tom 52, 2003 numer 4 (261) strony 469–479

11
JÓZEF BEDNARA Zakład Anatomii i Cytologii Roślin Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej Akademicka 19, 20-033 Lublin e-mail: [email protected] ROLA SZKIELETU CYTOPLAZMATYCZNEGO W ROZMNAŻANIU ROŚLIN WPROWADZENIE Szkielet cytoplazmatyczny stanowi istotną część cytoplazmy komórek, osiągając zwykle kilkanaście procent wagi wszystkich białek protoplastu. Od około 40. lat jest obiektem in- tensywnych badań, początkowo ultrastruktu- ralnych, a później immunocytochemicznych. Istotny postęp w badaniach cytoszkieletu do- konał się wraz z udoskonaleniem czułych me- tod immunocytochemicznych, zwłaszcza po zastosowaniu dwustopniowej immunolokali- zacji z fluorescencyjnymi markerami przeciw- ciał na poziomie mikroskopu świetlnego oraz koloidalnym złotem, jako uniwersalnym znacz- nikiem przeciwciał widocznym zarówno w mi- kroskopie świetlnym, jak i elektronowym. Pre- cyzyjną lokalizację elementów cytoszkieletu uzyskuje się przez działanie na preparat mi- kroskopowy przeciwciałami przeciwko anty- genom, w tym przypadku białkom wcho- dzącym w skład cytoszkieletu. Przeciwciało I wiąże się wówczas wybiórczo ze strukturami zawierającymi odpowiednie białko, w drugim etapie reakcji do kompleksu przyłącza się jeszcze przeciwciało II zawierające widoczny w mikroskopie marker, lokalizując białka szkieletowe. Najważniejszymi elementami cytoszkieletu komórek roślinnych są mikrotubule, sztywne, rurkowate struktury o średnicy ok. 26 nm złożone z białka tubuliny, z polarnym upo- rządkowaniem dwu nieco różnych podjed- nostek alfa i beta. Innym elementem cytoszkie- letu są mikrofilamenty, tworzące włókna o grubości ok. 7 nm będące liniowo-spiralnymi polimerami globularnych, jednakowych podjednostek aktyny. Mikrofilamenty wykazu- ją także kierunkowy porządek polimeryzacji i polarną budowę umożliwiającą uporządkowa- ny transport. Na powierzchni włókien cytoszkieletu wykrywane liczne dodatkowe białka, z których kilka ma charakter motoryczny, wykazując zdolność do generowania ruchu. Dla mikrotubul są to białka dyneina i kinezyna, a dla mikrofilamentów aktynowych jest to np. miozyna, występująca także w dużych iloś- ciach w tkance mięśniowej zwierząt. Białka motoryczne umożliwiają przemieszczanie elementów cytoszkieletu względem siebie, przemieszczenia jąder, chromosomów i dużych organelli komórkowych, takich jak plastydy bądź mitochondria, a także przesu- nięcia małych obiektów, np. pęcherzyków diktiosomalnych lub rozet związanych z bu- dową ścian komórkowych tzw. terminalnych kompleksów syntezy celulozy. Zaskakująco szerokie są możliwości transportowe pojedyn- czych włókien szkieletowych, np. zdolność do równoczesnego transportu pęcherzyków w przeciwnych kierunkach, za sprawą różnych białek motorycznych: dyneiny, mającej zdolność przesuwania od bieguna dodatniego mikrotubuli do ujemnego, i kinezyny, od bieguna ujemnego do dodatniego. Dość dobrze poznana została struktura elementów cytoszkieletu komórek soma- Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

Upload: nguyenbao

Post on 11-Jan-2017

224 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

JÓZEF BEDNARAZakład Anatomii i Cytologii Roślin

Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej

Akademicka 19, 20-033 Lublin

e-mail: [email protected]

ROLA SZKIELETU CYTOPLAZMATYCZNEGO W ROZMNAŻANIU ROŚLIN

WPROWADZENIE

Szkielet cytoplazmatyczny stanowi istotnączęść cytoplazmy komórek, osiągając zwyklekilkanaście procent wagi wszystkich białekprotoplastu. Od około 40. lat jest obiektem in-tensywnych badań, początkowo ultrastruktu-ralnych, a później immunocytochemicznych.Istotny postęp w badaniach cytoszkieletu do-konał się wraz z udoskonaleniem czułych me-tod immunocytochemicznych, zwłaszcza pozastosowaniu dwustopniowej immunolokali-zacji z fluorescencyjnymi markerami przeciw-ciał na poziomie mikroskopu świetlnego orazkoloidalnym złotem, jako uniwersalnym znacz-nikiem przeciwciał widocznym zarówno w mi-kroskopie świetlnym, jak i elektronowym. Pre-cyzyjną lokalizację elementów cytoszkieletuuzyskuje się przez działanie na preparat mi-kroskopowy przeciwciałami przeciwko anty-genom, w tym przypadku białkom wcho-dzącym w skład cytoszkieletu. Przeciwciało Iwiąże się wówczas wybiórczo ze strukturamizawierającymi odpowiednie białko, w drugimetapie reakcji do kompleksu przyłącza sięjeszcze przeciwciało II zawierające widocznyw mikroskopie marker, lokalizując białkaszkieletowe.

Najważniejszymi elementami cytoszkieletukomórek roślinnych są mikrotubule, sztywne,rurkowate struktury o średnicy ok. 26 nmzłożone z białka tubuliny, z polarnym upo-rządkowaniem dwu nieco różnych podjed-nostek alfa i beta. Innym elementem cytoszkie-letu są mikrofilamenty, tworzące włókna o

grubości ok. 7 nm będące liniowo-spiralnymipolimerami globularnych, jednakowychpodjednostek aktyny. Mikrofilamenty wykazu-ją także kierunkowy porządek polimeryzacji ipolarną budowę umożliwiającą uporządkowa-ny transport.

