGGGCCCTCTAGACTCGAG

IRESPseq GAGAGGGAGTACTCACCCC

M1seq1 GTATGGGCCTCATATACAAC

M1seq2 CCTGATTAGTGGATTGGTGG

mCherryseq1 CGTGAAGCACCCCGCC

mCherryseq2 GAAGCTGAAGGACGGCG

mCherryseq3 GCCCTCGATCTCGAACTC

Met25_seq1 TTCGTGTAATACAGGGTCG

NPseq1 TATGAAAGAATGTGCAACATTC

NPseq2 ATATGAGTGCAGACCGTGC

Npseq3 GATGAGTTCTCTCCTCCAC

Npseq4 AATAGACCCTTTCAGACTGC

Npseq5 TCAGAATGATCAAACGTGGG

NS1seq1 CATGGCCTCTGTACCTGC

Ns1seq2 CAATTGTCCCCTCTTCGG

Ns1seq3 GTAGAGTTTCAGAGACTCG

pDUALseq4 CATCGCGATGGAGCAAAAG

pDUALseq5 GGCCTTGAATTGATCATATGC

Red_delta_rev ATCGATAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG

Red_NLS_fwd AAAGAAAAAGAGAAAGGTTGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAG

TetRseq1 AAGGTTTTTCACTAGAGAAC


- 92 -

5.1.8.1.3 siRNA

siRNA wurde von der Firma Eurofins MWG (Ebersberg (DE)) bezogen und in 1x siMax

Puffer (MWG, hergestellt aus einem 5x Puffer mit RNAse freiem, sterilem Wasser) zu einer

Konzentration von 100 pmol/µl gelöst.

Name Sequenz von 5‘ nach 3‘

siNP-1 UCUGGCGCCAAGCUAAUAA

siNP-2 CAUGGAGACUAUGGAAUCA

uspRNA AGGUAGUGUAAUCGCCUUG

5.1.8.2 Plasmide

Im Falle von Plasmiden, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden, sind nur bei den

Ausgangskonstrukten alle relevanten genetischen Elemente angegeben. Bei abgeleiteten

Konstrukten werden nur die Änderungen im Vergleich zum jeweiligen Ausgangskonstrukt

angeführt.

5.1.8.2.1 Plasmide, die aus anderen Arbeiten verwendet wurden

Plasmid Charakteristika Referenz

pcDNA-NS1 Gen für NS1 aus Influenza A/WSN/1933 unter

transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors,

NeoR unter transkriptioneller Kontrolle des SV40

Promotors,

pBR322 Replikationsursprung, AmpR

Keine Referenz bekannt, zur

Verfügung gestellt von:

Dr. Ervin Fodor,

University of Oxford,

Oxford (UK)

pE1411 Humanadaptiertes Gen für mCherry unter


pUC Replikationsursprung,

AmpR, Zeocin

™R

(Danke, 2010)

pEGFP-N1 Vektor zur Herstellung von EGFP

Translationsfusionen am C-Terminus eines

Proteins, Gen für EGFP unter transkriptioneller

Kontrolle des CMVIE Promotors,

pUC Replikationsursprung, KanR/Neo

R unter

transkriptioneller Kontrolle des SV40 sowie eines

prokaryontischen Promotors

Clontech, Mountain View

(US)

pHH-M Gen für M1 aus Influenza A/FPV/Rostock unter

transkriptioneller Kontrolle eines humanen RNA-

Polymerase I Promotors, AmpR

(Thaa et al., 2009)


- 93 -

pIRESPuro2 Integrationsvektor für die Zellkultur,

Expressionskassette unter transkriptioneller

Kontrolle des CMVIE Promotors, AmpR, Puro

R

Clontech, Mountain View

(US)

pOG44 Expression einer temperatursensitiven

Flp-Rekombinase, AmpR

Invitrogen, Karlsruhe (DE)

pPolI-A/NP/WSN/33 Gen für NP aus Influenza A/WSN/1933 unter

transkriptioneller Kontrolle eines RNA-

Polymerase I Promotors, AmpR

(Fodor et al., 1999)

pSB2K3-BBaE2060 Hefeadaptiertes Gen für mCherry, KanR (Nevozhay et al., 2009)

pTripTTGTK Lentiviraler Vektor, hEF1-HTLV Promotor, AmpR (Flurer, 2010)

pWH1200 p15A Replikationsursprung, KanR (Altschmied et al., 1988)

pWH2101 Gen für TrxA-W-TIP unter transkriptioneller

Kontrolle des tac Promotors,

pMB1 Replikationsursprung, AmpR

(Klotzsche, 2005)

pWH527(B) lacIq, Expression von tetR(B)auf niedrigem

Niveau, p15A Replikationsursprung, KanR

(Klotzsche et al., 2005)

pWH806 pMB1 Replikationsursprung, AmpR (Wissmann et al., 1991)

pWHE120(B) Gen für tTA (TetR(B) wt-FFF) unter


pUC Replikationsursprung, AmpR

(Krueger et al., 2003)

pWHE705 Gen für mYFP(NLS)2-W-TIP unter

transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,

p425Met25 Derivat

(Stöckle, 2008)

pWHE711-WT Gen für tTS (TetR(B) wt-Ssn6) unter

transkriptioneller Kontrolle des cyc1 Promotors,

gfp+ unter transkriptioneller Kontrolle des adh1-

Promotors aus S. pombe, TRE mit 7 x tetO2

stromaufwärts des adh1 Promotors, p416CYC1

Derivat

(Stöckle, 2008)

pcDNA5/FRT Integrationsvektor für das Flp-In™

System,

Expressionskassette unter transkriptioneller

Kontrolle des CMVIE Promotors, FRT, pUC

Replikationsursprung, HygR, Amp

R

Invitrogen, Karlsruhe (DE)

p416CYC1 Expressionskassette unter Kontrolle eines

gekürzten cyc1 Promotors aus S. cerevisiae,

ARSH4/CEN6 und pMB1 Replikationsursprung,

URA3, AmpR

(Mumberg et al., 1995)

p425Met25 Expressionskassette unter Kontrolle des met25

Promotors aus S. cerevisiae, 2µ und pMB1

Replikationsursprung, LEU2, AmpR

(Funk et al., 2002)


- 94 -

5.1.8.2.2 Plasmide, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden

Plasmid Charakteristika

pEF1-HTLV/FRT Abgeleitet von pcDNA5/FRT durch Austausch des CMVIE Promotors gegen den

hEF1-HTLV Promotor

pEF1-HTLV/NP-TIP2 Gen für NP mit C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des

hEF1-HTLV Promotors, pEF1-HTLV/FRT Derivat

pIP/NP-TIP2 Gen für NP mit C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des

CMVIE Promotors, pIRESPuro2 Derivat

pIPRBF Gen für tTA (TetR-FFF) unter transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors,

pIRESPuro2 Derivat

pM1-EGFP Gen für Translationsfusion aus EGFP und M1 unter transkriptioneller Kontrolle

des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat

pM1Mut-EGFP Gen für Translationsfusion aus EGFP und einer M1 Mutante mit den

Aminosäureaustauschen 101RKLKR105 nach 101SNLNS105 (M1Mut) unter

transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat

pNP-EGFP Gen für Translationsfusion aus EGFP und NP unter transkriptioneller Kontrolle


pNPMut-EGFP Gen für Translationsfusion aus EGFP und einer NP Mutante mit den

Aminosäureaustauschen 7KR8 gegen 7AA8 (NPMut) unter transkriptioneller

Kontrolle des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat

pNS4-EGFP Gen für Translationsfusion aus EGFP und NS4 unter transkriptioneller Kontrolle


pNS4Mut-EGFP Gen für Translationsfusion aus EGFP und einer NS4 Mutante mit den

Aminosäureaustauschen R148A, E152A und E153A (NS4Mut) unter

transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat

pWH2101/NP Gen für NP unter transkriptioneller Kontrolle des tac Promotors,

pWH2101 Derivat

pWH2101/NP-TIP2 Gen für das NP-Protein mit C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle

des tac Promotors, pWH2101 Derivat

pWHE705/C1 Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 1: Gen für mCherry

(mcherry(ha)) mit N-terminaler SV40 NLS unter transkriptioneller Kontrolle des

met25 Promotors, pWHE705 Derivat

pWHE705/C2-TIP2 Expressionskassette für eine TIP2 Fusion der Trägerprotein-Variante 2: Gen für

mCherry (mcherry(ha)) mit N- und C-terminaler SV40 NLS, sowie C-terminaler

Fusion von TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,

pWHE705 Derivat


(mcherry(ha)) mit N- terminaler BP SV40 NLS und 10 AS langer

„Linkersequenz“ unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,

pWHE705 Derivat


- 95 -


(mcherry(ha)) mit N- terminaler SV40 NLS und 10 AS langer „Linkersequenz“

unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors, pWHE705 Derivat


(mcherry(ya)) mit N- terminaler BP SV40 A6 NLS und 10 AS langer

„Linkersequenz“ unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,

pWHE705 Derivat


(mcherry(ya)) mit N- terminaler c-Myc NLS und 10 AS langer „Linkersequenz“



(mcherry(ya)) mit N- terminaler SV 40 NLS und 10 AS langer „Linkersequenz“


pWHE705/C7-TIP2 Expressionskassette für die TIP2 Fusion der Trägerprotein-Variante 7: Gen für

mCherry (mcherry(ya)) mit N- terminaler SV 40 NLS und 10 AS langer

„Linkersequenz“ sowie C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des

met25 Promotors, pWHE705 Derivat

Herstellung der Plasmide

Alle Klonierungen erfolgten, wenn nicht anders vermerkt, mit dem E. coli Stamm DH5α.

pWHE705/C1: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N-terminaler SV40 NLS wurde über

eine zweistufige PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte mit dem Plasmid pE1411 als

Matrize und den Oligonukleotiden Red_NLS_fwd und Red_delta_rev. Das hieraus

resultierende, 742 bp lange Amplifikat wurde in der zweiten Stufe N-terminal mit dem

Oligonukleotid YFP_NLS2_fwd2 verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente hierbei erneut

Red_delta_rev. Das 763 bp lange Produkt wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den

gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen,

wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide mCherryseq1, mCherryseq2,

mCherryseq3, Red_delta_rev und Red_NLS_fwd sequenziert.

pWHE705/C2-TIP2: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N- und C-terminaler SV40 NLS

sowie einer für TIP2 kodierenden Sequenz am C-Terminus wurde in einer dreistufigen PCR

hergestellt. Die erste Stufe erfolgte mit dem Plasmid pE1411 als Matrize und den

Oligonukleotiden Red_NLS_fwd und R2P5_rev. Das hieraus resultierende, 758 bp lange

Amplifikat wurde in der zweiten Stufe N- und C-terminal mit den Oligonukleotiden

YFP_NLS2_fwd2 und R2P5_rev2 verlängert. In der dritten Stufe wurde das 810 bp lange

Produkt der zweiten Stufe am C-Terminus mit dem Oligonukleotid R2P5_rev3 verlängert, als


- 96 -

zweites Oligonukleotid diente erneut YFP_NLS2_fwd2. Das in der dritten Stufe erzeugte,

843 bp lange Produkt wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen

geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige

Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids 190PU sequenziert.

pWHE705/C3: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N-terminaler BP SV40 NLS und

10 AS langer „Linkersequenz“ wurde in einer vierstufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe

erfolgte mit dem Plasmid pE1411 als Matrize und den Oligonukleotiden R3fwd1_2 und

Red_delta_rev. Das hieraus resultierende, 755 bp lange Amplifikat wurde in der zweiten,

dritten und vierten Stufe sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R3fwd2_2,

R3-fwd3 und R3-fwd4 verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente hierzu bei allen

Reaktionen Red_delta_rev. Die Amplifikate der zweiten, dritten und vierten Stufe umfassten

788, 818 und 850 bp. Das Produkt der vierten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert

und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu

überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids 190PU sequenziert.

pWHE705/C4: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N-terminaler SV40 NLS und 10 AS

langer „Linkersequenz“ wurde in einer dreistufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte

mit dem Plasmid pE1411 als Matrize und den Oligonukleotiden R4-fwd1 und Red_delta_rev.

