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ACTIVACION VOLTAJE - DEPENDIENTE DE IKACh POR EL AGONISTA
MUSCARINA EN CARDIOMIOCITOS
Ricardo A. Navarro-Polanco1, Eloy G. Moreno Galindo1, Rodrigo Zamora Cardenas1,
Berenice Ocón Moran2
1 University Center for Biomedical Research, Universidad de Colima, Colima, México. 2Superior School of Medicine of University of Colima, México
Resumen
Objetivos: Evaluar en miocitos cardiacos la dependencia de voltaje del agonista muscarina
para activar a IKACh y determinar el efecto que tienen sobre la relajación de esta corriente.
Métodos: Con la técnica de fijación de voltaje en configuración de célula completa y el
programa pClamp10 (Axon Intruments), se registraron corrientes macroscópicas de
cardiomiocitos (aurícula izquierda) felinos realizando curvas concentración respuesta (C-R)
de muscarina a tres diferentes voltajes: -100, -30 y +50mV. Resultados: Los resultados
preliminares muestran que muscarina activo IKACh con mayor potencia a -100 mV (EC50 =
0.12 µM ± 0.02) que a +50 mV (EC50 = 0.79 µM ± 0.03). La medición a -30mV resultó
con una potencia intermedia (EC50 = 0.24 µM ± 0.04) a la de los otros voltajes de prueba .
Conclusion: Estos resultados apoyan la hipótesis de la dependencia de voltaje específica de
ligando de los receptores M2, y a que la relajación de IKACh es consecuencia de dicha
dependencia de voltaje.
Palabras clave: Muscarina, Receptores M2, dependencia de voltaje.
INTRODUCCION
La función del corazón es generar la presión que se necesita para mantener
circulando la sangre en el organismo. Para esto, depende de la contracción rítmica y
coordinada de los millones de células (cardiomiocitos. La coordinación de estas células está
establecida por cuatro propiedades celulares: excitabilidad, automatismo, conducción y
contractilidad.
El potencial de acción es considerado como un cambio temporal del potencial
membranal, el cual es originado por cambios de permeabilidad en la membrana. Cuando
aumenta la permeabilidad de la membrana para un ion, éste se desplaza a favor del
gradiente electroquímico en una magnitud que depende de la diferencia entre el potencial
membranal y el potencial de equilibrio del ion, conocida como fuerza de empuje o, en
inglés, driving force. El movimiento o flujo de iones genera 2 corriente eléctrica (corrientes
iónicas). La entrada de cationes o salida de aniones producen despolarización de la
membrana, generando corrientes negativas o entrantes (deflexiones hacia abajo); por otro
lado, la salida de cationes o la entrada de aniones producen hiperpolarización, que se
traducen en corrientes positivas o salientes (deflexiones hacia arriba) (Mascher, 1997). El
potencial de acción no es similar en todos los tejidos cardiacos, pues presenta diferencias en
su amplitud, velocidad de cambio durante la despolarización (dV/dt) y en el valor del
potencial durante la meseta. Farmacológica y funcionalmente, se han reportado cinco
diferentes subtipos de receptores muscarínicos, distribuidos en tejidos y órganos
específicos. Estos subtipos fueron clasificados como M1, M2, M3, M4 y M5. En un gran
número de estudios se ha constatado que el subtipo de receptor muscarínico que predomina
ampliamente en el tejido cardiaco de varias especies animales, incluyendo a los humanos,
es el M2 (A. y Tuček S., 2002). Adicionalmente, cabe destacar que el único subtipo de
receptor muscarínico involucrado funcionalmente en la regulación de la frecuencia cardiaca
es también el M2 (Stengel y cols. 2000; Wess, 2004).Los canales IKACh pertenecen al grupo
de canales de K+ rectificadores entrantes (Kir) acoplados a proteínas G, perteneciendo a la
subfamilia Kir3.0. Se puede decir que estos canales representan una de las clases más
primitiva de canales iónicos, pues carecen de un dominio sensible al voltaje, y se pueden
encontrar en diversos organismos, desde unas simples bacterias hasta mamíferos superiores
(Hille, 2001). La estructura elemental de los canales Kirestá constituída por 2 regiones
transmembranales, una región formadora de poro (H5) y los extremos amino y carboxilo,
que se encuentran ambos en el lado citoplasmático (Fig.3B). Los canales Kir se ensamblan
en tetrámeros, de tal forma que el canal KACh está compuesto por subunidades Kir 3.1 y
Kir 3.4 en una estequiometría 2:2 (Kurachi y ishii, 2004). Como 5 su nombre lo indica, los
canales Kir se distinguen por conducir más fácilmente las corrientes entrantes que las
corrientes salientes (Fig.3A). El mecanismo de rectificación entrante de los canales Kir se
explica por un rápido bloqueo, dependiente de voltaje, por el Mg2+ y las poliaminas
intracelulares (Ruppersberg, 2000).
