UniverzitetuNovomSaduPrirodno‐matematičkifakultet

h b h š ž dDepartmanzahemiju,biohemijuizaštituživotnesredineUdruženjezaunapređenjezaštiteživotnesredine„NoviSad“Fondacija"DocentdrMilenaDalmacija"

TOKSIČNOST UMONITORINGU OTPADNIH VODATOKSIČNOSTUMONITORINGUOTPADNIHVODAINDIREKTNIMONITORINGOTPADNIHVODAUPOTREBOM

TESTOVATOKSIČNOSTI

Dr Dragan Radnović, Dr Jasmina Agbaba

NoviSad21‐23.septembar,2016.

SadržajSadržaj

• Uvod – sinergija hemije i biologije• WEA – pristup• Laboratorijski testovi toksičnosti• Laboratorijski testovi toksičnosti• Procena toksičnosti otpadnih voda• Monitoring otpadnih voda zasnovan na WEA• Ograničenja WEA• Implementacija WEA u nekim zemljama

Hemijski pristupHemijskipristup

• Eutrofizacija i izlivanje toksičnih materija glavni stresogenifaktori za živi svet u vodenim ekosistemimafaktori za živi svet u vodenim ekosistemima

• Veliki broj hemikalija sa trenutno nalaze u upotrebi asvakodnevno se sintetišu novesvakodnevno se sintetišu nove

• Stvaraju se brojni nusprodukti i vrši se njihova transformacijanpr mikrobiološkom razgradnjomnpr. mikrobiološkom razgradnjom

• Brojne supstance su nepoznate kao i njihov uticaj na okolnusredinusredinu

• Mnoga “nova” jedinjenja su perzistentna, mogu sebioakumulirati i potencijalno su toksičnabioakumulirati i potencijalno su toksična

Hemijskipristupj p p• Otpadne vode uglavnom sadrže 

mešavine različitih jedinjenja

• Sastav otpadnih voda osim prisustva pojedinih supstanci uglavnom nije poznatpoznat

• Nepoznate supstance i kombinovan efekat hemikalija uzrokuju neželjeneefekat hemikalija uzrokuju neželjene efekte

• Hemikalije u mešavini mogu imati j gaditivni efekat na živi svet iako su pojedinačne komponente ispod efektivnih koncentracija

Biološkipristupp p

• Nemoguće je identifikovati sve supstance i njihove metabolite u efluentu i proceniti združeni efekatefluentu i proceniti združeni efekat 

• Hemijske metode samostalno ne garantuju da neće biti štetnog uticaja po živi svet recipijentaj p p j

• WEA – ukupna toksičnost efluenta je biološki metod kojim je moguće proceniti ekotoksičnost celog efluenta

• Uzimaju se u obzir kombinovani efekti kao i efekti nepoznatih susptanci

PRINCIPIUKUPNEPROCENEUZORKA(WEA‐WHOLEEFFLUENTASSESMENT)

OSNOVNI PRINCIPI I KORIŠĆENI TESTOVIOSNOVNIPRINCIPIIKORIŠĆENITESTOVI

• Ukupna procena uzorka (whole effluent assesment – WEA)

• Osnovni princip WEA podrazumeva primenu biološkihodnosno ekolotoksikoloških testova sa vodenim organizmimagkoji se izvode sa celokupnim efluentom

• celokupan uzorak uključuje poznate i nepoznate supstance i• celokupan uzorak uključuje poznate i nepoznate supstance injihove kombinovane efekte – HOLISTIČKI PRISTUP

P t ji t ličitih k t k ik l ških t t• Postoji set različitih ekotoksikoloških testova

• Najčešće izvođeni su laboratorijski testovi toksičnosti

ČLABORATORIJSKITESTOVITOKSIČNOSTI

• Izvode se u strogo kontrolisanim uslovimaIzvode se u strogo kontrolisanim uslovima• Svaka test vrsta se ispituje odvojeno

AKUTNITESTOVITOKSIČNOSTI

• mere efekat toksičnog agensa na izabrani akvatični organizamj d t j ži t iklsamo u jednom segmentu njegovog životnog ciklusa.

