trabajar con proteinas-1
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TRABAJAR CON
PROTEÍNASTÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
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SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN
1º. ROTURA DE LAS CÉLULAS EXTRACTO CRUDO
2º.FRACCIONAMIENTO
3º. DIALISIS
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DIFERENCIAS EN LA CARGA,TAMAÑO Y AFINIDAD DE UNIÓN.
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
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EJEMPLO CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO
EXPLICACIÓN
FACTORES DE RESOLUCIÓN ( LONGITUD ,VELOCIDAD ,TIEMPO)
CONCLUSIÓN
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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
(FILTRACIÓN GEL)
APROVECHA
MÉTODO
CONCLUSIÓN
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CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
APROVECHA
MÉTODO
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HPLC BOMBAS DE ALTA PRESIÓN QUE ACELERAN EL PROCESO
MATERIALES DE MEJOR CALIDAD QUE SOPORTAN LA PRESIÓN
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HPLC
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ELECTROFORESIS
¿Para qué sirve?
Análisis de pureza
Determinación de la masa molecular de proteínas,
Verificación de la concentración de proteínas,
Detección de proteólisis e
Identificación de proteínas inmunoprecipitadas, para
Conocer el punto isoeléctrico,
El nº de cadenas polipeptídicas
Identificación y secuenciación de proteínas.
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• Equipo necesario:
• Fuente de poder
• Cámara/cubeta: puede ser horizontal o vertical.
• 2 electrodos
Factores que influyen en la velocidad de migración:
Voltaje aplicado
La carga neta de la proteína
El tamaño y forma de la proteína
La porosidad del gel
Y la densidad, temperatura y fuerza iónica del medio
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Preparación:
Tampón de carga:
Buffer
Gel
Fundamento de la técnica :Hacer pasar corriente por la celda Las biomoléculas empezaran a moverse El resultado son una serie de bandas
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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS
• FUERZA IÓNICA DEL MEDIO Y CARGA NETA DE LA PROTEÍNA
• MASA MOLECULAR
• VOLTAJE
• POROSIDAD DEL GEL
• TIEMPO DE DURACIÓN
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LECTURA DE RESULTADOS
Proteínas Colorantes orgánicos (rojo Ponceau y azul brillante de Coomassie)Ácidos nucléicos sustancias fluorescentes que aumentan la sensibilidad(Bromuro de etidio)
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TÉCNICAS ESPECIALES
Isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Electroforesis de campo pulsante Electroforesis preparativa Inmunoelectroforesis Electroforesis capilar