tipos de morte celular: necrose e apoptose · '-synuclein, parkin mutations poly-cag...
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Tipos de morte celular: Necrose e Apoptose
Biologia Celular e Molecular, 2008/2009
Objectivos:• Definir o papel da morte celular em biologia, tanto
fisiológica quanto patologicamente.
• Exemplificar a sua função no desenvolvimento embrionário, na organogénese, na renovação de células, na regressão de tumores e ainda em processos neurodegenerativos
• Definir necrose. • Listar alguns tipos de necrose e caracterizar as diferentes
alterações celulares.
• Definir a apoptose.
• Identificar e descrever as diferentes vias apoptóticas.
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Homeostase de um organismo
multicelular
Controlada por: Proliferação – Diferenciação – Morte Celular
Remoção activa de células indesejáveis a uma comunidade social
Controlo social da comunidade
Sobrevivência do organismo
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Longevidade das células• 210 tipos de células diferentes
• Cerca de 5x1011 de células de sangue morrem por dia
• Os neutrófilos vivem 6-7 h na circulação
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Em células incapazes de receber sinais de sobrevivência e/ou
capazes de receber sinais de morte
Em células que não podem reparar uma lesão adequadamente
Perda do contacto c/ membrana basal - ANOIKIA (Loss of Home)
Hormonas, citocinas (TNF),
Radiação, citostáticos
Activação de um programa genético de suicídio
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Morte celular em diferentes processos
biológicos
Desenvolvimento embrionário
Ex: Formação dos dedos
Sindactilia
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Evolução da perda neuronal num doente de Parkinson
Actividade Dopaminérgica
Doenças degenerativas
Morte celular patológica
Cancro
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Necrose:
• Processo passivo (independente de ATP)
• Caracterizado por uma destruição massiva da célula:
-Colapso da membrana plasmática e por conseguinte das membranas dos organelos
-Libertação dos componentes intracelulares
-Geralmente, os restos celulares são difíceis de serem fagocitados, por falta de emissão de sinais, pelas células do sistema imunológico !inflamação
Morte acidental das células ou de um tecido, por causas fisiológicas (isquémia, isto é, obstrução arterial), traumatismos graves ou agentes infecciosos (fungos, bactérias e vírus)
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Exemplos de doenças onde a necrose está envolvida: Peste bubónica (peste negra)
• Pandemia que, no século XIV (Idade Média), assolou a Europa e dizimou cerca de 25 a 75 milhões de pessoas (1/3 da população).
• Doença infecciosa causada pela Yersinia
pestis, bactéria transmitida ao homem pelas pulgas dos ratos-pretos (Rattusrattus) ou outros roedores.
– Estas bactérias (bacilos) invadem os nódulos linfáticos que ficam inflamados, necróticos e hemorrágicos.
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Acidente Vascular Cerebral:
interrupção da irrigação sanguínea (oxigénio e glicose) numa região do cérebro ! perda da função neuronal;
Existem dois tipos:Isquémico: falta de irrigaçãoHemorrágico: ruptura de um vaso sanguíneo intracraniano
Factores de risco para AVC: Hipertensão,Aterosclerose,Diabetes, Colesterol elevado,Tabagismo, Álcool, Problemas cardíacos
Doença Vascular
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Gangrena devido a uma úlcera diabetica
• Gangrena: é a necrose de um tecido por isquémia, ou
seja, devido a uma obstrução arterial, por embolia,
choque, infecção, ou por exposição a frio intenso
!1º. perda do fornecimento de
oxigénio e outros nutrientes
!2º. invasão bacteriana
!3º. putrefacção do tecido
Doença Vascular
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Necrose - eventos celulares
http://www.youtube.com/watch?v=g4tlx2W8ssY
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O que é a Apoptose
Apoptose ou Morte Celular Programada é um modo de "autodestruição celular" que requer energia e síntese proteica, exercendo o papel oposto ao da mitose
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Regulação defeituosa - Doenças
Cancro, doenças autoimunes
Doenças neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento
Regulação defeituosa - Doenças
Cancro, doenças autoimunes
Doenças neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento
Condições fisiológicas
Desenvolvimento embrionário - Metamorfose
- Morfogenese
- Sinaptogenese
Adulto - Normal turnover celular
- Selecção tímica negativa
- Citotoxicidade mediada por células
Condições fisiológicas
Desenvolvimento embrionário - Metamorfose
- Morfogenese
- Sinaptogenese
Adulto - Normal turnover celular
- Selecção tímica negativa
- Citotoxicidade mediada por células
Apoptose
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Fases da apoptose
A mitocôndria controla a decisão para a morte celular
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Citocromo c