Se utilizaron gatos adultos (sexo indistinto), a los cuales se les administró una
dosis de heparina (1000 U/kg, i.p) 30 min antes de la aplicación de la anestesia,
pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.). Una vez anestesiado, se extrajo el corazón mediante
una toracotomía bilateral y posteriormente se colocó en solución Tyrode previamente
burbujeada con gas carbógeno (95% O2 y 5% CO2). Una vez extraído el corazón, los
miocitos se aislaron mediante el método de separación enzimática descrito inicialmente por
Isenbergy Klöcner (1982) y modificado por Moreno-Galindo y cols. (2011). Los registros
electrofisiológicos se realizaron a temperatura ambiente (23-25° C) al usar el sistema de
perfusión rápida para las curvas concentración-respuesta (C-R), ya 36.5±0.5°C al utilizar la
perfusión convencional para el protocolo de pulsos cuadrados de voltaje. Los electrodos de
registro se elaboraron a partir de capilares de vidrio (WPI Inc., USA), y mediante la
utilización de un estirador P-97 (Sutter Instruments, USA). Previo a la utilización de éstos
con los miocitos, los electrodos fueron sometidos a un proceso de pulido final con la
utilización de una microforja MF-83 (Narishige, Japón). Para las curvas C-R, la sustancia a
utilizar (agonista) se aplico a través de un sistema de perfusión rápida, mientras que para la
aplicación del protocolo de pulsos cuadrados de voltaje se empleó la perfusión
convencional. Los electrodos se colocaron en un sujetador (“holder”) que permite la
succión y que se conectaba a un preamplificador que, a su vez, era la entrada hacia un
amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments, USA). La generación de pulsos de
respuesta de adquisición y el procesamiento de datos se realizaron utilizando un sistema de
trabajo conformado por una computadora, un convertidor A/D/A Digidata 1322A y el
programa pClamp10 (ambos de Axon Instruments).
ESTADO DEL ARTE
Los receptores acoplados a proteínas G (RAPG) representan uno de los principales
sistemas de detección y/o recepción de señales extracelulares con más éxito evolutivo.
También son denominados receptores heptahélicos de siete dominios transmembranales, y
éstos se encuentran conectados mediante tres asas intracelulares y tres extracelulares. Los
RAPG son una de las familias más grandes e importantes de las proteínas membranales,
pues están implicados en un sinfín de procesos de transducción de señales celulares. Estos
receptores se encuentran en los genomas de prácticamente todos los seres vivos (Kroezey
cols., 2003).En los humanos ya se han identificado más de 800 genes (3 % de su genoma)
que se sabe que codifican para estos receptores (Holinstat y cols., 2006).
Los RAPG son responsables de mediar un gran número de respuestas fisiológicas
ante diferentes estímulos como hormonas, neurotransmisores, luz, olores y sabores
(Lagerström y Schiöth, 2008). Estas respuestas son originadas gracias a su interacción con
sustancias (ligandos o agonistas) de variada estructura molecular (Kroeze y cols.,
2003).Así, dentro de las funciones importantes de estos receptores se encuentran: la
regulación de la secreción de glándulas endócrinas y exócrinas, la exocitosis, quimiotaxis,
el control de la presión sanguínea y la función plaquetaria, además de procesos de
regeneración tisular, embriogénesis, angiogénesis, y control del crecimiento celular normal
o aberrante (Marinissen y Gutkind, 2001; Jacoby y cols., 2006).