• preživljavanje test organizma od 24 do 96 sati

• serija razređenja – multidilucioni test (pet koncentracija)

• statički testovi– ne menja se rastvorj

• Akutna toksičnost je parametar koji je u širokoj upotrebi i čijametodologija je dobro razvijena i standardizovana ‐ bakterije,alge i račići ‐ opšte prihvaćeni testovi

• testovi sa ribama se izbegavaju iz ekonomskih

i etičkih razloga.

TESTOVIHRONIČNETOKSIČNOSTI

• jedinke se izlažu toksičnim materijama tokom značajnog perioda njihovog životnog veka, a najmanje deseti deo dužine životaj g g , j j

• 16 sati do 90 dana 

• Većinom ‐ protočni testovi ili semistatični uslovi• Većinom ‐ protočni testovi ili semistatični uslovi

• Mortalitet, subletalni efekat: rast, reprodukcija, ponašanje…

O i i b kt ij l čići tif šk ljk b dlj k š i• Organizmi: bakterije, alge, račići, rotifere, školjke, bodljokošci, ribe i više biljke 

• Broj hroničnih testova toksičnosti ‐ Švedska (8), Holandija (6),Broj hroničnih testova toksičnosti  Švedska (8), Holandija (6), Nemačka (6) i Portugalija (4) 

• SAD ‐ 4 testa hronične toksičnosti za slatkovodne i 5 za marinske iorganizme

PregledtestovakojisenajčešćeprimenjujuzaprocenuAKUTNETOKSIČNOSTIuslatkimislanimvodama(preuzetoiz:OSPAR,2007)

Organizam Test vrsta EN ISO Slatka S)/Slana (M) voda

Opšti/specifičan test

Bakterija Vibrio fischeri ISO 11348 2 S/M OBakterija Vibrio fischeri ISO 11348-2 S/M OAlga P. subcapitata ISO 8692 S O

Senedesmusb it t

DIN 3841233 S SsubcapitatusSkeletonemacostatum

ISO 10523 M O

Račić Daphnia magna ISO 10706/2000

S O

Tisbe battagliai ISO 14669 M O

Acartia tonsa ISO 14669 M O

Riba Oncorhynchus mykiss

OECD 203 S O

Danio rerio, test sa ribljim jajima

ISO 15088 S S

PregledtestovakojisenajčešćeprimenjujuzaPROCENUHRONIČNETOKSIČNOSTIuslatkimislanimvodama(preuzetoiz:OSPAR,2007)

Organizam Test vrsta EN ISO Slatka (S)/Slana (M) voda

Opšti/specifičan test(M) voda test

Bakterija Pseudomonas putida 10712:1995 S S

Mikro-organizam

Mikrobiološka zajednica aktivnog mulja

15522:1999 S Sorganizam aktivnog mulja

Alga Jednoćelijske zelene alge ISO 8692:2004  S S

Desmodesmus subcapitata DIN 38412‐33:1991

S O

Skeletonema costatum ISO M OSkeletonema costatum Phaeodactylum

ISO 10253:2006

M O

Račić Daphnia magna   OECD 211 S ODaphnia magna ISO S ODaphnia magna  ISO 

10706:2000S O

Luminiscentni bakterijski test j

• Statični kratkotrajni test za i i i j OVispitivanje  OV

• Test organizam – marinska bioluminiscentna bakterija Vibriobioluminiscentna bakterija Vibrio fisheri

• Poremećaj metabolizma‐ smanjenje bioluminiscencije

• Luminometer• Vreme trajanja testa: Redukcija u• Vreme trajanja testa: Redukcija u 

emitovanju  svetla se meri nakon 30 minuta u poređenju sa kontrolom

Test inhibicije rasta mikroalgiTest inhibicije rasta mikroalgi

• Planktonske zelene alge Desmodesmus subspicatus

ili Pseudokirchneriella subcapitata

• Serija razređenja – definisani svetlo i temperaturaj j p

• Statičan test ‐ 72 sata

• Triplikat, a kontrola u šest ponavljanjap , p j j

• Biomasa ‐ 24, 48 i 96 sati (broj ćelija, fluorescencija, OD))

• Određuje se EC50 ili kod OV najveća koncentracija koja izaziva inhibiciju manju od 5%

• Najmanje neefektivno razređenje (LID)

