ya que sólo se esperan células NK son responsables de la lisis de AMLcells primarios (Fig. 1B) también en hypoxia. consecuentemente con el aumento de CD69 en 1% de O2, encontramos células that NK expuestos a 48 h de hipoxia de 1% de lisis O2increased oftarget células K562 por 20% después de 4 h (1,6 resultado combinado de plegado, E: Tratio que van 20: 1 [1.5 veces mayor] a 40: 1 [1.3 veces mayor], p <0,05, Fig 1C.). Como las células K562 representan un sistema clásico para NKcell lisis mediada, pero no son de origen AML, investigamos NKcell lisis mediada en 5 líneas de células de AML (HEL, HL-60, KG-1a, NB-4y OCI-AML3). En consecuencia con los resultados obtenidos con K562, weobserved un aumento medio de 1,39 veces la lisis de líneas de células de AML inhypoxia (p <0,05), sin embargo con la variabilidad entre las líneas differentcell (HEL: 1,19 plegado, HL-60: 1,36 veces, KG-1a : 1,32 veces, NB-41.29 veces, OCI-AML3 1,48 veces) .

En el siguiente paso, se utilizó muestras primarias AML (n = 5, por Char-caracteriza- de pacientes con LMA ver Tabla 1) como células diana. Viabilityof muestras primarias AML no fue alterado de manera significativa después de 48 hof cultivo hipóxico. Sin embargo, no hemos podido observar una significantincrease en células NK lisis mediada por hipoxia-activado (40: 1: 32% (al 21% de O2) frente al 25% (1% de O2) lisis, 80: 1: 53% (al 21 % O2) versus 48% (1% de O2) de lisis, no significativo). Curiosamente, mientras que las células inK562 de células NK lisis mediada podría aumentarse por ofPBMCs de exposición a IL-2 (100 U / ml) después de 48 h (37% de lisis frente a 62% de lisis withIL-2), en muestras de AML primarias no hubo efecto de células IL-2 stimulatedNK en condiciones de hipoxia (Fig. 1D) .

3.3. Medición de la lisis mediada por células en un sistema de co-cultivo ByFlow cytometry

To investigar la lisis celular mediada con un methodthat no radiactivo permite que un sistema de co-cultivo de tres celdas, un ensayo basado en FACS wasdeveloped. En una primera etapa, las células efectoras (es decir, PBMCs) y células diana (es decir, células blastos AML) se midieron individualmente por FACS y specificgate que separa las dos poblaciones por su positividad para calceinwas definidos (Fig. 2A izquierdo y central, puerta R3). La cantidad de lysedcells se definió como células positivas PI en la puerta de destino R3 (Fig. 2C) andanalyzed través de histogramas. Además, este método permite el cálculo pre-CISE del efector a la proporción de células por calculationthe número de células diana en la puerta R3 diana en comparación con cellnumbers.

By total de la adición de un marcador adicional, este sistema podría ser expandedto analizar una cooperación de células de triple sistema de cultivo. Como mesenquimales stromalcells tinción negativa para CD45, se usó este marcador para definir gateR2 que incluye sólo las células CD45 positivas (es decir, leucocitos), las células includingtarget (Fig. 2B, izquierda) y la combinación de las células diana y efec-tor (Fig. 2B, medio). MSC quedan fuera de esta puerta y se hencenot analizado más de lisis (Fig. 2B, derecha). A continuación, se analizó la puerta R2 (objetivo y efectoras células INCLUD-ing) de positividad PI asmentioned antes.

3.4. MSC proteger blastos AML contra de células NK mediada lysis Next,

se aplicó este sistema para investigar los efectos de las células del estroma mes-enchymal (MSC) como otro componente pertinentes del microambiente cuando se co-cultivaron con células diana.

Células PrimaryAML fueron elegidos como células diana (n = 5, para la caracterización ofAML pacientes por favor consulte la Tabla 1). Viabilidad de las muestras de AML wasnot alterado de manera significativa cuando se co-cultivadas con MSC (25 × 103perassay) durante 48 h (viabilidad 90,0% frente a 90,6%, no significativo). Inter-Curiosamente, hemos observado que la co-cultura de la LMA primaria explosiones withMSC durante 48 h protegidas significativamente blastos AML de células NK-medi ado lisis (E: T ratio de 20: 1, la reducción de la lisis 50,7%; p <0,05, Fig. 3A, E: T relación de 10: 1 la reducción de la lisis 50,8%, p <0,05%).