Los RAPG han recibido su nombre debido a su interacción con las proteínas G
localizadas en el lado interno de la membrana citoplasmática. Tras la unión del ligando
activador, el receptor sufre cambios conformacionales en las subunidades de la proteína G,
provocando que dicha proteína se disocie en las subunidades Gα y Gβγ. El receptor
activado, provoca la salida del GDP de la subunidad Gα, con lo que entra el GTP,
promoviendo de este modo la disociación de la subunidad Gαde la Gβγ. En este momento
es cuando ambas subunidades, Gα y Gβγ, pueden acceder a sus efectores iniciando distintas
vías de señalización, siendo finalizadas cuando la subunidad Gα hidroliza el GTP y así se
reestructura el trímero inactivo (Hoz-Jiménez, 2008).
Sensibilidad al voltaje de los receptores acoplados a proteínas G
Como se sabe, la interacción de los RAPG con sus ligandos constituye el principal
mecanismo de control sobre sus vías de señalización acopladas, sin embargo, estudios de
los últimos 25 años han venido a demostrar que el voltaje membranal de las células es
capaz de modular a varios de estos receptores (Marty y Tan, 1989; Ito y cols., 1992;
Mahaut-Smith y cols., 1999; Perroy y cols., 2002; Dekel y cols., 2005). Así por ejemplo,
expresando heterólogamente receptores M2 en ovocitos de rana Xenopus se mostró que
tienen mayor afinidad, es decir, mayor fuerza de interacción por ACh en la
hiperpolarización, y menor afinidad en la despolarización (Ben-Chaim y cols., 2003). 7
En los primeros trabajos no quedaba claro si la sensibilidad al voltaje residía en el
propio receptor o en cualquier otro elemento de la vía de señalización. La evidencia más
sólida sobre la capacidad inherente que poseen los RAPG para detectar cambios en el
voltaje membranal fue confirmada de manera directa al registrarse corrientes asociadas con
movimientos de cargas en el receptor M2, expresado en ovocitos de Xenopus (Ben-Chaim y
cols., 2006; Navarro Navarro-Polanco y cols., 2011), semejantes a las que se han reportado
en los canales iónicos sensibles a voltaje (gating currents). Estas corrientes aportan
información importante de la generación de cambios conformacionales, ya que reflejan la
reorientación de las cargas dentro del receptor en respuesta a cambios en el voltaje.
También, se aportaron evidencias fuertes para los receptores muscarínicos M1 (Ben-Chaim
y cols., 2003 y 2006), los purinérgicos P2Y1 (Martinez-Pinna y cols. 2005), los
glutamaérgicos (Ohana y cols., 2006) y, recientemente, los adrenérgicos α2A (Rinne y
cols., 2013). De esta manera, el hecho que el voltaje modifique la actividad de los RAPG,
sugiere una capacidad adicional para modular finamente la señalización celular en los
tejidos excitables como el sistema nervioso y los músculos esquelético y cardiaco.
Importantemente, como mecanismo para explicar la dependencia de voltaje, Ben-
Chaim y cols. (2006) propusieron que: 1) estos receptores pueden adoptar dos estados de
afinidad hacia sus ligandos, uno de alta afinidad cuando se acoplan a su proteína G y otro
de baja afinidad cuando están libres, 2) los movimientos de carga producidos por el cambio
en el voltaje generan cambios conformacionales en la región del receptor que se acopla con
su proteína G, de manera tal que la hiperpolarización favorece dicho acoplamiento y
conduce al receptor a un estado de alta afinidad, mientras que la despolarización favorece
un estado de baja afinidad debido a un menor acoplamiento con su proteína G.
