Title 微小管運動における運動方向および速度制御に関する研究( Dissertation_全文 )

Author(s) 中原, 佐

Citation Kyoto University (京都大学)

Issue Date 2015-09-24

URL https://doi.org/10.14989/doctor.k19305

Right 許諾条件により本文は2016-04-01に公開; 許諾条件により要旨は2015-10-01に公開

Type Thesis or Dissertation

Textversion ETD

Kyoto University

微小管運動における

運動方向および速度制御に関する研究

中原 佐

i

目次

第 1 章 緒論 ................................................................................................ 1

1.1 背景 .................................................................................................................... 1

1.2 微小管の運動方向制御 .................................................................................... 4

1.3 微小管の速度制御 ............................................................................................ 6

1.4 本論文の目的 .................................................................................................... 8

1.5 本論文の構成 .................................................................................................... 9

参考文献 ...................................................................................................................... 11

第 2 章 電界による微小管の運動方向制御 ......................................... 15

2.1 緒言 .................................................................................................................. 15

2.2 マイクロ流体デバイスの原理と構造 .......................................................... 17

2.2.1 原理................................................................................................................ 17

2.2.2 提案する原理のデバイス .......................................................................... 17

2.3 実験方法 .......................................................................................................... 18

2.3.1 密閉型マイクロ流路の作製プロセス ..................................................... 18

2.3.2 マイクロ流路内におけるアッセイ系の構築方法と電界による方向制

御のための電極構造 .................................................................................. 22

2.3.3 電界による方向制御のための計測装置 ................................................. 23

2.4 実験結果と考察 .............................................................................................. 24

2.4.1 密閉型マイクロ流路構造の作製.............................................................. 24

2.4.2 マイクロ流路内におけるアッセイ系の構築 ......................................... 29

2.4.3 電界による運動方向の制御結果.............................................................. 30

2.5 結言 .................................................................................................................. 32

参考文献 ..................................................................................................................... 33

第 3 章 励起光と金薄膜を用いた微小管速度制御技術の開発 ......... 35

3.1 緒言 .................................................................................................................. 35

3.2 局所的な速度制御を実現する原理とデバイス .......................................... 36

ii

3.2.1 原理................................................................................................................ 36

3.2.2 提案する原理のデバイス .......................................................................... 37

3.3 実験方法 .......................................................................................................... 38

3.3.1 金薄膜のパターニングとフローセルの構築方法 ................................ 38

3.3.2 温度センサの校正方法 .............................................................................. 42

3.3.3 速度評価の実験装置と計測・評価方法 ................................................. 43

3.4 結果と考察 ...................................................................................................... 45

3.4.1 パターン作製の結果 .................................................................................. 45

3.4.2 温度センサの校正結果 .............................................................................. 46

3.4.3 微小管速度の計測結果 .............................................................................. 48

3.4.4 温度依存性の検証結果 .............................................................................. 50

3.4.5 速度切り替えの計測結果 .......................................................................... 52

3.5 結言 .................................................................................................................. 53

参考文献 ..................................................................................................................... 55

第 4 章 金/SU-8 構造による微小管の局所的速度制御 ....................... 57

4.1 緒言 .................................................................................................................. 57

4.2 光の照射範囲内における速度差を実現する原理とデバイス .................. 57

4.2.1 原理................................................................................................................ 58

4.2.2 デバイスの構造 ........................................................................................... 59

4.3 解析モデルと解析条件 .................................................................................. 60

4.4 実験方法 .......................................................................................................... 62

4.4.1 デバイスの作製とフローセルの構築方法 ............................................. 62

4.4.2 励起光の照射範囲内における温度分布の計測方法 ............................ 69

4.4.3 アッセイ系の構築と微小管速度の計測・評価方法 ............................ 69

4.5 結果と考察 ...................................................................................................... 70

4.5.1 解析結果 ....................................................................................................... 70

4.5.2 デバイスの作製結果 .................................................................................. 72

4.5.3 温度勾配の計測結果 .................................................................................. 73

4.5.4 微小管速度の計測結果 .............................................................................. 74

4.6 結言 .................................................................................................................. 78

参考文献 ..................................................................................................................... 80

iii

第 5 章 結論 .............................................................................................. 83

5.1 本論文の結論 .................................................................................................. 83

5.2 将来への展望 .................................................................................................. 85

5.2.1 複数の微小管を対象とした方向制御 ..................................................... 85

5.2.2 反応および濃縮を目的とした微小管の速度制御 ................................ 85

本論文に関する公表論文 ......................................................................... 87

謝辞 91

1

第 1章 緒論

1.1 背景

生体内で起こる細胞分裂や鞭毛運動，筋収縮などの運動は，生物の活動を維持

する上で不可欠である．細胞分裂時には，染色体を二つの娘細胞に分裂するため

の紡錘体が形成された後，DNA の核分裂および細胞質の分裂が起きる．また，

筋収縮の場合は，神経系から伝達された刺激によって，互い違いに重なった筋繊

維が収縮することで物理的な力を生成する．さらに，精子などの鞭毛運動は，鞭

毛の基部から先端部へ向けた波状運動によって，遊泳に必要な推進力を生み出

している．これらの運動を担っているのが回転運動型のモータタンパク質と直

線運動型のモータタンパク質である[1, 2]．回転運動型モータタンパク質の一つ

である F1-ATPase は，ミトコンドリア内膜などに存在し，生命のエネルギー源で

あるアデノシン三リン酸(ATP: adenosine triphosphate)を合成する．また，直線運

動型モータタンパク質の例としてはキネシンやダイニンがあり，これらは細胞

骨格である微小管上を移動することができる．キネシンは，大きさ約 80 nm の

タンパク質であり[3]，ATP 結合部位である二つの頭部と一つの尾部から構成さ

れており，ATP の加水分解によって二つの頭部が微小管に対して結合と乖離を

交互に繰り返すことで，微小管上を歩くように移動する[4](図 1-1)．

キネシンの運動の足場となる微小管は，チューブリンおよびチューブリン

の非共有結合によって結合した二量体がフィラメント状に連なり，それが螺旋

状に 13 本集まってできた直径約 25 nm，長さ数十 µm の管状構造のタンパク質

である(図 1-2)[5]．微小管はプラスとマイナスの極性を有し，その極性は，管状

構造の重合速度によって決まり，形成が早い方がプラス端，遅い方がマイナス端

となる．微小管上を運動するキネシンは，マイナス端からプラス端方向へ移動す

る．

微小管上を移動するモータタンパク質の運動系を生体外で再構築し，その運

動機構の解明や対象物質を輸送するための研究が生化学の分野で多くおこなわ

れてきた．例えば Svoboda らは，微小管上を運動するシリカビーズ修飾したキネ

シンを光ピンセットで捉え，光ピンセットで捉えた中心位置からの移動距離を

計測することで，キネシンの二つの頭部が一回のステップで約 8 nm 移動するこ

とを明らかにしている[6]．また，Muthukrishnan らは，微小管をポリリジン(PLL)