Na powierzchni włókien cytoszkieletuwykrywane są liczne dodatkowe białka, zktórych kilka ma charakter motoryczny,wykazując zdolność do generowania ruchu.Dla mikrotubul są to białka dyneina i kinezyna,a dla mikrofilamentów aktynowych jest to np.miozyna, występująca także w dużych iloś-ciach w tkance mięśniowej zwierząt. Białkamotoryczne umożliwiają przemieszczanieelementów cytoszkieletu względem siebie,przemieszczenia jąder, chromosomów idużych organelli komórkowych, takich jakplastydy bądź mitochondria, a także przesu-nięcia małych obiektów, np. pęcherzykówdiktiosomalnych lub rozet związanych z bu-dową ścian komórkowych tzw. terminalnychkompleksów syntezy celulozy. Zaskakującoszerokie są możliwości transportowe pojedyn-czych włókien szkieletowych, np. zdolność dorównoczesnego transportu pęcherzyków wprzeciwnych kierunkach, za sprawą różnychbiałek motorycznych: dyneiny, mającejzdolność przesuwania od bieguna dodatniegomikrotubuli do ujemnego, i kinezyny, odbieguna ujemnego do dodatniego.

Dość dobrze poznana została strukturaelementów cytoszkieletu komórek soma-

Tom 52, 2003

Numer 4 (261)

Strony 469–479

Page 2: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

-tycznych, ich skład białkowy oraz wyglądkonfiguracji zmieniających się w kolejnychfazach cyklu życiowego komórek. Poznanotakże część funkcji, poszczególnych kategoriicytoszkieletu. Znane w świecie zwierząt inneelementy cytoszkieletu, np. filamentypośrednie lub tubulina gamma, występujątakże w komórkach roślinnych, ale doniesieniao nich w komórkach biorących udział w pro-cesach rozmnażania są bardzo nieliczne.

Zjawisko rozmnażania jest atrybutem wszyst-kich organizmów żywych. W świecie roślin or-ganizmy prokariotyczne i niektóre jednokomór-kowe gatunki eukariotyczne rozmnażają się przezprosty podział mitotyczny na dwie identycznekomórki potomne, co jest formą rozmnażaniawegetatywnego. Olbrzymia większość gatun-ków eukariotycznych, w tym wszystkie roślinywyższe, mogą rozmnażać się płciowo prze-chodząc przy tym przemianę pokoleń z dwoma

następującymi po sobie poziomami ploidalnościchromosomów, haploidalnym — gametofito-wym, 1n (z pojedynczym garniturem chromo-somów w komórkach) i diploidalnym — sporo-fitowym, 2n (z podwójnym garniturem). Czas eg-zystencji kolejnych pokoleń nie jest jednakowy,ale cykl ma stałe punkty graniczne: zapłodnienie,czyli fuzję gamet oraz mejozę. Mejoza zachodzizwykle tylko w niektórych komórkach sporofitui prowadzi do wytworzenia haploidalnych za-rodników oraz wyrośnięcia z nich gametofitów,wytwarzających męskie i żeńskie gamety.

Wszystkim wspomnianym procesom:podziałom mitotycznym i mejotycznym,zapłodnieniu oraz morfogenezie, towarzyszązmiany konfiguracji cytoszkieletu, lepiejpoznane, gdy chodzi o komórki diploidalne, asłabiej w części dotyczącej mejozy, rozwoju idojrzewania gametofitów oraz formowaniagamet lub szczegółów zapłodnienia.

KONFIGURACJE CYTOSZKIELETU W CYKLU MITOTYCZNYM

Logicznie będzie zacząć opisy konfiguracjicytoszkieletu od stadium zygoty zapoczątko-wującej rozwój diploidalnego pokolenia, wktórej zachodzą podziały mitotyczne komórek.W cyklu życiowym komórki wyróżnia się 5konfiguracji cytoszkieletu, dość ściślezwiązanych z fazami cyklu życiowego. W sta-dium międzypodziałowym (G1, S i G2 oraz G0)mikrotubule rozmieszczone są w peryfery-cznej cytoplazmie tuż przy ścianiekomórkowej, tworząc luźne spiralne irównoległe układy zwane siecią kortykalną.Następna konfiguracja nosi nazwę pierścieniapreprofazowego i pojawia się pod koniec fazyG2, ale przed jakimikolwiek oznakami profazy.Preprofazowy pas zajmuje równikową częśćcytoplazmy między ścianą i jądremkomórkowym, dokładnie w płaszczyźnieprzyszłego podziału. Pas preprofazowy jestszczególną postacią sieci kortykalnej, aleskłada się zarówno z silnie zagęszczonychmikrotubul, jak i mikrofilamentów aktyno-wych oraz szeregu dalszych komponentów,m.in. zawiera cyklinę Cyc B 1 zm 2—jeden z

enzymów wyzwalających podział mitotyczny.Trzy pozostałe konfiguracje to: wrzecionokariokinetyczne, fragmoplast i radialny układokołojądrowy stanowiący krótki etapprzejściowy do sieci kortykalnej. Konfiguracjete związane są odpowiednio: wrzeciono — zrozmieszczeniem chromosomów w płytce me-tafazowej i rozdziałem chromatyd w anafaziemitozy, fragmoplast — z dystansowaniem jąderpotomnych i wytworzeniem przegrodypierwotnej, zaś radialny układ stanowiprzejście do konfiguracji sieci kortykalnej, do-konujące się przez depolimeryzację przyjądro-wych, ujemnych odcinków mikrotubul.

Kolejne podziały mitotyczne i procesymorfogenezy prowadzą do uformowaniarośliny, diploidalnego, sporofitowego poko-lenia, które po odpowiednim pobudzeniuzawiązuje kwiaty. Wówczas w workachpyłkowych pręcików (czyli w męskiej częścikwiatu) oraz w ośrodku zalążka w słupkach (wżeńskiej części kwiatu) zachodzi mejoza,rozpoczynająca haploidalne pokolenie roślinyzdolne do wytwarzania gamet.

MEJOZA, MIKROSPOROGENEZA I ROZWÓJ PYŁKU

Plan przebiegu mejozy jest jednakowy uroślin, grzybów i zwierząt, ale występująróżnice charakterystyczne dla dużych grup sys-

tematycznych oraz różnice gatunkowe. Nie-równy jest także czas trwania mejozy, którymoże wynosić kilka miesięcy (obejmując zimę)

470 JÓZEF BEDNARA

Page 3: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

lub trwa zaledwie 1–2 doby w optymalnychwarunkach temperaturowych. Komórki zdol-ne potencjalnie do mejozy noszą nazwę arche-sporialnych i mają stałe położenie; w obrębiepylników — w przypadku męskiej linii, zaśwśród komórek zalążka — w przypadku liniiżeńskiej. Worki pyłkowe i ośrodek zalążkapełnią funkcję zarodni męskich bądź żeńskichz różną liczbą komórek męskiego i żeńskiegoarchesporu. Jest ona olbrzymia w przypadkupłci męskiej i niewielka (1 lub kilka komórek)w przypadku płci żeńskiej.