Test inhibicije rasta mikroalgij g

Postavka testa inhibicije rasta mikroalgi u laboratoriji

Račići u testiranju ič i ftoksičnosti efluenta

• Model organizam : Daphnia magna – vodena buva

• Cilj testa – imobilizacija jedinkiCilj testa imobilizacija jedinki

• Akutni test

• Za svaku koncentraciju efluenta dva seta posuda sa po 5 jedinki• Za svaku koncentraciju efluenta ‐dva seta posuda sa po 5 jedinki

• Statični test ‐ 24 sata

d đ f k đ k h• Određuje se najmanje neefektno razređenje sa ≥ 90% pokretnihjedinki (LID). LID je obrnuto proporcionalan udelu otpadne vodeu testuu testu

Račići u testiranju t k ič ti fl ttoksičnosti efluenta

• Model organizam : Daphnia magna – vodena buvag p g• Hronični test • Cilj testa – procena uticaja uzorka na reprodukciju• Kratak živ. ciklus i bespolno razmnožavanje• Najvažniji test hronične toksičnosti• Mlade dafnije (<24h) • Tri nedelje – dve do tri generacije• Određuje se broj preživelih roditelja i potomaka u odnosu na 

kontrolu• Određuje se EC LOEC NOEC• Određuje se EC50, LOEC, NOEC 

Ribe u testiranju t k ič ti fl ttoksičnosti efluenta

• Model organizam : različite vrste riba: Danio rerio (zebrica), Pimephales promelas (klen), Cyprinus carpio (šaran), Poecilia p p ( ), yp p ( ),reticulata (gupi), Lepomis macrochirus (plavoškrga sunčanica), Oncorhynchus mykiss , Salmo gairdneri (kalifornijska pastrmka)pastrmka)

• Prati se mortalitet i uslovi tokom testiranja ‐ 24, 48, 72, i 96 h, • LC50 se izračunava na osnovu odnosa doze i efekta; 50 ;• Kod otpadnih voda koristi se test sa ribljim jajima

Procena toksičnosti efluenta testom iblji j j i ć lijsa ribljim jajnim ćelijama

• Danio rerio jajne ćelije –j j jakutna toksičnost efluenta na embrionalne stadijume zebricezebrice 

• Odrasle ribe – zamenjene tzv suborganizmičnimtzv. suborganizmičnimtestom pre razvoja centralnog nervnog sistema

• Oplođene jajne ćelije izložene efluentu  ‐ 48h 

Procena toksičnosti efluenta testom iblji j j i ć lijsa ribljim jajnim ćelijama

• Nakon 24 i 48 sati se prate: koagulacija oplođenih jaja,Nakon 24 i 48 sati se prate: koagulacija oplođenih jaja, prestanak srčanog rada, nepostojanje odvajanje repa od žumančane kese, nedostatk formiranog somita, g

• Procena toksičnosti ‐ na osnovu 4 pokazatelja LID (najmanja neefektivno razređenje ‐ 90% oplođenih jaja prežive)neefektivno razređenje  90% oplođenih jaja prežive)

MUTAGENOSTIGENOTOKSIČNOST

• Genotoksičnost ‐ bilo koji štetni efekat efluenta na genom živog organizmag

• Mutagenost ‐ nasledne promene genetskog materijala

• nekoliko testovanekoliko testova

• Ames‐ov test na bakteriji roda Salmonella typhimurium

• umu‐esej ‐ Salmonella typhimurium TA1535pSK1002• umu‐esej ‐ Salmonella typhimurium TA1535pSK1002

• Genotoksičnost

• mutatox i mikronukleus štetno delovanje na hromozome i• mutatox i mikronukleus – štetno delovanje na hromozome i mitotički aparat ćelijske linije V79 kineskog hrčka

