A cromatografia lquida de

Pode ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tecnicas instrumentais de analise, vem tendo destaque devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de espcies qumicas. Trata-se de um mtodo fsico-qumico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis (fase mvel e estacionria). Utiliza colunas fechadas que contm partculas muito finas que proporcionam separaes muito eficientes, so utilizadas altas presses para forar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da anlise.2.2 Tipos de CromatografiaA classificao dos mtodos cromatogrficos pode ser quanto ao mecanismo de separao, quanto a tcnica empregada e em relao ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificao mais popular a que leva em considerao o tipo de superfcie na qual ocorre a separao, sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.

Cromatografia

Planar

Coluna

3.2 Diferenas entre a HPLC e a cromatografia lquida clssica (CLC)

A cromatografia lquida clssica utiliza-se de um equipamento barato no qual o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se adsorver de forma irreversvel; a coluna deve ser cheia a cada separao acarretando desperdcio de material e de mo-de-obra; o analista deve ser experiente; a eluio feita pela ao da gravidade tornando o processo demorado; a quantificao e deteco so feitas pela anlise manual das fraes individuais, o que requer muito tempo devido ao grande nmero de fraes coletadas, tambm pode ser usada alguma tcnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, anlise qumica ou registro gravimtrico e os resultados so registrados em forma de cromatograma, um grfico da concentrao da amostra versus o nmero da frao.

Etapas da cromatografia lquida clssica

Na cromatografia lquida de alta eficincia a coluna fechada, podendo ser utilizada inmeras vezes; as colunas utilizadas so bastante eficientes, mas oferecem resistncia vazo da fase mvel necessitando aplicao de sistemas de bombas de alta presso, isso faz com que a velocidade da eluio aumente. As anlises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente controlada. A injeo feita com microsseringas ou atravs de vlvulas de injeo e diversos tipos de detectores podem ser utilizados. Este mtodo no necessita tanta experincia do operador; tem alta resoluo, sensibilidade e reprodutibilidade, mas dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao.

Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia

3.3 Comparao da CLAE com a cromatografia gasosa (CG)

Na cromatografia gasosa as amostras devem ser volteis, para que possam passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estveis, a fim de que no se decomponham nas condies da separao. A amostra no deve interagir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel um gs inerte tendo como funo somente carregar a amostra volatilizada. Neste mtodo os equipamentos so mais baratos e o tempo de anlise reduzido.Na HPLC as amostras no precisam ser volteis nem termicamente estveis, basta que sejam solveis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. A amostra interage com as duas fases enquanto que na CG a amostra s interage com a fase estacionria. Este mtodo possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variao tanto na fase mvel como na fase estacionria, o que ocorre no na CG, pois a fase mvel sempre um gs inerte.

Vantagens e desvantagens

O PROCESSO CROMATOGRFICO

O processo cromatogrfico consiste na partio dos componentes de uma mistura entre a fase mvel e a fase estacionria. No caso da cromatografia gasosa o fluido um gs e na cromatografia lquida o fluido um solvente. Na cromatografia lquida a fase estacionria constituda de partculas slidas empacotadas em uma coluna, a qual atravessada pela fase mvel. So as foras fsicas e qumicas que atuam entre os solutos e as duas fases so responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na magnitude dessas foras que determina a resoluo e portanto a separao dos solutos individuais.

As foras elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos:

1) Foras de disperso de London ou Foras de Van der Waals;

2) Interaes de dipolo induzido;

3) Ligaes de hidrognio;

4) Interaes dieltricas;

5) Interaes eletrostticas e coulombianas.3.4 Fases

3.4.1 Fases Mveis (FM)

Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fcil purificao; deve dissolver a fase mvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificao; no deve dissolver a fase estacionria; deve ser compatvel com o detector; no ser txico e deve ter baixa viscosidade, pois isso ir interferir diretamente na eficincia da separao, devido ao fato de solventes viscosos alm de dificultarem a transferncia de massa entre a fase mvel e a fase estacionria, tambm influenciarem na intensidade da vazo.Uma fase mvel adequada indispensvel para a HPLC, por isso necessrio examinar fatores que determinam sua escolha, como a polaridade desta, que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase estacionria e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separao for com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da polaridade. Outros fatores que tambm devem ser considerados so o ponto de ebulio, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxidez.3.4.2 Fases Estacionrias (FE)

Devem ter alta resoluo entre os componentes da amostra, devem ser de fcil introduo na coluna, ter dimetro uniforme, partculas porosas ou peliculares e serem slidos rgidos, semi-rgidos ou no rgidos.