Omawianie procesu rozmnażania w aspek-cie cytoszkieletu najłatwiej będzie przedstawićna przykładzie roślin okrytozalążkowych, le-piej poznanych ze względu na ich dostępność,ważność gospodarczą oraz szybkość przebiegucyklów rozmnażania. Różnice są duże, w po-równaniu np. z roślinami nagonasiennymi (wy-sokimi, niedostępnymi drzewami), u którychprocesy tworzenia pyłku, zapłodnienia i wy-twarzania nasion trwają 2–3 lata, zaś uniektórych paprotników podobne procesytrwają nawet kilka lat.

Procesy rozwoju męskiej i żeńskiej linii ko-mórek generatywnych: mikrosporogeneza itworzenie pyłku oraz megasporogeneza i for-mowanie woreczków zalążkowych wykazująistotne różnice, dlatego trzeba je omawiaćoddzielnie.

Mejoza rozpoczynająca mikrosporogenezęma konfiguracje cytoszkieletu zbliżone do mi-tozy, choć są także istotne różnice. Uderzającyjest na przykład brak w mejozie preprofazo-wego pierścienia, który tworzy się przed mi-tozą i wyznacza późniejszą płaszczyznę ścianykomórkowej, formującej się w telofazie.

Kilkanaście lat temu pierwsze opisy szkie-letu tubulinowego w mikrosporogenezie (VANLAMMEREN i współaut. 1985) dotyczyły roślinjednoliściennych, a wkrótce identyczne kon-figuracje szkieletu podał (HOGAN 1987) udwuliściennych. Dalsze badania ujawniłypodobieństwa rozmieszczenia mikrotubul imikrofilamentów oraz wykazały ich wzajemnezależności funkcjonalne w mejozie (TRAAS iwspółaut. 1989).

We wczesnej profazie mejotycznej mikro-sporocyt traci sieć kortykalną, a w całej objęto-ści cytoplazmy pojawia się tubulina w postacidrobnych ziaren i krótkich mikrotubul. W póź-niejszej profazie (w diplotenie) nowe mikro-tubule pojawiają się wokół jądra w stycznym iradialnym ułożeniu (Ryc. 1), a w diakinezieprofazy mejotycznej i w metafazie I, całe pęczki

mikrotubul polimeryzują się na kinetochorachbiwalentów, tworząc wrzeciono kariokine-tyczne (Ryc. 2). W anafazie I widać, że wrze-ciono składa się z dwu populacji mikrotubul:kinetochorowych, widocznych w postaci oka-pów na biegunach oraz luźniej ułożonych mi-krotubul polarnych, biegnących między gru-pami chromosomów homologicznych (Ryc. 3).Później, między dwoma telofazowymi jądramipojawia się fragmoplast złożony w części znowo powstałych mikrotubul, a w części z mi-krotubul biegunowych będących pozosta-łością wrzeciona kariokinetycznego (Ryc. 4).

Dalszy przebieg mejozy jest nieco od-mienny u gatunków z tzw. cytokinezą równo-czesną (w większości roślin dwuliściennych),oraz u gatunków z cytokinezą sukcesywną (wwiększości jednoliściennych). W pierwszymprzypadku, po telofazie I nie zachodzi cyto-kineza i nie buduje się ściana komórkowa, leczmikrosporocyt wchodzi bezpośrednio w pro-fazę II i metafazę II. Budują się wrzeciona ka-riokinetyczne podziału homotypowego me-jozy (Ryc. 5, 6). W anafazie w jednej coenocyty-cznej komórce znajdują się więc cztery grupychromosomów rozdzielone bardzo wydłużo-nymi wrzecionami (Ryc. 7). Telofaza II (u ro-ślin z równoczesną cytokinezą) ma szczególnekonfiguracje cytoszkieletu. Tworzą się cztero-biegunowe fragmoplasty, z mikrotubulami po-jawiającymi się zarówno w przestrzeni międzyjądrami siostrzanymi, jak i jądrami niesios-trzanymi (Ryc. 8). Ostatecznie zachodzi syn-chroniczna cytokineza oddzielająca ścianami 4jądra komórkowe, w efekcie czego powstają 4mikrospory z radialnym okołojądrowymukładem mikrotubul (Ryc. 9). Coenocytycznakomórka dzieli się więc na mikrospory wedługstałego schematu, właściwego mejozie z cyto-kinezą równoczesną. Listewki nowych ścianzakładają się przy zewnętrznej ścianie mejo-cytu i budują ją dośrodkowo, rozdzielająccytoplazmę z jądrami komórkowymi.

W mejozie z cytokinezą sukcesywną, po te-lofazie I pojawia się ściana komórkowa od-dzielająca dwie komórki diady, a metafaza II itelofaza II przebiegają w oddzielnych kom-partmentach cytoplazmy. We fragmoplastachdominuje ruch pęcherzyków diktiosomalnychod strefy przyjądrowej do przegrody i jest stałapolaryzacja elementów cytoszkieletu. Mikro-tubule mają końce dodatnie w części przyśrod-kowej, a ujemne bliżej jądra komórkowego, zaśmikrofilamenty mają końce zaostrzone przyjądrach, a tępe przy budującej się ścianie

Rola szkieletu cytoplazmatycznego w rozmnażaniu roślin 471

Page 4: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

472 JÓZEF BEDNARA

Ryc. 1–12. Rozmieszczenie mikrotubul w mikrosporocytach i pyłku tytoniu widoczne po reakcji im-munocytochemicznej z antytubuliną. Skala liniowa na Ryc. 1–12 — 10 �m, na Ryc. 12 — 7 �m.

