Toxicity Testing using Toxicity Testing using MicroorganismsMicroorganisms

Marlia Singgih WibowoMarlia Singgih Wibowo

Introduction Introduction •• AkibatAkibat revolusirevolusi industriindustri, , penggunaanpenggunaan bahanbahan

kimiakimia baikbaik sintetiksintetik maupunmaupun bahanbahan alamalam didilingkunganlingkungan industriindustri semakinsemakin tinggitinggi, , sehinggasehinggamasalahmasalah ekologiekologi dandan toksikologitoksikologi menjadimenjadi munculmunculdandan semakinsemakin bermasalahbermasalah..

•• PenyebabPenyebab utamautama adalahadalah polutanpolutan industriindustri((industrial effluentsindustrial effluents) ) misalnyamisalnya: : herbisidaherbisida, , insektisidainsektisida, , fertilizerfertilizer ((pupukpupuk), ), polusipolusi kendaraankendaraan((asapasap knalpotknalpot), ), asapasap pabrikpabrik ((hasilhasil pembakaranpembakaran, , dsbdsb))

•• ToksisitasToksisitas umumnyaumumnya diujidiuji untukuntuk BahanBahan Baku Baku ObatObat, , EksipienEksipien, , PengawetPengawet, , dandan BahanBahan KimiaKimialain.lain.

•• ToksisitasToksisitas dapatdapat terjaditerjadi terhadapterhadap : : Host Host ((manusiamanusia, , hewanhewan), ), atauatau mikroorganismemikroorganisme((parasitparasit dandan nonnon--parasitparasit))

Screening of toxicity Screening of toxicity

•• UjiUji ““efekefek terhadapterhadap kesehatankesehatan”” secarasecarainin--vitrovitro

•• UjiUji ““efekefek terhadapterhadap ekologiekologi atauataulingkunganlingkungan”” secarasecara inin--vitrovitro

UjiUji ““efekefek terhadapterhadap kesehatankesehatan””secarasecara inin--vitro vitro

•• UjiUji iniini berdasarkanberdasarkan penggunaanpenggunaan komponenkomponen subsub--selularselular ((mis.enzimmis.enzim, DNA, RNA), , DNA, RNA), atauatau selsel--selselyang yang diisolasidiisolasi ((kulturkultur selsel, , selsel darahdarah merah,dllmerah,dll), ), atauatau potonganpotongan jaringanjaringan , , atauatau seluruhseluruh organ organ yang yang diisolasidiisolasi..

•• UjiUji--ujiuji iniini terdiriterdiri atasatas ::–– PenetapanPenetapan viabilitasviabilitas selsel : : ujiuji inklusiinklusi pewarnapewarna

utamautama, , efisiensiefisiensi plating, plating, pembentukanpembentukan kolonikoloni–– ReproduksiReproduksi selsel–– BiosintesisBiosintesis makromolekulmakromolekul

UjiUji ““efekefek terhadapterhadap ekologi/lingkunganekologi/lingkungan””secarasecara inin--vitrovitro

•• UjiUji iniini dilakukandilakukan untukuntuk mengukurmengukur terutamaterutamatoksisitastoksisitas akutakut bahanbahan--bahanbahan kimiakimia terhadapterhadaporganismeorganisme air. air.

•• OrganismeOrganisme air air mewakilimewakili berbagaiberbagai tingkattingkat rantairantaimakananmakanan tropistropis. . UjiUji iniini membantumembantumemperkirakanmemperkirakan toksisitastoksisitas kimiakimia didi alamalam dandan dididalamdalam ekosistemekosistem yang yang telahtelah diubahdiubah oleholehmanusiamanusia. .

•• BakteriBakteri, Algae, zooplankton, invertebrate, , Algae, zooplankton, invertebrate, dandanikanikan, , digunakandigunakan didi dalamdalam uji2 uji2 iniini. .

UjiUji menggunakanmenggunakan bakteribakteridandan enzimenzim

•• BakteriBakteri dandan enzimenzim seringsering digunakandigunakan untukuntuk ujiujiberbagaiberbagai senyawasenyawa toksiktoksik, , organikorganik dandan inin--organikorganikyang yang terdapatterdapat didi air air alamalam, , tanahtanah, , dandan prosesproses--prosesproses pengolahanpengolahan limbahlimbah..

•• NasibNasib senyawasenyawa ujiuji ((toksikantoksikan) ) dapatdapat terjaditerjadi 2 2 halhal : : dimetabolismedimetabolisme menjadimenjadi metabolitmetabolit yang nonyang non--toksiktoksik, , atauatau melakukanmelakukan aktivitasaktivitas toksiktoksik terhadapterhadapsuatusuatu populasipopulasi mikrobamikroba..