で表面処理したガラス基板上に吸着させた後，ビオチン-アビジン結合を用いて

2

量子ドットを修飾したキネシンを導入し，全反射照明蛍光顕微鏡を利用して微

小管上を移動するキネシンの移動距離および速度を評価している[7]．さらに，

Yokokawa らは，ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いて作製した流路内に PLL

を導入し，その後，微小管を PLL 上に選択的に吸着させることで，幅 30 µm の

パターンを足場として構築し，蛍光ビーズおよび微小構造体を対象としたキネ

シンによる輸送を実証している[8]．

これらは，モータタンパク質の選択的な移動特性を利用して，分子等の検出や

輸送をおこなうものであり，特に近年は，その応用が注目されている µTAS

(Micro Total Analysis Systems)分野への展開が期待されている．しかし，微小管を

基板上に固定した上記の運動系の場合，微小管上を移動するキネシンは，二つの

頭部を交互に動かす際に熱揺らぎの影響を受けて数 µm で微小管から剥離する．

そのため長距離の輸送は難しい[9]．また，微小管の長さ以上にキネシンを移動

させることはできない．そこで，微小管を基板上に固定するのではなく，キネシ

ンを基板上に固定し，その上で微小管を移動させるグライディングアッセイと

いう運動系が Vale らによって提案されている[10]．グライディングアッセイ系

においては，キネシンを固定している範囲内を微小管が移動できるため，移動距

離はキネシンの固定範囲に拡張することが可能となる．グライディングアッセ

イ系の概念図を図 1-3 に示す．ガラスまたはシリコン基板上にキネシンを非特異

的に固定し，その上に微小管を導入し，ATP 溶液を加えることで，モータタンパ

ク質の微小管に対する結合と乖離の運動により，微小管は相対的にキネシン上

図 1-1 生体内におけるキネシン-微小管の運動系．

図 1-2 微小管の極性．

3

を移動する．この運動系を利用する場合は，微小管に分子等の対象物質を修飾す

ることにより，微小管が物質を運ぶことになる．

溶液中に浮遊する分子などの対象物質を微小管に特異的に結合する系を構築

し，グライディングアッセイ系によって目的の領域へ輸送および収集すること

ができれば，濃度の低い分子の計測や定量化なども可能になる．また，目的の分

子を特定の領域に運び，そこで反応を起こす実験系を構築できれば，極微量また

は分子スケールでの反応の様子を観察することが可能となる．さらに，微小管の

移動速度を制御することができれば，ナノスケールの物質を迅速に輸送するナ

ノトランスポータとして利用することが可能である．このように，グライディン

グアッセイ系において，微小管と対象物質の特異的な分子系を構築して目的の

領域へ移動させることが可能になれば，多くの利用領域を創出することが可能

になる．

しかし，アッセイ系の環境が変化しない場合，キネシン上を移動する微小管の

方向は不規則な向きとなり，また，その移動速度はアッセイ系全体で一様となる．

不規則な移動方向は，キネシンに固定されていない微小管の先端部がブラウン

運動の影響を受けるためだと考えられる．そのため，目的の領域へ微小管を操作

するには，キネシン上を移動する微小管に電界や磁界，流れ場などの外力を作用

させて，微小管の進行方向を決める先端部を制御する必要がある．また，微小管

の移動速度についても，特定の領域およびタイミングで微小管による物質輸送

をおこなうためには，外力による作用力を微小管に与える方法やキネシンのATP

加水分解サイクルを制御する方法などによって，迅速かつ局所的な物質輸送が

おこなえる方法を確立する必要がある．そこで本研究では，グライディングアッ

セイ系における微小管の運動方向および速度制御を目的とした新たな方法を提

案し，その有効性を考察する．本章の以下では，微小管の運動方向制御および速

度制御に関する現状を概説した後，本研究の目的および本論文の構成について

図 1-3 グライディングアッセイ．

4

述べる．

1.2 微小管の運動方向制御

図 1-3 の概念図に示すように，基板上に固定するモータタンパク質のキネシン

は，稠密に基板上に固定できるのではなく，固定の際にはキネシン間に隙間が生

じる．微小管がモータタンパク質上を移動する場合，図 1-4(a)に示すように微小

管の先端はモータタンパク質と結合している状態と，図 1-4(b)に示すように結合

していない状態の 2 種類が生じる．微小管の先端が基板上のキネシンに結合し

ていない場合，微小管の先端は，ブラウン運動の影響や微小管が極性をもつこと

による電界の影響および流れ場によるせん断力の影響などを受けて進行方向を

決定する．

すなわち，流れ場や電界などを微小管に作用させることにより，微小管の移動

方向を操作することが可能である．図 1-5(a)に示すように，Heuvelらは，幅 2 µm，

深さ 800 nm の微小流路内にアッセイ系を構築し，電界によって微小管の運動方

図 1-4 グライディングアッセイ系における先端部の運動 (a)先端がキネ

シンと結合している状態，(b)先端がキネシンと結合していない状態．

図 1-5 微小管移動方向の操作方法 (a)電界による操作方法，(b)微小構造

による操作方法．

5

向を制御する方法を提案している[11]．また，Kim らは，作製した幅 400 µm，深

さ 100 µm のマイクロ流路内に流れ場を印加し，せん断力をキネシン上の微小管

に作用させることによって微小管の進行方向を操作する方法を提案している

[12]．さらに，Huang らは，図 1-5(b)に示すような幅 5 µm，深さ 1 µm の微小流

路構造を作製し，一方向に整流する構造を利用して微小管の運動方向を制御し，

目的の領域内に回収する方法を提案している[13]．しかし，これまでに提案され

ている方法において，グライディングアッセイ系による濃縮や分離を目的とし

た密閉型のマイクロ流路構造を考案し，その作製条件を導出するとともに，アッ

セイ系を構築するための送液条件の検討，そして微小管の運動方向の制御まで

をおこなった例は報告されていない．ナノスケールのキネシンおよび微小管を

有効に利用するための微小流体システムを提案する上では，上記の内容を検討

し，その有用性を示す必要がある．

使用する密閉型のマイクロ流路は，微小管およびキネシンの大きさがナノス

ケールであることから，その運動系を用いて対象分子を回収し濃縮する場合，流

路体積をできるだけ小さくすることが重要である．また，密閉型のマイクロ流路

内においてグライディングアッセイ系を構築するためには，キネシン，微小管，

そして ATP 溶液を順次導入する必要がある．溶液を導入する際には，流路体積

を小さくした場合，圧力損失の影響により高い圧力が必要となる．これまでに，

圧力送液によってマイクロ流路内に溶液を導入する方法が多く報告されており，

酵素反応などを観察できる実験系が提案されているが[14, 15]，送液時の圧力が

基板上に固定したキネシンへ与える影響については検証されていない．そのた

め，送液圧力を変化させたときのアッセイ系を評価し，その圧力条件について検

討する必要がある．

また，密閉型のマイクロ流路を作製する場合，送液時に印加する圧力に耐えら

れる構造と微小管の蛍光観察が可能となる材料の透過性が不可欠である．これ

までに，蛍光観察が可能な密閉型マイクロ流路の作製方法として，図 1-6(a)に示

すような PDMS (Polydimethylsiloxane)とガラス基板を接合する方法および図 1-

6(b)に示すようなガラス基板同士を接合する方法が広く用いられている．PDMS