• sporadično se koriste u D NL P i Fsporadično se koriste u  D, NL, P i  F

ENDOKRINADISRUPCIJAJ• efekat na endokrini sistem , menjaju fiziologiju uključujući razvoj 

i reprodukciju živih organizama p j g• Testovi se još uvek razvijaju. Vrlo retko se primenjuju i to u nekoj 

od kasnijih faza ispitivanja uticaja efluenta na živi svet• Hepatocite potočne pastrmke, rekombinantne ćelije kvasca, 

kulture humanih ćelija ili in vivo testovi sa akvarijumskim zebricama

H t it ibHepatocite ribe  

Odabirtestorganizama

• Kriterijumi za odabir test organizma:

k l šk č• Ekološki značaj

• Jednostavnost i troškovi izvođenja testa

• Poznavanje biologije test organizma

• Salinitet uzorka ‐ slatkovodni i marinski organizmi

• Preporuke – testovi se izvode na 3‐5 vrsta različitog trofičkognivoa odnosno funkcionalnih grupa (npr. bakterije,fit l kt b kič j i ib itd )fitoplankton, beskičmenjaci, ribe itd.)

• Korišćenjem različitih vrsta raste pouzdanost testova i dobija sebolji uvid o uticaju otpadnih voda na živi svet recipijentabolji uvid o uticaju otpadnih voda na živi svet recipijenta

PERZISTENTNOST

• otpornost supstance prema degradaciji ‐ biodegradacija,hidroliza ili fotoliza.

• suprotna degradabilnosti• Testovi ‐ mikrobiološka razgradnja jedinjenja od strane

mikroorganizama iz uređaja za prečišćavanje komunalnihotpadnih voda ili vode samog recipijenta

• Kvantifikacija ‐ merenjem koncentracije rastvorenog organskogKvantifikacija merenjem koncentracije rastvorenog organskogugljenika ili oslobođenog CO2.

• Često korišćen Zahn‐Wellens test (EN ISO 9888:1999)• jedinjenje se može okarakterisati kao perzistentno

(nedegradabilno), perzistentno‐neperzistentno (degradabilno doodređenog stepena) i neperzistentno (degradabilno)određenog stepena) i neperzistentno (degradabilno).

“Zahn-Wellens test”Zahn Wellens test

• Mineralni  medijumj• Aktivni mulj (0.2‐1 g/l)• 7 do 28 dana• 50‐400 mg/l DOC• Referentne probe:• Aktivni mulj –slepa proba• Degrad. Pozn. Supst.• Inaktivisani akt mulj sa supstancom http://www hydrotox de/• Inaktivisani akt. mulj sa supstancom http://www.hydrotox.de/

BIOAKUMULACIJA

• Potencijal jedinjenja da se akumulira u akv. organizmu

F k bi k ij BF k S ki /k S di• Faktor biokoncentracije BF= konc. S u tkivu/konc. S u vodi

• Podeoni koef. oktanol/voda (Kow) – oktanol surogat tkivnih lipida

b šk l k k d l č k• Na ribama i školjkama – rizik po zdravlje čoveka

• 28 dana do dostizanja ravnotežnog stanja 1/10LC50(• Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (solid phase micro‐extraction

SPME) procena bioakumulacije

• SPME br a jednosta na jeftinai i dobro odraža a potencijal• SPME ‐ brza, jednostavna, jeftinai i dobro odražava potencijalbioakumuacije u ekosistemu.

• Kvantifikacija se postiže gasnom ili tečnom hromatografijom• Kvantifikacija se postiže gasnom ili tečnom hromatografijom.

PROCENA TOKSIČNOSTI OTPADNIH VODAPROCENATOKSIČNOSTIOTPADNIHVODA

Procenatoksičnostiotpadnihvoda

• COHIBA Projekat ‐ sve baltičke zemlje u cilju kontrole 

zagađenja mora od strane opasnih materija

• za objektivnu  ukupnu procenu efluenta potrebno primeniti 2 

do 3  standardizovana testa 

• za analizu je potrebno uzeti 24 h kompozitni uzorak• za analizu je potrebno uzeti 24 h kompozitni uzorak. 