1. Wczesna profaza, mikrotubule ułożone wokół jądra komórki mejotycznej. 2. Metafaza II, wszystkie mikrotubu-le zebrane w obrębie wrzeciona kariokinetycznego. 3. Anafaza I, późne wrzeciono z okapami mikrotubul kinet-ochorowych i mikrotubulami biegunowymi (interzonalnymi). 4. Telofaza I, mikrotubule fragmoplastu. 5. ProfazaII podziału mejotycznego, zachowane resztki fragmoplastu i budujące się mikrotubule nowych wrzecion. 6. Me-tafaza II podziału z dwoma wrzecionami. 7. Anafaza II, rozbudowane mikrotubule interzonalne oraz resztki mi-krotubul kinetochorowych na końcach wrzeciona. 8. Czterobiegunowy fragmoplast we wczesnej telofazie II. 9.Młode mikrospory z radalnym cytoszkieletem tubulinowym. 10. Starsza mikrospora z acentrycznymi mikrotubu-lami i bocznie ułożonym jądrem. 11. Pyłek 2-komórkowy z niesymetrycznym fragmoplastem. 12. Kiełkujący pyłekz wrzecionowatą komórką generatywną.

Page 5: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

(SCHOPFER i HEPLER 1991). Nie tworzy sięwówczas czterobiegunowy fragmoplast, leczdwa oddzielne, przebiegające między sio-strzanymi jądrami ostatniego podziału. Zakła-danie ściany dokonuje się odśrodkowo, czyliodmiennie jak w cytokinezie sukcesywnej.Ostatecznie jednak powstaje tetrada mikro-spor z radialnie ułożonymi mikrotubulami.Identyczny jest także dalszy rozwój mikrosporw ziarna pyłku (BROWN i LEMMON 1992).

Pierwszą oznaką różnicowania mikrosporyjest zakłócenie symetrii mikrotubul, które roz-budowując się z jednej strony powodują prze-mieszczenie jądra komórkowego w pobliżesporodermy (Ryc. 10). Tam dochodzi do po-działu mitotycznego z wytworzeniem nierów-nych komórek: soczewkowatej małej komórkigeneratywnej i dużej komórki wegetatywnej(Ryc. 11). Są doniesienia o występowaniu sku-pień mikrotubul w mikrosporach w miejscuprzyszłego usytuowania jądra (przyszły biegungeneratywny), ale agregaty takie nie występująu wszystkich gatunków (BROWN i LEMMON1994) lub wręcz tworzą się na wegetatywnymbiegunie (TERASAKA i NIITSU 1995).

Prawdopodobnie, peryferyczne lub przy-środkowe zagęszczenie cytoszkieletu jestzmienne w czasie i powinno być uważane zaniesymetryczne modyfikacje systemu radial-nego (VAN LAMMEREN i współaut. 1989).

O polaryzującą rolę w rozwoju pyłku są tak-że podejrzewane filamenty pośrednie (YANG iwspółaut. 1992), ale nie jest jasne czywspółdziałają one z mikrotubulami, mikrofila-mentami czy funkcjonują samodzielnie.

W dalszym rozwoju komórka generatywnazmienia kształt z soczewkowatej na wrzecion-owaty (Ryc. 12) i w pyłku lub w łagiewce ulegajeszcze jednej mitozie dającej początek dwukomórkom plemnikowym. Wydłużony kształt iwspólne przemieszczanie komórek plemnik-owych i jądra wegetatywnego (męskiej jed-nostki płciowej) w łagiewce ma podłoże cy-toszkieletowe.

Zmiana kształtu komórki generatywnej nawrzecionowaty dokonuje się za sprawą for-mujących się na obrzeżu mikrotubul, bie-gnących równolegle do jej długiej osi, wsposób podobny do prętów klatki kanarka. Po-wstaje dwubiegunowa wrzecionowata struk-tura, ale jeden biegun mocniej zaostrzony opa-suje jądro wegetatywne pyłku i mocno łączy sięz jego powierzchnią, wymuszając nawet po-wstanie wklęśnięcia.

Po drugiej mitozie powstają dwie komórkiplemnikowe, które jednak nie rozdzielają się.Łączy je wspólna, odziedziczona po komórcegeneratywnej błona, nowo zbudowane mikro-tubule fragmoplastu oraz dodatkowo, dużowcześniej spolimeryzowane mikrotubule kor-tykalne, które nie depolimeryzują mimo rozpo-częcia mitozy. W zwykłych podziałach mito-tycznych, mikrotubule kortykalne znikają wewczesnej profazie, a fragmoplast istnieje zaled-wie kilkanaście minut. W przypadku mitozy wkomórce generatywnej obydwie konfiguracjemikrotubul istnieją kilkadziesiąt godzin, byćmoże ze względu na pożądany bliski kontaktgamet z jądrem wegetatywnym.

Ziarna pyłku mają uboższy szkielet cyto-plazmatyczny niż kiełkujące z nich łagiewki.Przed kiełkowaniem reakcja immunocyto-chemiczna ujawnia obecność krótkich mikro-tubul, występujących w skupieniach lub od-dzielnie oraz tubulino-pozytywne ziarnistości.W komórce wegetatywnej młodego pyłku znaj-dują się także mikrofilamenty aktynowe orazwykrywane są białka motoryczne — miozyna ikinezyna.

O sukcesie reprodukcyjnym rośliny w tymstadium decyduje szybkość i kierunek wzrostułagiewki oraz skuteczny transport gamet. Wia-domo, że gamety znajdują się w szczytowej, naj-mniej zwakuolizowanej części łagiewki i mogąprzemieszczać się autonomicznie, nawet nieza-leżnie od nurtu cytoplazmy. Z badań immuno-cytochemicznych wynika, że w cytoplazmiełagiewki istnieje aktynowo-miozynowy systemgenerowania ruchu, a także niezależny systemzwiązany z mikrotubulami i białkiem motorycz-nym — dyneiną (bądź dyneino-podobnymbiałkiem). Zgodne z tym są także badania ultra-strukturalne. Oglądany w mikroskopie elek-tronowym pod dużym powiększeniem szkieletmikrotubularny komórek plemnikowychujawnia niespodziewane szczegóły. W przyś-ciennej cytoplazmie znajdują się mikrotubuleułożone zgodnie z długą osią wrzecionowatejkomórki lub nieco spiralnie, w pęczkach po kil-kadziesiąt sztuk. Mikrotubule nie tworząukładów koncentrycznych 9+2 typowych dlarzęsek, jakie mają plemniki mszaków, paprotni-ków czy niektórych roślin nasiennych jak np.Ginkgo lub sagowców. Jednak część mikro-tubul ściśle przylega do siebie tworząc grupy po2, 3, 4, 5 i 6. Na niektórych mikrotubulach widaćboczne ramiona, podobnie jak na ślizgającychsię względem siebie parach mikrotubul w rzęs-