Morte da Célula
Receptores Membranares Apoptóticos
(Família TNF/NGF)
Pró-Caspase-8
Domínio Apoptótico
Molécula Adaptadora
Caspase-8
Insultos Celulares(comp. citotóxicos, radiação, choque térmico, privação de
factores de crescimento)
Pró-Caspase-9
ApoptossomaApoptossoma
Caspase-9
Caspase-3 Caspase-7
Caspase-6 Caspase-2
Pró-Caspase-4
RERE
Caspase-4
Insultos ao RE(Tapsigargina)
NNúúcleocleo
Condensação e Fragmentação do
ADN
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Via membranar ou
extrínseca
Via membranar ou
extrínseca
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Via mitocondrial ou intrínsecaVia mitocondrial ou intrínseca
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Libertação de Citocromo c da Mitocôndria
A
B C D
BaxBaxtBidtBid
!![Ca[Ca2+2+], ROS, ], ROS, !"#!"#mm, , Bax, Bax, !!pH, PpH, Pii, ,
$$[[nuclenucleóótidos adeninatidos adenina]]
(Desagher & Matinou, 2000)
A) Formação de um megacanal mitocondrial não selectivo de elevada condutância(PTP: ANT + VDAC + Ciclofilina D)
Ruptura não EspecRuptura não Especíífica da fica da Membrana Mitocondrial Membrana Mitocondrial
ExternaExterna
FormaFormaçção de Canais ão de Canais Condutores de Citocromo cCondutores de Citocromo c
Função Mitocondrial Preservada(Importante para o processo de
activação das caspases)
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Via mitocondrial ou intrínsecaVia mitocondrial ou intrínseca
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ProteProteíínasnas
AntiAnti--apoptapoptóóticasticas
ProteProteíínana
ProPro--apoptapoptóóticatica
MorteMorte celularcelular porpor apoptoseapoptose
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Proteínas que promovem ou suprimem a
apoptose
• Pró-apoptóticas FunçãoCaspases Clivagem de enzimas, citosqueleto e canais iónicosBax, Bad Formação de poros, libertação de Cit cReceptores do glutamato Influxo de Ca2+, activação de cinases e proteasesFas Inicia cascata da morte/caspase-8Par-4 Disfunção mitocondrial, inibição NF-kBp53 Transcrição genes de morte, aumento de acção da Bax
• Anti-apoptóticasBcl-2, Bcl-XL Estabiliza função mitocondrial, antioxidanteIAPs Inibição das caspasesFactores tróficos/Citoquinas Expressão de enzimas antioxidantes, proteínas
reguladoras de Ca2+, IAPs, Bcl-2Telomerase Previne o encurtamento dos telómerosEnzimas antioxidantes Reduz o stresse oxidativo
Proteína cinase C% Estimula a expressão de NF-kBProteínas que ligam Ca2+ Homeostase de Ca2+
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APOPTOSE
Activação de Caspases
(cysteine-aspartic proteases)
&Activação de endonucleases
&Fragmentação do DNA
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Apoptose: eventos celulares
http://www.youtube.com/watch?v=witLM-V2v8Biologia Celular e Molecular (1º semestre - 1º ano, 2008-2009) – Ciclo Básico de Medicina e Medicina Dentária Sandra Morais Cardoso
• Anexina
• Br-dUTP
• TUNEL
• Imunohistoquímica
• Função mitocondrial
• Microarrays
Análise da Apoptose
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• São proteínas que ligam fosfolipidos na presença de cálcio• As alterações celulares que ocorrem durante o processo apoptótico
incluem a perda da assimetria dos fosfolípidos numa fase inicial• Os conjugados de Anexina V são utilizados para se detectar células
apoptóticas• Utiliza-se a Anexina V marcada fluorescentemente (Citometria de fluxo,
microscopia de fluorescência e confocal)
Anexina
PI Annexin V
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• Degradação do ADN genómico em fragmentos de 180-200 pb• A fragmentação cria locais 3’-OH• Estes locais podem ser marcados com Br-dUTP (bromodeoxiuridina
trifosfato)• Pela acção da TdT (transferase terminal)
“DNA Laddering”
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• Análise da expressão génica diferencial
• Genes agrupados em famílias de genes
Nº total de genes envolvidos na apoptose: 198
“Microarrays”
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• Seres humanos têm aproximadamente 1014
células-Capazes de entrarem em apoptose
• O processo apoptótico pode ficar comprometido-Pode resultar numa morte celular inapropriada dando origem a doença
• Potencial uso terapêutico-Modulação da apoptose para o tratamento de doenças
Apoptose na clínica
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Factores Genéticos e Ambientais podem
desencadear a apoptose:
Disorder Genetic factors Environmental factors
AD
PD
HD
ALS
APP, Presenilin mutations, ApoE
'-synuclein, parkin mutations
Poly-CAG expansions in huntingtin
Cu/Zn-SOD mutations
Head trauma, low education, calorie intake
Head trauma, toxins, calorie intake
Toxins, autoimmune response
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Doença de Alzheimer
* Doença neurodegenerativa que ocorre tardiamente:
- clinicamente ( decréscimo progressivo da capacidade cognitiva
- primeiro sintoma da DA ( declínio da memória recente
* Estadio inicial da DA: Alteração do citosqueleto por hiperfosforilação anormal
da proteína tau (neurónios piramidais corticais)
