trampas extracelulares de neutrofilos
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Cell Research (2013) 21:290-304. © 2013 IBCB, SIBS, CAS All rights reserved 1001-0602/13 www.nature.com/CH
REPORTE DE ESTANCIA: MEDICIÓN DE LA
ACTIVIDAD FAGOCÍTICA POR MICROMÉTODOS
S. aureus and PMA induces neutrophil extracellular traps
Velázquez Soto1 and Murrieta Coxca2
1Laboratorio de Inmunología Celular, Depto. De Inmunología, ENCB-IPN; 2Laboratorio de Inmunología Innata, Depto. De Inmunología ENCB,
México, D. F. E-mail: [email protected]
Abstract Neutrophil extracellular traps (NETs) are extracellular chromatin structures that can trap and degrade microbes.
Activation of NETosis has been shown to involve NADPH oxidase activity, disintegration of the nuclear envelope and
most granule membranes, decondensation of nuclear chromatin and formation of NETs. We report that in S. aureus-
stimulated neutrophils, intracellular chromatin decondensation and NET formation, superoxide production, which are
required to mediate S.aureus-induced NETosis. In addition, neutrophils were stimulated with PMA found similar results.
Keywords: neutrophil extracellular trap; superoxide; myeloperoxidase, S. aureus
Resumen
Neutrophil extracellular traps (NETs) son estructuras cromáticas extracelulares que pueden atrapar y
degradar microorganismos. La activación de la NETosis involucra actividad de la NADPH oxidasa,
desintegración de la envoltura nuclear y a la mayoría de las membranas de los gránulos, des condensación
de la cromatina nuclear, y la formación de NETs. En este estudio reportamos que en neutrófilos estimulados
con S. aureus, la descondensación de la cromatina intracelular y la formación de NETs, la producción de
ROIs, son requeridas para mediar la NETosis inducida por S. aureus. Además, se encontraron resultados
similares en neutrófilos estimulados con PMA.
Palabras clave: Trampas extracelulares de neutrófilos, intermediarios reactivos de oxígeno,
mieloperoxidasa, S. aureus.
INTRODUCCIÓN
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs)
son estructuras cromáticas extracelulares que
pueden atrapar y degradar microorganismos. El
DNA es el componente principal de estas NETs,
además contienen proteínas de los gránulos
azurófilos primarios como elastasa, catepsina G,
mieloperoxidasa (MPO) y proteínas de los
gránulos secundarios como lactoferrina,
gelatinasa. La activación de la NETosis involucra
actividad de la NADPH oxidase, desintegración de
la envoltura nuclear y a la mayoría de las
membranas de los gránulos, des condensación de
la cromatina nuclear, y la formación de NETs. Los
neutrófilos son de corta duración, sin embargo son
muy abundantes estas células fagocíticas que
forman una primera línea vital de defensa contra
los patógenos invasores. En 2004, se informó de
un nuevo tipo de muerte celular, trampa
extracelular de neutrófilo (NET) [1], o también
llamada NETosis [2]. La activación de NETosis ha
sido demostrado que la participación de la
NADPH media el estallido oxidativo [3] y la
desintegración de la envoltura nuclear y la mayoría
de las membranas de los gránulos, que juntos dan
como resultado la vacuolización masiva [4], de
condensación intracelular de la cromatina nuclear
[5] y, finalmente, formación de NETs. [1] Los
datos recogidos durante los últimos 5 años,
demuestran la ocurrencia in vivo de NETosis en
diferentes entornos clínicos tales como apendicitis
[1], fascitis necrotizante [6], la neumonía [7], la
sepsis [8], la leishmaniasis [9] y vasculitis de vasos
pequeños[10], lo que sugiere una relevancia
fisiopatológica en estas condiciones.
Recientemente, se ha monitoreado la formación de
NETs in vivo en los pulmones murinos en
respuesta a la infección por Aspergillus y los
resultados mostraron que las NETs se forman
durante las primeras etapas de infección. [11]
En este estudio de evalúa la función fagocitica y la
formación de NETs usando estímulos con S.
aureus y PMA, poniendo en evidencia la presencia
de MPO, reducción de Nitroazul de tetrazolio y la
formación de NETs por inmunofluorescencia.
MATERIALES Y MÉTODOS
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Opsonización de S. cerevisiae . Un gramo de S.
cerevisiae fue resuspendido en de PBSG e
incubados con suero para que fueran opsonizadas.
Preparación de monocapas. Una mezcla de
sangre y una solución de gelatina al 3% en
solución de Alsever, fue incubada a 37°C durante
20min. Se depositaron 40 µL de la suspensión
celular en cada uno de los círculos del portaobjeto
en cámara húmeda y se incubó durante30min/37°
Estimulación de células. Se agregaron 30µL de
levaduras opsonizadas y no opsonizadas a los
PMN.