Rola szkieletu cytoplazmatycznego w rozmnażaniu roślin 473

Page 6: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

kach z dyneiną. Układ bocznych ramion na mi-krotubulach widziany w mikroskopie elekt-ronowym jest przynajmniej wizualnie podobnydo dyneiny i podejrzewany o generowanie ru-chów ślizgowych. Dodatkowo w obrazach z mi-

kroskopu konfokalnego żywych łagiewekwidać zmiany kształtu komórek plemnikowych,w tym tworzenie wypustek plazmatycznych.

MEGASPOROGENEZA I FORMOWANIE GAMETOFITU ŻEŃSKIEGO

Badanie przeróżnicowań szkieletu cyto-plazmatycznego w megasporogenezie i przypowstaniu gametofitu żeńskiego jest trudniej-sze, dlatego znane jest tylko u nielicznych ga-tunków. Rozwój żeńskiej linii komórek gener-atywnych dokonuje się na podobnej drodze jakmikrosporogeneza, ale z mejozą w jednej lubkilku komórkach zalążka. Wobec występo-wania licznych wariantów rozwoju żeńskiej li-nii komórek generatywnych u roślin, celowebędzie przedstawienie przeróżnicowań cy-toszkieletu na przykładzie powstawania mo-nosporowego woreczka zalążkowego typuPolygonum, tj. najpowszechniej występu-jącego, bo aż u ok. 95% gatunków roślin. Me-joza zachodzi najczęściej w zalążkach wukładzie liniowym, a nie tetraedrycznym, jak wpręcikach. Komórka archesporialna, a późniejmegasporocyt wydłużają się szybko w osi mi-kropylarno-chalazalnej zalążka. Archespor róż-nicuje się tuż pod epidermą zalążka i tam wcho-dzi w podział mejotyczny (w zalążkach cienko-ośrodkowych), albo wcześniej oddziela jeszczekomórkę przykrywkową (Ryc. 13), która za-myka megasporocyt w głębi zalążka (w zaląż-kach gruboośrodkowych) (Ryc. 14, 15). W me-jotycznej profazie obserwuje się regularneprzemieszczenia jądra komórkowego, które zpołożenia centralnego (Ryc. 13, 14) przecho-dzi na stronę bliższą chalazy (Ryc. 15), a póź-niej bliżej mikropyle (Ryc. 16, 17). Ruchy te sązależne od szkieletu mikrotubularnego, któryrozbudowuje się okresowo po mikropylarnejlub chalazalnej stronie. W każdym przypadkuintruzywny wzrost megasporocytu na długośćuszkadza połączenia plazmatyczne na bocznejścianie. Najmniej zmienione pozostają ścianyterminalne, chalazalne i mikropylarne, wktórych plazmodesmy pozostają.

W mejotycznej profazie drożność całej ścia-ny megasporocytu zostaje dodatkowo ograni-czona przez warstwę kalozy. Kaloza w zygo-tenie tworzy dość grubą, ciągłą warstwę, powewnętrzej stronie ściany megasporocytu.Pod koniec mejotycznej profazy kaloza jednakdegraduje się na jednym biegunie; chalazalnym

lub mikropylarnym tj. tam, gdzie po mejoziebędzie usytuowana megaspora aktywna (Ryc.18, 19). Selekcja aktywnej megaspory (jednej zczterech) wynika z charakterystycznego wzo-ru odkładania kalozy (RODKIEWICZ 1970), aleintrygujący problem drożności ścian znalazłwyjaśnienie dopiero po badaniach cytoszkiele-tu. Mianowicie z badań szkieletu aktynowegowynika, że jest on całkowicie symetryczny ażdo metafazy I, kiedy wchodzi w skład wrze-ciona oraz tworzy na nim rodzaj żeberkowanejotoczki (Ryc. 20). W żadnym miejscu ściany niewidać aktyny, która wskazywałaby powierzch-nie transferowe. Później w telofazie aktyna po-jawia się w obrębie fragmoplastu i na chala-zalnej ścianie, świadcząc o rozpoczęciu trans-portu do mejocytu z tej właśnie strony. Dowo-dem na rzeczywiste istnienie połączeń plaz-matycznych na chalazalnej stronie megasporo-cytu jest obecność licznych mikrofilamentówaktynowych (Ryc. 21). Otwarcie plasmodesmma więc miejsce dopiero w połowie mejozy,choć izolacja kalozowa przestała istnieć już wprofazie. U niektórych gatunków taka ścianapokrywa się dodatkowo transferowymi wy-pustkami (Ryc. 22).

Ostatecznie w wyniku mejozy powstającztery megaspory. W typie rozwojowym Poly-gonum 3 megaspory degenerują, a jedna, cha-lazalna, przechodzi 3 cykle mitoz, które dająpoczątek 8 jądrom komórkowym woreczkazalążkowego.

Szkielet cytoplazmatyczny młodego wo-reczka zalążkowego jest ubogi, praktycznieogranicza się do figur mitotycznych, wrzecionkariokinetycznych i fragmoplastów. W cytop-lazmie jest niewiele mikrotubul i brak zupełniepierścieni preprofazowych, które tworzyłybysię przed profazami w typowych mitozach.Spekuluje się, że ów brak wynika ze specyfikiprocesów morfogenetycznych (podziały jąderbez cytokinez) oraz z charakteru późniejszychścian komórkowych, bardziej podobnych doprzegrody pierwotnej niż celulozowych ścianzwykłych komórek, będących częścią składo-wą tkanek.

474 JÓZEF BEDNARA

Page 7: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

Rola szkieletu cytoplazmatycznego w rozmnażaniu roślin 475

Ryc. 13–22. Megasporogeneza w zalążkach Ornithogalum umbellatum (Ryc. 13–17), Gasteria verruc-

osa (Ryc. 18–21) i Epipactis palnstre (Ryc. 22). Skala liniowa na Ryc. 13–21—10 µm, na Ryc. 22—5 µm.