- A tau fosforilada dissocia-se dos microtúbulos ( filamentos
insolúveis
* Cortex cerebral de doentes de DA: depósitos extracelulares de b-amilóide (Ab,
)4 kDa); Ab - produto minoritário do metabolismo da APP
Evidências de morte celular por apoptose: - decréscimo Bcl-2 em neurónios contendo tranças neurofibrilhares- aumento dos níveis de Bax (obs. antes da clivagem do ADN)- abertura PTP; libertação citocromo c; activação de caspases
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“Gostaria de não ficar inutilizada e se possivel melhorar”
(Escrito por um doente de Alzheimer)
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• Causadas por repitição do codão CAG, que codifica a glutamina
Doença de Poliglutaminas
Disease Gene name Chromosomal
location
Pattern of
inheritance
Protein Normal repeat
length
Disease repeat
length
Spinobulbar
muscular atrophy
(Kennedy disease)
AR Xq13–21 X-linked recessive androgen receptor
(AR)
9–36 38–62
Huntington disease HD 4p16.3 autosomal dominant huntingtin 6–35 36–121
Dentatorubral-
pallidoluysian
atrophy (Haw River
syndrome)
DRPLA 12p13.31 autosomal dominant atrophin-1 6–35 49–88
Spinocerebellar
ataxia type 1
SCA1 6p23 autosomal dominant ataxin-1 6–44 39–82
Spinocerebellar
ataxia type 2
SCA2 12q24.1 autosomal dominant ataxin-2 15–31 36–63
Spinocerebellar
ataxia type 3
(Machado-Joseph
disease)
SCA3 14q32.1 autosomal dominant ataxin-3 12–40 55–84
Spinocerebellar
ataxia type 6
SCA6 19p13 autosomal dominant '1A-voltage-
dependent calcium
channel subunit
4–18 21–33
Spinocerebellar
ataxia type 7
SCA7 3p12–13 autosomal dominant ataxin-7 4–35 37–306
Spinocerebellar
ataxia type 17
SCA17 6q27 autosomal dominant TATA binding
protein
25–42 45–63
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Mecanismos
celulares
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Biologia da Proteólise:Autofagia e Sistema Ubiquitina
Proteassoma
Biologia Celular e Molecular, 2008/2009
Objectivos:• Descrever o processo autofágico e relacionar este
processo com a doença.• Descrever autofagia celular como a chave para o
desenvolvimento de novos tratamentos contra o cancro, doenças degenerativas e infecções.
• Descrever o papel dos lisossomas na função celular.• Identificar as doenças associadas à disfunção dos
lisossomas.
• Definir o papel do sistema ubiquitina-proteassoma na função celular.
• Identificar as doenças associadas à disfunção do proteassoma.
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Rough ER Smooth ER
Centrosome
CYTOSKELETON
Microfilaments
Microtubules
Microvilli
Peroxisome
Lysosome
Golgi apparatus
Ribosomes
Nucleolus
Chromatin
NUCLEUS
Flagelium
Intermediate filaments
ENDOPLASMIC RETICULUM (ER)
Mitochondrion
Nuclear envelope
Plasma membrane
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Lisossomas: compartimentosDigestivos
Lisossoma– É um organelo membranar do citosol das células
– Contem várias enzimas hidrolíticas
– Tem um pH de 4.5 a 5.5
– Tem como função a digestão intracelular
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Lisossomas: compartimentosDigestivos
As enzimas do lisossoma são as hidrolases
Peptidases
DNAases
RNAases
Lipases
Fosfatases
Glucosidases
Carboxilases
Sulfatases
Esterases
Existe uma hidrolase para cada tipo de biomolécula
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Lisossomas: compartimentosDigestivos
H+
Glicoproteínas que protegem contra a hidrólise
Transportadores membranares
Bomba de protões
H+
H+
H+
H+
aminoácidos
glucose
nucleótidos
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Função dos lisossomas
• Fagocitose: processo pelo qual as células internalizam material do meio extracelular (<0.5 !m) que é depois digerido pela acção do lisossoma. Ex: macrofagos
• Autofagocitose ou autofagia: processo pelo qual as células degradam organelos velhos ou danificados
• Endocitose mediada por receptores: processo pelo qual as células que tem determinados receptores tomam determinadas macromoléculas. Ex: hormonas, anticorpos, lipoproteínas
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Digestão intracelular
Fagocitose
(a) Phagocytosis: lysosome digesting food
1 µm
Lysosome containsactive hydrolyticenzymes
Food vacuole fuses with lysosome
Hydrolyticenzymes digestfood particles
Digestion
Food vacuole
Plasma membrane
Lysosome
Digestiveenzymes
Lysosome
Nucleus
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Autofagocitose Fagocitose
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Doenças associadas aos lisossomasMorquio A Disease
Morquio B Disease
Mucolipidosis IIIC
Mucolipidosis IV
Mucopolysaccharidosis IX
Multiple Sulfatase Deficiency
Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
Niemann-Pick Disease A, B, C1, and C2
Northern Epilepsy
Pompe Disease
Pseudo-Hurler Polydystrophy (mucolipidosis
IIIC)
Pycnodysostosis
Salla Disease
Sandhoff Disease
Sanfilippo disease A, B, C, and D
Santavuori-Haltia disease
Scheie Disease
Schindler Disease
Sialidosis
Sly disease
Sphingolipid Activator Protein Deficiency
Tay-Sachs Disease
Wolman Disease