As partculas da fase estacionrias podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: - macropartculas, quando apresentam dimetro entre 20 e 40m; - intermedirias, quando tem entre 20 e 10m;

- micropartculas, de 3 a 10m

Quanto menor for a partcula, maior ser a eficincia da separao, melhorando assim o processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das partculas, pois partculas menores reduzem a distncia de contato do soluto com as fases estacionria e mvel, facilitando o equilbrio e, consequentemente, melhorando a eficincia da coluna. Elas podem ser de formato esfrico, tambm chamado de regular, e de formato irregular, sendo que as regulares so mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutvel da coluna e por esse motivo so mais caras.

De acordo com a natureza das fases mvel e estacionria pode-se classificar o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa.

Cromatografia em fase normal: a fase estacionria utilizada polar e a fase mvel apolar, em relao eluio, os solutos mais apolares so eludos primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estacionria e so eludos depois.

Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionria apolar e a fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais apolares eludos posteriormente.

Sendo o material mais utilizado como empacotamento de colunas a slica, que consiste principalmente em dixido de silcio (SiO2) com o tomo de silcio no centro de um tetraedro, sendo a valncia remanescente na superfcie ocupada por uma hidroxila (-OH). Esta no deve ser utilizada em pH acima de 8,0, pois isso acarretaria sua dissoluo, ento, para a cromatografia de compostos bsicos com pH entre 8,0 e 12,0 recomenda-se o uso de compostos polimricos como poliestireno (o poliestireno expandido o isopor), ligado covalentemente a fase estacionria.

Estrutura esquemtica da slica gel.

A slica sozinha pode ser usada como fase estacionria para a cromatografia de adsoro, j para sua utilizao na cromatografia de partio esta deve estar quimicamente ligada, na qual dependendo do radical R esta pode ser utilizada como fase normal ou fase reversa. A fase estacionria de octadecil (C18) a mais utilizada na cromatografia lquida de alta eficincia, sendo representada por ODS (octadecilsilano). Como fase estacionria, alm da slica, podem ser utilizados slidos semi-rigdos, que geralmente, so constitudas de partculas porosas de poliestireno entrecruzado com divinilbenzeno. Estes podem ser usados em HPLC por excluso com fase mvel orgnica e ainda so muito utilizados na cromatografia por troca inica.Na cromatografia lquido-slido pode ser utilizada a alumina, alm da slica, podendo esta tambm ser utilizada na cromatografia lquido-lquido, assim como o vidro de porosidade controlada, carbono grafitizado, titnia, zircnia e slica recoberta com zircnio.3.5 Mecanismos da HPLC

3.5.1 Lquido-lquido ou partio

A cromatografia lquido-lquido ou partio foi desenvolvida por Martin e Synge, em 1941 com a finalidade de obter a separao de AMINOCIDOS , utilizando como fase estacionria gua em slica e como fase mvel clorofrmio.

O mtodo consiste de uma fase lquida (estacionria) que por adsoro fsica retida na superfcie da coluna empacotada geralmente com slica e de uma fase mvel, tambm lquida, que passa sobre esta fase estacionria sendo uma destas polares e a outra apolar. Esse mecanismo de separao baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra da fase mvel e estacionria. Os componentes da amostra que so mais solveis na fase mvel so eluidos primeiro enquanto os que tm maior afinidade com a fase estacionria so seletivamente retidos por ela.

Desvantagem da CLL: O inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase estacionaria e mvel que pode acarretar a deteriorao da coluna, levando a no reprodutibilidade nas separaes repetidas. Pode ser resolvido de duas maneiras: 1 Saturando a fase mvel com a fase estacionaria por meio de uma pr-coluna, colocada antes do injetor que tenha uma alta percentagem de fase estacionaria. 2 Utilizado materiais que contenham a fase estacionaria quimicamente ligada a um suporte solido.