を用いる方法は，SU-8 などのフォトレジストを用いて鋳型を作製し，それを元

に PDMS で型取りをおこない，ガラス基板と接合させて密閉型マイクロ流路を

構築する．この方法は，鋳型を用いた大量生産に適していることや，溶液導入用

の孔を先の開いたパンチなどによって容易に形成できる特徴を有しているが，

ガラス基板と PDMS の表面電荷密度が異なるため，電界を印加したときの電気

浸透流は安定しない[16]．そのため，電界によって微小管を操作する場合，一様

な作用力を与えることができない可能性がある．一方，ガラス同士の接合によっ

て作製した密閉型のマイクロ流路は，同じ材質で構成されているため，電界を印

6

加したときの電気浸透流は PDMS を用いた場合に比べて安定している．ガラス

を用いて密閉型のマイクロ流路を作製する場合，用意した二枚の基板の内，片方

の基板に流路構造を作製し，溶液導入用の孔を穿孔した後，もう一枚の基板と接

合する必要がある．これまでに，ガラス接合の方法として，熱融着[17]や低濃度

のフッ化水素酸[18-20]，およびケイ酸ナトリウム水溶液などを用いた方法が提

案されており[21, 22]，用いる接着剤の濃度や温度，圧力条件を変化させること

で，ガラス接合に対する影響が評価されている．しかし，基板表面に残る微粒子

の除去に必要な洗浄工程，基板表面に残る水分を除去するための脱水ベーク処

理，およびガラス基板同士の接着力に影響するケイ酸ナトリウム溶液の塗布条

件について，一連の工程をそれぞれ検討し，接合を評価した例は報告されていな

い．高い圧力送液に耐えることができる密閉型のマイクロ流路を作製するため

には，用いる基板の洗浄から接合までの工程を評価し，その接合条件を導出する

必要がある．

1.3 微小管の速度制御

グライディングアッセイ系の微小管速度は，通常 0.6 μm·s−1から 0.8 μm·s−1で

あり[23]，グライディングアッセイ系を用いて迅速な分子の輸送や分離，濃縮を

図 1-6 密閉型マイクロ流路の作製方法 (a)PDMS とガラス基板を張り合

わせる方法，(b)ガラス基板同士を張り合わせる方法．

7

実現するためには，微小管の移動速度を制御する方法が必要である．

グライディングアッセイ系において微小管の移動速度を制御する方法として

は，キネシンの運動機構を制御する方法とキネシン上を移動する微小管に外力

を作用させる方法が提案されている．キネシンの運動機構を制御する方法とし

て，キネシンの ATP 加水分解サイクルが酵素の温度依存性に従うことを利用し

た方法が提案されている[24-27]．Böhm らは，観察用の顕微鏡を囲むチャンバー

型の温度制御装置を用いて，アッセイ系の雰囲気温度を制御し，温度変化に対す

る微小管速度の変化を評価している[24]．また，ATP 濃度やバッファ条件によっ

て制御する方法も提案されており，Böhm らは，フローセル内に構築したアッセ

イ系の ATP 濃度を変化させることで微小管速度が制御できることを示している

[28, 29]．そして，キネシンの運動機構を光変異性物質によって制御する方法も

提案されており[30-37]，Kumar らは，光変異性アゾベンゼンをキネシンの尾部に

修飾し，ATP の加水分解サイクルを紫外線および可視光の切り替えによって制

御することで，図 1-7(a)に示すように微小管速度を ON/OFF で切り替える方法を

提案している[36]．さらに，微小管速度を外力によって制御する方法としては，

電場や流れ場を用いた方法が提案されている[38, 39]．Dujovne らは，微小管が負

に帯電している特性を利用し，電界による外力を微小管に作用させることで，マ

イクロ流路内を運動する微小管の速度を目的の速度に制御する方法を提案して

図 1-7 微小管運動の速度制御方法 (a)光変異性アゾベンゼンによる制御

方法，(b)Caged-ATP と紫外線照射による方法．

8

いる[38]．これまでに微小管速度を制御するために多くの方法が提案されており，

その多くは一様な外力によってフローセルなどのアッセイ系全体の微小管速度

を一括で操作することを可能にしているが，アッセイ系の異なる領域間で速度

差を生じさせる方法は提案されていない．構築したアッセイ系において，異なる

領域上にそれぞれ微小管の速度を設定し，目的の速度で操作することが可能に

なれば，複数の領域で分離操作や濃縮，反応をおこなう分子アプリケーションに

有用であると考えられる．したがって，上記の分子アプリケーションを実現する

ためには，一つのアッセイ系において，異なる速度で制御できる方法の確立が必

要である．

また，ナノスケールのキネシン-微小管の運動系を利用し，効率的な分子アプ

リケーションへと展開する上では，局所的な速度制御を実現する方法が必要不

可欠である．これまでに局所的な速度制御をおこなう方法として，光による温度

変化もしくは光変異性物質を利用した方法が提案されている．Kawaguchi らは，

直径 10 μm のアルミパターンをガラス基板上に作製し，そこに赤外線レーザー

を照射することで温度勾配を形成し，照射位置からの距離に応じた速度変化を

評価している[27]．また，Reuther らは，ガラス基板上にカーボンコーティングを

施し，そこに直径 20 μm の可視光を照射することで局所的な温度変化を生じさ

せる方法を提案し，温度に依存した微小管速度の変化を評価している[40]．さら

に，Tucker らは，紫外光の照射によって ATP が解放される Caged-ATP を用いて，

フローセル内にアッセイ系を構築後，直径 15 μm の紫外光を照射し，図 1-7(b)に

示すような微小管速度の勾配を形成する方法を提案している[32]．上記に示すよ

うな局所的な微小管速度の制御方法が提案されてきているが，これらは光を照

射した範囲内の微小管速度を制御する方法であり，照射範囲内において速度差

のある制御を実現することには至っていない．光の照射範囲内において，局所的

な速度制御が可能になれば，ナノスケールのキネシン-微小管の運動系を有効に

活用できるだけでなく，制御系の簡易化や微小領域における分子操作などを対

象とする分子アプリケーションへの応用性が期待できる．そのため，光の照射内

における局所制御を実現する方法が必要である．

1.4 本論文の目的

本研究は，基板表面上に固定したキネシン上で微小管を移動させる，グライデ

ィングアッセイ系を用いて溶液内に分散する分子の収集や搬送，濃縮などを実

現するために必要な移動方向制御と速度制御の方法について，新たな方法を提

案するとともに，その有効性を考察することを目的とする．

微小管の移動方向の制御については，密閉型のマイクロ流路構造の提案とそ

9

の作製工程の導出，マイクロ流路内におけるアッセイ系の構築と電界による微

小管の制御方法を提案する．密閉型マイクロ流路の作製に関しては，二枚のガラ

スを接合するときに必要な洗浄，脱水ベーク，および接着剤として利用するケイ

酸ナトリウム溶液の塗布条件を検討する．また，作製したマイクロ流路内にアッ

セイ系を構築するために，送液時の圧力条件を検討する．そして電界によって微

小管の運動方向を制御するとともに，その制御性の有意性に関して従来方法と

比較し，考察をおこなう．

速度制御に関しては金薄膜への励起光照射による昇温効果を用いることで，

アッセイ系の温度制御をおこない，酵素の温度依存特性を利用した微小管の速

度制御方法を提案する．微小管の移動速度が温度に依存していることを確認す

るために，微細加工技術によって温度センサを基板上に集積し，励起光強度に対

する温度変化および微小管の速度変化を計測する．また，ヒーターを用いた実験

系の速度変化と比較することで，提案する方法の温度依存性を検証する．さらに，