Dependencia de voltaje de los receptores muscarínicos M2 cardiacos
Más recientemente, ya en estudios realizados en miocitos cardiacos felinos, se ha
mostrado que el voltaje membranal modifica la potencia con la que ACh activa a IKACh
(Fig. 1), observación congruente con el cambio en la afinidad con la que ACh se une a los
receptores M2 (Ben-Chaim y cols., 2003). Además, se observó que otro agonista
muscarínico, la pilocarpina, también manifiesta dependencia de voltaje para activar a
IKACh, sólo que de una manera opuesta a la de ACh, mayor potencia en los voltajes más
positivos que a los más negativos (Fig. 1), como resultado de una mayor eficacia pero
también de una mayor afinidad durante la despolarización (Navarro-Polanco y cols., 2011).
También, los resultados con ACh y pilocarpina fueron reproducidos en miocitos cardiacos
de conejo (Moreno-Galindo, 2008). Así pues, estas evidencias debilitan ampliamente la
propuesta de que la despolarización favorece un estado de baja afinidad debido a una
reducción en la interacción entre los receptores M2 y sus proteínas G (Ben-Chaim y cols.,
2006; Parnas y Parnas, 2007), ya que se esperaría que la afinidad disminuyera con la
despolarización sin importar el agonista muscarínico en cuestión. Opuesto a esta hipótesis,
y en congruencia con los resultados anteriores obtenidos en cardiomiocitos, un estudio
reciente muestra que los receptores adrenérgicos α2A manifiestan una sensibilidad al
voltaje en donde la afinidad y/o la eficacia son
dependientes de agonista e independientes del
acoplamiento del receptor con la proteína G
(Rinne y cols., 2013).
Fig. 1 Efectos dependientes de voltaje opuestos de la ACh y pilocarpina (Pilo) sobre la activación de IKACh en miocitos cardiacos. A, registros de corrientes a un voltaje de +50 mV (trazos superiores) y -100 mV (trazos inferiores). La línea punteada indica el nivel cero de corriente. B, curvas C-R para la activación de IKACh por ACh y pilocarpina a los potenciales
de -100 y +50 mV. Las líneas continuas representan el ajuste de los datos con una ecuación de Hill. La concentración efectiva al 50% (EC50) para ACh fue de 45 ± 10 nM a -100 mV y de 176 ± 39 nM a +50 mV, mientras que para pilocarpina fue de 12 ± 3 μM a -100 mV y de 4 ± 1 μM a +50 mV. (Modificada de Navarro-Polanco y cols., 2011).
DESARROLLO CAPITULAR EN SECCIONES
Sistema de perfusión rápida
Para la aplicación de los agonistas sobre los miocitos se utilizó un sistema de perfusión
rápida (SF-77B, Warner Instruments, USA) consistente de multi-pipetas capilares de 3
salidas, conectadas a las múltiples soluciones contenidas en cada una de las jeringas
empleadas. En la cámara de registro, se aplicaba perfusión convencional de solución
extracelular sobre las células a una velocidad aprox. de 1 mL/min. Una vez que se tenía la
célula adherida al electrodo o micropipeta (configuración cell attached), se activaba el
sistema de perfusión rápida sobre dicha célula y posteriormente se establecía la
configuración de célula completa (whole cell), fijando un potencial de mantenimiento de –
100 ó +50 mV (aleatoriamente) y perfundiendo las soluciones de agonistas. Los tiempos de
aplicación y lavado de las sustancias sobre las células se controlaron mediante el propio
programa pClamp (Axon Instruments).
Protocolo experimental para las curvas concentración-respuesta (C-R) secuenciales
Se realizaron curvas C-R a dos voltajes de prueba, -100 y +50 mV, para el agonista a
evaluar, muscarina. Para lo cual, se aplicaron concentraciones crecientes de agonista sólo
durante el tiempo necesario para obtener el estado estable de la corriente activada, IKACh,
continuando con un lavado hasta recuperar el nivel de corriente basal antes de aplicar la
siguiente concentración de agonista. Los tiempos de perfusión dependieron de la
concentración de agonista (5-14 s), mientras que los tiempos de lavado oscilaron entre 15-
40 s, según la concentración de agonista.