Aspartylglucosaminuria
Batten Disease
Cholesterol Ester Storage Disease
Cystinosis
Danon Disease
Fabry Disease
Farber Disease
Fucosidosis
Galactosialidosis
Gaucher Disease
GM1 Gangliosidosis
GM2 Gangliosidosis (AB Variant)
Hunter Disease
Hurler Disease
Hurler-Scheie Disease
I-Cell Disease (mucolipidosis II)
Infantile Free Sialic Acid Storage
Disease
Jansky-Bielschowsky Disease
Krabbé Disease
Kuf Disease
Mannosidosis
Maroteaux-Lamy Disease
Metachromatic Leukodystrophy
Sistema Ubiquitina-Proteassoma: processo de degradação proteica
• Ubiquitinação– Marcação da proteína alvo a uma cadeia de
poliubiquitina
– Direciona estas proteínas para o proteassoma
• Proteassoma– É um complexo multienzimático que degrada
proteínas
– Estas enzimas são proteases
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Via da Ubiquitinação
E1, activadora da ubiquitina
E2, conjugadora da ubiquitina
E3, ligase da ubiquitina4 monomeros de
ubiquitina
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Translocação de proteínas marcadas
DUB: Enzimas que desubiquitinam ou são proteases específicas para a ubiquitina; ambas removem a ubiquitina das proteinas alvo, impedindo a sua degradação
Proteólise
A subunidade 20S do proteassoma tem 3 subunidades catalíticas com diferentes especificidades para o substracto:
-“Quimiotripsina-like”
-“Tripsina-like”
-“PHGH-like” (peptidyl-glutamyl peptide-hydrolyzing)
O resultado da proteólise são polipeptídeos de 4 a 25 resíduos
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Via de degradação
• Essencial para muitos
processos celulares:
Ciclo celular-mitose
Expressão génica
Respostas ao stress oxidativo
Apoptose
• Produtos da degradação:
Pequenos peptídeos
Factores de transcrição activos-NFkB
Reguladores do ciclo celular activos-p53
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Função do Proteossoma
http://www.youtube.com/watch?v=w2Qd6v-4IIc
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Disfunção do proteossoma
• InibiçãoActividade anti-tumural
Redução das lesões da psoriase
Efeito positivo na asma
Doenças associadas ao proteossoma
• Directamente: Duas formas familiares de Parkinson:
Mutação no gene da parkina (ligase E3 da ubiquitina)
Mutação no gene da UCHL1 (terminal carboxilico da hidrolase 1 da ubiquitina)
• Indirectamente: Doença de Parkinson
Doença de Creutzfeldt-Jakob
Doença de HuntingtonBiologia Celular e Molecular (1º semestre - 1º ano, 2008-2009) – Ciclo Básico de Medicina e Medicina Dentária Sandra Morais Cardoso
Doença de Parkinson• Afecta 1-2 % da população >65 anos• Esporádica ou familiar• Marcadores Neuropatológicos:- Morte dos neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta
seguida de perda da inervação dopaminérgica do striatum
- Corpos de Lewy ('-sinucleína agregada)
• Característica clínicas:- distúrbios extrapiramidais : bradicinésia, tremor de repouso, rigidez
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Kuru
Doença neurológica descoberta em 1950 no povo Fore da Papua Nova Guiné
Tipo de encefalia espongiforme
Sintomas: tremores
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Doença Creutzfeldt-Jakob• Afecta 1-1000000 de indivíduos
• Idade média de início 50 anos
• Sintomas:
perda de memória, tremores, desordem na marcha, postura rígida e ataques epilépticos devida à uma rápida perda de células cerebrais causada por uma proteína transmissível chamada prião
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Doença de Hungtinton
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• Idade média de início: 40-50 anos (tb alguns casos de ocorrência juvenil)
• Morte dos doentes após 10-20 anos• Autossómica dominante (1:10000 indivíduos)
• Marcadores Neuropatológicos:- Morte dos neurónios ao nível do estriado, envolvido na iniciação dos
movimentos voluntários, e do cortex cerebral
• Característica clínicas:
- Movimentos involuntários, frequentes e rápidos,
- Redução da função cognitiva e demência progressiva distúrbios
Doença de Hungtinton
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AutofagiaLysosome containingtwo damaged organelles 1 µ m
Mitochondrionfragment
Peroxisomefragment
É um processo catabólico que envolve a degradação de componentes celulares através da maquinaria do lisossoma
Permite manter a homeostase celular, entre a síntese e a degradação de produtos celulares
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Tipos de autofagia
MacroautofagiaCaracteriza-se pela sequestração de organelos ou de proteínas numa vesícula membranar- autofagossoma- que posteriormente funde com o lisossoma –autofagolisossoma- sendo o seu conteúdo degradado por hidrolaseslisossomais
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Microautofagia
Ocorre quando os lisossomas “engolem” partes do citoplasma
Tipos de autofagia
H+
H+
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Tipos de autofagia
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Desde o principio…
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Autofagia: visualização por M.E.