励起光強度の切り替えによる微小管の速度変化を計測することで，連続的に速

度制御がおこなえることを実証するとともに，提案する方法の有効性について

考察する．

また，金薄膜への励起光照射による微小管の速度制御を改善し，一視野内で速

度差を生じさせる方法を提案する．局所的な速度差を生じさせるためには，急峻

な温度勾配を形成する必要があり，それを実現するためには，熱伝導率および比

熱容量が異なる材料を用いることが有効である．本研究では，シリコン基板と

SU-8 を用いて，放熱性と断熱性を有する構造を一つの基板上に作製する．温度

勾配の評価は，基板上に作製した温度センサを用いて，センサの中心位置に励起

光を照射したときの温度とセンサから離れた位置に照射したときの温度を比較

することで，照射範囲の内側と外側における温度勾配を評価する．さらに，シリ

コン基板上の SU-8 構造表面に金薄膜を成膜した Au/SU-8/Si 構造とシリコン基

板上に直接金薄膜を製膜した Au/Si 構造の境界面における微小管運動の速度分

布を計測し，提案する制御方法の空間分解能を評価するとともに，その有効性に

ついて考察する．

1.5 本論文の構成

本論文は 5 章から構成される．

第 2 章では，微小流体デバイスの作製条件の検討および流路内におけるアッ

セイ系の構築条件の導出，そして電場による微小管の制御方法を提案する．密閉

型の微小流体デバイスは，微細加工技術によって形成した流路構造を有する石

英ガラス基板ともう一枚の石英ガラス基板を接合することによって閉じた流路

10

構造を作製する．接合に関しては，基板表面に残る微粒子の洗浄，脱水ベーク処

理，および接着剤として利用するケイ酸ナトリウム溶液の塗布条件を検討し，再

現性の良い接合条件を明らかにする．また，マイクロ流路内におけるアッセイ系

の構築については，蛍光溶液および純水の圧力送液をおこない，溶液の置換を確

認した後，アッセイ系の構築に必要なキネシン，微小管，および ATP 溶液を順

次流し入れ，印加する圧力を変化させたときのアッセイ結果を比較し，送液時の

圧力が基板に固定したキネシンに与える影響を検証する．さらに，微小流路内に

電場を印加し，微小管の運動方向を制御するとともに，その運動軌跡を従来研究

の結果と比較することで，本研究で提案した方法の有効性について考察する．

第 3 章では，励起光と金薄膜による微小管速度の制御方法を提案する．まず，

励起光による温度変化を評価するために，温度センサを金のパターニングによ

ってガラス基板上に作製し，励起光の照射強度の変化に対する温度変化および

微小管の速度変化を計測する．また，励起光による微小管の速度変化が温度に依

存して変化することを実証するために，温度制御装置を用いた別の実験系で得

た計測結果と本研究で得た結果を比較し，その有意性を評価する．さらに，励起

光の強度を連続的に切り替えることで，微小管の運動が励起光の強度に追従し

て変化する様子を観察し，迅速な速度制御が可能であることを明らかにする．

第 4 章では，3 章で提案する励起光と金薄膜による方法について，局所的な速

度差を生じさせることができる方法を提案する．熱伝導率および熱容量の異な

る素材であるシリコン基板と感光性レジストの SU-8 に着目し，金薄膜で生じた

熱を保持する領域と放熱する領域を組み合わせることで局所的な温度勾配を形

成し，微小管の速度差を生じさせる．提案する方法について，数値解析シミュレ

ーションをおこない，用いる材料の断熱特性および温度勾配を評価する．また，

パターニングをおこなった SU-8 の構造上に金薄膜を成膜し，アッセイ系を構築

する．アッセイ系を構築後，励起光の強度および SU-8 の膜厚に対する微小管の

速度変化を計測し，その制御性を明らかにする．さらに，Au/SU-8/Si 構造と Au/Si

構造の境界面に励起光を照射したときの一視野内の速度分布を計測することで，

提案する方法の空間分解能を評価するとともに，その有効性について考察する．

第 5 章では，本論文の成果について総括をおこない，将来への展望について

記述する．

11

参考文献

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15

第 2章 電界による微小管の運動方向制

御

2.1 緒言

溶液中に存在するタンパク質などの分子を分離や濃縮する方法として，さま

ざまな方法が提案されているが，その多くは分子が電荷を帯びていることや分

子量の違いを利用して濃縮する方法である[1, 2]．微小管に対象の分子を特異的

に吸着させるための分子修飾をおこない，微小管を運動させて溶液内に分散す

る対象の分子を目的の領域に集めることができれば，濃度の低い溶液中でも分

子を回収し濃縮することが可能となるため，計測の高感度化などを実現するこ

とができる．微小管を目的の領域に集めるためには，微小管が分極していること

を利用し，電界を外力として作用させて，微小管の運動方向を制御する必要があ

る．また，微小管によって分子を回収し濃縮するためには，微小管が直径約 25

nm と小さいことから，密閉型のマイクロ流路を利用する場合においても，微小

管を流路底面で運動させる場合には，流路体積をできるだけ小さくし，単位体積

あたりに占める微小管の割合を大きくすることが必要不可欠である．

微小管を流路内で運動させるには，キネシンを流路内の底面に吸着させた後，

微小管を導入し，最後に ATP を導入する，いわゆるアッセイ系を構築する必要

がある．上述したように，流路の構造としては，流路の幅や高さをできるだけ低

くした密閉型のマイクロ流路が必要である．密閉型のマイクロ流路内にアッセ

イ系を構築し，分子の濃縮などをおこなう場合には，キネシン・微小管・ATP 溶

液および対象分子を含むタンパク溶液をマイクロ流路内に導入するために，高

い圧力で送液する必要がある．そのため，密閉型のマイクロ流路は，タンパク質

を含む溶液の圧力送液に耐えることができる構造が必要である．

密閉型のマイクロ流路の作製には，PDMS (polydimethylsiloxane)を用いる方法

やガラス基板同士を接合する方法などがある．PDMS を用いる場合，マイクロ流

路を鋳型の型どりによって作製し，その後，ガラス基板などに貼り合せることで

密閉型のマイクロ流路を作製できる．しかし，PDMS とガラスの表面電荷密度は

異なるため，電界を印加したときの電気浸透流は安定しない[3]．そのため，電界

によって微小管を操作する場合には，微小管にかかる作用力を一様にできない

可能性があり，PDMS の使用は適切ではない．一方，ガラス同士の接合を用いる

方法は，作製したマイクロ流路の表面電荷密度が同じであることから，電界を印

16

加したときの電気浸透流は PDMS を用いた場合に比べて安定している．ガラス

を用いたマイクロ流路の作製には，まず，一方のガラス基板上にマイクロ流路構

造を作製し，タンパク質などの溶液を導入するための孔を設けた後，密閉のふた

となるもう一方のガラス基板を用意し，それら 2 枚を接合する必要がある．

ガラスの接合には，熱融着[4]や低濃度のフッ化水素酸[5-7]，または，ケイ酸ナ

トリウム水溶液などを用いて接合する方法が提案されている．ケイ酸ナトリウ

ム水溶液を用いた接合プロセスは，毒性のあるフッ化水素酸を用いた方法に比

べて比較的安全であり，熱融着で用いる高温炉のような大型の装置を必要とし

ない利点がある．そのため，ケイ酸ナトリウム水溶液を用いるガラス接合の研究

が多く報告されており[8, 9]，その中で接合プロセスについても考察されている．

Wang らは，2 wt%と 7 wt%のケイ酸ナトリウム水溶液を用いてガラスの接合を

おこない，その接着性および絶縁性について評価している[10]．また，Ito らは，