Una vez aplicadas las concentraciones de agonista a cierto voltaje, se permitió a la célula un
reposo de 1-2 min a un voltaje de -40 mV. Durante este lapso de tiempo, se verificó la
condición de la célula y posteriormente se repitió el mismo procedimiento en el otro voltaje
de prueba. Se cuantificó la amplitud de la corriente (medida al pico) activada por los
agonistas muscarínicos (IKACh) y se normalizó con respecto a la respuesta de IKACh
provocada por una concentración máxima de agonista, que servía como la referencia de qué
tanto proporcionalmente se activaba la vía de señalización por el agonista. Todo esto, con el
propósito de homogenizar las respuestas y poder hacer comparaciones entre las distintas
células, entre los voltajes de prueba y entre los agonistas a ensayar.
Ajustes de las curvas concentración-respuesta
En las curvas C-R, se graficó la magnitud de la corriente activada (IKACh), expresada en
fracción, con respecto a la concentración de agonista muscarínico utilizado, y se ajustó en
base a la ecuación de Hill: y = Emax• Xn/ [(EC50)n+ Xn]
Donde:
y = Amplitud fraccional de IKACh.
Emax= Efecto máximo alcanzado.
X = Concentración de agonista.
EC50 = Concentración que produce el 50% de la respuesta máxima.
n= Número o coeficiente de Hill.
Protocolo experimental de pulsos cuadrados de voltaje
Adicionalmente, para cada agonista se realizaron registros electrofisiológicos de corrientes
macroscópicas utilizando un protocolo de pulsos cuadrados de voltaje durante la activación
de la corriente (IKACh) en estado estable. Se aplicaron dos concentraciones del agonista,
200 nM y 10 μM. El protocolo de pulsos cuadrados de voltaje consistió en aplicar, a partir
de un potencial de mantenimiento de -40 mV, pre-pulsos de 2 s de duración desde +50 mV
hasta -130 mV con decrementos de 20 mV, seguidas por el pulso de prueba a -130 mV
(Figs. 9 y 10, inserto arriba).
Una vez ensayada una concentración de agonista (generalmente la menor), y posterior a su
lavado, se verificaba la condición de la célula y, en caso de ser buena, se procedía a repetir
el mismo protocolo de pulsos, pero ahora con la otra concentración de prueba. La corriente
activada, IKACh, se obtuvo por la sustracción digital de la corriente registrada en presencia
del agonista, menos la corriente registrada en condiciones control, aplicando en ambas el
mencionado protocolo de pulsos de voltaje.
Condiciones control de los registros electrofisiológicos
Las condiciones control para el registro de las corrientes macroscópicas en los miocitos se
realizaron siempre en la presencia de bloqueadores de otras corrientes que existen en los
miocitos auriculares de gato. Se usaron: el E-4031 (3 μM), bloqueador de la corriente
rectificadora tardía rápida (IKr); el chromanol 293B (50 μM), bloqueador de la corriente
rectificadora tardía lenta (IKs) (Sanguinetti y cols., 1991; Bosch y cols., 1998; Sun y cols.,
2000). También, esta misma concentración de chromanol 293B, 50 μM, es capaz de
bloquear un 60-70% a la corriente de K+ transitoria (Ito) (Bosch y cols., 1998; Sun y cols.,
2000). El cobalto (2 mM) en la solución externa y el BAPTA (5 mM) en la solución interna
se utilizaron para bloquear la corriente de Ca2+ tipo L y las corrientes activadas por Ca2+,
respectivamente.
Análisis estadístico de los datos
Los resultados obtenidos se presentan como los valores promedio ± el error
estándar de la media. Para las curvas C-R, los datos obtenidos en cada célula se ajustaron
de manera individual con la ecuación de Hill. Se utilizó la prueba t de Student pareada para
evaluar las diferencias estadísticas. Un valor de probabilidad de menos del 0.05 (p<0.05)
fue considerado estadísticamente significativo.