Das 755 bp lange Amplifikat aus der ersten Stufe wurde in Stufe zwei und drei mit den

Oligonukleotiden R4-fwd2 und R4-fwd3 auf 777 und 798 bp verlängert. Als zweites

Oligonukleotid diente jeweils Red_delta_rev. Das Produkt der dritten Stufe wurde mit HindIII

und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um

die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids 190PU

sequenziert.

pWHE705/C5: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler BP SV40 A6 NLS und

10 AS langer „Linkersequenz“ wurde in einer vierstufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe

erfolgte mit dem Plasmid pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R5fwd1

und R5delta_rev. In den Stufen zwei, drei und vier wurde das 787 bp lange Amplifikat der

ersten Stufe sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R5fwd2, R5fwd3 und

R5fwd4 auf 816, 844 und 867 bp verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente jeweils

Red_delta_rev. Das Produkt der vierten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in

den gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu

überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids Met25_seq1

sequenziert.


- 97 -

pWHE705/C6: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler c-Myc NLS und 10 AS


mit dem Plasmid pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R5fwd1 und

R5delta_rev. In den Stufen zwei und drei wurde das 787 bp lange Amplifikat der ersten Stufe

sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R6fwd1 und R6fwd2 auf 814 und

840 bp verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente jeweils Red_delta_rev. Das Produkt der

dritten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen

Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit

Hilfe des Oligonukleotids Met25_seq1 sequenziert.

pWHE705/C7: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler SV40 NLS und 10 AS


mit dem Plasmid pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R7fwd1 und

R5delta_rev. In den Stufen zwei und drei wurde das 773 bp lange Amplifikat der ersten Stufe

sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R4fwd2 und R4fwd3 auf 795 und

816 bp verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente jeweils Red_delta_rev. Das Produkt der

dritten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen

Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit

Hilfe der Oligonukleotide Met25_seq1 und 190PU sequenziert.

pWHE705/C7-TIP2: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler SV40 NLS und

10 AS langer „Linkersequenz“ sowie einer TIP2 kodierenden Sequenz am C-Terminus wurde

in einer dreistufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte mit dem Plasmid

pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R7fwd1 und R7P5rev. In der

zweiten und dritten Stufe wurde das 786 bp lange Amplifikat der ersten Stufe am C- und am

N-Terminus sukzessive verlängert. Die zweite Stufe mit den Oligonukleotiden R4fwd2 und

R7P5_rev2 ergab ein 837 bp langes Produkt und die dritte Stufe mit den Oligonukleotiden

R4fwd3 und R7P5_rev3 ergab ein 871 bp umfassendes Amplifikat. Das Produkt der dritten

Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor

pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der

Oligonukleotide Met25_seq1 und 190PU sequenziert.

pM1-EGFP: Die Punktmutation T587G des m1 Gens aus pHH-M wurde über eine

zweistufige PCR revidiert. In der ersten Stufe wurden über zwei parallele PCR Reaktionen

mit den Olignukleotidpaaren M1-XhoI-fwd und M1-GT-rev sowie M1-EcoRI-rev und

M1-GT-fwd jeweils mit dem Plasmid pHH-M als Matrize zwei Produkte erzeugt. Diese

bestanden aus der M1 Sequenz stromaufwärts und stromabwärts der Mutation und


- 98 -

überlappten im Bereich der Mutation mit der korrekten Sequenz um 37 bp. In der zweiten

Stufe werden die beiden 625 und 208 bp umfassenden Produkte der ersten Stufe mit Hilfe

der Oligonukleotide M1-XhoI-fwd und M1-EcoRI-rev zu einem 796 bp großem Amplifikat

fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und EcoRI restringiert und in den gleichermaßen

geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige

Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide M1seq1 und M1seq2 sequenziert.

pM1Mut-EGFP: Das Gen für M1Mut wurde über eine zweistufige PCR nach dem gleichen

Prinzip wie die Revision der Punktmutation für die Konstruktion von pM1-EGFP hergestellt.

Als Matrize für die erste Stufe diente die zweite Stufe aus der Konstruktion von

pM1-EGFP. Die beiden parallelen Reaktionen der ersten Stufe erfolgten mit den

Oligonukleotiden M1-XhoI-fwd und M1-Mut-rev sowie M1-EcoRI-rev und M1-Mut-fwd. Die

350 und 490 bp großen Produkte der ersten Stufe enthielten eine überlappende Sequenz

von 44 bp und wurden in der zweiten Stufe mit den Oligonukleotiden M1-XhoI-fwd und

M1-EcoRI-rev zu einem 796 bp großen Amplifikat fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und

EcoRI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um

die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide

M1seq1 und M1seq2 sequenziert.

pNP-EGFP: Das Gen für NP wurde in einer PCR mit den Oligonukleotiden NP-XhoI-fwd und

NP-EcoRI-rev aus pPolI-A/NP/WSN/33 amplifiziert. Das 1532 bp große Produkt wurde mit

EcoRI und XhoI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1

kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der

Oligonukleotide NPseq1, NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.

pNPMut-EGFP: Das Gen für NPMut wurde in einer zweistufigen PCR hergestellt. Die erste

Stufe erfolgte mit pPolI-A/NP/WSN/33 als Matrize und den Oligonukleotiden NPMut-fwd1

und NP-EcoRI-rev. Das 1515 bp lange Amplifikat der ersten Stufe wurde in der zweiten Stufe

am N-Terminus mit dem Oligonukleotid NPMut-fwd2 auf 1532 bp verlängert. Als zweites

Oligonukleotid diente erneut NP-EcoRI-rev. Das Produkt der zweiten Stufe wurde mit EcoRI

und XhoI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert.

Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide

NPseq1, NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.

pNS4-EGFP: Das Gen für NS4 wurde in einer zweistufigen PCR nach dem gleichen Prinzip

wie die Revision der Punktmutation für die Konstruktion von pM1-EGFP hergestellt. Die

erste Stufe erfolgte mit den Oligonukleotidpaaren NS1-XhoI-fwd und NS3ss-rev sowie


- 99 -

NS1-EcoRI-rev und NS3ss-fwd und dem Plasmid pcDNA-NS1 als Matrizen. Die 549 und

217 bp großen Produkte der ersten Stufe enthielten eine überlappende Sequenz von 31 bp

und wurden in der zweiten Stufe mit den Oligonukleotiden NS1-Xho-fwd und NS1-EcoRI-rev

zu einem 735 bp großen Amplifikat fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und EcoRI restringiert

und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um die Sequenz zu

überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide NS1seq1 und NS1seq2

sequenziert.

pNS4Mut-EGFP: Das Gen für NS4Mut wurde in einer zweistufigen PCR nach dem gleichen

Prinzip wie die Revision der Punktmutation für die Konstruktion von pM1-EGFP hergestellt.

Die erste Stufe erfolgte mit den Oligonukleotidpaaren NS1-Xho-fwd und NS1Mutrev sowie

NS1-EcoRI-rev und NS1Mutfwd und dem Plasmid pcDNA-NS1 als Matrize. Die 494 und

280 bp großen Produkte der ersten Stufe enthielten eine überlappende Sequenz 39 bp und

wurden in der zweiten Stufe mit den Oligonukleotiden NS1-XhoI-fwd und NS1-EcoRI-rev zu

einem 735 bp großen Amplifikat fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und EcoRI restringiert und

in den gleichermaßen verdauten Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen,

wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide NS1seq1 und NS1seq3

sequenziert.

pIPRBF: Das Gen für die tTA Variante TetR-FFF wurde mit den Oligonukleotiden RB-fwd

und RBFFF-rev mit dem Vektor pWHE120(B) als Matrize amplifiziert. Das 561 bp lange

Produkt wurde mit EcoRI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor

pIRESPuro2 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe

der Oligonukleotide CMVForward, IRESPseq, pDUALseq4, pDUALseq5 und TetRseq1

sequenziert.

pEF1-HTLV/FRT: Die Sequenz für den hEF1-HTLV Promotor wurde mit den

Oligonukleotiden EF1a-HTLV-fwd und EF1a-HTLV-rev mit dem Vektor pTripTTGTK als

Matrize amplifiziert. Das 561 bp große Amplifikat wurde per BglII und NheI restringiert und in

den gleichermaßen geschnittenen Vektor pcDNA/FRT kloniert. Um die Sequenz zu

überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids EF1seq1 sequenziert.

pIP/NP-TIP2: Das Gen für NP-TIP2 wurde in einer zweistufigen PCR hergestellt. Die erste

Stufe erfolgte mit pNP-EGFP als Matrize sowie den Oligonukleotiden NP-NheI-fwd und

NP-P5-1. Das 1551 bp lange Produkt der ersten Stufe wurde in der zweiten Stufe C-terminal

mit Hilfe des Oligonukleotids NP-P5-2 auf 1588 bp verlängert. Das Amplifikat der zweiten

Stufe wurde mit NheI und EcoRI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor


- 100 -

pIRESPuro2 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe

der Oligonukleotide NPseq1, NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.

pEF1-HTLV/NP-TIP2: Das Gen für NP-TIP2 wurde mit den Oligonukleotiden CMVForward

und IRESPseq und dem Vektor pIP/NP-TIP2 als Matrize amplifiziert. Das 1824 bp lange

Amplifikat wurde per NheI und NotI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen

Vektor pEF1-HTLV/FRT kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige

Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.

pWH2101/NP: Die Sequenz für NP wurde per PCR mit den Oligonukleotiden NP-XhoI-fwd2

und NP-MfeI-rev sowie dem Vektor pEF1-HTLV/NP-TIP2 als Matrize amplifiziert. Das

1545 bp lange Produkt wurde per MfeI und XhoI restringiert und in den gleichermaßen

geschnittenen Vektor pWH2101 kloniert. Die Klonierung erfolgte mit dem E. coli Stamm

RB791. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der

Oligonukleotide NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.

pWH2101/NP-TIP2: Das Gen für NP-TIP2 wurde per PCR mit den Oligonukleotiden

NP-XhoI-fwd2 und NPP5-MfeI-rev mit dem Vektor pEF1-HTLV/NP-TIP2 als Matrize

amplifiziert. Das 1605 bp lange Produkt wurde per MfeI und XhoI restringiert und in den

gleichermaßen geschnittenen Vektor pWH2101 kloniert. Die Klonierung erfolgte mit dem

E. coli Stamm RB791. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe

der Oligonukleotide NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.