10 wt%のケイ酸ナトリウム水溶液を用いて 2 枚のホウケイ酸ガラス基板を接合

し，亜硝酸の濃度を計測するための化学分析チップを作製している[11]．しかし，

これらの研究では，塗布するケイ酸ナトリウム水溶液の濃度や膜厚，接合時の圧

力や温度条件について検討されているが，接合までに必要な基板の洗浄，脱水ベ

ーク，ケイ酸ナトリウム水溶液の塗布条件について，一連の工程をそれぞれ検討

し，接合を評価した研究は報告されていない．アッセイ系を実現する際に必要な

タンパク質の溶液を圧力送液によって導入できる密閉型のマイクロ流路を作製

するために，本研究では，まず基板の洗浄から接合までの工程を評価した．

また，密閉型のマイクロ流路内にタンパク質を含む溶液を送液する場合には，

マイクロ流路の圧力損失が大きいことから，高い圧力を必要とする．圧力による

マイクロ流路内への送液に関する研究は多く報告されており，Tsukahara らは，

微小流路内に蛍光基質と-ガラクトシダーゼを圧力送液によって導入し，30 秒

程度で酵素反応を観察できる実験系を提案している[12-14]．しかし，これらの研

究では，送液時の圧力がガラス基板上に固定したキネシンおよび微小管に与え

る影響については検証されていない．

溶液中の分子を微小管によって収集し，その後，目的の位置に微小管を集める

ためには，微小管の運動をマイクロ流路内で制御することが必要である．マイク

ロ流路内で，微小管の運動方向を制御する方法としては，電界や流れ場，微細構

造を用いた方法が提案されている[15, 16]．Heuvel らは，幅 2 µm，深さ 800 nm

の微小流路内にアッセイ系を構築し，電界によって微小管の運動方向を制御す

る方法を提案している[17]．また，Huang らは幅 5 µm，深さ 1 µm の微小流路を

作製し，一方向に整流する構造を用いて微小管の運動方向を制御し，濃縮する方

法を提案しているが，微小管を望む方向に自由に運動させることには至ってい

ない[18]．

17

そこで，本研究では，電界を用いた微小管の運動方向制御を密閉型のマイクロ

流路内で実現することを目的に，新たなデバイス構造の提案とその作製プロセ

スの導出，運動方向の制御方法を提案するとともに，その有効性に関して考察し

た．

2.2 マイクロ流体デバイスの原理と構造

2.2.1 原理

図 2-1 に，本研究で提案する電界を用いた微小管の運動方向制御をおこなう密

閉型のマイクロ流体デバイスの概念図を示す．

本研究では，極性をもつ微小管に対して電界を外力として作用させることで，

微小管の運動方向を制御する．密閉型のマイクロ流路内にキネシン・微小管・

ATP を導入し，ガラス基板に固定したキネシン上を運動する微小管に対し，電界

によって運動方向を制御することで得られる運動軌跡を計測する．そのため，提

案する密閉型のマイクロ流路構造には，電界を作用させる領域と微小管をその

領域へ誘導し，移動方向に対して垂直に電界が印加されるようにするためのマ

イクロ流路を設けた．また，電界を作用させる流路の先には，円形の回収構造を

有する領域を設けた．

2.2.2 提案する原理のデバイス

アッセイ系に必要なタンパク質を含む溶液を圧力送液によって導入し，電界

を正確にマイクロ流路内に作用させるためには，圧力送液への耐久性およびリ

ークのない密閉された構造が必要である．そこで，本研究では，密着性の高いガ

ラス接合を用いて密閉型のマイクロ流路を作製した．図 2-2 に本研究で提案する

マイクロ流路の概念図と構造図を示す．30 mm × 20 mm で厚さが 0.5 mm の石英

ガラスを用いて，その上に深さ 2 µm のマイクロ流路とキネシン・微小管・ATP

の導入用と回収用の直径 3 mm の 3 つの孔(インレットとアウトレット)を設け

た．その後，マイクロ流路に 30 mm × 20 mm で厚さが 0.17 mm の石英ガラスを

用いて封止することで，密閉型の流路を作製した．電界は 2 つのアウトレット

に電極を挿入し，電圧を印加することで作用させた．

図 2-2①は，微小管をインレットから導入するための流路であり，1.5 µm × 100

µm で深さ 2 µm とした．図 2-2②は，導入する流路から進入した微小管に対し，

電界を作用させて運動方向を制御するための流路であり，60 µm × 2.1 mm で深

さは 2 µm とした．制御流路の後流側には，微小管の制御作用により異なる角度

に運動した微小管をそれぞれ別々に回収するために，角度が 33.4 度の分岐構造

と図 2-2③に示すリング状の外径 25 µm，内径 22 µm，幅が 1.5 µm の流路を 2 つ

18

設けた．

図 2-1 提案方法の概念図．

図 2-2 マイクロ流路の概念図と構造図．

2.3 実験方法

2.3.1 密閉型マイクロ流路の作製プロセス

図 2-3(a)-(i)と図 2-4(a)-(d)に密閉型のマイクロ流路の作製プロセスを示す．

デバイスの作製プロセスは 1)クロムの蒸着，2)レーザー描画による流路パタ

ーンの作製，3)ウェットエッチング，4)ガラス穿孔，5)ガラス接合からなり，以

19

下にその手順と各プロセスにおける加工条件を示すとともに，5)以外の詳細を表

2-1 にまとめる．

1)クロムの蒸着

20 mm × 30 mm で厚さ 0.5 mm の石英ガラス基板(Corning 7980, Senyo-opt.)の

表面に残る有機物を除去するために，ピラニア溶液(硫酸:過酸化水素 = 3:1)を用

いて 100°C で 5 分間洗浄した．洗浄後，エッチング時にガラス面を保護するた

めに，抵抗加熱真空蒸着装置(VPC-260F, Ulvac)を用いて基板表面にクロムを 40

nm の厚さで成膜した．

2)レーザー描画による流路パターンの作製

クロムを成膜した基板の上に，レジストとの密着性を高めるため，プライマー

(OAP, Tokyo Ohka Kogyo)をスピンコータ(1H-D7, Mikasa)により塗布し，その後，

感光性ポジ型レジスト(S1805, Rohm and Haas Electronic Materials)をスピンコータ

で塗布した．

プライマーを 3000 rpm，30 秒間，また，レジストを 4000 rpm，30 秒間スピン

コートした．レジストの塗布後，ホットプレートを用いて，115°C で 1.5 分間プ

リベークした後，レーザー描画装置(µPG101, Heidelberg Instruments)を用いて流路

構造をレジスト上に描画した．CD-26 (Rohm and Haas Electronic Materials)を用い

て 1.5 分間現像をおこない，基板上に残ったレジストと基板の接着性を向上させ

るために，ハードベークとして 120°C で 5 分間加熱処理した．

3)ウェットエッチング

流路構造は 2)で作製したクロムのマスク構造を用いてウェットエッチングに

より作製した．

クロムエッチャント(S-24, Sasaki Chemical)を用いてレジストに保護されてい

ないクロムを取り除いた後に，石英ガラスを緩衝フッ化水素酸(LAL1400, Stella

Chemifa)を用いてエッチングすることで深さ約 2 µm の流路を作製した．

4)ガラス穿孔

流路構造を作製した石英ガラス基板にキネシン・微小管・ATP の導入用インレ

ットおよび電極挿入・回収用のアウトレットを機械加工により作製した．

インレットおよびアウトレットのための貫通孔の直径は 3 mm とした．穴の機

械加工には，超音波ドリル (SOM-121, Shinoda)および純水と研磨剤 (C600,

Maruto Instruments)を重量比 5:1 で懸濁したラップ液を使用した．貫通孔の加

