torque teno vírus (ttv)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS. Torque teno vírus (TTV). (Exame de qualificação). Thais Fumaco Teixeira. Histórico. 1997: Torque teno vírus (TTV) - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULFACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Torque teno vírus(TTV)Thais Fumaco Teixeira
(Exame de qualificação)
Histórico
•1997: Torque teno vírus (TTV)
▫Paciente com hepatite pós-transfusional de etiologia desconhecida
Iniciais do nome do paciente (T.T.)
“transfusion transmitted virus”
Histórico
•2000: “TTV-like mini virus” (TLMV)
•2005: Novo significado para TTV e TLMV▫Torque teno vírus (TTV)▫Torque teno mini vírus (TTMV)
“Torque” = colar “teno” = pequeno
Histórico
•2007: Torque teno midi-vírus (TTMDV)
▫Vírus relacionado ao TTV
▫Tamanho intermediário
Histórico
•Infecção por TTV não é restrita a humanos
▫Chimpanzés ▫Tupaias▫Suínos▫Bovinos▫Cães▫Gatos▫Leões marinhos
Taxonomia• Família Anelloviridae
• Gênero Anellovirus
▫ Sub-classificados em genogrupos
Taxonomia
Características moleculares
• DNA circular
• Fita simples
• Polaridade negativa
• Variabilidade no tamanho
▫ TTV humano (3,4 kb – 3,9 kb)
▫ TTMDV (3,2 kb)▫ TTMV (2,8 kb – 2,9 kb)▫ TTSuV (2,9 kb)▫ TTV felino (2,1 kb)
Epidemiologia
•Amplamente difundidos▫Distribuição não está associada com a sua
origem geográfica
•Prevalência TTSuV1 varia de 24% a 100%
•Prevalência de TTSuV2 na Espanha (77%)
Epidemiologia
•TTV estaria associado a diferentes patologias
auto-imunes:▫Doenças reumáticas▫Patologias hepáticas ▫Disturbios respiratórios
•Não existem dados definitivos indicando que TTV é responsável por qualquer doença em humanos▫Vírus órfão
Epidemiologia
•Em suínos: TTSuV infecta uma elevada proporção de animais aparentemente saudáveis
•Co-infecção com outros patógenos
•Prevalência de TTSuV2 em suínos com SMDS (91%) e em suínos saudáveis (72%) (Kekarainen et al., 2006)
•TTSuV1 facilita indução da SMDS pelo PCV2 (Ellis et al., 2008)
Patogenia
•DNA de TTV tem sido identificado em:
▫Células mononucleares de sangue periférico;▫Células hematopoiéticas da medula óssea;▫Plasma;▫Fezes;▫Saliva;▫Suabes nasais e de garganta.
•Aparentemente necessita de células em multiplicação ativa para se replicar
Transmissão
• Principal transmissão TTSuV: oral-fecal (soro, plasma, fezes)
• Transmissão vertical: colostro, útero, soro de porcas e seus natimortos
• Sêmen
• Trato respiratório: pulmões, secreções nasais e saliva
Detecção de Torque teno vírus suíno 1 (TTSuV1)
em diferentes tecidos de suínos
Introdução
• Aparentemente TTSuV não tem associação com qualquer patologia
• Estudo mostrou uma aparente associação negativa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS (Teixeira et al., 2008)
• Estudo de distribuição de TTSuV em tecidos detectou uma maior prevalência de TTSuV no pulmão (Bigarré et al., 2005)
Introdução
• Replicação do TTSuV não parece estar restrita a este órgão
• Formas replicativas intermediárias de fita dupla de TTV foram encontradas:
▫ Fígado ▫ Células da medula óssea▫ Pulmão▫ Pâncreas▫ Baço▫ Outros tecidos linfóides
Objetivos
• Detecção de TTSuV em órgãos de suínos com e sem a Síndrome Multissistêmica do
Definhamento dos Suínos;
Material e Métodos
• Amostras
▫ Órgãos de suínos (pulmão, fígado, rim, baço e linfonodo)
11 suínos saudáveis 76 suínos com SMDS
• Extração de DNA• Quantificação (100 ng)• PCR
Material e Métodos
• Sensibilidade da PCR
▫ Produto da PCR de TTSuV1 (349 pb) e TTSuV2 (572 pb) clonado no vetor pCR2.1;
▫ Sequenciamento;
▫ Plasmídeo: C+1 e C+2;
▫ DNA plasmidial foi quantificado;
▫ Diluição seriada na base 10.