- 101 -

5.1.9 Medien, Lösungen und Puffer

Medien, Lösungen und Puffer wurden mit deionisiertem Wasser angesetzt und bei Bedarf,

wenn nicht anders vermerkt für 25 min bei 121 °C und 2 bar autoklaviert. Lösungen mit

hitzelabilen Substanzen wurden mit einem Filter der Porengröße 0,2 µm steril filtriert. Puffer

für die Gelelektrophorese wurden unsteril verwendet. Die Lagerung von Medien erfolgte bei

4 °C. Lösungen und Puffer wurden, wenn nicht anders vermerkt bei RT gelagert.

5.1.9.1 Medien

5.1.9.1.1 Fakultative Zusätze für Medien

Für Ampicillin, Kanamycin und IPTG wurden Stammlösungen in deionisiertem Wasser

hergestellt und anschließend sterilfiltriert. Hygromycin- und Puromycinlösungen wurden

gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen. Die Konzentrationen der Stammlösungen, die

Endkonzentrationen im Medium und die Lagertemperaturen sind in der unten stehenden

Tabelle angegeben. Die Zugabe der fakultativen Zusätze zum Medium erfolgte unter sterilen

Bedingungen bei Flüssigmedien im kalten Zustand und bei Plattenmedien nach Abkühlen auf

ca. 50 °C (Sambrook, 1989).

Zusatz Stammlösung Lagerung Endkonzentration im Medium

Ampicillin 100 mg/ml

-20 °C

100 mg/l

Kanamycin 50 mg/ml 50 mg/l

Dox 1 mg/ml

1 mg/l für die Zellkultur

0,24 mg/l µM für S. cerevisiae

0,1 mg/l für E.coli

IPTG 60 mM 30, 60, 90 µM

Puromycin 10 mg/ml 0,5; 1,0; 1,5 oder 2,0 mg/l

Hygromycin 50 mg/ml 4 °C

250 mg/l

Methionin 2 mg/ml 3, 10, 150 mg/l

5.1.9.1.2 Bakteriennährmedien

Plattenmedien wurden vor dem Autoklavieren zusätzlich mit 1,2 % (w/v) Agar versetzt.

LB-Medium

10 g/l Trypton

5 g/l Hefeextrakt

10 g/l NaCl


- 102 -

5.1.9.1.3 Hefenährmedien

Hefenährmedien wurden für 15 min bei 121 °C und 2 bar autoklaviert. Plattenmedien wurden

vor dem Autoklavieren zusätzlich mit 1,2 % (w/v) Agar versetzt.

Vollmedium (YPAD)

20 g/l Glukose (w/v)

10 g/l Hefeextrakt

20 g/l Pepton aus Fleisch

100 mg/ml Adenin

5.1.9.1.4 Medien für die Zellkultur

Die Medienkomponenten für die Zellkultur DMEM (4,5 g/l Glucose und L-Glutamin), FKS und

Penicillin/Streptomycin (100x) wurden gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen und unter

sterilen Bedingungen gemischt. Hierbei wurde FKS in einer Endkonzentration von 10 bzw.

15 % und Penicillin/Streptomycin in einer Endkonzentration von 1 % zugegeben.

Minimal-/ Selektionsmedien

2 g/l Yeast Nitrogen Base

5,5 g/l Ammoniumsulfat

55 mg/l Uracil

55 mg/l Tyrosin

55 mg/l Adenin

Aminosäuremix für Hefemedien

2 g/l Arginin

1 g/l Histidin

6 g/l Iso-Leucin

6 g/l Leucin

4 g/l Lysin

1 g/l Methionin

6 g/l Phenylalanin

5 g/l Threonin

4 g/l Tryptophan

Für - Ura Selektionsmedien wurde kein Uracil

zugegeben. Nach dem Autoklavieren wurden

100 ml einer autoklavierten 20 % (w/v)

Glucose-Lösung und 10 ml Aminosäuremix

unter sterilen Bedingungen zugegeben.

Nach Einwaage wurden die Substanzen in

deionisiertem Wasser gelöst, sterilfiltriert und

bei 4 °C gelagert. Für Selektionsmedien

wurden die entsprechenden Aminosäuren

nicht zugegeben.


- 103 -

5.1.9.2 Lösungen und Puffer

5.1.9.2.1 Allgemeine Puffer 10 x PBS

580 mM Na2HPO4

170 mM NaH2PO4

680 mM NaCl

50 x TAE Puffer

2 M Tris Base

1 M Na-Acetat

62,5 mM EDTA

DNA Auftragepuffer

5 % (v/v) 20x TAE

50 % (v/v) Glycerin

0,05 % (w/v) Bromphenolblau

0,05 % (w/v) Xylencyanol

0,2 % (w/v) SDS

0,1 mM EDTA

Agarosegel

1-3 % (w/v) Agarose in

1 x TAE

TE-Puffer

10 mM Tris-HCl, pH 8,0

1 mM EDTA

5.1.9.2.2 Lösungen und Puffer für E. coli

Puffer für die LacZ-Aktivitätsmessung:

5x Z-Puffer

300 mM Na2HPO4

200 mM NaH2PO4

50 mM KCl

5 mM MgCl2

250 mM β-Mercaptoethanol

pH 7,0 (eingestellt mit NaOH)

Lyse-Lösung

1x Z-Puffer

Start-Lösung

1x Z-Puffer

0,8 mg/ml ONPG

Stop-Lösung

1 M Na2CO3

5.1.9.2.3 Lösungen und Puffer für S. cerevisiae

DAPI-Färbelösung

Lösung mit einer DAPI Konzentration von 5 mg/ml in deionisiertem Wasser, Lagerung bei

-20 °C.

Transformation von S. cerevisiae

Träger-DNA: Für die Herstellung der Träger DNA wurden 100 mg Heringssperma-DNA in

deionisiertem Wasser zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml gelöst. Diese wurde

anschließend bei 95 °C für 15 min inkubiert und für 15 min bei Raumtemperatur abgekühlt.

Die Lösung wurde 20 x durch eine 20 ml Spritze mit einer dünnen Kanüle (Nr. 1) gedrückt,

um über die entstehenden Scherkräfte kurze DNA-Fragmente herzustellen. Nach einer

erneuten Inkubation für 15 min bei 95 °C und Abkühlung bei RT wurden 0,5 ml Aliquots

hergestellt, die bei -20 °C gelagert wurden.


- 104 -

5.1.9.2.4 Lösungen und Puffer für die Zellkultur

Messung der Luciferaseaktivität

Lysepuffer

25 mM Tris Phosphat pH 7,8

2 mM EDTA

5 % Glycerin

1 % Triton X-100

2 mM DTT (frisch zugegeben)

Messpuffer

100 mM KH2PO4/K2HPO4 pH 7,8

15 mM MgSO4

5 mM ATP

Luciferinlösung

0,25 mM D-Luciferin (in Messpuffer)

Puffer und Lösungen für die LacZ in situ Färbung

Färbelösung (50 ml)

1ml 100 mg/ml X-Gal

106 mg K4(Fe(CN)6) x (H2O)3

82 mg K3(Fe(CN)6)

48 ml Waschlösung

Waschlösung

2 mM MgCl2

0,2 % NP 40

0,1 M Phosphatpuffer

Fixierlösung (frisch angesetzt)

0,2 % Glutaraldehyd

5 mM EGTA pH 7,3

2 mM MgCl2

0,1 M Phosphatpuffer

0,1 M Phosphatpuffer pH 7,3 (500 ml)

115 ml 0,1 M NaH2PO4

385 ml 0,1 M Na2HPO4

Höchst 33342 Färbelösung

Lösung mit einer Höchst 33342 Konzentration von 1 mM in deionisiertem Wasser, Lagerung

bei -20 °C

5.2 Methoden

5.2.1 Nukleinsäure Methoden

5.2.1.1 Plasmidisolierung aus E. coli

Die Isolierung des jeweiligen Plasmides erfolgte aus dem Zellniederschlag von 4 bzw. 100 ml

Übernachtkultur mit dem NucleoSpin® Extract II bzw. dem Nucleobond® Xtra Midi Kitsystem

nach Angaben des Herstellers. Die Anzucht der Zellen erfolgte wie unter 5.2.2.1

beschrieben.


- 105 -

5.2.1.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA

Die Restriktionsspaltung mit Endonukleasen erfolgte unter den vom Hersteller empfohlenen

Reaktionsbedingungen. Die eingesetzte Enzymmenge und Inkubationsdauer richtete sich

nach der eingesetzten DNA-Menge, der Anzahl an vorhandenen Schnittstellen und dem

Volumen des Gesamtansatzes. Die benötigten Einheiten (U) des Enzyms wurden mit der

unten abgebildeten Formel berechnet.

5.2.1.3 Dephosphorylierung von 5’-DNA-Enden

Um die Religation von linearisierten Vektoren mit kompatiblen Enden zu verhindern, wurden

die Phosphatgruppen an deren 5’-Enden mit der „Antarctic Phosphatase“ abgespalten. Die

Durchführung erfolgte nach den Vorgaben des Herstellers.

5.2.1.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

PCR mit gereinigter DNA als Matrize

Für die PCR wurden entsprechende Komponenten, wie in der unten angeführten Tabelle

angegeben, nach Ansatz A für Plasmid-DNA und nach Ansatz B für chromosomale DNA

eingesetzt. Die Hybridisierungstemperatur richtete sich nach den verwendeten Oligo-

nukleotiden und die Extensionsdauer wurde in Abhängigkeit von der Länge des Amplifikats

nach Vorgaben des Herstellers der Polymerase berechnet. DMSO und HF Puffer sind vom

Hersteller der Polymerase geliefertes Zubehör.