工後，石英基板表面に残ったレジストおよびクロム膜をアセトンおよびクロム

20

エッチャントを用いて取り除いた．

5)ガラス接合

図 2−3 に示した工程で石英ガラス基板上に作製したマイクロ流路を図 2−4 に

示す工程でガラス接合をおこなうことで，密閉型の流路構造を作製した．接合は，

流路構造を作製した石英ガラス基板と 20 mm × 30 mm で厚さ 0.17 mm (Corning

7980, Senyo-opt.)の石英ガラス基板を a)基板の洗浄，b)脱水ベーク，c)ケイ酸ナト

リウム水溶液の塗布，d)熱圧着の工程により接合した．以下にその手順の詳細に

関して述べる．

a)基板の洗浄

流路構造を作製した石英ガラス基板に付着した有機物および切削片などの微

粒子を除去するため，ピラニア溶液(硫酸:過酸化水素 = 3:1, 180°C)を用いて洗浄

した後，超音波で励起した硝酸を用いて 30 分間洗浄した．また，封止用の石英

ガラス基板は，同様の条件で洗浄した後，基板表面の微小な凹凸を平滑化するた

めに緩衝フッ化水素酸を用いて 2 分間浸漬処理した．

b)脱水ベーク

洗浄後の脱水処理をするために，石英ガラス基板に対して 120°C で 5 分間加

熱処理した．

c)ケイ酸ナトリウム水溶液の塗布

流路を作製した基板と封止用の基板の接着には，ケイ酸ナトリウム水溶液

(193-08185, Wako)を接着剤として使用した．ケイ酸ナトリウム水溶液はスピンコ

ータを用いて封止用の石英ガラス基板上に塗布した．

d)熱圧着

ケイ酸ナトリウム水溶液を塗布した後，封止用の石英ガラス基板と流路を作

製した石英ガラス基板を貼り合せた．その後，基板を保護するためのフッ素樹脂

シート(F-8034-03, Flon industry)を用いて貼り合せた基板を挟み，熱プレス機によ

り 90°C で 2 時間熱圧着をおこなうことで，接合した．

21

表 2-1 マイクロ流路の作製条件．

Process name Condition Time

Substrate cleaning Piranha solution

(H2SO4:H2O2 = 3:1) 100°C 5 min

Chromium deposition 40 nm –

Spin coat

(OAP)

Slope 2 s

500 rpm 5 s

Slope 2 s

3000 rpm 30 s

Slope 2 s

Spin coat

(S1805)

Slope 2 s

500 rpm 5 s

Slope 2 s

4000 rpm 30 s

Slope 2 s

Prebake 115°C 1.5 min

Laser expose 40 mW, 50% –

Development CD-26 1.5 min

Hard bake 120°C 5 min

Chromium etching S-CLEAN S-24 1 min

Fused silica etching Buffered hydrofluoric acid 15 min

Drilling holes SOM-121 –

Residual resist removal Acetone 1 min

Chromium etching S-CLEAN S-24 15 min

22

図 2-3 マイクロ流路の作製プロセス (a)基板洗浄，(b)クロムの蒸着，(c)レ

ジストの塗布，(d)フォトリソグラフィ，(e)クロムエッチング，(f)ガラスエッ

チング，(g)ガラス穿孔，(h)レジストの除去，(i)クロム膜の除去．

図 2-4 接合プロセス (a)基板洗浄，(b)脱水ベーク，(c)ケイ酸ナトリウムの

塗布，(d)熱圧着による接合．

2.3.2 マイクロ流路内におけるアッセイ系の構築方法と電界による方向制御

のための電極構造

アッセイ系の構築に必要な 0.1 mg·mL−1キネシン(Casein 終濃度 0.2 mg·mL−1)，

TAMRA (C1171, Invitrogen)で蛍光標識した 0.1 mg·mL−1蛍光微小管，そして退色

防止剤を含む 1 mM ATP 溶液を調製した．試薬の濃度調整には BRB80 緩衝液(80

mM PIPES, 1 mM EGTA, 1mM MgCl2, pH 6.8)を使用した．詳細な試薬の調製方法

については，原著論文[19]に示す．

溶液の導入には，シリンジによる圧縮空気(圧空)を使用した．圧空を加える

際は，石英基板との密着性が高い PDMS を使用した．テフロンチューブとシリ

ンジを繋いだ厚さ約 5 mm の PDMS シートをデバイス上に貼り，シリンジから

の圧力を加えることによりインレットに溜めた溶液を送液した．圧力送液によ

って溶液交換ができることを確認するために，インレットから蛍光溶液と純水

を 50 kPa，1 分間で交互に送液し，流路内の蛍光輝度値が変化する様子を観察

した．アッセイ系を構築する際には，まず，キネシン溶液をインレットに滴下

23

し，圧空によってマイクロ流路内へ送液した．その後，PDMS シートを一旦取

り外し，微小管溶液をインレットに滴下した後，再度 PDMS シートを貼り合

せ，圧力送液をおこなった．最後に ATP 溶液を同様の手順で送液した．

アッセイ系の構築に必要な溶液を導入した後，微小管の運動方向を電界によ

って制御するために，電圧を印加する孔に合わせて穿孔した厚さ約 5 mm の

PDMS シートをデバイスに貼り合せた．穿孔した孔に ATP 溶液を溜めた後，そ

こに直流電源(E3612A, Agilent)と接続した白金電極を挿入した．

図 2-5 圧空による送液．

2.3.3 電界による方向制御のための計測装置

図 2-6 は実験系の写真であり，微小管の観察系の概念図を図 2-7 示す．微小管

の運動は，100 倍の油浸対物レンズ(UPLSAPO 100XO, Olympus)と CCD カメラ

(ORCA-D2, Hamamatsu)を備え付けた倒立顕微鏡(IX-71, Olympus)を用いて観

察した．倒立顕微鏡には，蛍光キューブ(U-FGW, Olympus)を設置しており，蛍光

観察の際は，波長 530–550 nm の光を蛍光微小管に照射し，蛍光微小管が発した

光のうち，波長 575 nm 以上の光を CCD カメラでとらえた．微小管の運動は，

蛍光顕微鏡による観察画像を画像処理ソフトウェア(HCImage, Hamamatsu)を用

いて，露光時間 500 ms，2 fps の動画として取得した．得られた動画から，解析

ソフト (Mark2, NICT)を用いて微小管の後端座標を 1フレーム毎に分析すること

で，微小管の運動軌跡を取得した．

24

図 2-6 微小管操作の実験系．

図 2-7 電界印加および微小管計測装置の概念図．

2.4 実験結果と考察

2.4.1 密閉型マイクロ流路構造の作製

図 2-8(a), (b)に回収領域のレジストの現像処理後とクロム膜のエッチング処理

後の写真を示す．クロム膜のエッチング処理と，その後のガラスのエッチング処

理により，幅 6.3 ± 0.19 µm (平均 ± 標準偏差，N = 5)，深さ 2.36 ± 0.01 µm (N =

3)のマイクロ流路を作製した．

25

図 2-9(a)に機械加工により作製したインレットとアウトレット周辺の写真を，

図 2-9(b)に回収部の写真を示す．穿孔時に使用した研磨剤や切削したガラス片が

基板上に付着し，これらはガラス接合をおこなう際，接合を阻害する要因となる．

そのため，接合前の工程として，これらを除去するための洗浄が必要である．

密閉流路を作製するためのガラスの接合処理に関しては，従来の研究事例に

おいても十分に検討された報告が無いことから，本論文では，a)基板の洗浄，b)