Material e Métodos
• Construção do controle interno
▫ Mesmos primers usados na PCR para TTSuV1 e 2;▫ PCR com temperatura de anelamento de 40 °C;▫ TTSuV1: célula de linhagem de rim de suíno (SK6);
Produto de 293 pb foi clonado e sequenciado; Plasmídeo: CI1;
▫ TTSuV2: célula de linhagem de rim de suíno livre de PCV1 (PKsC3); Produto de 441 pb foi clonado e sequenciado; Plasmídeo: CI2;
▫ DNA plasmidial foi quantificado;▫ Diluição seriada na base 10.
Resultados2 3 4 5 6 71
200 bp
400 bp 349 bp293 bp
1 2 3 4 5 6 7
500 bp572 bp441 bp
A)
B)
Figura1.A) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV1B) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV2
Resultados
Tabela 1. Prevalência de TTSuV1 e 2 em tecidos de suínos saudáveis e com Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Com um tecido positivo o animal foi considerado positivo para TTSuV.
Suínos saudáveis (n=11)
Suínos com SMDS (n=76)
Total (n=87)
100 (11/11)
48.7 (37 /76)
55.17 (48/87)
100 (11/11)
94.7 (72 /76)
93.1 (81/87)
% de suínos positivos para
sTTV1
% de suínos positivos para
sTTV2
Resultados
Tabela 2. Prevalência de TTSuV1 e 2 em 5 diferentes amostras de tecidos de suínos saudáveis e com a Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS).
Suínos
saudáveis
Grupos Órgãos
Pulmão Fígado Rim Baço Linfonodo
100% (11/11) 100% (11/11)
90.9% (10/11)
100% (11/11) 100% (11/11)
TTSuV1
TTSuV2
TTSuV1
TTSuV2Suínos com
SMDS
37.7% (26/69)
41.9% (31/74)
37.8% (28/74)
38.5% (27/70)
30.4% (21/69)
76.8% (53/69) 81.1% (60/74)
59.4% (44/74)
77.1% (54/70)
68.1% (47/69)
81.8% (9/11)
81.8% (9/11)
100% (11/11)
81.8% (9/11)
90.9% (10/11)
Resultados
Figura 2. árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos da região não traduzida do genoma do TTSuV.Número de acesso do GenBank das sequências de referência para TTSuV1 (AB076001 e AY823990) e TTSuV2 (AY823991).
Discussão
• Bigarré et al. (2005) relatou que o TTSuV foi encontrado mais frequentemente no pulmão.
(11,2% pulmão; 8,1% linfonodo inguinal; 5,6% linfonodo mesentérico; 4,4% tonsila; 3,1% ileo)
• Difere dos resultados encontrados por Ellis et al. (2008) e Kekarainen et al.(2006).
Conclusão
• Trabalho mostra que a distribuição de TTSuV1 em tecidos aparentemente não apresenta em particular um órgão alvo.
• Resultados reforçam uma aparente correlação inversa entre a presença de TTSuV1 e o desenvolvimento da SMDS.
• Corrobora com trabalho prévio realizado por nossa equipe.