•• KonsentrasiKonsentrasi //kadarkadar sangatsangat berpengaruhberpengaruh terhadapterhadapbesarnyabesarnya aksiaksi atauatau kerjakerja toksikantoksikan, , misalnyamisalnyaFenolFenol padapada konsentrasikonsentrasi rendahrendah dapatdapatdimetabolismedimetabolisme oleholeh bakteribakteri, , tetapitetapi padapadakonsentrasikonsentrasi tinggitinggi bersifatbersifat toksiktoksik..

EfekEfek toksikantoksikan terhadapterhadapmikroorganismemikroorganisme

•• ToksikanToksikan dapatdapat menyebabkanmenyebabkan kerusakankerusakan materimaterigenetikgenetik atauatau dapatdapat menyebabkanmenyebabkan denaturasidenaturasiprotein (protein (mismis. halogen). halogen)

•• MerusakMerusak membranmembran selsel bakteribakteri ((mis.senyawamis.senyawa fenolfenolatauatau ammonium ammonium kuartenerkuartener) ) sehinggasehingga dapatdapatmenyebabkanmenyebabkan kerusakankerusakan padapada DNA, RNA , protein DNA, RNA , protein dandan bahanbahan organikorganik lainlain

•• MenggantiMengganti kationkation--kationkation ((mis.Namis.Na++ atauatau CaCa++) ) daridaritempattempat adsorpsinyaadsorpsinya padapada selsel bakteribakteri ((mis.asammis.asamdandan basabasa))

•• MenghambatMenghambat kemoreseptorkemoreseptor bakteribakteri, , sehinggasehinggaterjaditerjadi inhibisiinhibisi dekomposisidekomposisi organikorganik dandan prosesprosespemurnianpemurnian--sendirisendiri (self(self--purification) purification) padapada pabrikpabrikpengolahanpengolahan limbahlimbah dandan padapada airair--air yang air yang terkenaterkenabahan2 bahan2 fekalfekal

FaktorFaktor pentingpenting dalamdalam aktivitasaktivitastoksisitastoksisitas terhadapterhadap bakteribakteri

•• AktivitasAktivitas enzimenzim•• FaktorFaktor fisikofisiko--kimiakimia ((adaada tidaknyatidaknya kationkation

lain, pH, lain, pH, potensialpotensial redoksredoks, , suhusuhu, , senyawasenyawa organikorganik, mineral , mineral tanahtanah, , dlldll))

EfekEfek terhadapterhadap bakteribakteri dapatdapat diukurdiukurmelaluimelalui ujiuji biokimiabiokimia

•• MengukurMengukur aktivitasaktivitas enzimenzim•• KandunganKandungan ATPATP•• BioluminesensBioluminesens

BeberapaBeberapa indikatorindikator biokimiabiokimia ((mismis. ATP, . ATP, LPS, LPS, asamasam muramatmuramat) ) digunakandigunakan untukuntukpenentuanpenentuan biomasabiomasa mikrobamikroba didi dalamdalamsampelsampel daridari alamalam..

UJI BIOKIMIAUJI BIOKIMIA•• EnzimEnzim memegangmemegang peranperan pentingpenting dalamdalam reaksi2 reaksi2

metabolismemetabolisme didi dalamdalam selsel mikrobamikroba, , tanamantanaman dandanhewanhewan, , sehinggasehingga inhibisiinhibisi terhadapterhadap enzimenzim dapatdapatmenyebabkanmenyebabkan kerusakankerusakan padapada selsel. .

•• EfekEfek toksiktoksik polutanpolutan atauatau toksikantoksikan yang yang menggangumengganguaktivitasaktivitas enzimenzim kebanyakankebanyakan terhadapterhadap enzimenzimdehidrogenasedehidrogenase. .

•• EnzimEnzim dehidrogenasedehidrogenase mengkatalisismengkatalisis oksidasioksidasi substratsubstratdengandengan caracara transfer transfer elektronelektron melaluimelalui sistemsistem transportransporelektronelektron (ETS) (ETS) yaituyaitu : : suatusuatu rantairantai komplekskompleksintermediate (intermediate (flavoproteinflavoprotein, , sitokromsitokrom, , dlldll) yang men ) yang men transport transport elektronelektron daridari sumbersumber nutrisinutrisi keke oksigenoksigen((sebagaisebagai akseptorakseptor elektronelektron) )

•• BahanBahan pewarnapewarna (dyes) yang (dyes) yang spesifikspesifik dapatdapatdigunakandigunakan sebagaisebagai indikatorindikator aktivitasaktivitas ETS. ETS. Dyes Dyes bekerjabekerja sebagaisebagai akseptorakseptor hidrogenhidrogen palsupalsudandan akanakan berubahberubah warnawarna setelahsetelah terjaditerjadireduksireduksi. . JadiJadi aktivitasnyaaktivitasnya dapatdapat dengandengan mudahmudahdiukurdiukur secarasecara spektrofotometrispektrofotometri. . PewarnaPewarna yang yang banyakbanyak digunakandigunakan misalnyamisalnya metilenmetilen birubiru, TTC , TTC ((TrifenilTrifenil TetrazoliumTetrazolium ChloridaChlorida), ), tetrazoliumtetrazolium birubiru, , dlldll. .

