DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS POR HPLC Y

ELISA

MICOTOXINAS:

• Son metabolitos secundarios tóxicos ( Swanson 1987) producidos por

determinados hongos como Aspergillus, Penicillium, Fusarium sp.

• La I.A.R.C. ( Agencia Intenternacional para Investigación sobre el Cáncer) considera:

-Cancerígenas: Aflatoxina B1,M1, Ocratoxina A.

-Posibles cancerígenos: Fumonisina B1.

HPLC

• Método físico basado en separar sustancias (analitos) de una mezcla entre dos fases miscibles ( Fase móvil y fase fija estacionaria).

• Elegido como método oficial de referencia para análisis de micotoxinas (AOAC International).

Tipos de cromatografía líquida:

a) de reparto: separación de solutos por solubilidadb) de adsorción: separación según la afinidad de

adsorciónc) de exclusión: separación según el peso molecular d) de intercambio iónico: separación según la carga iónica

-La muestra es disuelta en una fase móvil (gaseosa o líquida).

-Esta fase móvil es forzada hacia una fase inmóvil e inmiscible llamada fase estacionaria.

-Si un componente resulta ser bien soluble en la fase estacionaria, le tomará más tiempo viajar a través de ella que un componente no muy soluble en esta fase pero si bien soluble en la fase móvil.

• Como resultado de estas diferencias en la movilidad de los componentes, estos se separan entre sí, al pasar por la fase estacionaria.

• La separación de los componentes y los cambios de fase son generados en el interior de una columna, por donde viajan las partículas.

• La columna va unida a un detector y este último a un grabador o cromatógrafo; de esta forma las partículas se separan en la columna y viajan por ella hasta llegar al detector, y luego el grabador entrega un registro del movimiento realizado por las partículas en el tiempo.

ELISA

• Enziyme Linked Immuno-Sorbent Assay

• Fundamento:

- Competencia entre las micotoxinas que pueden existir en la muestra y el producto enzimoconjugado (coloreado). Este producto se añade de forma controlada y marcada para su unión con el anticuerpo.

-Cuanto más contaminada esté la muestra ↑ micotoxinas ( sin marcar) se unen al anticuerpo ↓micotoxina conjugada con enzima (coloreada).

Etapa 1. Conjugación de la toxina pura a una enzima

Etapa 2. La competencia entre este conjugado y la toxina libre del producto por los sitios activos de los anticuerpos

Competitive Direct ELISA

Competitive Direct ELISA

Competitive Direct ELISA

Características que deben reunir las enzimas para ELISA

•Debe ser económica y obtenerse con un alto grado de pureza

•Elevada actividad específica

•Estable en condiciones de almacenamiento y prueba

•Soluble

•Sencilla, sensible y medible con gran rapidez

•No debe estar presente en el medio analizado

•Sustratos inhibidores no deben interferir con el ensayo

•No perder actividad cuando se conjuga

•Debe conservar la actividad en condiciones de ensayo

Factores Para Seleccionar un Método

•Matriz de la muestra, preparación de la muestra

•Límite de detección, Rango dínamico

•Micotoxina de interés

•Localización del análisis: elevadores de granos, planta procesadora, laboratorios analíticos

•Entrenamiento del analista

•Facilidad de uso, Costos

Criterios para la Selección de Un Método

•Experiencia requerida del analista

• Costo del equipo

•Número de análisis

•Tiempo requerido

•Localización del análisis

•Deposición de desechos

•Seguridad

Selección del Método

•Simple

•Rápido

•Preciso

•Barato

•Automatizado

•Sensible

•Selectivo

Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

Ventajas:

•Precisa

•Exacta

•Sensible

•Mas eficiente

•No necesita ser validado para ceda aplicación.

Cromatografía de Alta Eficiencia (HPLC)

Desventajas:

Alto costo del equipo y de manutención

Analiza una muestra a la vez

Exigente en las condiciones de operación

Personal entrenado

Exige una purificación exhaustiva de la muestra.

ELISA

• Ventajas:• Rápido.• Simple.• Sencillo de usar.• Posibilidad de trabajar al mismo tiempo

con un gran nº de muestras.• Capacidad de testar micotoxinas “in situ”.• Económico.

ELISA

Desventajas • Anticuerpos solo son producidos en centros

especializados• Anticuerpos necesitan tener propiedades

correctas• ELISA necesita ser validado para cada

aplicación• ELISA necesita estar acoplado con confirmación

de identidad. Falsos positivos.• Las respuestas tienden a ser por exceso en algunos

elisa pues detectan otros metabolitos con estructuras similares

Conclusiones:

• Elegiría HPLC salvo en los casos en los que fuese indispensable un análisis rápido, “in situ” y barato de las muestras.

Bibliografía

• 1. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CONTROL DE MICOTOXINAS EN INGREDIENTES PARA LA NUTRICIÓN ANIMAL. Ph.D. Javier Lara Arellano. 2003. Asociación Mexicana de Nutrición Animal (AMENA).

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• 3. Mycopathologia (2005) 159: 255–263: Validation of an elisa test kit for the detection of total aflatoxins in grain and grain products by comparison with HPLC - Zhongming Zheng, Craig W. Humphrey, Robin S. King & John L.Richard.

• 4. Mycopathologia (2005) 159: 265–272: Validation of an elisa test kit for the detection of ochratoxin A in several food commodities by comparison with HPLC - Zhongming Zheng, Jonne Hanneken, Donna Houchins, Robin S. King, Peter Lee & John L. Richard.

• 5. Determination of Aflatoxin B 1 in Highly Contaminated Peanut Samples Using HPLC and ELISA. R Asis, RDD Paola, MAJ Aldao - Food and Agricultural Immunology, 2002 .

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