3.5.2 Cromatografia Lquida com Fase Ligada

A fase estacionaria para cromatografia liquida com fase ligada surgiu como resposta aos problemas com CLL. Como a fase estacionria quimicamente ligada superfcie do suporte, no h mais solubilidade da fase estacionria na fase mvel. O mecanismo principal desta tcnica baseia-se na partio.Como esta fase estacionria apresenta influncia de grupos ativos (polares) da superfcie (isto , tambm ocorre o mecanismo de adsoro). Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionria possvel obter diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares, como o grupo amino (-NH2) e o grupo nitrilo (-CN), que funcionam similarmente s fases polares da CLS, sendo chamados de fase normal. E h os de natureza apolar, como os grupos octil (-C8H17), octadecil (-C18H37), fenil (-C6H5), que so chamados de fase reversa. 3.5.3 Lquido-slido ou absoroA forma mais clssica da cromatografia lquida e devido a recentes adaptaes tornou-se o mais importante membro dos mtodos de HPLC. O mecanismo de separao se baseia na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase estacionria). O equilbrio estabelecido : Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionria, primeiro uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se assumir que o adsorvente possui uma superfcie polar (por exemplo: slica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por essa superfcie e no iro deslocar a molcula da fase mvel; por isso, no sero retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrognio tero fortes afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos.

3.5.4 Cromatografia por troca inica

A Cromatografia por troca inica um mtodo de absoro que baseia-se na interao eletrosttica entre o soluto e a fase estacionria, buscando o equilbrio de troca entre ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido que deve ser insolvel e de alto peso molecular. A amostra a ser separada geralmente uma soluo aquosa contendo ons orgnicos e inorgnicos. Geralmente os compostos que so separados por este mtodo so cidos carboxlicos, bases orgnicas, peptdeos e aminocidos, que podem se ionizar em solues com pH devidamente tamponado, bem como nions inorgnicos e ctions metlicos ou complexos.

3.5.5 Cromatografia por excluso

Geralmente utilizada na separao de componentes de alto peso molecular, a cromatografia por excluso (CE) baseia-se na separao de acordo com o tamanho efetivo das molculas. Este mtodo subdividido em cromatografia por filtrao em gel (GFC) e cromatografia com permeao em gel (GPC). A GFC utilizada na separao de espcies solveis gua (polares) sendo a fase estacionria hidroflica, na GFC os solventes utilizados so orgnicos apolares e fases estacionrias hidrofbicas, o que torna o mtodo complementar sendo que podem ser analisadas substncias polares e apolares.

Quanto rigidez existem trs tipos de materiais:A) (no rgidos), constitudos de gis de polidextrano (Sephadex), poliacrilamidas (Bio-Gel P ) e poliagaroses (Sepharose e Bio Gel A), usados quase sempre com fases mveis aquosas.

B) semi-rgidos que normalmente resistem a presses da ordem de 100 a 150 bars. Estes materiais so constitudos de microesferas de algum copolmero, como o poliestireno-divinilbenzeno. Podem ser empregados com fases mveis aquosas ou no aquosas e existem em uma grande variedade de porosidade.

C) materiais rgidos que resistem a qualquer presso e so geralmente constitudos de partculas de slica porosa ou de vidro poroso. Devido a sua rigidez podem-se obter separaes muito rpidas com fluxo de fase mvel muito alto, o que produz presses elevadas

Equipamentos

As principais caractersticas que devem ser levadas em considerao na escolha de um equipamento para CLAE so:

a) Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos, servir a distintas tcnicas cromatogrficas e realizar o mximo de operaes, tais como, gradiente de fase mvel, coleta das fraes, reciclagem de fraes, etc., necessrias s anlises sofisticadas.

b) Rapidez: Para se conseguir anlises rpidas, deve-se obter as melhores condies de CLAE, isto , fase mvel de baixa viscosidade, bomba de alta presso e colunas com partculas de pequeno dimetro (grande rea de superfcie, que ajuda os processos de separao).

c) Reprodutibilidade e Estabilidade: caractersticas essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parmetros de operao, como vazo, temperatura, presso e composio da fase mvel.

d) Sensibilidade: Um bom equipamento, mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra, deve gerar sinais de intensidade aprecivel.

Preparao de coluna

Aplicao de Amostra

Eluio

Deteco e Quantificao

Evaporar para pesagem

Anlise Qumica Espectrofoto-mtrica

Etc

Clssica

Gasosa

HPLC

Camada delgada

Fludo Supercrtico

Lquida

Papel