•• UjiUji ToksisitasToksisitas berdasarkanberdasarkan padapada reduksireduksipewarnapewarna iniini misalnyamisalnya padapada percobaanpercobaanpengukuranpengukuran aktivitasaktivitas enzimenzim (ATP (ATP asease, , ureaseurease, , esteraseesterase dlldll))

ATP AssaysATP Assays•• ATP ATP adalahadalah produkproduk reaksireaksi katabolismekatabolisme, ,

paling paling umumumum padapada seluruhseluruh protistaprotista, , selselhewanhewan, , dandan selsel tanamantanaman

•• ATP ATP mudahmudah rusakrusak setelahsetelah selsel matimati, , oleholehkarenakarena ituitu halhal iniini merupakanmerupakan salahsalah satusatucaracara yang yang tepattepat untukuntuk membedakanmembedakan selselhiduphidup dandan selsel yang yang matimati

•• MetodeMetode : : mengukurmengukur radiasiradiasi yang yang dipancarkandipancarkan setelahsetelah mereaksikanmereaksikansenyawasenyawa luciferinluciferin dengandengan ATP. ATP. ReaksiReaksiiniini dikatalisisdikatalisis oleholeh luciferaseluciferase dandan Mg Mg 2+2+

ATP assayATP assay

LuciferinLuciferin + + LuciferaceLuciferace + ATP+ ATP

LuciferinLuciferin--LuciferaceLuciferace--AMPAMP + PP + O2+ PP + O2

OxyluciferinOxyluciferin--LuciferaseLuciferase--AMPAMP + H2O+ H2O

OxyluciferinOxyluciferin + + LuciferaseLuciferase + AMP ++ AMP + hhµµ (560nm)(560nm)

UJI MENGGUNAKAN BAKTERIUJI MENGGUNAKAN BAKTERI

•• BakteriBakteri terlibatterlibat terutamaterutama dalamdalam mineralisasimineralisasi substratsubstratorganikorganik dandan didi dalamdalam rere--siklisasisiklisasi nutrisinutrisi mineral. mineral.

•• AktivitasnyaAktivitasnya pentingpenting untukuntuk prosesproses selfself--purificationpurification didilingkunganlingkungan air. air. SiklusSiklus hidupnyahidupnya pendekpendek dandan cepatcepatbereaksibereaksi terhadapterhadap perubahanperubahan didi dalamdalam lingkunganlingkungan. .

•• BakteriBakteri cukupcukup stabilstabil dandan mudahmudah dipeliharadipelihara sertasertamurahmurah biayanyabiayanya..

•• BakteriBakteri sangatsangat sesuaisesuai digunakandigunakan untukuntuk menapismenapistoksikantoksikan yang yang adaada didi lingkunganlingkungan air. air.

•• TigaTiga kategorikategori utamautama assay assay menggunakanmenggunakan bakteribakteri : : berdasarkanberdasarkan luminesensiluminesensi, , viabilitasviabilitas atauataupertumbuhanpertumbuhan bakteribakteri spesifikspesifik, , dandan assay assay efekefekekologiekologi..

Assay Assay berdasarkanberdasarkan luminesensiluminesensibakteribakteri

BakteriBakteri yang yang dapatdapat berluminesensiberluminesensikebanyakankebanyakan adalahadalah bakteribakteri lautlaut antaraantara lain : lain : PhotobacteriumPhotobacterium ((vibriovibrio) ) fisherifisheri, , P.PhosphoreumP.Phosphoreum, , dandan BeneckeaBeneckea harveyiharveyiDari Dari segisegi biokimiabiokimia, , sistemsistem bioluminesensibioluminesensidianggapdianggap sebagaisebagai bagianbagian daridari sistemsistem transport transport elektronelektron dimanadimana enzimenzim luciferaseluciferasemengkatalisismengkatalisis oksidasioksidasi FMNH (FMNH (flavinflavinmononukleotidamononukleotida tereduksitereduksi) ) dandan suatusuatu aldehidaldehiddihasilkandihasilkan daridari produksiproduksi FMN, FMN, asamasam dandancahayacahaya. .