3.5. Mecanismos de protección de explosiones ALD por MSC Next,

nos trataron de aclarar aún más los medios de protección de explosiones ofAML por el MSC en el sistema de co-cultivo. Especialmente nos wantedto sé si es el contacto directo célula-célula de MSC blaststo leucémica que es de protección (por ejemplo, cambiando la E: T o células relación hidingtarget) o si MSC factores protectores secretos. Por lo tanto, usedMurine líneas de células del estroma EL08-1D2 y EL28-1B3 que son o "seguidores" (EL08-1D2) o "no-partidarios" (EL28-1B3) para células principales que contiene progenitoras hematopoyéticas [18]. Curiosamente, sólo MSCcell línea EL08-1D2 como una línea celular partidario significativamente explosiones protectedAML de lisis mediada por células, mientras que no hubo células effectof "no partidario" (68,1% de lisis sin MSC, 67,5% forEL28-1B3 lisis y 36,4% de lisis para EL08-1D2, p <0,01, Fig. 3B). Accord-vez más, estos resultados también se pudo confirmar en el modelo K562, aunque con menor lisis celular (34,5% de lisis sin MSC, 31,5% lysisfor EL28-1B3 y 17.6% de lisis para EL08-1D2, p = 0,01, Fig. 3C) . Takentogether, estos datos sugieren un apoyo effectinstead específico MSC relacionado de un mero efecto inespecífico, física.

4. Discussion

The razones para los resultados decepcionantes para muchos enfoques Immunother péutico en la LMA son en gran parte desconocido, pero en general reflect nuestro pobre entendimiento de la compleja mechanismsinvolved. Mientras una gran incertidumbre radica en el imperfecto conocimiento cornisa de antígenos diana pertinentes sobre los blastos leucémicos, hay podríaser otros factores involucrados, lo que podría no ser evidente cuando lookingat las explosiones o células efectoras alone.The área putativa de solicitud de inmune dirigida tera- tartas de AML habrá terapia de mantenimiento y / o el tratamiento ofminimal enfermedad residual. Aquí, las células diana (es decir leucémica StemCells) residen en la médula ósea, donde sobrevivieron el initialtreatment y, finalmente, se iniciará de nuevo para causar la proliferación de recaída theclinical. Por lo tanto, podría ser la pena investigar los efectos de la médula ósea en la respuesta inmune de effectorcells contra AML explosión. La médula ósea, o mejor el (células madre) espacio pequeño, ofrece un santuario o microambiente que las con-siste de ciertos componentes específicos. La mejor identificados y characterizedcomponent son las células estromales mesenquimales y la presión parcial recientemente theoxygen ha sido identificado como un jugador crítico enel células madre compartment.First, se encontró que la hipoxia de 1% de células NK O2activates pero no las células T, lo que sugiere un tipo altamente específica de respuesta de estas células inmunocompetente hacia la hipoxia. Consistente con este hallazgo, NKcells fueron