13. Komórka przykrywkowa i komórka archesporialna przy mikropyle zalążka. 14. Młody megasporocyt z cen-tralnie ułożonym jądrem komórkowym i okołojądrowymi mikrotubulami. 15. Megasporocyt w stadium zygotenuz acentrycznie ułożonym jądrem, usytuowanym bliżej chalazy (strona dolna zdjęcia). 16. Megasporocyt w diplo-tenie z jądrem komórkowym przesuniętym bliżej mikropyle, z mikropylarnym zagęszczeniem mikrotubul. 17.Ten sam megasporocyt — po fluorochromie DAPI widać diplotenowy stan kondensacji chromosomów z jąder-kiem przy mikropyle oraz rozproszone w cytoplazmie nukleoidy mitochondriów i proplastydów. 18. Fluores-cencja kalozy w diplotenowym megasporocycie, widać rozrzedzenie otoczki izolującej na biegunie chalazalnym.19. Rozmieszczenie kalozy w telofazie I mejozy z pełną izolacją mikropylarnej komórki diady i częściowo otwartąchalazalną ścianą drugiej komórki. 20. Megasporocyt w metafazie I z widocznym szkieletem aktynowym na wrze-cionie kariokinetycznym. 21. Szkielet aktynowy w telofazie I z zagęszczeniem mikrofilamentów w obrębie frag-moplastu oraz silnym zagęszczeniem przy transferowej, chalazalnej ścianie. 22. Zdjęcie z mikroskopu elektrono-wego megasporocytu w stadium profazy mejotycznej II. Widać skondensowane chromosomy i wypustki trans-ferowe ściany chalazalnej.

Page 8: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

Ta część cyklu rozwojowego roślin jestmało zbadana i wymaga pilnego uzupełnienia.Lepiej poznany jest cytoszkielet dojrzałychworeczków zalążkowych, które można badaćna skrawkach, jak też in toto po mechanicznejlub enzymatycznej izolacji.

W najbardziej powszechnym przypadku, wworeczku powstałym według typu Polygonumznajduje się 3-komórkowy aparat jajowy przybiegunie mikropylarnym, duża dwujądrowakomórka centralna w środku woreczka i trzyantypody od strony chalazalnej. Aparat jajowyskłada się z dwu synergid i komórki jajowej,mających podobne wymiary oraz identycznygruszkowaty kształt, ale wykazujących od-mienną polaryzację i odmienne konfiguracjemikrotubul. W synergidach dominujepodłużny układ mikrotubul (w osi mikropylar-no-chalazalnej), z silnym zagęszczeniem wkształcie pędzla przy mikropyle, w pobliżuaparatu włókienkowego. Komórka jajowa i ko-mórka centralna (będące gametami) mają dośćubogi szkielet tubulinowy, o wyglądzie siecikortykalnej. W komórkach antypod natomiastwystępują liczniejsze mikrotubule o tangenc-jalnym i promienistym ułożeniu. Wydaje się, żeobecne w gametoficie żeńskim trzy typy ko-mórek — o roli transportowej, generatywnej itroficznej, mają trzy odmienne konfiguracjemikrotubul.

Interesujące jest rozmieszczenie szkieletuaktynowego (YING i współaut. 2000). Licznemikrofilamenty występują przy aparaciewłókienkowym synergid, prawdopodobnie to-warzysząc mikrotubulom. Jedna z synergid jestjednak wyraźnie bogatsza w aktynę (Ryc. 23).

Inaczej, bo radialnie są ułożone mikrofila-menty wokół jądra komórki jajowej (Ryc. 24)oraz komórki centralnej (Ryc. 25).

U kilku gatunków roślin poznane są takżeszczegóły zapłodnienia: wnikanie łagiewki do

synergidy, przeniesienie gamet męskich do ko-mórki jajowej i centralnej oraz pierwsze po-działy w zygocie. Sekwencja zdarzeń związa-nych z podwójnym zapłodnieniem jest zależnaod szkieletu aktynowego. Są poglądy, że sy-nergida bogatsza w aktynę degeneruje wcześ-niej i przy zapłodnieniu ona właśnie przyjmujełagiewkę. Wówczas po przeciwnej, chalazalnejstronie synergidy buduje się aktynowa korona(Ryc. 25), która umożliwia przemieszczenie ga-met męskich do komórki jajowej i centralnej(HUANG i RUSSELL 1994, RUSSELL 1996). Speku-luje się, że synteza elementów aktynowych wprzestrzeni pozakomórkowej jest możliwadzięki uwolnieniu dużej puli jonów wapnia zwakuoli zdegenerowanej synergidy, awspółdziałanie aktynowego cylindra (korony)i białek motorycznych (HESLOP-HARRISON iHESLOP-HARRISON 1989) na powierzchni ga-met męskich umożliwia ich przemieszczanie ifuzję z gametami żeńskimi. Przebieg zapłod-nienia jest znany z badań niewielu gatunków,ale prawdopodobnie zachodzi jednakowo, na-wet u gatunków, u których brak synergid, np. uPlumbago zeylandica. Tam aktynowa koronatworzy się w komórce jajowej, co umożliwiazapłodnienie (HUANG i współaut. 1993).

W komórce zygotycznej cytoszkielet ak-tynowy i tubulinowy, czyli zbudowany z mik-rofilamentów i mikrotubul, jest niesymetry-czny. Rzutuje to na późniejsze formowanie za-rodka z biegunem troficznym — suspensoro-wym i ściśle merystematycznym — apikalnymbiegunem zarodka właściwego (Ryc. 26, 27).Istniejące przy chalazalnym biegunie wo-reczka zalążkowego antypody mają elementycytoszkieletu aktynowego rozmieszczone po-dobnie jak mikrotubule, czyli stycznie i ukoś-nie (Ryc. 28).