RESULTADOS
Determinación de las concentraciones de referencia de la agonista muscarina para la
activación de IKACh en miocitos cardiacos
Primero, se procedió a determinar la concentración de muscarina que activa al máximo la
vía de señalización de IKACh, es decir, la concentración que serviría de referencia para
conocer el nivel de activación que generan las concentraciones submáximas y así poder
hacer comparaciones entre los voltajes de prueba y entre las distintas células. Con este fin,
se realizaron registros electrofisiológicos a los dos voltajes de mantenimiento (-100 y +50
mV), aplicando concentraciones crecientes en un orden de magnitud para y permitiendo
lavados entre cada concentración. Para confirmar el nivel de activación de la vía, al final se
aplicó el agonista fisiológico, ACh, a una concentración (10 μM) que la activa al máximo
(Ben-Chaim y cols., 2003; Navarro-Polanco y cols., 2011 y 2013).
Respecto a la respuesta producida por ACh 10 μM, se observó que muscarina 1 μM produjo
respuestas apenas submáximas de 0.80 ± 0.11 y de 0.70 ± 0.15 a -100 mV y +50 mV,
respectivamente. Las otras concentraciones de muscarina, 10, 100 y 1000 μM activaron a
IKACh prácticamente a un mismo nivel a ambos voltajes (Fig.2). Así pues, se observó que
con muscarina sí se alcanzó el nivel de respuesta que activa una concentración máxima del
agonista fisiológico ACh, y hasta lo rebasó en un 12-30%.
Fig. 2. Activación de IKACh por el agonista muscarina en miocitos auriculares de
gato. Registros representativos de las corrientes (IKACh) activadas por 1, 10, 100 y 1000
μM de muscarina y por ACh 10 μM, a un voltaje de mantenimiento de -100 mV (A) y de
+50 mV (B). Las barras horizontales sobre las corrientes indican la duración de la
aplicación del agonista y la línea punteada señala el nivel de corriente cero. IKACh
activada por las distintas concentraciones de muscarina a -100 mV (C) y +50 mV (D),
normalizadas respecto a la respuesta obtenida con ACh 10 μM. n = 4.
Dependencia de voltaje del agonistas muscarina en la activación de IKACh
A continuación, con objeto de conocer si la vía de señalización de la corriente cardiaca
IKACh manifiesta o no dependencia de voltaje cuando es activada por muscarina, se
realizaron curvas concentración-respuesta (C-R) a partir de los registros de las corrientes
generadas a los dos voltajes de comparación, -100 y +50 mV. 22
Con muscarina, se encontró que la activación de IKACh fue dependiente del potencial de
membrana de los cardiomiocitos. Por ejemplo, los registros de la Fig. 3A muestran que,
cuando el voltaje se mantiene a -100 mV, las concentraciones 0.03, 0.3 y 3 μM produjeron
respuestas respectivas de 0.11, 0.71 y 0.93, normalizadas al efecto de la concentración
saturante de 30 μM; mientras que dichas respuestas a +50 mV fueron significativamente
menores: 0.06, 0.39 y 0.83, respectivamente. En resumen, los resultados arrojaron una
potencia significativamente mayor (~5 veces) a -100 mV, con una concentración efectiva al
50 % (EC50) de 114 ± 23 nM, que a +50 mV (EC50 = 588 ± 144 nM) (Fig. 3B).
Fig. 3. Dependencia de voltaje de muscarina para la activación de IKACh con curvas
C-R en miocitos cardiacos. A, Registros de IKACh a un voltaje de mantenimiento de +50
mV (trazos superiores) y -100 mV (trazos inferiores). Las barras horizontales sobre las
corrientes indican la duración de la aplicación del agonista y la línea punteada señala el
nivel de corriente cero. B, Curvas C-R de muscarina para la activación de IKACh a un
potencial de mantenimiento de -100 mV (■) y a +50mV (○). Los datos se normalizaron
respecto de la corriente activada por la concentración saturante de 30 μM de muscarina,
registrada en esa misma célula a ambos voltajes, y se graficaron en función de la
concentración de muscarina. Las líneas continuas representan el ajuste de los datos a la
ecuación de Hill. Los valores de Emax, EC50 y del coeficiente de Hill fueron 0.96 ± 0.04,
114 ± 23 nM y 1.03 ± 0.16, respectivamente (-100 mV), y de 1.05 ± 0.04, 588 ± 114 nM y
0.73 ± 0.08, respectivamente (+50 mV). n = 4 miocitos en ambos voltajes.