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Funções da autofagia
• Privação de nutrientes
– Durante o jejum prolongado, os níveis de autofagia aumentam: !degradação de componentes celulares não vitais e, consequentemente, !libertação de nutrientes para a própria célula ! processo de sobrevivência, adaptativo, da célula e do organismo.
• Infecção
– Quando as células são infectadas por determinadas bactérias, o processo autofágico é activado como forma de as eliminar.
• Morte celular autogáfica (autophagic cell death)
– Morte celular tipo II
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Regulação da autofagia
Estimulam a autofagia
Inibem a autofagia
TOR-Regulador da autofagia
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Como é que a autofagia mata uma célula?
Autofagia massiva (Morte celular tipo II)
Durante este processo ocorre a destruição de largas porções de citosol e de organelos, causando uma irreversível atrofia celular, induzindo o colapso da função celular.
Autofagia activa a Apoptose (Morte celular tipo I)
A autofagia desenvolve-se como a primeira resposta ao estimulo (stress) e sódepois activa a apoptose que vai ser responsável pela morte celular
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A relação entre a autofagia e a apoptose
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Interacção entre a autofagia e a apoptose
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Doenças associadas
• Indirectamente: Doença de Parkinson
Doença de Alzheimer
Doença de Huntington
Cancro
SIDA
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Doença de Parkinson
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• A SIDA é provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (human
imunnedeficiency virus, HIV), podendo a sua transmissão ocorrer por:
– relações sexuais,
– contacto com sangue infectado (por exemplo, transmissão de mãe para filho durante a gravidez ou durante o parto),
– amamentação (transmissão de mãe para filho).
• A SIDA matou mais de 20 milhões de pessoas nos últimos 20 anos.
• Ao atingir o sistema sanguíneo do organismo humano, o VIH começa de imediato a reproduzir-se nos linfócitos T4 (células CD4+) conduzindo-os àsua morte.
• Sob a acção do vírus, a função de defesa do organismo fica enfraquecida; a pessoa infectada, ou seropositiva, torna-se mais vulnerável à infecção por outras bactérias e vírus ! doenças oportunistas: são exemplos as formas raras de pneumonia, toxoplasmose, candidose, meningite criptocócica e cancros, como o Sarcoma de Kaposi.
HIV-SIDA
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HIV-SIDA
• No início ! infecção aguda (até quatro semanas após o contágio)
– O indivíduo infectado manifesta vários sintomas pouco característicos, semelhantes aos de uma gripe;
• O vírus continua-se a multiplicar, podendo o indivíduo ser seropositivo e não apresentar quaisquer sintomas por um período de tempo longo (exemplo, 15 anos);
• O organismo já não consegue repor completamente a quantidade de células CD4+ destruídas pelo vírus; esta fase caracteriza-se por uma imunodepressão moderada, com sintomas e sinais associados: emagrecimento, suores nocturnos, diarreia prolongada e febre;
• O indivíduo seropositivo passa a desenvolver a doença – SIDA –quando as células CD4+ baixam para valores inferiores a 200 celulas por mililitro de sangue, ficando o organismo desprotegido ! infecções e/ou doenças oportunistas.
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HIV-SIDA
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HIV-SIDA
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Cancro
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Cancro
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Bibliografia• Papers:
- Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol, 21: 165-170 (2002)
– Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding inless than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 931-937 (2007).
– Ravikumar B, Rubinsztein DC. Role of autophagy in the clearance of mutanthuntingtin: a step towards therapy? (Review) Mol Aspects Med, 27: 520-527(2006).
– Espert L et al. Autophagy and CD4+ T lymphocyte destruction by HIV-1(Review). Autophagy. 3: 32-34 (2007).
- Karantza-Wadsworth V, White E. Role of autophagy in breast cancer.Autophagy. 3: 610-613 (2007)
– Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol,21: 165-170 (2002)
– Maiuri MC et al. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagyand apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 741-752 (2007)
– Thorburn A. Apoptosis and autophagy: regulatory connections between twosupposedly different processes. Apoptosis (in press, 2008)
• Livros:
- Alberts et al. Cell Biology: Chapter 18
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Biologia das células estaminais:Terapias Celular e Génica
Biologia Celular e Molecular 2008/2009
Objectivos:• Definir o que são células estaminais.
• Identificar os diferentes tipos de células estaminais.
• Explicar o cancro como uma doença das células estaminais.
• Analisar a aplicabilidade da terapia celular na prática clínica. -Doenças autoimunes-Diabetes-Doenças Neurodegenerativas
• Descrever a Terapia Génica como um novo ramo terapêutico da medicina moderna.