significativamente más activo y la lisis de las células diana wasincreased durante condiciones de hipoxia cuando se aplica un modelo cellline. Curiosamente, para las células T un efecto diferente de la hipoxia ha beendescribed, con hipoxia inhibición de la respuesta inmune hacia solidtumours [17]. Sin embargo, las células NK han demostrado ser las células efec-tor en la LMA tanto in vitro como in vivo; por ejemplo se demostró que los pacientes inAML con células activas NK supervivencia libre de recaída fue signif-vamente mayor que en los pacientes con células NK inactivos [19]. Por lo tanto, nos centramos en las células NK y no investigar más a fondo la hipoxia effectsof de células-T. Estábamos sin embargo incapaz de observar cualquier lisis-sig significa- de blastos primarios AML por las células NK en nuestro sistema, butin nuestro modelo estimulación de las células NK con IL-2, que se conoce células NK toactivate de una manera significativa, hizo tampoco mejorar celllysis . Una limitación significativa sin embargo es que los datos no eran obtenido en un entorno autólogo con células PBMC y AML fromthe mismo paciente. De hecho, la hipoxia podría influir cellmediate NK innata pero deja de células T mediada por MHC más específica immunityunaffected. Sin embargo, la observación de que las células NK lysisis mediada disminuido al utilizar muestras primarias AML está en línea con theprevious hallazgos de las llamadas células "mieloide", que son células espectadoras presentas en muestras primarias AML, inactivar las células NK [5], posiblemente a través de la generación de especies de radicales de oxígeno [20] .SECOND, que fueron capaces de identificar en este contexto otra población-ción de células mieloides "" (que se derivan de la médula ósea) que protegen las células de AML cuando se co-cultivaron con células efectoras: MES-enchymal las células del estroma (MSC), que tenían una fuerte effecton protectora blasts.MSC leucémica han cosechado un gran interés en los últimos años, mainlydue a sus efectos conocidos de quimioprotección en blastocitos de la AML. Mecanismos-Var ious se han descrito, pero ninguno de estos pueden bereally aplicada a la protección contra la lisis mediada por células, como theywere principalmente relacionados con una disminución de la capacidad para la apoptosis en AMLblasts por ejemplo, misbalancing de proteínas o metabolicchanges [12,13] anti-apoptóticos. Ya sea que la lisis celular mediada corto plazo es la inducción de la apoptosis relacionadascon puede ser cuestionada, en cambio, los mecanismos cito-tóxicos directos están involucrados. Por lo tanto, la protección de la LMA explosiones bydecreasing su capacidad para someterse a la apoptosis parece poco probable en ourcontext.Instead, MSC podría proteger blastos AML por la inhibición de Ort-células NK. Este mecanismo podría ser más relevante en la protección ofmicroenvironment mediada contexto, como la célula a célula de con-tacto directo no era necesaria para la protección. Por lo tanto, los factores solubles secretedby MSC podrían ser pertinentes que aún sin embargo tiene que ser defined.Interestingly, MSC se sabe que tienen inmunomoduladores capaci-dades tanto in vitro como in vivo. Ellos han demostrado positivelyinfluence injerto agudo y crónico frente al anfitrión de enfermedad (GvH-D), anautoimmune como el trastorno después Transplanta-ción alogénico de células madre, donde alorreactivas células T del donante ataque del anfitrión, dando lugar a daños orgánicos graves, como en el hígado, el intestino o theskin. En esta configuración, el MSC clínicamente podría mejorar GvH-D [21], los mecanismos de andproposed incluyen la supresión de la proliferación de células T, la alteración de los perfiles de citoquinas de células o la inducción T y NK ofregulatory células T [22-25] .La explicación podría ser más fácil simplemente el hecho de que el MSC pro-cionar una especie de santuario anatómica de blastocitos de la AML, por ejemplo,

Cómo cambiar el por relación E: T (como alo-reactiva PBMC que hacer frente a más células enel co-cultivo) o cubriendo o "esconder" blastos AML, por lo tanto pre-ventilación contacto directo célula a célula con el efector lymphocytesand posterior lisis de las explosiones. Esta explicación, sin embargo seemshighly poco probable, ya que sólo la línea celular MSC apoyo EL08-1D2 pro-protegidas explosiones ALD y no morfológica similar, pero functionaldistinct, "no partidario" línea celular MSC EL28-1B3. Si la "protección anatomi-cal" por el MSC sería correcto, que el "no-partidario" MSC debe ser protector como well.Thus, es razonable especular que el MSC mediada protecciónde blastos leucémicos parece ser iniciado por sustratos secretadas byThe MSC , por ejemplo, como se describe en el contexto de la inmunosupresión ofGvH-D por MSC.While nuestro estudio no es ciertamente capaz de identificar los mecanismos relevantmolecular, proporciona datos razonables para señalar outthe importancia del microambiente en el contexto de la respuesta inmune contra AML. Además, con el ejemplo de la hipoxia, es claro ver que la influencia es complejo y no onlyand siempre resulta en la inhibición o efectos disminuidos. En lugar de ello, theinfluence del microambiente es altamente complejo, dependingon el tipo de célula diana, el tipo de célula efectora, el tipo de stromaand el nivel de la hipoxia, para nombrar unos pocos. Sería interestingto combinar los diferentes componentes del microambiente, por ejemplo hipoxia y MSC, para imitar lo natural nicho in vivo para (I) investigar los efectos sobre la respuesta inmune, (II) para estudiar themechanisms involucrados y (III) para encontrar medios para superar la INHI-bición proporcionado por MSC.

Conflicts de interest

None de los autores no tienen ningún conflicto de trabajo pertinentes interés todeclare.AcknowledgmentsThis fue financiado por una subvención de la ResearchFoundation alemana (DFG FI 1487/2) y una beca de la Fundación Wilhelm Sander-(2013.005.1) a MF.