DISCUSION Y PROPUESTAS
Al activar la vía de señalización de IKACh en miocitos cardiacos, las evidencias
más importantes de este trabajo son: 1) el agonista muscarina se comporto como agonista
total y con potencia (nM) similar a la del agonista fisiológico ACh; 2) las curvas C-R,
manifestaron efectos dependientes de voltaje, 3) utilizando el protocolo de pulsos
cuadrados de voltaje, se observó una dependencia de voltaje similar a la obtenida con las
curvas C-R: mayor activación al hiperpolarizar (muscarina).
En el sistema de señalización celular aquí utilizado, activación de IKACh en miocitos
auriculares felinos, y bajo nuestras condiciones experimentales, se encontró que muscarina
se comporta como agonista total, dado que es capaz de generar la máxima respuesta, la
cual se comprobó con la aplicación de una concentración saturante del agonista endógeno,
ACh 10 μM (Ben-Chaim y cols., 2003; Moreno-Galindo, 2008; Navarro-Polanco y cols.,
2011 y 2013). El agonismo y la potencia fueron congruentes con lo observado en estudios
funcionales de disminución de la frecuencia y contractilidad cardiacas en cobayo (Clague y
cols., 1985; De Amici y cols., 2000).
En cuanto a la dependencia de voltaje, muscarina activó a IKACh de manera
semejante a como lo hace ACh (Moreno-Galindo y cols., 2011), tanto en la potencia, la
cual osciló en el rango nanomolar; así como en el sentido y magnitud del cambio de la
potencia ocasionado por el voltaje, la cual fue ~5 veces menor a -100 mV que a +50 mV.
Hasta el momento, sólo agonistas estructuralmente muy semejantes a ACh (con un
grupo sustituído),como carbacol y metacolina, habían tenido una dependencia de voltaje
similar a ACh (Salazar-Fajardo, en preparación); mientras que con agonistas con un poco
de mayor diferencia estructural a la ACh (con dos o más grupos sustituídos), como colina,
pilocarpina, tetrametil amonio y betanecol, se ha observado una dependencia de voltaje
diferente a la de ella (Moreno-Galindo, 2008; Navarro-Polanco y cols., 2011 y 2013). Así,
puede decirse que el resultado con muscarina fue inicialmente algo sorpresivo porque
estructuralmente se asemeja a ACh y a pilocarpina, lo cual quiere decir que se necesitaría el
apoyo de estudios de interacción ligando-receptor (docking), sobre todo ahora que
recientemente se hizo la descripción cristalográfica de los receptores M2 (Haga y cols.,
2012)
Con respecto al fenómeno de la relajación de IKACh, utilizando concentraciones
donde la dependencia de voltaje se manifiesta con muscarina 200 nM, la despolarización
generó la disminución gradual de IKACh, y la hiperpolarización ocasionó el aumento
paulatino de esta corriente. Todo lo cual es precisamente lo que se observó en las curvas C-
R: muscarina activó mayor corriente en los voltajes negativos (-100 mV) que a los positivos
(+50 mV. Así, se puede decir que la muscarina manifestó el comportamiento típico de la
relajación (Noma y Trautwein, 1978). Con las concentraciones altas, donde la gran mayoría
de canales están activados y la dependencia de voltaje tiende a saturarse, la dependencia de
voltaje de la relajación igualmente tendió a desaparecer. Estos resultados, donde la
relajación de IKACh es dependiente de voltaje, de concentración y de ligando, son
congruentes con lo reportado con ACh y pilocarpina (Moreno-Galindo y cols., 2011). De
esta manera, encontramos una estrecha relación entre la dependencia de voltaje y el
fenómeno de la relajación de IKACh que manifestó el agonista evaluado.
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