STRUKTURY WOLNOJĄDROWE

W procesach rozmnażania roślin obserw-uje się przypadki rozwoju coenocytycznychwielojądrowych struktur, które są etapamirozwojowymi w powstawaniu gametofitówżeńskich u roślin nago- i okrytozalążkowych,w aposporycznych woreczkach zalążko-wych, we wczesnych etapach rozwoju biel-ma, a wyjątkowo także w rozwoju zarodków(np. u Peonia). Zachodzące wówczas szybkiemitozy nie są skojarzone z cytokinezami,

przez co powstają przejściowo komórczaki okilku, kilkuset lub nawet kilku tysiącach jąderkomórkowych. Po pewnym czasie zachodząjednak cytokinezy kończące podziały ko-mórek. Procesy te rozpatrywane od stronykonfiguracji cytoszkieletu wyglądają jedna-kowo, choć dotyczą coenocytów haploi-dalnych (gametofity), diploidalnych (apomi-ktyczne woreczki zalążkowe, zarodki Peonia

i niektóre typy bielma), triploidalnych lub o

476 JÓZEF BEDNARA

Page 9: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

wyższym stopniu ploidalności w bielmie róż-nych typów.

W cyklach podziałowych coenocytów do-minującą konfiguracją jest stabilny okołojądro-wy układ radialny. Nie obserwuje się szkieletukortykalnego, ani jego szczególnej postaci —pierścienia preprofazowego. Pojawiają się na-tomiast dalsze, typowe dla mitozy konfigura-cje: wrzeciono kariokinetyczne i fragmoplast.W obrębie fragmoplastów nie powstaje jednakprzegroda pierwotna i ściana. Wydaje się, że

okołojądrowa część fragmoplastu jest trwalszaniż w typowej mitozie. W ten sposóbokołojądrowy radialny układ mikrotubul możeutrzymywać jądra w stałej odległości, stabi-lizując coenocyt (BROWN i współaut. 1994).Znacznie później, po kilku lub wielu cyklachpodziałowych zachodzi celularyzacja komór-czaka. Gwałtownie wówczas pojawia się nowageneracja fragmoplastów (niezależnie od fazycyklu jąder komórkowych) tworząca się przywcześniej istniejącej, granicznej ścianie wo-

Rola szkieletu cytoplazmatycznego w rozmnażaniu roślin 477

Ryc. 23–28. Szkielet aktynowy w gametoficie żeńskim Galanthus nivalis. Skala liniowa — 10 �m.

23. Mikropylarna część woreczka zalążkowego z synergidami. Fluoryzujące mikrofilamenty skupione głownieprzy mikropyle, w miejscu aparatów włókienkowych. Jedna synergida jest bogata w aktynę. 24. Synergidy z za-gęszczeniem aktyny przy mikropyle i wysunięta do chalazy komórka jajowa z radialnie ułożonym szkieletem ak-tynowym. 25. Część komórki centralnej z radialnym ułożeniem aktyny w okołojądrowych strumieniach cytop-lazmy oraz cylinder aktynowy przy aparacie jajowym. 26. Wygląd komórki jajowej po zapłodnieniu, a przedpierwszym podziałem zygoty. Więcej aktyny znajduje się w głównej masie cytoplazmy w pobliżu jądra. 27. Obrazmłodej zygoty w mikroskopie świetlnym pokazujący aparat włókienkowy i resztki łagiewki pyłkowej (w górnejczęści zdjęcia) oraz cytoplazmę z jądrem, która wejdzie w skład aplikalnej części zarodka. 28. Szkielet aktynowyw antypodach, widać tangencjonalne i skośne skupienia mikrofilamentów.

Page 10: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

reczka zalążkowego. Powstają ostatecznie cy-lindryczne fragmoplasty obejmujące jądrakomórkowe, a potem nowe ściany o takim sa-mym kształcie, przylegające do starej ściany jakkomórki plastra pszczelego. Polimeryzacja mi-krotubul wchodzących w skład fragmoplastówdokonuje się przez przedłużenie okołojądro-wych radialnych mikrotubul. Budujące sięściany pierwszej warstwy są wyłącznie anty-klinalne, więc przejściowo tworzą się alweole,niekompletne komórki z otwartą przyśrodko-wą powierzchnią. Jest charakterystyczne, żezarówno młode coenocytyczne gametofityżeńskie, jak wczesne coenocytyczne stadia roz-woju bielma są podobne cytologicznie; mają je-

dynie cienką warstwę cytoplazmy o ubogim cy-toszkielecie i wielką centralną wakuolę. Dalszepodziały coenocytycznych tworów wy-pełniające np. gametofity żeńskie nagozalążk-owych lub wewnętrzne strefy bielma nie mająjuż rozdzielonej w czasie kariokinezy i cyto-kinezy. Ich ściany mogą budować się tuż po mi-tozie we wszystkich płaszczyznach; także pe-ryklinalnych i skośnych. Najwcześniejsze an-tyklinalne podziały w bielmie dają początekbardzo regularnej warstwie komórek aleur-onowych, wykształcających się w nasionach.

PODSUMOWANIE

Rola szkieletu cytoplazmatycznego w roz-mnażaniu roślin jest znana tylko fragmentary-cznie, ale wobec rosnącej aktualności nauko-wej tematyki i perspektyw aplikacyjnych lukimogą być szybko uzupełniane.

Przy badaniach szkieletu cytoplazmatycz-nego komórek stawia się czasem pytanie czy sąto badania podstawowe bez szansy na prak-tyczne zastosowanie, czy mogą mieć znaczenieaplikacyjne.

Zdaniem niektórych biotechnologów jestco najmniej kilka praktycznych zastosowań ta-kich badań.

1. Uzyskiwanie roślin poliploidalnych do-konuje się poprzez traktowanie merystemówwierzchołkowych roślin kolchicyną, uszka-dzającą mikrotubularny szkielet wrzecionakariokinetycznego.

2. Hodowcy androgenicznych zarodków zmikrospor i pyłku in vitro stosują wychładzaniepąków kwiatowych lub przegrzewanie pąkówdla podniesienia wydajności embriogenezy. Sty-mulacja następuje przez uszkodzenie cytoszkie-letu i zakłócenie przebiegu mitozy. Wówczas za-miast niesymetrycznego podziału na komórkęgeneratywną i wegetatywną zachodzi mitoza sy-metryczna rozpoczynająca embriogenezę.