Ansatz A: Plasmid-DNA (Gesamt 50 µl) Ansatz B: Chromosomale DNA (Gesamt 100 µl)

300 ng Matrize 1000 ng Matrize

10 pmol Oligonukleotid 1 100 pmol Oligonukleotid 1

10 pmol Oligonukleotid 2 100 pmol Oligonukleotid 2

1 µl dNTPs (10mM) 1 µl dNTPs (10mM)

0,5 µl Phusion Polymerase (2000 U/ml) 4 µl DMSO 100 %

10 µl Puffer HF (5x) 2,5 µl Phusion Polymerase (2000 U/ml)

ad 50 µl deionisiertes Wasser 20 µl Puffer HF (5x)

ad 100 µl deionisiertes Wasser

U Units l1 λ-Phagen Größe (bp) l2 Plasmidgröße (bp) n1 Schnittstellen im λ-Phagen n2 Schnittstellen im Plasmid


- 106 -

Programm für den Thermocycler

Schritt Dauer Temperatur

Deckelheizung

8 110 °C

Initiale Denaturierung 3 min 96 °C

25 Z

ykle

n

Denaturierung 30 s 94 °C

Hybridisierung 30 s 48 °C - 56 °C

Extension 30 s - 3 min 72 °C

Finale Extension 3 min 72 °C

Lagerung 8 4 °C

5.2.1.5 Gelelektrophorese

Die Analyse der Größe von DNA-Fragmenten erfolgte mittels der DNA-Gelelektrophorese

nach Sambrook (Sambrook, 1989). Dazu wurden je nach Fragmentgröße 1, 2 oder 3 %

Agarosegele verwendet. Die Agarose wurde auf rechteckige Kunststoffplatten bis zu einer

Schichtdicke von 3 - 4 mm gegossen und vor dem Erstarren mit Hilfe eines Kunststoff-

kammes Taschen ausgespart. Nach vollständigem Erkalten der Agarose wurde der Kamm

entfernt und die Platte mit dem Agarosegel in eine mit Puffer gefüllte horizontale

Gelektrophoresekammer gelegt. Anschließend wurde die mit DNA-Auftragepuffer (DAP)

versetzte DNA-Lösung in die Taschen pipettiert. Um die Fragmentgrößen abschätzen zu

können, wurde in einer Tasche zusätzlich ein DNA-Größenstandard aufgetragen. Die

Auftrennung erfolgte für etwa 1 h bei 100 V. Um die DNA anzufärben, wurden die Gele für

10 min in einer ethidiumbromidhaltige Lösung (5 μg/ml) inkubiert und anschließend unter

UV-Licht (λ = 254 nm) fotografiert.

5.2.1.6 Präparative Reinigung von DNA Fragmenten

Zur präparativen Reinigung von DNA Fragmenten wurden diese elektrophoretisch

aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt (Vorgehen siehe unter 5.2.1.5). Die

Visualisierung erfolgte auf einem UV-Schirm mittels Bestrahlung mit langewelligem UV-Licht

(λ = 366 nm). Die Bande der entsprechenden Größe wurde mit einem Skalpell

ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des NucleoSpin® Extract II Kitsystems gemäß den

Angaben des Herstellers aus der Agarose eluiert.


- 107 -

5.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation kompatibler Enden von DNA-Fragmenten erfolgte mit Hilfe der T4 DNA-Ligase.

Die Reaktionsbedingungen entsprachen den Vorgaben des Herstellers. Das Insertions-

fragment wurde in Bezug zur Vektor-DNA in dreifachen molaren Überschuss eingesetzt. Die

Ligation erfolgte für 1 h bei RT. Zur Kontrolle wurden Ansätze ohne Insert sowie ohne Insert

und Ligase durchgeführt, um den Anteil der rückligierten bzw. ungeschnittenen Plasmid-DNA

zu ermitteln.

5.2.1.8 Sequenzierung von DNA

Sequenzierungen wurden von der Firma GATC (Konstanz (DE)) mittels der Kettenabbruch-

Methode mit fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden nach Sanger durchgeführt (Sanger

et al., 1977). Die Ergebnisse der Sequenzierungen wurden mit dem Programm DNASTAR

Lasergene® SeqMan Pro ausgewertet.

5.2.1.9 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren

Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde mit Hilfe des NanoDrop® ND-1000

Spectrophotometers nach Vorgaben des Herstellers bestimmt.

5.2.2 Arbeiten mit E. coli

5.2.2.1 Anzucht von Bakterien

Anzucht in Flüssigmedium

Die Bakterien wurden in dem gewünschten Volumen an Flüssigmedium (gegebenenfalls

versetzt mit entsprechenden Antibiotika) in Schikanekolben oder Reagenzgläsern bei

gewünschter Temperatur auf einem Kulturschüttler inkubiert (200 - 300 Upm). Vorkulturen

wurden bei 37 °C für 10 - 16 h angezogen. Für Hauptkulturen wurde das Flüssigmedium

1:100 aus einer Vorkultur angeimpft, bis zu einer oD600 von 0,4 - 0,5 inkubiert und die Zellen

anschließend durch Zentrifugation (3400g, 10 min, RT) geerntet.

Anzucht auf Festmedium

Vereinzelungen oder Transformationsansätze von E. coli wurden auf agarhaltigem Medium

(gegebenenfalls versetzt Antibiotika) ausgestrichen bzw. ausplattiert und bei 37 °C für

10 - 16 h inkubiert. Bewachsenen Petrischalen wurden bei 4 °C aufbewahrt.


- 108 -

5.2.2.2 Herstellung Calciumchlorid-kompetenter E. coli Zellen

Die Herstellung Calciumchlorid (CaCl2)-kompetenter Zellen wurde nach (Hanahan, 1983) wie

im Folgenden beschrieben durchgeführt. 4 ml LB-Flüssigmedium in einem Reagenzglas

wurden mit einer frischen E. coli Einzelkolonie beimpft und bei 37 °C über Nacht auf einem

Kulturschüttler inkubiert (Vorkultur). Für die Hauptkultur wurden 2 x 100 ml LB-Flüssig-

medium in 300 ml Schikanekolben aus der Vorkultur 1:100 angeimpft und bis zu einer oD600

von 0,6 bei 37 °C inkubiert. Zum Abstoppen des Wachstums wurden die Zellen 10 min auf

Eis aufbewahrt. Anschließend erfolgte die Ernte in 50 ml PET-Röhrchen (10 min, 3400g,

4 °C). Die Zellniederschläge wurden jeweils 50 ml 0,1 M steriler und eisgekühlter CaCl2-

Lösung resuspendiert, 20 min auf Eis gestellt und unter gleichen Bedingungen nochmals

zentrifugiert. Die daraus resultierenden Niederschläge wurden in 10 ml eiskalter 0,1 M

CaCl2-Lösung aufgenommen und die beiden Suspensionen anschließend vereinigt. Vor

weiterer Verwendung wurden die Zellen mindestens eine Stunde auf Eis gelagert. Zur

dauerhaften Aufbewahrung bei -80 °C wurden die Zellen auf eine Endkonzentration von

15 % Glycerin eingestellt, in 0,5 ml Aliquots portioniert und in flüssigem Stickstoff schock-

gefroren.

5.2.2.3 Transformation von E. coli

Die Transformation wurde nach (Sambrook, 1989) durchgeführt. CaCl2-kompetente Zellen

wurden auf Eis aufgetaut und je 200 µl der Zellsuspension mit 100 - 200 ng DNA oder einem

Ligationsansatz versetzt. Nach 60-minütiger Inkubation bei 4 °C auf Eis erfolgte ein

Hitzeschock für 90 sec auf 42 °C. Im Anschluss wurden jeweils 800 µl LB Medium

zugegeben und die Zellen bei 37 °C im Wasserbad für 1 h inkubiert. Von diesen Ansätzen

wurden Aliquots von 100 µl auf Petrischalen mit LB-Selektionsmedium ausplattiert. Die

restliche Suspension wurde für 3 min bei 3500g bei RT abzentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Pellet in 100 µl deionisiertem Wasser resuspendiert. Die Suspension

wurde im Anschluss auf Petrischalen mit LB-Selektionsmedium ausplattiert.

5.2.2.4 Messung der β-Gal-Aktivität in E. coli im 96-Napfplatten Format

Prinzip der Messung

Das Enzym β-Galaktosidase (β-Gal) katalysiert die Spaltung des farblosen Substrats ONPG

in Galaktose und gelbes o-Nitrophenol. Die β-Gal-Aktivität korreliert mit der Konzentration

von o-Nitrophenol im Reaktionsansatz, die photometrisch über die Absorption bei der

Wellenlänge λ = 420 nm quantifiziert werden kann (Miller, 1972; Griffith et al., 2002).


- 109 -

Experimentelles Vorgehen

Für die Messung wurde der E. coli Stamm WH207(λtet50) wie unter 5.2.2.3 beschrieben mit

den entsprechenden Plasmiden transformiert und auf LB Agarplatten mit Selektionsmedium

ausgestrichen.

Vorkultur: Die Anzucht der Vorkultur erfolgte in einer sterilen 2,2 ml 96-Tiefnapfplatte in

jeweils 1 ml LB-Selektionsmedium ohne IPTG oder Dox. Die Vertiefungen wurden mittels

einer sterilen, gelben Pipettenspitze mit einer Einzelkolonie beimpft. Die 96-Tiefnapfplatte

wurde anschließend mit einer wasserdichten, atmungsaktiven Folie verschlossen und bei

37 °C und 800 Upm für 12 - 16 h inkubiert (Inkubator für 96-Napfplatten) Die Vorkultur

erreichte innerhalb dieses Zeitraums die stationäre Wuchsphase.

Hauptkultur: Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte ebenfalls in einer sterilen 2,2 ml

96-Tiefnapfplatte in 1 ml LB Selektionsmedium mit entsprechenden Konzentrationen an

IPTG oder Dox. Die Hauptkultur wurde mit 5 µl der Vorkultur beimpft und ebenfalls mit

atmungsaktiver Folie versiegelt. Das Beimpfen der Hauptkultur erfolgte wie alle folgenden

Pipettierschritte mit Hilfe einer automatischen 8-Kanalpipette. Die Inkubation erfolgte unter

den gleichen Bedingungen wie für die Vorkultur beschrieben. Beim Erreichen einer oD600 von

0,4 - 0,5 wurde die 96-Tiefnapfplatte für 10 min in Eiswasser gestellt, um das Wachstum der

Zellen zu unterbrechen. Von jeder Vertiefung wurden anschließend 200 µl in eine 96-Napf-

Flachbodenplatte überführt und die oD595 der Zellsuspensionen im TECAN Plattenlesegerät

bestimmt.

Lyse der Zellen: Parallel zur Messung der oD595 der Zellsuspensionen wurden die

Vertiefungen einer 1,2 ml 96-Tiefnapfplatte jeweils mit 340 µl Lyselösung und 50 µl

Chloroform befüllt. In diese 96-Tiefnapfplatte wurden anschließend von der Hauptkultur

jeweils 60 µl Suspension transferiert. Anschließend erfolgte die Zelllyse durch zweiminütiges

Schütteln auf einem Reaktionsgefäßeschüttler. Diese Zellysate wurden im Anschluss für

30 min bei 28 °C inkubiert, um die Zellysate auf die Messtemperatur von 28 °C zu

äquilibrieren und eine möglichst vollständige Trennung zwischen Chloroform und der

wässrigen Phase zu ermöglichen.