Torque teno vírus suíno (TTSuV) em cultivos celulares e tripsina
Introdução
• Interação entre TTSuV e PCV2
• Sistema eficaz de replicação para o TTSuV
• Nenhum cultivo que permita a propagação de TTSuV foi identificado
• Nenhum cultivo foi avaliado em busca de TTSuV como contaminante
Objetivos
• Detectar a presença de genomas de TTSuV em células de linhagem, soro e tripsina
Material e Métodos
• Amostras
▫ 25 células de linhagem 10 células em cultivo 15 ampoladas e estocadas em nitrogênio líquido
▫ 9 lotes de soros (diferentes fornecedores) Soro fetal bovino Soro de equíno Soro de ovino Soro de terneiro
▫ 5 lotes de tripsina
Material e Métodos
• Extração de DNA
• Quantificação (100 ng)
• PCR ▫ forward-1: 5’ GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG 3’▫ forward-2: 5’ GGG CCW GAA GTC CTC ATT AG 3’▫ reverso: 5’ GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC 3’
(Rijsewijk,2008) • TTSuV1: 106 pb• TTSuV2: 103 pb
Material e Métodos
• Todos os produtos de PCR foram clonados e sequenciados
• Sequências obtidas foram depositadas no GenBank n° de acesso (GU574709 A GU574729)
• Análise filogenética
Resultados
Células de linhagemPresença deDNA viral de
TTSuV1
Presença deDNA viral de
TTSuV2Baby hamster kidney (BHK-21) - +Chicken embryo related (CER) - +Crandell feline kidney (CRFK) - +Human embryonic intestine (H407) + -Human leukemic cell (K562) (28/05/04)* + -African green monkey kidney embryonic (MA-104) (28/04/93)* + -
Madin-darby bovine kidney (MDBK) (17/08/01)* + -Madin-darby canine kidney (MDCK) (25/10/05)* + -Porcine kidney PK(15) + +Porcine kidney (PK-2a) - +Porcine kidney sub-clone 3 PCV1 free (PKsC3) + +Swine kidney (SK6) - +Swine testicle (ST) + +Bovine thyroid cell (TB) (27/02/85)* + -African green monkey kidney (Vero) - +
Resultados
Células de linhagemPresença deDNA viral de
TTSuV1
Presença deDNA viral de
TTSuV2Canine Carcinoma (A-72) (2/07/08)* - -Mutant MDBK Resistant to BVDV Infection (CRIB) (16/01/06)* - -
Embryonic Bovine Trachea (EBTr) (29/12/04)* - -Equine Dermis (ED) (9/07/08)* - -Foetal Lamb Kidney (FLK) (6/12/90)* - -Murine Fibrosarcoma (L929) (3/06/08)* - -Monkey Kidney (LLC-MK2) (15/07/86)* - -
Murine Neuroblastoma (N2A) (18/10/04)* - -Rabbit Kidney (RK13) (13/01/93)* - -Murine myeloma (SP2/O-Ag14) - -
Resultados
Soro e tripsina Presença deDNA viral de sTTV1
Presença deDNA viral de sTTV2
Fetal Bovine Serum (supplier A) - -
Fetal Bovine Serum (supplier B) - -
Fetal Bovine Serum (supplier C) - -
Calf Serum (treated in house with polyethylene glycol) - -
Horse serum (inactivated) - -
Horse serum (1 donor) - -
Horse serum (pool) - -
Ovine serum - -
Calf serum - -
Trypsin (supplier A) + +
Trypsin (supplier B) - -
Trypsin (supplier C) - -
Trypsin (supplier D) - -
Trypsin (supplier E) - -
Resultados
Fig. 1. Árvore filogenética baseada nas sequências de nucleotídeos da região não codificante do genoma dos sTTVs. AB076001 e AY823990 são as sequências de referência para sTTV1 e AY823991 é a sequência referência para sTTV2.
Discussão
• Devido a natureza ubíqua do TTSuV fontes comuns de transmissão devem existir (McKeown et al., 2004)▫ Vacinas preparadas em células contaminadas
• Kekarainen et al. (2009) relataram presença de TTSuV1 e 2 em enzimas e vacinas.
• Segales et al. (2009) também detectaram TTSuV1 e 2 em soro de suínos desde 1985.
Conclusão
• Primeira evidência de TTSuV como contaminante celular.
• Resultados sugerem que a fonte da contaminação pode ter sido a tripsina.
• Contaminação existente no laboratório desde 1985 (Tireóide bovina-TB).
Obrigada !
Thais Fumaco TeixeiraDoutoranda PPGCV