• u različitim laboratorijama nije zabeleženo značajnije variranje 

rezultata ‐ tri testa toksičnosti izvedenih na bakterijama, 

algama i račiću Daphnia magna

Procenatoksičnostiotpadnihvodaoce a to s č ost otpad voda

• Od 1989. u SAD obavezna primena WET=WEA1995 US EPA ič li i• 1995. US EPA – zvanična lista test organizama

• Toksikološke analize –akutni i hronični testovi toksičnosti• Akutni testovi• Akutni testovi• Letalna koncentracija (LCx) i inhibitorna koncentracija (ICX)

koncentracija efluenta koja izaziva smrt u X% populacije• Hronični testovi• NOEC – najviša zaprem.konc. koja ne dovodi do promena

ć k d t t ipraćenog par. kod test organizama• LOEC – najniža zaprem.konc. koja dovodi do promena

praćenog par. kod test organizamap g p g

Procenatoksičnostiotpadnihvodap

• EPA preporučuje uvođenje toksičnih jedinica:

• Toksične jedinice (Toxicity unit ‐ TU) –TU se izračunavaju kadasu parametri određeni testiranjem već poznati.

• Veća TU znači i veću toksičnost efluenta.

• Akutna toksična jedinica TUa predstavlja recipročnu vrednostLC50 pomnoženu sa 100 (TUa=100/LC50)

• Hronična toksična jedinica (TUc) predstavlja recipročnuvrednost NOEC pomnoženu sa 100 (TUc= 100/NOEC).c

Toksičnostefluentasemožeizrazitiličit činarazličitenačine

• Primer: preporuka EPA ‐ maksimalna toksičnost efluenta

bude najviše 0,3 TUa i 1 TUc za najosteljiviju od tri ispitivane

test vrste

• Tom prilikom US EPA ne precizira koje testove treba koristiti.

U Nemačkoj su granične vrednosti toksičnih jedinica

karakteristične za svaku industrijsku granu. Vrednosti

toksičnih jedinica se kreću od 4‐32 za bakterije, do 16 za alge

i 2 do 8 za Daphnia

MONITORINGOTPADNIHVODAZASNOVANNAPROCENI UKUPNE TOKSIČNOSTI EFLUENTAPROCENIUKUPNETOKSIČNOSTIEFLUENTA

WEAPRISTUP

Preporukezasprovođenjekontinuiranogit i t d ih d WEA i tmonitoringaotpadnihvoda–WEApristup

• UZIMANJE UZORAKA

• Tokom prve godine ‐ uzorke za akutne testove ‐ jedanput mesečno,  a za hronične dva puta godišnje ‐ leto i zima

• Nakon prve godine

Ak t k ič t fl t ij b l ž t iti d t• Ako toksičnost efluenta nije zabeležena ‐ nastaviti dva puta godišnje i to primenom hroničnih testova

• U slučaju sezonskog variranja toksičnosti – 4x godišnje primenom i akutnih i hroničnih testova toksičnosti. 

Preporukezasprovođenjekontinuiranogit i t d ih d WEA i tmonitoringaotpadnihvoda–WEApristup

• IZBOR TESTA TOKSIČNOSTI • Preporučeni akutni testovi toksičnosti. Kada se otpadne vode 

ispuštaju u slatkovodne ekosisteme, preporučuju se akutni testovi toksičnosti na račiću Daphnia magna test inhibicijetestovi toksičnosti na račiću Daphnia magna, test inhibicije rasta algi najčešće na vrsti, Pseudokirchneriella subcapitata, kao i test inhibicije rasta na luminiscentnoj bakteriji Vibrio f hfischeri

• Preporučeni hronični testovi toksičnosti. Preporučuju se standardizovani bioeseji sa jajnim ćelijama zebrica, hroničnistandardizovani bioeseji sa jajnim ćelijama zebrica, hronični test sa Daphnia magna, kao i testovi koji pokazuju genotoksični efekat kao što su Ames, umu‐test ili mikronukleus test na ć lij ki li ij V79 i t t i k ji k j h k f ktćelijskim linijama V79 i testovi koji pokazuju hormonske efekte, a koji se izvode na ćelijama kvasca. 

Preporukezasprovođenjekontinuiranogit i t d ih d WEA i tmonitoringaotpadnihvoda–WEApristup

• PREPORUČENE GRANIČNE VREDNOSTI ZA EFLUENTE

• moraju biti zasnovane pre svega na vrednostima za EC50, LID dobijenih u akutnim i hroničnim testovima, 

• ali i na procenama koje proizilaze na osnovu testova  genotoksičnosti i endokrine disrupcije. 

• Primer: WEA procena pokaže toksičnost nekog efluenta, 

• kvalitativna analiza uzorka 

• preduzimanje mera radi smanjenja štetnog uticaja efluenta na životnu sredinu. 