• Analisar a aplicabilidade da terapia génica na terapia celular
-Exemplificar a importância dos siRNA
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Células estaminais
• Células indiferenciadas com capacidade proliferativa.
• Podem-se diferenciar em diferentes tipos celulares em resposta a diferentes estímulos.
• Têm o potencial de se desenvolver em células maduras, com funções especializadas
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Classificação das células estaminais
• Células Totipotentes: Zigoto ou Ovo fertilizado
• Células Pluripotentes: Células que dão origem a todas as células das camadas embriónicasgerminativas
• Unipotente: dão origem a um tipo específico de células
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Células estaminais embrionárias
Derivam do embrião antes da sua implantaçãono útero
Oviducto
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• Uma fonte de células estaminais não embrionárias é o sangue do cordão umbilical, que possui uma grande concentração de células estaminais hematopoiéticas, para além de células estaminais mesenquimais e células estaminais/progenitoras endoteliais.
• Estas células estaminais neonatais podem ser colhidas e processadas logo após o nascimento, num processo totalmente seguro e indolor para a mãe e para o recém-nascido, tendo substancial aplicabilidade terapêutica
Células estaminais da placenta e do cordão umbilical
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Células estaminais adultas
Como qualquer célula estaminal divide-se durante longos períodos dando origem a cópias idênticas,
Podem dar origem a diferentes tipos de células diferenciadas
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Tipicamente são chamadas de células precursoras ou progenitoras de um determinado tipo de células diferenciadas
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Tipos de células estaminais adultas
• Células estaminais neuronais:- na zona Subventricular
- na zona Ventricular
- no Hipocampo
- no cérebro fetal
- na crista neural
• Células estaminais da medula óssea e sangue:- Hematopoiéticas
- Medula óssea
• Células estaminais adultas em diferentes tecidos:- Células progenitoras endoteliais
- Células musculo esquelético
- Células precursoras epiteliais da pele e sistema digestivo
- Células do pâncreas e fígado
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Plasticidade de células estaminais adultas
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Doenças autoimunes
• Esclerose múltipla
• Diabetes tipo1
• Lúpus
• Tem de distinguir os mais variados componentes celulares do próprio corpo dos componentes celulares dos organismos invasores
•Infecção versus Doenças autoimunes
• Pneumonia
• Cistite
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Sistema Imunológico• No Timo as células T são educadas a
distinguirem as proteínas do próprio corpo das outras
• As células T auto-reactivas, são eliminadas no Timo
• Se o sistema falha: doenças auto-imunes
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Células estaminais hematopoiéticas
• Hematopoiese: todas as células derivadas de uma única
célula precursora, o hemocitoblasto, que dá origem a um progenitor para cada tipo de célula
- Eritrócitos
- Leucócitos
- Plaquetas
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Diferenciação das células hematopoiéticas e da medula
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Selecção de células estaminais hematopoiéticas
FACS
Células marcadas com fluorescência
(1:10000 células)
Células ligadas a ferro
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Cancrouma doença das células estaminais
• As células estaminais adultas permaneceram no organismo durante um período de tempo alargado, podendo acumular mutações pró-oncogénicas.
• As células estaminais (em constante divisão) podem facilmente adquirir um fenótipo tumorogénico.
• O transplante de células estaminais em indivíduos adultos pode conduzir à formação de tumores: teratocarcinomas, tumores complexos derivados de células embrionárias pluripotentes. No entanto nunca foram encontradas metástases após transplantes de células estaminais embrionárias.
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Terapêutica
• Drogas anti-inflamatórias, imunossupressores (esteróides, inibidores de citocinas)
• Transplante de células hematopoiéticas do próprio indivíduo (autólogo)
- Injecções de um factor de crescimento: libertação de células estaminais da medula óssea para a corrente sanguínea
- Isolam-se as células estaminais do sangue do doente
- Faz-se quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar as células maduras do sistema imunológico
- Transfusão das células estaminais, que migram para a medula óssea onde se começam a diferenciar
7 doentes com Lúpus receberam este tratamento e durante 3 anos
não necessitaram de medicação imunossupressora
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Diabetes• Caracterizada por níveis elevados
de glicose no sangue (hiperglicemia).
• Os sintomas mais comuns são: secreção excessiva de urina(poliuria), sede (polidpsia) e fome (polifagia) intensas.
• O diabetes tipo 1 é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células beta pancreáticas pelas células do sistema imune, e os pacientes necessitam de injecções de insulina exógena para sobreviver.
• O diabetes tipo 2, está intimamente relacionado a obesidade e atinge principalmente pessoas com mais de 40 anos.
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How are embryonic stem cells stimulated to differentiate?