FMNH2 + O2 + RCHO FMNH2 + O2 + RCHO →→ FMN + H2O + RCOOH + FMN + H2O + RCOOH + cahayacahaya

MicrotoxMicrotox®®assayassay : : berdasarkanberdasarkan padapada pengukuranpengukuranbioluminesenbioluminesen bakteribakteri

Assay Assay berdasarkanberdasarkan pengukuranpengukuraninhibisiinhibisi pertumbuhanpertumbuhan, , respirasirespirasi dandan

viabilitasviabilitas selsel bakteribakteri•• BeberapaBeberapa mikroorganismemikroorganisme padapada daerahdaerah pembuanganpembuangan

(sewage) (sewage) adalahadalah daridari genus genus Pseudomonas, Pseudomonas, KlebsiellaKlebsiella, , AeromonasAeromonas, , atauatau CitrobacterCitrobacter. .

•• SalahSalah satusatu mikrobamikroba yang yang khususkhusus yaituyaitu NitrobacterNitrobacter yang yang memilikimemiliki kemampuankemampuan nitrifikasinitrifikasi padapada prosesproses pengolahanpengolahanlimbahlimbah pabrikpabrik. . MikrobaMikroba iniini digunakandigunakan untukuntuk mengukurmengukurtoksisitastoksisitas logamlogam beratberat dandan limbahlimbah industriindustri. . HilangnyaHilangnya nitritnitritatauatau pembentukanpembentukan nitratnitrat merupakanmerupakan indikatorindikator dalamdalam assay assay tersebuttersebut. . KonsentrasiKonsentrasi toksikantoksikan (ED50) yang (ED50) yang menyebabkanmenyebabkan50% 50% inhibisiinhibisi konversikonversi nitritnitrit menjadimenjadi nitratnitrat dapatdapat ditentukanditentukanmelaluimelalui kurvakurva antaraantara lajulaju metabolikmetabolik relatifrelatif NitrobacterNitrobacterterhadapterhadap konsentrasikonsentrasi toksikantoksikan..

Bioassay lain Bioassay lain

•• UjiUji menggunakanmenggunakan SpirillumSpirillumvolutansvolutans berdasarkanberdasarkan hilangnyahilangnyakoordinasikoordinasi dandan mobilitasmobilitas mikrobamikroba tsbtsbdengandengan adanyaadanya toksikantoksikan..

•• Cara Cara respirometrirespirometri : : berdasarkanberdasarkankemampuankemampuan pengambilanpengambilan oksigenoksigen((oxygen uptake rateoxygen uptake rate))

UjiUji efekefek ekologiekologi

•• UjiUji iniini memberikanmemberikan informasiinformasiterhadapterhadap efekefek merugikanmerugikan toksikantoksikanpadapada alamalam dandan ekosistemekosistem buatanbuatanmanusiamanusia. .

•• UjiUji mencakupmencakup : : evaluasievaluasi efekefek polutanpolutanterhadapterhadap siklussiklus nutrisinutrisi, , dekomposisidekomposisibahanbahan organikorganik, , transformasitransformasi nitrogen nitrogen ((amonifikasiamonifikasi, , nitrifikasinitrifikasi) ) dandan reduksireduksisulfatsulfat..

UjiUji MenggunakanMenggunakan Algae Algae

•• Algae Algae digunakandigunakan untukuntuk ujiuji tosikantosikan padapadalingkunganlingkungan air. air.

•• Algae Algae lebihlebih mudahmudah ditanganiditangani dibandingkandibandingkanikanikan atauatau invertebratainvertebrata

•• UjiUji dilakukandilakukan terhadapterhadap suatusuatu parameter , parameter , misalnyamisalnya : : JumlahJumlah selsel, , fluoresensifluoresensi inin--vivo, vivo, asimilasiasimilasi CC1414, , aktivitasaktivitas nitrogenasenitrogenase, , muatanmuatanenergienergi adenilatadenilat

UjiUji MenggunakanMenggunakan Fungi Dan Fungi Dan RagiRagi

•• Fungi Fungi dandan ragiragi memegangmemegang perananperanan pentingpenting dalamdalamdekomposisidekomposisi bahanbahan organikorganik didi dalamdalam tanahtanah dandanlingkunganlingkungan air, air, jugajuga didi dalamdalam prosesproses industriindustri. .

•• UjiUji menggunakanmenggunakan fungi fungi atauatau ragiragi berdasarkanberdasarkan padapada: : pengukuranpengukuran lajulaju pertumbuhanpertumbuhan radial radial padapada media media padatpadat, , inhibisiinhibisi pertumbuhanpertumbuhan dalamdalam media media caircair, , ujiujigerminasigerminasi sporaspora, , metodemetode difusidifusi agar, agar, respirometrirespirometri, , aktivitasaktivitas ETS , ETS , pengukuranpengukuran pelepasanpelepasan KK++ setelahsetelahterpaparterpapar oleholeh toksikantoksikan, , dlldll..