Start und Stop der β-Gal-Reaktion, Bestimmung der β-Gal-Aktivität: Parallel zur Lyse

der Zellen wurden die Vertiefungen einer 96-Napf-Flachbodenplatte mit 270 µl Start-Lösung

befüllt und ebenfalls für 30 min bei 28 °C äquilibriert. Alle Schritte vom Start bis zum

Abstoppen der β-Gal-Reaktion erfolgten bei einer konstanten Temperatur von 28 °C im

Konstantraum. Der Start der β-Gal-Reaktion erfolgte durch Zugabe von 50 µl des Zelllysates

in die Vertiefungen der mit der Start-Lösung befüllte 96-Napf-Flachbodenplatte. Nach


- 110 -

Durchmischung der Reaktionsansätze durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren wurden

160 µl der Lösung in eine zweite 96-Napf-Flachbodenplatte übertragen. Diese zweite Platte

wurde nach vollständiger Befüllung mit einer Noppenfolie versiegelt, um eine Diffusion des

o-Nitrophenols zu verhindern. Die Reaktionen in der ersten 96-Napf-Flachbodenplatte

wurden nach 10 min und die der zweiten 96-Napf-Flachbodenplatte nach 120 min durch

Zugabe von 75 µl Stop-Lösung terminiert. Unmittelbar nach dem Abstoppen der Reaktionen

wurde die Absorption der Reaktionsansätze bei den Wellenlängen λ = 420 und 550 nm im

TECAN Plattenlesegerät bestimmt. Aus diesen Werten sowie der vorher bestimmten oD595,

der Reaktionszeit und dem Reaktionsvolumen wurde die β-Gal-Aktivität in „Miller-Units“

berechnet.

5.2.3 Arbeiten mit S. cerevisiae

5.2.3.1 Anzucht von S. cerevisiae

Anzucht auf Festmedium

Vereinzelungen oder Transformationsansätze von S. cerevisiae wurden auf agarhaltigem

Medium (YPAD oder Minimalmedium) ausgestrichen bzw. ausplattiert und bei 28 °C für

24 - 72 h in einer feuchten Kammer inkubiert. Bewachsenen Petrischalen wurden bei 4 °C

aufbewahrt.

5.2.3.2 Herstellung Lithiumacetat-kompetenter S. cerevisiae Zellen

Kompetente Hefezellen wurden nach (Gietz et al., 1992) hergestellt. Hierzu wurde eine

Übernachtkultur mit 10 ml YPAD in einem 100 ml Schikanekolben beimpft und für 20 h bei

28 °C und 180 Upm auf dem Kulturschüttler inkubiert. Aus dieser Vorkultur wurde eine

Hauptkultur mit 50 ml YPAD in einem 300 ml Schikanekolben auf eine oD600 von 0,125

angeimpft. Die Inkubation der Hauptkultur erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie für

die Vorkultur bis eine oD600 von ca. 0,5 erreicht wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden die

Zellen durch Zentrifugation in PET-Röhrchen geerntet (5 min, 3000g) und der Überstand

wurde verworfen. Der Zellniederschlag wurde anschließend in 25 ml deionisiertem Wasser

resuspendiert und unter den gleichen Bedingungen nochmals abzentrifugiert. Der

Zellniederschlag wurde in 1 ml 100 mM Lithiumacetat (LiAc)-Lösung resuspendiert, in ein

1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß transferiert und für 10 s (Biofuge pico) abzentrifugiert. Das

U Miller-Units oD420 Absorption von o-Nitrophenol oD550 Absorption der Zelltrümmer oD595 Zelldichte der Kultur 1,754 Korrekturfaktor für die Lichtstreuung durch Zelltrümmer V Probenvolumen in ml Δt Reaktionszeit in min

(Zeitdifferenz zwischen Reaktionsstart und -stop)


- 111 -

Pellet wurde mit einer 100 mM LiAc-Lösung auf ein Lösungsvolumen von 0,5 ml (nach

Skalierung Eppendorf Reaktionsgefäß) aufgefüllt und erneut resuspendiert. Die so erhaltene

Zellsuspension wurde in 50 µl Aliquots portioniert und im Kryocontainer in der -80 °C

Gefriertruhe eingefroren.

5.2.3.3 LiAc-Transformation

Die Transformation von S. cerevisiae erfolgte mit der LiAc-Methode nach (Gietz et al., 1992).

Für die Transformation wurden 50 µl kompetente Hefezellen 10 s (Biofuge pico)

abzentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Pipette abgezogen und der Zellniederschlag

mit 350 µl Transformationsansatz durch vortexen vermischt. Der Transformationsansatz

setzte sich wie folgt zusammen:

240 µl 50 % PEG 3350

36 µl 1 M LiAc

5 µl Träger-DNA

1.000 ng Plasmid-DNA pro zu transformierendem Konstrukt

ad 350 µl deionisiertes Wasser

Anschließend wurde der Ansatz erst für 15 min bei 30 °C und dann für 20 min bei 42 °C

inkubiert und erneut für 10 s (Biofuge pico) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen

und das Pellet in 300 µl deionisiertem Wasser resuspendiert. Jeweils 100 µl dieser

Suspension wurden auf Petrischalen mit Selektionsmedium ausplattiert.

5.2.3.4 DAPI-Färbung

Die Hefezellen wurden von einer Petrischale mit Festmedium abgeschabt und in

Reagenzgläsern mit 5 ml eines entsprechenden Selektionsmediums für 20 h bei 28 °C auf

dem Rollinkubator inkubiert. Von dieser Kultur wurden 1,8 ml in einen 100 ml

Schikanekolben mit 20 ml frischem Selektionsmedium überimpft und für 7 h bei 28 °C auf

dem Kulturschüttler inkubiert. Von dieser Kultur wurde 1 ml entnommen, in ein 1,5 ml

Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und für 30 s bei 1000g abzentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und die pelletierten Hefezellen wurden in 1 ml deionisiertem Wasser

resuspendiert, erneut abzentrifugiert und wiederum in 1 ml deionisiertem Wasser

resuspendiert. Zu der Suspension wurden 3 µl DAPI Färbelösung gegeben und durch

vortexen gemischt. Nach einer Inkubation für 5 min wurde der nicht gebundene Farbstoff

durch zwei Zyklen Zentrifugation (30 s, 1000g) und Resuspension (in 1 ml deionisiertem

Wasser) entfernt. Nach erneuter Zentrifugation unter denselben Bedingungen wurde der

Zellniederschlag in 50 µl deionisiertem Wasser resuspendiert und die gefärbten Zellen im

Fluoreszenzmikroskop analysiert (siehe unter 5.2.3.5).


- 112 -

5.2.3.5 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von S. cerevisiae

Um Hefezellen im Mikroskop fotografieren zu können, müssen sie auf dem Objektträger

immobilisiert werden. Ohne Immobilisierung ist die Aufnahme einer Folge desselben

Bildausschnittes mit unterschiedlichen Einstellungen aufgrund der ständigen Bewegung der

Zellen im Flüssigkeitsstrom nicht möglich. Hierzu wurde auf den Objektträger eine dünne

Schicht Agarose (2 % in deionisiertem Wasser) pipettiert und sofort das Deckglas aufgesetzt.

Als Abstandshalter zwischen Deckglas und Objektträger dienten hierbei zwei Stecknadeln

(Abb. 36). Nach dem Erstarren der Agarose wurde das Deckglas mit Hilfe der Stecknadeln

abgehoben und 5 - 15 µl der entsprechenden Hefesuspension auf die Agarose pipettiert. Die

fluoreszenzmikroskopische Analyse erfolgte mit einem Mikroskop des Typs Axio Scope A1

mittels eines 100x Objektiv mit Öl-Immersion. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgte mit

entsprechenden Dioden.

Abb. 36: Immobilisierung von Hefezellen für die Mikroskopie

Zwischen Deckglas und Objektträger befindet sich

eine dünne Schicht 2 % Agarose. Stecknadeln

dienen als Abstandshalter.

5.2.3.6 Erstellung von Wuchskurven

S. cerevisiae wurde mit den entsprechenden Plasmiden wie unter 5.2.3.3 beschrieben

transformiert und auf Festmedien ausgestrichen. Nach einer Inkubation von 48 h bei 28 °C

wurden 250 µl deionisiertes Wasser auf die bewachsene Petrischale pipettiert und die

Hefezellen mit Hilfe einer Glaspipette und eines Drehtellers gleichmäßig auf der Petrischale

verteilt. Die so behandelte Kultur wurde für weitere 24 h bei 28 °C inkubiert. Durch diese

Behandlung entstand ein gleichmäßiger Rasen einer homogenen Zellpopulation. Von den

Agarplatten wurde mit einer sterilen Glaspipette eine ca. 20 µl entsprechende Menge

abgeschabt und in 10 ml Selektionsmedium in einem 100 ml Schikanekolben resuspendiert.

Diese Vorkultur wurde für 24 h bei 28 °C und 180 Upm auf dem Kulturschüttler inkubiert.

Innerhalb dieses Zeitraums wurde die stationäre Wachstumsphase erreicht. Ausgehend von

dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur mit 100 ml Selektionsmedium in einem 300 ml

Schikanekolben auf eine oD600 von 0,1 beimpft. Die Inkubation der Hauptkultur erfolgte unter

den gleichen Bedingungen wie für die Vorkultur. In regelmäßigen Zeitabständen wurde 1 ml

der Hauptkultur entnommen und die entsprechende oD600 bestimmt.

Objektträger

Deckglas

Stecknadeln

Agarose


- 113 -

5.2.3.7 Fluoreszenzquantifizierung

Die Herstellung einer homogenen, mit den entsprechenden Plasmiden transformierten

Zellpopulation erfolgte wie unter 5.2.3.6 beschrieben. Von dieser Kultur wurde mit Hilfe einer

sterilen gelben Pipettenspitze eine ca. 20 µl entsprechende Menge abgeschabt und in einem

Reagenzglas mit 5 ml Selektionsmedium (optional mit Zusätzen) resuspendiert. Nach einer

20-stündigen Inkubation bei 28 °C auf dem Rollinkubator wurden 1,8 ml der Kultur in einen

100 ml Schikanekolben mit 20 ml frischen, identischem Selektionsmedium überimpft. Nach

7 h auf dem Reaktionsgefäßschüttler bei 28 °C und 180 Upm lag die oD600 bei 0,6 - 0,9. Zu

diesem Zeitpunkt wurden 10 ml der Kultur entnommen, in ein PET-Röhrchen überführt, für

5 min bei 1000g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Zellniederschlag wurde in

10 ml 1 x PBS resuspendiert, erneut bei 1000g für 5 min zentrifugiert und der Überstand

verworfen. Die pelletierten Hefezellen wurden in 5 ml 1 x PBS resuspendiert und die oD600

der Suspension bestimmt. Für die Fluoreszenzmessung wurden zwei oD600 Einheiten

eingesetzt und auf 2 ml Gesamtvolumen mit 1 x PBS aufgefüllt (oD600 der Suspension für die

Fluoreszenzmessung = 1). Die Zellsuspension wurde jeweils vor der Messung mit Hilfe eines

Tablettenrührstabes in der Küvette für 30 s gemischt. Die Quantifizierung der Fluoreszenz

erfolgte in einem Spektralfluorimeter des Typs Fluorolog 3. Die entsprechenden

Einstellungen des Spektralfluorimeters finden sich in der unten stehenden Tabelle.