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Doenças Neurodegenerativas: Doença de Parkinson
!! Segunda doença neurodegenerativa mais comum - idade média de início: 55 anos
!! Afecta 1-2 % da população > 65 anos!! Idade é o principal factor de risco
Características clínicas
!! ~80% dos casos de Parkinsonismo!! distúrbios motores graves
- bradicinésia (lentidão de movimentos)- tremor de repouso- rigidez
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Na doença de Parkinson a via nigrostriatal degenera
! Perda acentuada de neurónios dopaminérgicos que projectam para o putamen
e modesta dos neurónios que projectam para o caudate
! Despigmentação da SNpc devido à perda de neurónios dopaminérgicos (perda do pigmento castanho escuro neuromelanina)
Início dos sintomas: ~80% de
deplecção de DA no putamen e
~60% de morte de neurónios
dopaminérgicos na SNpc
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Terapias Neuroprotectoras
"Antioxidantes" L-DOPA" Agonistas dopaminérgicos" Antagonistas dos receptores do glutamato" Inibidores da NOS
Terapias de Substituição Celular
" Transplantes: células neuronais fetaiscélulas estaminais embrionáriascélulas estaminais neuronais adultas
Terapias na doença de Parkinson
Terapias Cirúrgicas
" Estimulação cerebral profunda" Palidotomia
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Transplante de células neuronais fetais dopaminérgicas
Problemas: éticos (neurónios de mesencéfalo de fetos com 6 a 9 semanas)células não formam sinapses
viabilidade e funcionalidade das células
aquisição de um fenótipo dopaminérgico
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Investigação em células estaminais: porquê?
http://www.youtube.com/watch?v=a9WB_PXjTBo
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Ensaios clínicos em 2005:10% doenças hereditárias monogénicas (ex: fibrose quística, SCID)
66% doenças poligénicas (ex: cancro)
Embora esta tenha muito potencial, é ainda muito experimental
Fase I: número pequeno de pacientes que são cuidadosamente observados, sendo dada atenção especial a quaisquer efeito colateral detectados. Testada em várias doses, com o objectivo de descobrir a dosagem ideal.
Fase II: se o tratamento apresenta um efeito positivamente útil, serátestado num número maior de pacientes
Fase III: Geralmente, esse ensaio envolve a comparação do novo tratamento com o que tem sido o tratamento padrão até o momento. Num ensaio aleatório, geralmente metade dos pacientes recebem o tratamento padrão e metade, o tratamento experimental.
A promessa:
• Transplantes terapêuticos
1. Podem crescer em cultura indefinidamente (fáceis de manter)2. Pluripotentes (formam vários tipos de células)3. A presença de vírus/doenças transmissíveis pode ser analisada4. Assumem o fenótipo das células vizinhas após transplante5. Possuem a capacidade de migração após transplante6. Produzem factores que contribuem para a reparação tecidular
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Terapia Génica
• É um novo ramo terapêutico da medicina moderna.
• Permite a transferência de informação genética em células, tecidos ou órgãos de pacientes para que o produto da sua expressão possa curar ou retardar a progressão da doença.
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Terapia Génica
• Esta abordagem permite tratar doenças:
- eliminando genes deletérios
- substituir genes anormais por genes normais
- introduzir genes que codificam proteínas mediadoras, por ex do sistema imunológico que ajudem a combater o cancro
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Tipos de Terapia Génica
• Terapia Génica in situ – O gene(s) terapêutico transportado por um vector é directamente administrado ao tecido afectado.
• Terapia Génica in vivo - O gene(s) terapêutico transportado por um vector é directamente administrado ao doente.
• Terapia Génica ex vivo – As células do paciente são colhidas e semeadas em laboratório. São incubadas com vectores que transportam o gene terapêutico. As células com a nova informação genética são colhidas e transplantadas no paciente.
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Terapia génica: onde?
• Terapia germinativa – O gene é inserido no DNA das células germinativas (óvulo ou espermatozóide), de modo a que a descendência tenha o gene inserido.
• Terapia somática – Envolve a manipulação da expressão génica em células que ser alteradas no paciente mas não nos seus descendentes. As células somáticas incluem todas as células do corpo humano menos as reprodutivas.
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Vectores: veículos que transportam e protegem o DNA até à
sua chegada a uma população celular alvo
• Viralintegram o seu material
genético no genoma hospedeiro
-Retrovirus-Lentivirus (HIV)-Adeno-associados
Mantêm o seu material genético epissomal
-Adenovirus
• Não viralFísico
-Injecção do DNA livre na célula-Electroporação
Químico
-Lipossomas
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• SCID ligada ao X (Severe Combined Immune Deficiency)
- Mutação no gene que codifica a proteína "c presente na membrana celular dos precursores dos linfócitos
- Estes não diferenciam em linfócitos NK e T- 3 das 17 crianças tratadas desenvolveram leucemia
• Hemofilia
- Mutação nos genes que codificam factores de coagulação- O gene terapêutico foi inserido no fígado dos doentes - O efeito terapêutico foi transiente, pois as células geneticamente
modificadas foram destruídas pelo sistema imune dos doentes.
Terapia Génica: Doenças
genéticas
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• Cancro
Terapêutica: Terapia Génica suicida; Terapia viral oncogénica ( Vírus modificados que reconhecem as células tumorais e promovem a sua lise) etc.