3. Praktyczną wartość mają np. badania cy-toszkieletu w przechowywanym przez długiczas pyłku. Pyłek jest wartościowy dopókikomórki plemnikowe utrzymują wrzeciono-waty kształt. Odchylenia od optymalnychwarunków przechowywania lub działanie stre-sów uszkadzających cytoszkielet upośledzajążywotność gamet, które stają się wówczaszaokrąglone.

ROLE OF CYTOSKELETON IN PLANTS REPRODUCTION

S u m m a r y

This review concerns the role of cytoskeletal ele-ments: microtubules and microfilaments in plants re-production brought to light by recent electron micro-scopic and immunofluorescence investigations on mi-totic and meiotic cells, as well as on the developmentof male and female gametophytes. Configurations ofthe cytoskeleton depend on the cell cycle phase andon morphogenetic processes. The mitotic cell cyclecontains five configurations of cytoskeletal fibers: cor-tical network, preprophase band, mitotic spindle andperinuclear radial arrangement. The cortical networkexists at the stages G1, S and G2 but at the end of theG2 the preprophase band exists as a peculiar form ofcortical microtubules, predicting the future divisionplane. The cytoskeleton of meiotic cells doesn’t con-

tain the preprophase band configuration. In anthers,the microsporocytes (the male line of generative cells)are divided into tetrads after successive or simulta-neous cytokinesis. There are quite dense arrange-ments of microtubules and microfilaments in cyto-plasm of prophase microsporocyte and two other con-figurations of the cytoskeleton; meiotic spindle andphragmoplast in the metaphase I and telophase I cyto-skeleton. Such configurations are doubled inmetaphase II and telophase II. The phragmoplast is ar-ranged between sister and non sister nuclei in case ofsimultaneous cytokinesis, while in two separate bipo-lar phragmoplasts in case of successive cytokinesis. Be-fore the first mitosis in the microspores an asymmetricmicrotubular cytoskleleton is developed, resulting in

478 JÓZEF BEDNARA

Page 11: Tom 52, 2003 Numer 4 (261) Strony 469–479

displacement of the nucleus to the cell periphery.Later the first, asymmetric, haploid mitosis forms amuch bigger vegetative cell and a smaller generativeone. The generative cell changes in the shape from alens to spherical and to a spindle shape. This cell di-vides (in pollen grain or in pollen tube) forming twomale gametes. The development of female line of gen-erative cells starts in hypodermal cell at the micropylarend of the ovule. The megasporocyte performs ran-dom or perinuclear disposition of cytoskeletal ele-

ments in mitotic prophase with a temporary concen-tration during nucleus migration. During the meiosisthe tetrad of megaspores is formed with the linear or Tshape arrangement. Finally the haploid embryo sac de-velops with a peculiar cytoskeletal organisation. Thepollen tube and gametes entrance is an effect of inter-action of the actin cytoskeleton and myosin (or a myo-sin like protein) on the surface of male gametes.

LITERATURA

BROWN R. C., LEMMON B. E., 1992. Cytoplasmatic do-

main; a model for spatial control of cytokinesis in

reproductive cells of plants. Electron Microsc. Soc.Am. Bull. 22, 48–53.

BROWN R. C., LEMMON B. E., OLSEN O.-A., 1994. Endos-

perm development in barley: microtubule

involvement in the morphogenetic pathway. PlantCell. 6, 1241–1252.

BROWN R. C., LEMMON B. E., 1994. Pollen mitosis in the

slipper orchid Cypripedium fasciculatum. Sex.Plant Reprod. 7, 87–94.

HESLOP-HARRISON J., HESLOP-HARRISON Y., 1989. Cytoc-

halasin effects on structure and movement in pol-

len tube of Iris. Sex. Plant Reprod. 2, 27–37.HOGAN C. J., 1987. Microtubule patterns during meios-

is in two higher plant species. Protoplasma 138,126–136.

HUANG B.-Q., PIERSON E. S., RUSSEL S. D., TIEZZI A., CRESTI

M., 1993. Cytoskeletal organisation and modifica-

tion during pollen tube arrival, gamete delivery

and fertilisation in Plumbago zeylanica. Zygote1, 143–154.

HUANG B.-Q., RUSSELL S. D., 1994. Fertilization in Nicot-

iana tabacum: cytoskeletal modification in the

embryo sac during synergid degeneration. A hy-

pothesis for short-distance transport of sperm cells

prior to gamete fusion. Planta 194, 200–214.RODKIEWICZ B., 1970. Callose in cell walls during me-

gasporogenesis in angiosperms. Planta 93, 39–47.RUSSEL S. D., 1996. Attraction and transport of male ga-

mets for fertilization. Sex. Plant Reprod. 9,337–342.

SCHOPFER C. R., HEPLER P. K., 1991. Distribution of

membrans and the cytoskeleton during cell plate

formation in pollen mother cells of Tradescantia.

J. Cell Sci. 100, 717–728TERASAKA O., NIITSU T., 1995. The mitotic apparatus du-

ring unequal microspore division observed by a

confocal laser scanning microscope. Protoplasma189, 187–193.

TRAAS J. A., BURGAIN S., DE VAULX R. D., 1989. The organ-

ization of the cytoskeleton during meiosis in

egg-plant [Solanum melongena (L.)]: microtub-

ules and F-actin are both necessary for coordina-

ted meiotic division. J. Cell Sci. 92, 541–550.VAN LAMMEREN A. A. M., KEIJZER C. J., WILLEMSE M. T. M.,

KIEFT H., 1985. Structure and function of the

microtubular cytoskeleton during pollen deve-

lopment in Gasteria verrucosa (Mil.) M. Duval.

Planta 165, 1–11.VAN LAMMEREN A. A. M., BEDNARA J., WILLEMSE M. T. M.,

1989. Organization of the actin cytoskeleton du-

ring pollen development in Gasteria verrucosa

(Mill.) M. Duval. Planta 178, 531– 539.YANG C., XING L., ZHAI Z., 1992. Intermediate filaments

in higher plant cells and their assembly in a

cell-free system. Protoplasma 171, 44–54.YING F., MING Y., BING-QUAN H., HONG-YUAN Y.,

SZE-YONG Z., O’BRIEN T. P., 2000. Changes in actin

organization in the living egg apparatus of Toren-

ia fournieri during fertilization. Sex. Plant Re-prod. 12, 315–322.

Rola szkieletu cytoplazmatycznego w rozmnażaniu roślin 479