Einstellungen des Spektralfluorimeters:

Anregungswellenlänge GFP+: λex = 491 nm

Detektionswellenlänge GFP+: λem = 512 nm

(Scholz et al., 2000)

Spaltbreite: 1,1 mm

(Messung in 3.1.4.3)

oder Spaltbreite 2,0 mm

(Messung in 3.1.3.4)

Anregungswellenlänge mCherry: λex = 587 nm

Detektionswellenlänge mCherry: λem = 610 nm

(Shaner et al., 2004)

Maximal drei Versuche

Standardabweichung: 1,5 %

Integrationszeit: 5 s

Detektorspannung: 950 V

5.2.4 Arbeiten in der Zellkultur

Alle Arbeiten in der Zellkultur wurden, wenn nicht anders vermerkt, unter einer Sterilbank

durchgeführt. Bei den beiden verwendeten Zelllinien handelte um die jeweils adhärent

wachsenden Zelllinien HeLa und HEK293. Die verwendeten Medien und Lösungen wurden

entweder gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen oder autoklaviert. Die Inkubationsschritte

erfolgten, wenn nicht anders vermerkt, bei 37 °C unter 7,5 % CO2 Atmosphäre.


- 114 -

5.2.4.1 Kultivierung von HeLa und HEK293 Zellen

Die Kultivierung von humanen Zelllinien erfolgte in Gewebekulturschalen (∅ 10 bzw. 15 cm)

in 10 bzw. 20 ml DMEM (10 % FKS). Je nach Wuchsgeschwindigkeit wurden die Kulturen im

Zwei- bis Dreitagesrhythmus bei Erreichen von 80 - 90 % Konfluenz abgelöst, verdünnt und

in frisches Medium umgesetzt. Hierzu wurde das Zellkulturmedium mittels einer

Membranpumpe abgesaugt, die Zellen einmalig mit 10 ml PBS gewaschen und

anschließend mit 5 ml Trypsin/EDTA für 10 min inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden in

ein 15 ml PET-Röhrchen überführt und bei RT für 5 min bei 100g sedimentiert. Nach

Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in 10 ml DMEM (10 % FKS) resuspendiert

und jeweils 0,5 - 3 ml dieser Suspension auf eine frische Zellkulturschale mit 10 ml DMEM

(10 % FKS) überführt.

5.2.4.2 Kryokonservierung und Auftauen von HeLa und HEK293 Zellen

Für die Kryokonservierung wurden pro Kryoröhrchen mindestens 5 x 106 Zellen eingesetzt.

Hierzu wurden die Zellen wie unter 5.2.4.1 beschrieben, kultiviert und geerntet. Allerdings

erfolgte hier die Resuspension nicht in DMEM, sondern in 1 ml Einfriermedium (90 % FKS,

10 % DMSO). Anschließend wurde die Suspension in Kryoröhrchen überführt und in einem

Kryocontainer im -80 °C Gefrierschrank eingefroren. Die Lagerung der Kryokulturen erfolgte

anschließend bei -80 °C oder im Stickstofftank. Um die Kulturen wieder aufzutauen, wurden

die Kryoröhrchen im Wasserbad auf 37 °C erwärmt und die Zellsuspension wurde

anschließend in 10 ml DMEM (10 % FKS) in einer 10 cm Schale überführt. Nach 24 h wurde

das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden einmalig mit PBS gewaschen und

mittels 3 ml Trypsin/EDTA bei 37 °C für 10 min abgelöst. Alle weiteren Schritte entsprachen

dem unter 5.2.4.1 beschriebenen Vorgehen.

5.2.4.3 Zellzählung

Die Bestimmung des Titers einer Zellsuspension erfolgte mittels eines Zellzählers. Die

Zellzählung erfolgte stets mit Zellen die frisch geerntet, abzentrifugiert und in 10 ml DMEM

(10 % FKS) resuspendiert wurden (Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1). Von der so

hergestellten Suspension wurde 1 ml in ein Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und die

Zellen für 5 min bei 300g sedimentiert. Nach Abziehen des Überstandes wurde das Zellpellet

in 1 ml Elektrolyt (1 % NaCl) resuspendiert und in einem Zählgefäß mit weiteren 9 ml

Elektrolyt gemischt. Der Titer dieser Suspension wurde im Zellzähler (100 µm Kapillare)

bestimmt und auf die ursprüngliche Zellsuspension umgerechnet. Die hier beschriebenen

Schritte erfolgten ab der Umfüllung in ein Eppendorf Reaktionsgefäß unter unsterilen

Bedingungen. Die für die Zählung verwendeten Zellen wurden im Anschluss verworfen.


- 115 -

5.2.4.4 Stabile Transfektion von HeLa Zellen

Für die stabile Transfektion wurden die Zellen in 6-Napfplatten umgesetzt. Hierzu wurde eine

Zellsuspension hergestellt und der Titer bestimmt (Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1 bzw.

5.2.4.3). Für die Aussaat der Zellen wurde die Suspension auf 1 x 105 Zellen/ml eingestellt

und 2 ml pro Vertiefung einer 6-Napfplatte ausgebracht. Nach 24-stündiger Inkubation

erfolgte die Transfektion. Als Kontrolle dienten hierbei Zellen der Ausgangszelllinie, die einer

Leertransfektion ohne Zugabe von DNA unterzogen wurden. Der Ablauf der Transfektion

erfolgte in Abhängigkeit vom transfizierten Konstrukt:

Stabile Transfektion von pIPRBF

Das Plasmid pIPRBF wurde mit dem Restriktionsenzym AhdI geschnitten und das

linearisierte Produkt gelelektrophoretisch gereinigt (Vorgehen beschrieben unter 5.2.1.6). Pro

Transfektionsansatz wurde 1 µg der auf diese Weise hergestellten DNA mit 12,5 µl

OPTI-MEM® gemischt und zu einer Lösung aus 2 µl Lipofektamine™ in 18 µl OPTI-MEM®

gegeben. Nach einer Inkubation von 20 min bei RT wurde diese Lösung mit 1 ml OPTI-

MEM® vermischt, das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt und durch die

Transfektionslösung ersetzt. Nach Inkubation für 4 h wurde die Transfektionsreaktion durch

Zugabe von 1 ml DMEM (20 % FKS) mit oder ohne Zugabe von Dox (2 mg/l) terminiert.

Nach Inkubation für 24 h wurde das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden einmalig

mit PBS gewaschen und für 10 min mit 600 µl Trypsin inkubiert. Die abgelösten Zellen

wurden auf 15 cm Schalen mit 20 ml DMEM (10 % FKS) ausgebracht und für 24 h inkubiert.

Anschließend wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und gegen Selektionsmedium

bestehend aus DMEM (10 % FKS) mit entsprechender Konzentration an Puromycin

(0,5; 1,0; 1,5 oder 2,0 µg/ml) je einmal in Ab- und Anwesenheit von 1 mg/l Dox ausgetauscht.

Die Selektion erfolgte für 14 Tage wobei das Zellkulturmedium im 48 h Rhythmus gegen

neues Selektionsmedium ausgetauscht wurde. Innerhalb dieses Zeitraums wuchsen

resistente Klone zu Zellhaufen mit 1 - 2 mm Durchmesser heran. Diese wurden mit Trypsin

abgelöst und jeder Klon in eine mit 1 ml DMEM (15 % FKS) angefüllte Vertiefung einer 24-

Napfplatte überführt (Isolation der Klone). Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Medium

von den Klonen abgesaugt und jeweils gegen Selektionsmedium aus DMEM (10 % FKS) mit

0,5 mg/l Puromycin ausgetauscht. Während der ca. 14 Tage dauernden Expansionsphase

wurden die Zellen bei Erreichen von 80 - 90 % Konfluenz von 24-Napfplatten über

6-Napfplatten auf 10 cm und 15 cm Schalen umgesetzt. Als Zellkulturmedium diente hier

jeweils Selektionsmedium aus DMEM (10 % FKS) mit 0,5 mg/l Puromycin.


- 116 -

Stabile Transfektion von pEF1-HTLV/NP-TIP

Für die chromosomale Integration über das Flp-In™ System (Invitrogen) wurden die Zellen

gleichzeitig mit den Plasmiden pEF1-HTLV/NP-TIP2 und pOG44 im molaren Verhältnis von

1:9 transfiziert. Hierfür wurden pro Transfektionsatz 100 ng pEF1-HTLV/NP-TIP2 und 850 ng

pOG44 mit 12,5 µl OPTI-MEM® gemischt und zu einer Lösung aus 2 µl Lipofektamine™ in

18 µl OPTI-MEM® gegeben. Nach einer Inkubation von 20 min bei RT wurde diese Lösung

mit 1 ml OPTI-MEM® vermischt. Nun wurde das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt

und durch die Transfektionslösung ersetzt. Nach einer Inkubation von 4 h wurde die

Transfektionsreaktion durch Zugabe von 1 ml DMEM (20 % FKS) terminiert. Nach

72-stündiger Inkubation bei 30 °C unter 7,5 % CO2 Atmosphäre wurde das Zellkulturmedium

abgesaugt, die Zellen wurden einmalig mit PBS gewaschen und für 10 min mit 600 µl Trypsin

inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden auf 15 cm Schalen mit 20 ml DMEM (10 % FKS)

ausgebracht und für weitere 24 h inkubiert. Anschließend wurde das Zellkulturmedium

abgesaugt und gegen Selektionsmedium bestehend aus DMEM (10 % FKS) und 250 mg/l

Hygromycin ausgetauscht. Die Selektion erfolgte für 14 Tage wobei das Zellkulturmedium im

48-stündigen Rhythmus gegen neues Selektionsmedium ausgetauscht wurde. Die Isolation

der Klone sowie deren Expansion erfolgte wie für die stabile Transfektion von pIPRBF

beschrieben. Als Selektionsmedium diente hierbei jeweils DMEM (10 % FKS) mit 250 mg/l

Hygromycin.