Preporukezasprovođenjekontinuiranogit i t d ih d WEA i tmonitoringaotpadnihvoda–WEApristup

• Preporučene granične vrednosti za akutne testovep g• Primer: COHIBA projekat• Bakterijski i algalni test–test konc. efluenta ≥ 80 % inhibicija <30% • Daphnia magna – 95% efluenta inhibicija <20%• Preporučene granične vrednosti za testove genotoksičnosti 

(organske supstance i metaboliti)(organske supstance i metaboliti)• Riblja mlađ‐mortalitet kod sirove OV ne sme da prelazi 40%• Vitalogenin test – nema indukcije kada je konc. testa ≤ 5 %. g j j• umu‐test – razređenje efluenta 1:1,5 indukcija mutacija mora biti 

≤ 1,5  

Preporukezasprovođenjekontinuiranogit i t d ih d WEA i tmonitoringaotpadnihvoda–WEApristup

• Toxicity Identification Evaluation (TIE) identifikacija toksičnosti efluenta 

• određivanju pojedinačnih ili grupe supstanci koje izazivaju neželjeni biološki efekatneželjeni biološki efekat

• hemijske analize efluenta ili samih vodotokova. • postupak je dug i skup ‐ tek kad testovi toksičnosti pokažu p p j g p p

jasnu indikaciju štetnih efekata efluenta na okolnu sredinu• uzimajući u obzir sva saznanja vlasnika uređaja za prečišćavanje 

t d ih d l kš id tifik ij i đ j i d k tiotpadnih voda ‐ lakše identifikacija izvora zagađenja i dokazati prisustvo zagađujuće materije.  

• Kompleksni efluenti ‐WEA može biti brži i jeftiniji način zaKompleksni efluenti  WEA može biti brži i jeftiniji način za procenu njihovog štetnog dejstva.

OGRANIČENJA WEA

Ograničenja WEAOg če j W

• Ništa nije savršeno pa ni WEA pristupNišta nije savršeno pa ni WEA pristup• Test organizmi nisu autohtoni – nije ista osetljivost• Pojedinačne vrste vs. biocenoza• WEA – se ne može koristiti samostalno za procenu ekološkog 

rizika• ne može da identifikuje supstance sa štetnim efektome o e da de t uje supsta ce sa štet e e to• Varijabilnost – inter‐ i intraspecijska, intra i interlaboratorijska 

varijabilnost K išć j i tički kt ( iti ij• Korišćenje organizama – etički aspekt (nema senzitivnije metode)

• Optimizacija medija pH i salinitet mogu da utiču na biodostupnost opasnih supstanci

IMPLEMENTACIJA WEA U NEKIM ZEMLJAMA

Implementacija WEA u nekim zemljama

• SAD, Kanada  i Irska• NL, UK i Francuska imaju neka iskustva WEA, ali bez  zakonskih 

ograničenja• SAD iskustvo u primeni WEA pristupa• SAD – iskustvo u primeni WEA pristupa• 1950'sWET počinje da se primenjuje • Od 1984 je bila deo kontrole kvaliteta vodaOd 1984. je bila deo kontrole kvaliteta voda• Operator odgovoran za monitoring• US EPA ima ulogu supervizoraUS EPA ima ulogu supervizora• Regulatorna tela su odgovorna za inspekciju

Implementacija WEA u nekim zemljama

• US EPA – vlasnik dozvole može prekoračiti limite toksičnosti ne više od tri puta godišnjep g j

• Ako se prekorači limit – izvrše se TIE i TER – sledi sankcija• Preporučeni su testovi • Neke države dozvoljavaju zone mešanja dok druge ne• NPDS dozvole su sistemi više zasnovane na kontrolu izvora

WEApristup– prednostiinedostacip p p

ukupna toksičnost efluenta (WEA) sa ostalim analizama ćeispuniti svoj osnovni cilj, a to je identifikacija, karakterizacija iispuniti svoj osnovni cilj, a to je identifikacija, karakterizacija ieliminacija toksičnog efekta otpadnih voda na vodeneekosisteme i ukazivanje na potencijalnu opasnost koje efluenti

i ti j k limogu imati na svoju okolinu

HVALANAPAŽNJI