2/3 dos ensaios clínicos são para cancro
• Doenças Neurodegenerativas
Terapêutica: Remover células da pele de doentes de Alzheimer, introduzir o gene que codifica o NGF (Nerve growth factor), e injectar estas células no cérebro dos doentes.
Terapia Génica: Doenças
adquiridas
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Terapia Génica & Terapia Celular
• Terapia Celular – Infusão ou transplante de células num paciente para o tratamento de doenças herdadas ou adquiridas
Sobreposição das terapias génicae celular: Ex – Utilização de linfócitos-T no tratamento do cancro. Muitos tumores são reconhecidos e destruídos pelas células T dos doentes. Isolam-se os linfócitos-Te expandem-se fora do corpo, para depois serem administrados ao doente. Estas células podem ser manipuladas geneticamente por forma a tornarem as células eficientes a matarem as células tumorais.
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Manipulação genética e selecção das células
estaminais em cultura
Para introduzir o material genético no interior da célula é necessário fazer chegar o gene até às células defeituosas.
Transfecção, processo de entrega e expressão de material genético com sucesso.
(lipossomas, DNA desaparece em poucos dias ou semanas se transiente)
(vector viral, transfecção estável, integração no genoma da células hospedeiras, mas episomal)
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Integração “random”-silenciamento de genes, -introdução de mutações
Recombinação homóloga(processo de reparação do DNA)
Processo raroIntegração do transgene no genoma das células
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Terapia génica: Hoje Janeiro, 2008
• Distrofia Muscular Duchenne
Gene que codifica a proteína distrofina (A distrofina é uma proteína que faz parte do complexo que liga o citoesqueleto de uma fibra muscular à matrix extracelular, através da membrana celular) está presente no cromossoma X. Mutações neste gene dão origem à distrofia muscular Duchenne em indivíduos do sexo masculino.
Injecção no musculo: gene da distrofina
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Estes doentes não têm linfócitos-T e têm poucos ou disfuncionais linfócitos B.
Terapêutica: Transplante de medula ossea.
Ou Terapia Génica: o gene da ADA é inserido nas células da medula
óssea do próprio doente. Estas células são depois administradas ao doente após
uma depleção moderada das células da medula óssea.
(SCID) (severe combined immunodeficient)
por deficiência da adenosina deaminase
(ADA)
Terapia génica: Hoje Outubro, 2007
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RNAi em células estaminais
• O RNA de interferência pode ser usado para manter um
determinado nível de actividade de um gene.
• A supressão estável de genes deletérios por RNAi, em células
estaminais adultas isoladas e modificadas ex vivo e depois
reintroduzidas, pode ser uma nova estratégia no tratamento de
determinadas doenças.
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RNA de interferência (RNAi):
• Processo biológico
altamente conservado,
desde os nemátodos até
ao homem.
• Regulação da expressão
génica por silenciamento
RNA de interferência
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Aplicações
1. Análise funcional de genes (genómica funcional)
a supressão estável dos genes pode ser induzida nas células de mamíferos, permitindo estudar os seus fenótipos em várias gerações de células,
estudo de genes implicados nas vias metabólicas;
2. Identificação de genes implicados no processo
tumoral;
3. Desenvolvimento de novas abordagens
terapêuticas:
cancro " inibição da expressão de oncogenes ou de genes que conferem resistência à quimioterapia,
doenças virais " inibição da replicação do vírus da SIDA ou do vírus da hepatite.
A quase totalidade dos 19 000 genes do C. elegans foi estudada por RNAi.
RNA de interferência e sua importância na
biomedicina molecular
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A promessa:
• Terapia génica
1. São facilmente transfectáveis com genes terapêuticos, podendo expressar mais de um gene de interesse
2. Apresentam uma implantação correcta no tecido hospedeiro, permitindo a transcrição genética, logo a expressão proteíca
3. Migram para áreas lesadas, permitindo a “distribuição”de genes em diferentes áreas (cérebro)
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Bioética
• O que é a vida?
• Um ser Humano vivo tem de ser protegido jurídica, ética e moralmente.
Critérios de morte cerebral por declaração da Ordem dos Médicos prevista no artigo 12º da Lei nº 12/93 de 22 de Abril, pressupõem que a certificação requer a demonstração da cessação das funções do tronco cerebral e da sua irreversibilidade. Após se assegurarem as condições prévias, como por exemplo a ausência de respiração espontânea e se observarem as regras de semiologia, que presupõem a ausência na totalidade de determinados reflexos do tronco cerebral, a verificação de morte cerebral requer entre outras metodologias a execução das provas de morte cerebral por dois médicos especialistas.
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• Portanto, se um indivíduo morto é aquele que não responde a um estimulo doloroso, não respira espontaneamente, etc
então será cientificamente correcto dizer que um zigoto ou óvulo fertilizado não é um indivíduo vivo, mesmo que tenha todo o potencial de vir a ser?
Bioética
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