脱水ベーク，c)ケイ酸ナトリウム水溶液の塗布，d)熱圧着工程により接合をおこ

ない，a)，b)，c)の各処理においての考察をおこなった．石英ガラスの基板の洗

浄については，ピラニア溶液の洗浄時間に関して，プロセスの時間短縮を目的に，

洗浄時間の検討をおこなった．脱水処理については，脱水処理の有無がガラス接

合に与える影響を評価した．また，ケイ酸ナトリウム水溶液の塗布処理について

は，ケイ酸ナトリウム水溶液の濃度と膜厚が，基板同士の接着性に大きく影響す

ること，さらに，塗布した膜厚が大きい場合，接合時に流路構造の内部へケイ酸

ナトリウム水溶液が流入すると言う問題があるため，適切な濃度およびスピン

回転数を検討した．

図 2-10 に接合の検討項目をまとめるとともに，各項目による処理のフローを

示す．処理検討の条件の違いによるフローは図中の実線に沿って上から下に示

し，その接合割合を百分率で評価した結果を下部に Success rate として示した．

接合の可否はニュートン・リングの有無によって判断し，ニュートン・リングが

マイクロ流路上に無いときを接合できた割合として評価した．ニュートン・リン

グの一例を図 2-11 に示す．

洗浄については，洗浄時間を 15 分と 2 時間に関して検討をおこなった結

果，15 分間の洗浄では接合できず(図 2-10 Result No. 6)，2 時間の洗浄が必要で

あった．これは，15 分の洗浄では，機械加工による穿孔加工によって生じた切

削片や微小な粒子が残留し，接合時にガラス面間の残留物により隙間が生じた

ことが考えられる．

脱水ベークの有無については，脱水ベークをしなかった場合，接合割合は 75%

であったが(図 2-10 Result No. 4)，脱水ベークをおこなうことにより接合割合を

83%に改善できた(図 2-10 Result No. 5)．これは，脱水ベークにより基板表面に残

った微量な水分が除去されたことにより基板表面の平滑性が保たれ，ケイ酸ナ

トリウム水溶液を塗布した際の膜厚の均一性が確保されたされたことによると

考えられる．

ケイ酸ナトリウム水溶液の濃度を 2 wt%と 10 wt%にした場合，2 wt%では，全

ての作製結果にニュートン・リングが存在し，接合できなかった(図 2-10 Result

No. 1, No. 2)．一方，10 wt%の場合には，接合できた流路は 33%以上であった(図

2-10 Result No. 3)．これは，2 wt%の濃度においては，ケイ酸ナトリウム水溶液の

26

粘性が不足することから塗布膜厚が不足し，その結果，接合を維持するために必

要な接着力を保持できなかったためと考えられる．また，10wt%のケイ酸ナトリ

ウム水溶液の場合，スピンコート時の回転数と接合割合を検討した結果，5500

rpm では 33%であったが，4000 rpm では 75%以上を接合することができた(図 2-

10 Result No. 4)．

本論文では，これらの検討をおこなった結果，表 2-3 に示す接合条件を導い

た．図 2-12(a)に検討した接合条件に基づいて作製した密閉型のマイクロ流路の

写真を示す．光の透過率の違いによりマイクロ流路部と接合部に明確な輝度値

の差が観察できた．また，図 2-12(b)にマイクロ流路内部に蛍光溶液を流し，リ

ークの有無を観察した結果を示す．蛍光溶液はマイクロ流路部のみを流れてお

り，密閉型のマイクロ流路を作製できたことがわかる．

27

表 2-3 接合時の適合条件．

Process name Condition Time

Substrate cleaning

Piranha solution

(H2SO4:H2O2 = 3:1) 180°C 2 h

Nitric acid solution with

sonication 30 min

Dehydration bake 120°C 5 min

Spin coat

(10 wt% sodium silicate)