5.2.4.5 Transiente Transfektion von HeLa und HEK293 Zellen

Für die fluoreszenzmikroskopische Analyse wurden transiente Transfektionen durchgeführt.

Die Anzucht der Zellen erfolgte hierbei auf einem runden 15 mm Deckglas in einer 12-

Napfplatte. Die Deckgläser wurden für diesen Zweck autoklaviert und unter sterilen

Bedingungen in den Vertiefungen der 12-Napfplatte vorgelegt. Von den zu transfizierenden

Zellen wurde eine Zellsuspension hergestellt und der Titer bestimmt (Vorgehen beschrieben

unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3). Für die Aussaat der Zellen wurde die Suspension auf

2,5 x 104 Zellen/ml eingestellt und 1 ml der Suspension pro Vertiefung der vorbereiteten

12-Napfplatte ausgebracht. Nach 24-stündiger Inkubation der Zellen erfolgte die Transfektion

mit den entsprechenden Plasmiden. Hierzu wurden pro Transfektionsansatz 400 ng Plasmid-

DNA mit 50 µl OPTI-MEM® gemischt und zu einer Lösung aus 2 µl Lipofektamine™ mit 50 µl

OPTI-MEM® gegeben. Nach einer Inkubation für 20 min bei RT wurde die Lösung mit 500 µl

OPTI-MEM® vermischt. Nun wurde das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt und durch

die Transfektionslösung ersetzt. Nach Inkubation für 4 h wurde die Transfektionsreaktion

durch Zugabe von 500 µl DMEM (20 % FKS) terminiert. Nach 24-stündiger Inkubation

erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse. Für die Experimente mit Nucleozin wurde

dieses bei der Termination der Transfektionsreaktion zugegeben.


- 117 -

5.2.4.6 Höchst-Färbung

Um den Kontrast zwischen Zellkern und Cytoplasma zu erhöhen, wurde die DNA der Zellen

mit dem Fluoreszenzfarbstoff Höchst 33342 angefärbt. Hierzu wurden 10 µl der Höchst-

Färbelösung zum Zellkulturmedium gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation wurde das

Zellkulturmedium abgesaugt und der überschüssige Farbstoff in drei Waschschritten mit je

300 µl PBS entfernt.

5.2.4.7 Herstellung von Lebendbeobachtungskammern

Die fluoreszenzmikroskopische Analyse von humanen Zellen erfolgte in allen Fällen in vivo

unter der Verwendung von Lebendbeobachtungskammern. Hierzu wurde auf einen

Objektträger mittels einer Spritze ein Ring aus Silikonpaste mit einem Durchmesser von

ca. 13 mm und einer Höhe von ca. 1 mm aufgebracht. In diesen Ring wurden 20 µl DMEM

(10 % FKS) pipettiert und das Deckglas mit den Zellen nach unten auf den Ring gelegt (Abb.

37). Im Anschluss daran erfolgte die mikroskopische Analyse. Die Herstellung von

Lebendbeobachtungskammern erfolgte unter unsterilen Bedingungen.

Abb. 37 Lebendbeobachtungskammer für die Mikroskopie

Die Kammer enthält 20 µl DMEM (10 % FKS) und

wurde durch einen Ring aus Silikonpaste abgedichtet.

Die Zellen sind auf der Unterseite des Deckglases

adhäriert und tauchen in das Zellkulturmedium ein.

Aufsicht (A) und Seitenansicht (B)

5.2.4.8 Fluoreszenzmikroskopische Analyse

Die fluoreszenzmikroskopische Analyse erfolgte in Lebendbeobachtungskammern (siehe

unter 5.2.4.7) mit einem konfokalen „laser-scanning“-Mikroskop. Alle Aufnahmen wurden

hierbei mit einem 40x Objektiv mit Öl-Immersion erstellt. Die Scanfrequenz betrug 400 Hz,

die jeweiligen Anregungswellenlängen und Detektionsbereiche für EGFP und Höchst 33342

finden sich in der unten stehenden Tabelle.

Detektion Anregung Detektionsbereich

EGFP 488 nm (Laser) 503-560 nm

Höchst 33342 405 nm (UV-Lampe) 420-480 nm


- 118 -

5.2.4.9 Präparation genomischer DNA aus HeLa Zellen

Die Präparation genomischer DNA erfolgte mit dem QIAamp® DNA Mini Kit aus jeweils

5 x 106 Zellen nach Vorgabe des Herstellers. Die Herstellung einer Zellsuspension sowie die

Bestimmung des Titers erfolgten wie unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3 beschrieben.

5.2.4.10 Messung der Luciferaseaktivität der ALF und ALF-NP Zelllinien

Prinzip

In der vorliegenden Arbeit wurde das luc Reportergen aus Photinus pyralis verwendet.

Dieses kodiert für das Enzym Luciferase, das die Oxidation von D-Luziferin in Gegenwart

von ATP, Sauerstoff und Mg2+ katalysiert. Bei dieser Reaktion wird Licht der Wellenlänge

λ = 562 nm emittiert, was zur Quantifizierung der Luciferaseaktivität verwendet wird (de Wet

et al., 1987).


Von den zu vermessenden Zellen wurde eine Zellsuspension hergestellt und der Titer

bestimmt (Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3). Für die Aussaat der Zellen

wurde die Suspension auf 2 x 104 Zellen/ml eingestellt und jeweils 1 ml in die Vertiefungen

einer 24-Napfplatte gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurden Dox, Nucleozin bzw.

DMSO in entsprechenden Konzentrationen zugegeben und die Luciferaseaktivität wurde

nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation gemessen.

Herstellung der Zelllysate: Die folgenden Schritte erfolgten unter unsterilen Bedingungen.

Zum entsprechenden Messzeitpunkt wurde das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen

wurden einmal mit 300 µl PBS gewaschen und anschließend mit 50 µl Lysepuffer für 10 min

bei RT lysiert.

Bestimmung der Proteinkonzentration im Zelllysat: Um die Gesamtproteinmenge der

Zelllysate zu bestimmen, wurden jeweils 10 µl des Zelllysats mit 190 µl deionisiertem Wasser

in einer 48-Napfplatte gemischt. Als Referenz diente ein Ansatz mit 10 µl Lysepuffer. Von

dieser Verdünnung wurden 20 - 80 µl in einer 96-Napf-Flachbodenplatte mit 170 - 230 µl

deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 µl aufgefüllt und mit 50 µl

Roti®-Quant gemischt. Nach 15-minütiger Inkubation bei RT wurde die Absorption bei

λ = 595 nm im TECAN Plattenlesegerät bestimmt. Die Ermittlung der Proteinkonzentration

erfolgte aus dem Vergleich der gemessenen Werte mit einer Kalibriergerade, die mit

definierten Konzentrationen von BSA und der jeweiligen Menge an Lysepuffer erstellt wurde.


- 119 -

Messung der Luciferaseaktivität: Für die Messung der Luciferaseaktivität wurden jeweils

10 µl Zelllysat in die Vertiefungen einer weißen LIA 96-Napfplatten pipettiert. Die Messung

der emittierten Lichtquanten bei 562 nm nach Zugabe von 100 µl Messpuffer (Messdauer

10 s) erfolgte in einem Orion II Plattenluminometer. Die auf diese Weise gemessenen Werte

wurden als absolute Lichteinheiten (ALU „absolute light units“) bezeichnet. Die Normierung

der ALU Werte erfolgte durch Division mit der entsprechenden Konzentration an Gesamt-

protein des Zelllysates (ALU/µg Protein).

5.2.4.11 siRNA Transfektion

Als Transfektionsreagenz für siRNA diente METAFECTENE® SI wobei die Transfektion

zeitgleich mit der Aussaat der Zellen erfolgt. Die Herstellung der Zellsuspensionen und die

Titerbestimmung erfolgten wie unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3 beschrieben. Je nach Messzeit-

punkt der Luciferaseaktivität wurden die Zellsuspensionen auf 4 x 104 Zellen/ml (24 h

Messung), 3 x 104 Zellen/ml (48 h Messung) und 2 x 104 Zellen/ml (72 h Messung) verdünnt.

Im Anschluss erfolgte die Herstellung des Transfektionsansatzes. Hierzu wurde in die

Vertiefungen einer 24-Napfplatte jeweils 60 µl 1x SI Puffer (Biontex, hergestellt aus einem

10x SI Puffer mit RNAse freiem, sterilem Wasser), 2 µl Transfektionsreagenz und

30 pmol siRNA pipettiert und vermischt. Nach 15-minütiger Inkubation wurden 500 µl der

entsprechenden Zellsuspension zum Transfektionsansatz gegeben. Die Messung der

Luciferaseaktivität zum jeweiligen Messzeitpunkt erfolgte wie unter 5.2.4.10 beschrieben.

5.2.4.12 LacZ in situ Färbung

Prinzip

Die LacZ in situ Färbung ermöglicht die mikroskopische Identifizierung β-Galaktosidase

exprimiernder Zellen in einer adhärenten Kultur. Hierbei werden die Zellen fixiert und

anschließend mit dem Farbstoff X-Gal behandelt. Dieser wird von der β-Galaktosidase zu

Galactose und 5-Brom-4-chlor-3-hydroxyindol umgesetzt, das spontan dimerisiert und mit

Sauerstoff zum wasserunlöslichen, blauen 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo oxidiert. Somit

färben sich β-Galaktosidase exprimierende Zellen (LacZ positiv) blau, Zellen ohne

Expression der β-Galaktosidase (LacZ negativ) bleiben hingegen farblos (Horwitz et al.,

1964).


Von den zu testenden Zellen wurde eine Zellsuspension hergestellt und der Titer bestimmt

(Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3). Für die Aussaat wurde die Suspension

auf 4 x 104 Zellen/ml eingestellt und jeweils 1 ml in die Vertiefungen einer 24-Napfplatte

gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die


- 120 -

Zellen einmal mit 1 ml PBS gewaschen. Alle folgenden Schritte erfolgten unter unsterilen

Bedingungen. Die Zellen wurden jeweils bei RT für 10 min mit 1 ml Fixierlösung fixiert und

anschließend dreimal mit 500 µl Waschlösung für jeweils 30 min gewaschen. Die Färbung

erfolgte für 16 h bei RT mit 1 ml Färbelösung in einer feuchten Kammer. Die so gefärbten

Zellen wurden anschließend in einem Mikroskop des Typs Axio Scope A1 analysiert und

fotografisch dokumentiert.