Slope 2 s

500 rpm 5 s

Slope 2 s

4000 rpm 30 s

Slope 2 s

Thermocompression

bonding 90°C 2 h

図 2-8 マイクロ流路の写真 (a)現像後，(b)クロム膜のエッチング後．

図 2-9 ガラス穿孔後の写真 (a)全体の写真，(b)回収部の拡大写真．

28

図 2-10 接合条件の検証結果．

図 2-11 未接合部(ニュートンリング)の写真．

29

図 2-12 接合後のマイクロ流路の写真と蛍光溶液導入後の写真 (a)マイクロ

流路部の全体写真，(b)蛍光溶液を導入したマイクロ流路の写真．

2.4.2 マイクロ流路内におけるアッセイ系の構築

作製した密閉型のマイクロ流路内にアッセイ系を構築するためにはキネシン，

微小管および ATP 溶液を順番に流路内へ送流し，各溶液を流路内で置換する必

要がある．溶液の置換が可能であることを確認するために，蛍光溶液と純水を交

互に導入し，マイクロ流路内の輝度値の変化を計測した結果を図 2-13 に示す．

図 2-13 Step 1 は，蛍光溶液をマイクロ流路に導入した後の写真であり，接合

部とマイクロ流路の間で蛍光輝度値の差が生じており，溶液の導入ができてい

ると言える．次に，図 2-13 Step 2 に示す純水を送液した結果では，蛍光溶液の

送液時に生じていた輝度値の差が生じていないことから，蛍光溶液は純水に置

換されたと言える．さらに再度，蛍光溶液を送液した結果を図 2-13 Step 3 に示

す．再び流路部と接合部の間で輝度値の差が生じており，これらの結果から，本

デバイスは，複数の溶液を圧力 50 kPa，1 分間の圧空送液によって置換できたと

言える．

キネシン・微小管・ATP を 50 kPa，1 分間の送液によりマイクロ流路内に導入

し，アッセイ系が構築できるかに関して考察した結果を図 2-14(a)に示す．微小

管は，流路内部に導入されていたにもかかわらず，基板上には付着せず，流路内

に浮遊しており，微小管のグライディングアッセイを実現することはできなか

った．すなわち，50 kPa，1 分間の加圧による送液では，この圧力により生じる

基板表面のせん断力が大きかったため，基板表面に付着していたキネシンの失

活または剥離が起きたと考えられる．せん断力の影響を抑えるため，送液時の圧

力を 10 kPa に下げ，送液の時間を 1.5 時間に変更し，タンパク溶液をマイクロ

流路内へ導入した．図 2-14(b)に送液後の顕微鏡画像を示す．微小管がマイクロ

流路内の基板上に付着し，移動する様子を観察した．すなわち，上記の条件によ

り，グライディングアッセイを実現できることがわかった．

30

図 2-13 純水と蛍光溶液の置換時の流路境界の蛍光の写真．

図 2-14 送液の圧力の違いによる微小管の挙動画像 (a)浮遊する微小管(50

kPa, 1 min)，(b)基板に付着した微小管(10 kPa, 1.5 h)．

2.4.3 電界による運動方向の制御結果

図 2-15 は，マイクロ流路内に固定したキネシン上を運動する微小管に対し，

電界を作用させた場合の微小管の挙動を観察した結果である．印加電圧は 20 V

であり，電界強度は 5 kV·m−1である．図 2−15 には電圧を印加した場合の微小管

の運動状況を電界の作用直後(0 秒として示した)から作用後 50 秒まで，25 秒間

隔で観察した結果である．図 2-15 において図の右側が陽極側であり，左側が陰

極側である．微小管の先端は，負に分極していることから電界によって右側に作

用力を受ける．図 2-15 の白矢印で示した微小管は，電界が作用したとき，すな

わち 0 秒時に導入用のマイクロ流路から電界が印加される領域へ進入し，その

後，25 秒時の観察画像においては，電界の作用力により陽極側へ運動方向が変

化した．さらに，50 秒経過後の観察画像においては，微小管の運動方向は電界

の向きと平行になるように変化した．このことから，電界の作用力が継続的に微

小管に作用することにより，微小管の運動方向を制御することができたと言え

る．すなわち，この結果は，電界を作用させる時間により運動方向を制御できる

ことを意味している．

31

図 2-16 にマイクロ流路部から進入した 3 本の微小管の運動軌跡を計測した結

果を示す．グラフの横軸は，電界を作用させる領域へ誘導するマイクロ流路の出

口を原点とした水平方向の距離であり，縦軸は出口からの垂直方向の距離であ

る．緑の●で示した微小管の運動軌跡は，マイクロ流路の出口から水直方向に 5

µm 程度移動した後，電界の作用力により陽極側へ運動方向が変化した．橙色の

◆で示した微小管は，出口から 3 µm 程度垂直に移動した後，陽極方向へ運動方

向が変化した．さらに，青の■で示す微小管は，出口を出てすぐに陽極側へ向け

て運動した．これら微小管の運動軌跡について，van den Heuvel らが提案した，

式(2-1)に示す運動軌跡に関する近似式を用いて分析した[17]．

𝑦(𝑥) = 𝐴 𝑎𝑟𝑐𝑐𝑜𝑠(𝑒−𝑥𝐴 ) (2-1)

ここで，A は最小二乗法で得られる微小管の曲率半径定数である．印加電界が 5

kV/m の場合，A 値は 5.7 ± 2.8 µm (平均 ± 標準偏差, N = 3)であった．この A は

van den Heuvel ら[17]が報告した値(A = 15 ± 2 µm, 35 kV/m)に比べて小さい．これ

は，基板に付着したキネシンの密度が小さかったため，微小管の先端が受ける外

力の影響が大きくなり，A の値が小さくなったことが考えられる．

図 2-15 電界印加に対する微小管運動軌跡変化の連続写真．

図 2-16 微小管の曲率評価．

32

2.5 結言

本研究は，溶液中に存在する特定の分子を分離・濃縮することを目的に，マイ

クロ流路構造の構築と密閉型のマイクロ流路内におけるアッセイ系の構築，そ

して電界を利用した微小管の運動方向制御を提案し，その有用性に関して考察

した．

密閉型のマイクロ流路の作製については，基板の洗浄，脱水ベーク，およびケ

イ酸ナトリウム水溶液の塗布条件に関して検討をおこない，高い再現性を実現

するプロセス条件を明らかにした．また，作製したマイクロ流路内にタンパク溶

液を導入する際には，マイクロ流路内でのキネシンの失活または剥離を防ぎ，ア

ッセイ系が構築できる送液条件を導いた．アッセイ系を構築したデバイス内で

微小管の運動制御を試みた結果，微小管の運動方向は，電界の作用力を受け，陽

極方向へ変化した．電界の作用により微小管の運動方向が変化するときの曲率

半径定数は，印加電界が 5 kV/m のとき，5.7 ± 2.8 µm であった．

これらの結果から，本研究は，提案した密閉型マイクロ流路を用いることによ

り，電界の作用力によってマイクロ流路内で微小管の方向制御が可能であるこ

とを明らかにした．

33

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35

第 3章 励起光と金薄膜を用いた微小管

速度制御技術の開発

3.1 緒言

キネシン-微小管のアッセイ系は，ナノスケールのアクチュエータとして機能

することから，マイクロ流路内における分子の輸送や分離，濃縮をおこなうため

の輸送体として活用することが可能である．しかし，流路内を運動する微小管は，

アッセイ系の環境が変化しない場合，一定の速度で運動するため，迅速な分子の

輸送や分離，濃縮を実現するためには，微小管の速度を制御する方法が必要であ

る．

微小管の運動速度を制御する方法に関する研究は用いる方法により，以下の 4

種類に分類できる．

1. ATP 濃度やバッファの条件[1, 2]，温度[3-6]によって制御する方法．

2. 電界や流れ場等の外力を用いる方法[7, 8]．

3. 熱や電気により構造が変化する温度変性ポリマー[9]や電気変性ポリマー

[10]を用いて，キネシン-微小管の運動をポリマーの立体構造や陽イオンの

変化により制御する方法．

4. ATP の解放やキネシンの ATP 加水分解の働きを光により制御し，微小管の

運動を ON/OFF で制御することができる光変異性 Caged-ATP[11, 12]や

Caged-peptide[13]，アゾベンゼン[14-16]を用いる方法．

温度による制御方法として，Böhm らは，キネシンの ATP 加水分解サイクルが

酵素の温度依存性に従う特性を利用し，顕微鏡ステージを囲むチャンバー型の

温度制御装置を用いて 20°C から 40°C までチャンバー内の室温を変化させるこ

とにより，微小管の運動速度を約 0.5 µm·s−1から約 1.0 µm·s−1まで制御する方法

を提案している[3]．この方法は，微小管の速度を約 2 倍に変化させることが可

能であるが，別の速度へ切り替える場合には，チャンバー内の温度が目的の温度

になるまで数分程度の時間を必要とするため，迅速な速度切り替えが困難であ

る．また，温度はアッセイ系の全体に作用するため，アッセイ系の局所的な領域

内において制御することは困難である．

電界を用いる方法として，Dujovne らは，負に帯電する微小管に電界を加える

36

ことで，流路内を運動する微小管の速度を約 0.8 µm·s−1から約 4.0 µm·s−1の間で

制御する方法を提案している[7]．外力による方法は，速度を約 5 倍に変化させ

る速度の変化率と数秒以内に制御できる高い応答性を実現できるが，微小管に

作用する力はアッセイ系の全体に印加されるため，アッセイ系の一部の領域で

微小管の速度を制御することは困難である．

温度変性ポリマーを用いた方法として，Korten らは，チャンバー型の温度制御

装置および微小管と基板のアビジン-ビオチン結合を用いて，20°C と 35°C の温

度の制御により温度変性ポリマーの立体構造を変化させて，微小管の速度を約

0.4 µm·s−1と 0.0 µm·s−1で切り替える方法を提案している[9]．この方法は，ビオ

チンの修飾をおこなった微小管と修飾していない微小管を用いることで，温度

変化による速度差を生じさせることが可能である．しかし，チャンバー内の温度

はアッセイ系の全体に作用するため，任意の領域内において速度差を生じさせ

ることには至っていない．

光を用いた方法として，Kumar らは，光変異性アゾベンゼンをキネシンに修飾

し，ATPの加水分解酵素の働きを紫外線と可視光によって制御すること