5.3 Computerprogramme

Programm Anwendung

Adobe® Photoshop

® CS2 Bildbearbeitung

Microsoft® Office Home and Student 2007 Erstellung von Dokumenten, Graphiken und

Durchführung von Tabellenkalkulationen

pBLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Vergleich von Proteinsequenzen

siMAX

http://www.eurofinsdna.com

Auswahl von siRNAs

RCSB - Protein Workshop Viewer

http://www.pdb.org

Betrachtung von Kristallstrukturen

GCUA “graphical codon usage analyser”

http://gcua.schoedl.de

Analyse des Codongebrauchs von Genen

EndNote® X3 Literaturverwaltung

DNASTAR Lasergene® EditSeq 7.1.0 Bearbeitung von DNA-Sequenzen

DNASTAR Lasergene® SeqMan Pro 7.1.0 Analyse von DNA-Sequenzierungen

Vector NTI® Suite 10.3.0

Clone Manager 5

Erstellung von Plasmidkarten und Verwaltung von

Plasmid-Datenbanken sowie

Oligonukleotiddatenbanken

6 Anhang __________________________________________________________________________

- 121 -

6 ANHANG

6.1 Codongebrauch der mcherry Genvarianten

6.1.1 Die „relative adaptiveness“ als Maß für die Codonfrequenz

Die Frequenz eines Codons in einer Codongebrauchstabelle wird durch dessen

prozentualen Anteil an der Gesamtheit der für eine AS codierenden Codons angegeben. Da

die Anzahl der für eine AS codierenden Codons jedoch nicht konstant ist, können die so

erhaltenen Werte der Codons für verschiedene AS nicht direkt miteinander verglichen

werden. Vor allem bei der Analyse des Codongebrauchs von Gensequenzen ist es von

Vorteil auf einfache Art entscheiden zu können, ob ein Codon mit hoher oder niedriger

verwendet wurde. Aus diesem Grund wurde die „relative adaptiveness“ eingeführt (Sharp et

al., 1987). Hierbei wird dem jeweils häufigsten Codon der Wert 100 % zugeordnet und die

Häufigkeit der anderen, für die gleiche AS kodierenden Codons nach diesem Wert skaliert.

6.1.2 Genvariante mcherry(ha)19

Die Anpassung von mcherry(ha) an den humanen Codongebrauch erfolgte nach der

Vorgabe, dass nach Möglichkeit nur Codons mit der höchsten Frequenz in der humanen

Codongebrauchstabelle verwendet wurden. In der Abbildung 38 findet sich eine grafische

Auswertung des Vergleichs der mcherry(ha) Sequenz mit der humanen Codongebrauchs-

tabelle. Wurde die Sequenz von mcherry(ha) mit der entsprechenden Codongebrauchs-

tabelle für S. cerevisiae verglichen, zeigte sich eine im Durchschnitt mittlere Frequenz der

Codons (Abb. 39). Weiterhin finden sich in mchehrry(ha) nur wenige Codons, die in

S. cerevisiae eine sehr hohe oder sehr niedrige Frequenz besitzen.

6.1.3 Genvariante mcherry(ya)20

Die Anpassung von mcherry(ya) an S. cerevisiae erfolgte im Gegensatz zu mcherry(ha) nicht

durch die Verwendung möglichst häufiger Codons. Stattdessen wurde die Frequenz der

einzelnen Codons in mcherry(ya) an die entsprechende Frequenz im Genom von

S. cerevisiae angepasst (Abb. 40). Durch diese Form der Anpassung entstand eine

Genvariante, die im Vergleich zu mcherry(ha) eine größere Anzahl der in S. cerevisiae

häufigsten Codons sowie eine geringere Anzahl an seltenen Codons beinhaltet (Abb. 41).

Eine Genvariante, die nach der gleichen Vorgabe an S. cerevisiae angepasst wurde wie

mcherry(ha) an den humanen Codongebrauch stand für diese Arbeit nicht zur Verfügung.

19

Humanadaptierte Genvariante 20

An S. cerevisiae adaptierte Genvariante

6 Anhang __________________________________________________________________________

- 122 -

Abb. 38: Vergleich des mcherry(ha) Gens mit der humanen Codongebrauchstabelle

Auf der Ordinate ist die Frequenz der einzelnen Codons beginnend am

N-Terminus mit dem ersten Codon nach dem Startcodon (Wert 1 auf der

Abszisse) als „relative adaptiveness“ aufgetragen. Die Grafik wurde mit dem

Programm GCUA („graphical codon usage analyser“, http://gcua.schoedl.de)

erstellt.

6 Anhang __________________________________________________________________________

- 123 -

Abb. 39: Vergleich des mcherry(ha) Gens mit der Codongebrauchstabelle für S. cerevisiae



Abszisse) als „relative adaptiveness“ aufgetragen. Werte ≥ 20 % sind mit

schwarzen Balken, Werte < 20 % sowie ≥ 10 % mit grauen Balken und ein Wert

< 10 % ist mit einem roten Balken dargestellt. Die Grafik wurde mit dem

Programm GCUA („graphical codon usage analyser“, http://gcua.schoedl.de)

erstellt.

6 Anhang __________________________________________________________________________

- 124 -

Abb. 40: Vergleich des Codongebrauchs in mcherry(ya) mit der Codongebrauchstabelle von S. cerevisiae

Auf der Ordinate ist der prozentuale Anteil („frequency“) des jeweiligen Codons im

Vergleich zur Gesamtheit aller, für eine AS codierenden Codons in mcherry(ha) (rote

Balken) bzw. dem Genom von S. cerevisiae (schwarze Balken) aufgetragen. Die

Grafik wurde mit dem Programm GCUA („graphical codon usage analyser“,

http://gcua.schoedl.de) erstellt.

6 Anhang __________________________________________________________________________

- 125 -

Abb. 41: Vergleich des mcherry(ya) Gens mit der Codongebrauchstabelle für

S. cerevisiae



Abszisse) als „relative adaptiveness“ aufgetragen. Werte ≥ 20 % sind mit

schwarzen Balken und Werte < 20 % mit grauen Balken dargestellt. Die Grafik

wurde mit dem Programm GCUA („graphical codon usage analyser“,

http://gcua.schoedl.de) erstellt.

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8 Abkürzungsverzeichnis __________________________________________________________________________

- 142 -

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

8.1 Einheiten 8.2 Vorsätze

bp Basenpaar M Mega (106)

°C Grad Celsius k Kilo (103)

Da Dalton m Milli (10-3

)

g Gramm µ Mikro (10-6

)

h Stunde n Nano (10-9

)

l Liter p Piko (10-12

)

m Meter f Femto (10-15

)

M molar (mol/l)

mol Mol

min Minute 8.3 Nomenklatur der Basen und Nukleoside

s Sekunde

U Einheit der Enzymaktivität

Upm Umdrehungen pro Minute Base Nukleosid

V Volt A Adenin Adenosin

W Watt C Cytosin Cytidin

g Erdbeschleunigung G Guanin Guanosin

cps counts per second T Thymin Thymdin

ALU absolute light units U Uracil Uridin

8.4 Aminosäuren-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarung (1969)

Alanin Ala A

Arginin Arg R

Asparagin Asn N

Aspartat (Asparaginsäure) Asp D

Cystein Cys C

Glutamin Gln Q

Glutamat (Glutaminsäure) Glu E

Glycin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V


- 143 -

8.5 Allgemeine Abkürzungen

(E)GFP (enhanced) green fluorescent

protein

(m)YFP (monomeric) yellow fluorescent

protein

Abb. Abbildung adh1 Gen für die

Alkoholdehydrogenase

ALF Aktivator Luciferase Flp-in™ AmpR Ampicillinresistenz

AS Aminosäure Atc Anhydrotetrazyklin

ATP Adenosintriphosphat BP bipartite

BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise

ca. circa CHO chinese hamster ovary

CMVIE immediate early Promotor des

Cytomegalie Virus

CMVmin CMV Minimalpromotor

c-Myc NLS Kernlokalisationssequenz aus

dem c-Myc Protein

CRM1 chromosome region maintenance

factor

cyc1 Gen für die Cytochrom-C-

Oxidase

DAPI 4',6-Diamidino-2-

phenylindoldihydrochlorid

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's

Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

Dox Doxyzyklin DTT Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat

et al. et alii (und andere) F Aktivatordomäne aus dem

Herpes simplex Virus

FKS Fötales Kälberserum FRT Flp recognition target

GDP Guanosindiphosphat goi gene of interest

GTP Guanosintriphosphat HA Hämagglutinin

HBV Hepatitis B Virus hEF1-HTLV synthetischer Promotor

HEK293 Human embryonic kidney 293 HLF33 HeLa Luciferase Flp-In™ 33

HTS high throughput screening HygR Hygromycinresistenz

IFN-β Interferon-β IPTG Isopropyl-β-D-

thiogalaktopyranosid

IRES internal ribosomal entry site KanR Kanamycinresistenz

LacI lac Repressor lacZ Gen für die β-Galaktosidase

LB Luria-Bertani-Medium LiAc Lithiumacetat

LTF Leertransfektion luc Gen für die Luciferase aus

Photinus pyralis

M1, 2 Matrixprotein 1, 2 mCherry7 Trägerprotein-Variante 7

MCS multiple cloning site MDCK Madin Darby canine kidney

met25 Gen für die Homoserin-Synthase mRNA messenger Ribonukleinsäure

Mut Mutante NA Neuraminidase

NeoR Neomycinresistenz NES nuclear export sequence

NF-κB nuclear factor kappa-light-chain-

enhancer of activated B cells

NP Nucleoprotein

ns Gen für NS1 und NS2 NS1, 2 & 4 Nichtstrukturprotein 1, 2 und 4

ns4ss Gen für NS4 oDx optische Dichte bei x nm


- 144 -

ONPG o-Nitrophenyl-β-D-

galaktopyranosid

P Promotor

p.A. pro Analysis PA polymerase acidic

PB1 & 2 polymerase basic 1 und 2 PCR polymerase chain reaction

PEG Polyethylenglykol POI protein of interest

PolyA Polyadenylierung PuroR Puromycinresistenz

Ran-GAP Ran GTPase aktivierenden

Protein

rev revers

RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur

rtTS reverser Tetrazyklin-abhängiger

Transsilencer

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

siRNA small interfering Ribonukleinsäure ss splice site

Ssn6 Repressordomäne aus S.

cerevisiae

SV40 NLS Kernlokalisationssequenz aus

dem Simianen Virus 40

Tab. Tabelle Tc Tetrazyklin

TetR Tetrazyklin-Repressor TIP TetR-induzierendes Peptid

Tn Transposon TRE Tet responsive element

Tris Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan

tRNA transfer Ribonukleinsäure

TrxA Thioredoxin A tTA Tetrazyklin-abhängiger

Transaktivator

tTR Tetrazyklin-abhängiger

Transregulator

tTS Tetrazyklin-abhängiger

Transsilencer

uspRNA unspezifische RNA UV ultraviolett

v Volumen w Gewicht, Masse

w/o without WHO Weltgesundheitsorganisation

wt Wildtyp X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-

galaktopyranosid

Zeocin™R

Zeocinresistenz β-Gal β-Galaktosidase

λem Emissionswellenlänge λex Anregungswellenlänge

tip-vermittelte induktion tetrazyklin-abhängiger

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