Tinción. Las células fueron teñidas con safranina.
Reducción de NBT.
Detección de la reducción de NBT. A las
monocapas previamente incubadas con levaduras
opsonizadas y no opsonizadas, se adiciono NBT
para poner en evidencia la presencia de ROIs.
Detección de mieloperoxidasa (MPO). Se
adiciono sustrato cromógeno a las monocapas
previamente incubadas con levaduras opsonizadas
y no opsonizadas, para poner en evidencia la
presencia de MPO.
Determinación de fusión fago-lisosomal.
Monocapas se incubaron con levaduras
opsonizadas y no opsonizadas, se cubrieron con
solución de orto-dianisidina para poner en
manifiesto el fenómeno.
Preparación de neutrófilos de sangre
periférica. Una mezcla de sangre y de gelatina al
3% en solución de Alsever, fue incubada a 37°C
durante 20min. Se lisaron las células que no eran
de interés y los neutrófilos fueron ajustados a 5
x106.
Formación de NETs. Se prepararon 2
portaobjetos con 50µL de la suspensión celular y
se les adicionaron estímulos: PMA, suspensión
bacteriana (250x106 bacterias/mL) de S. aureus
MOI 10:1. La lámina 1 se incubó 30min y la
lámina 2 por 60min. Las láminas se tiñeron con el
DAPI se montaron en resina y fueron observadas
en microscopio de fluorescencia.
Pruebas Bioquímicas: Curvas de calibración
para proteínas, peróxido de hidrogeno y
mieloperoxidasa. Usando soluciones Stock de
concentración conocida para cada espécimen, se
determinó la absorbencia a 600 nm para proteínas
y peróxido de hidrogeno así como a 492 nm para
MPO (HRPO) y de esta forma construir la curva
de calibración para su posible uso con muestras
problema.
RESULTADOS
Reducción de NBT: En las monocapas incubadas
con levaduras opsonizadas se observa con mayor
claridad y cantidad la reducción del NBT, esto es,
en los neutrófilos que fagocitaron mayor cantidad
de levaduras por el efecto de la opsonizacion. (No
se realizó conteo debido a la escasa recuperación
de las células en la monocapa).
Detección de MPO: En las monocapas incubadas
con levaduras opsonizadas se observa una mayor
presencia de MPO en comparación con las que se
incubaron con levaduras no opsonizadas.
Determinación de la fusión fago-lisosomal: En
este ensayo se apreció mejor la presencia de la
fusión fago-lisosomal en las monocapas que se
incubaron con levaduras opsonizadas.
Formación de NETs: Los neutrófilos estimulados
con PMA y S. aureus, muestran formación de
NETs en comparación con los neutrófilos no
estimulados usados como control negativo.
Fig. 1. Control negativo, nula presencia de NETs.
Fig. 2. Formación de NETs a los 60 min. de estimulación
con PMA
Fig. 3. Formación de NETs a los 120 min. de estimulación
con PMA
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Fig. 4. Formación de NETs a los 60 min. de estimulación
con S. aureus
Fig. 5. Formación de NETs a los 120 min. de estimulación
con S. aureus
Curva de calibración para BSA:
Tabla 1. Datos generados para la construcción de la curva
de calibración de BSA.
Fig. 6. Curva de calibración para BSA (Concentración Vs
Absorbencia)
Curva de calibración para H2O2:
Tabla 2. Datos generados para la construcción de la curva
de calibración de H2O2.
Fig. 7. Curva de calibración para H2O2 (Concentración Vs
Absorbencia)
Curva de calibración para mieloperoxidasa
(HRPO):
Tabla 3. Datos generados para la construcción de la curva
de calibración de HRPO.
Fig. 8. Curva de calibración para HRPO (Concentración Vs
Absorbencia)
Pozo 1 2 3 MediaConc.
(µg/10µL)
A 0.411 0.385 0.396 0.397 200
B 0.21 0.222 0.218 0.217 100
C 0.133 0.146 0.138 0.139 50
D 0.098 0.11 0.101 0.103 25
E 0.078 0.081 0.073 0.077 12.5
F 0.05 0.049 0.059 0.053 6.25
G 0.049 0.052 0.062 0.033 3.12
H 0.011 0.008 0.016 0.012 0
Abs por triplicado (600nm)
Curva de calibracion: Proteinas (BSA)
Pozo 1 2 3 MediaConc. H2O2
(ng/µL)
A 0.566 0.559 0.571 0.565 600
B 0.468 0.488 0.479 0.478 450
C 0.425 0.421 0.419 0.422 300
D 0.408 0.398 0.411 0.406 225
E 0.376 0.385 0.362 0.374 150
F 0.348 0.341 0.355 0.348 75
G 0.325 0.311 0.324 0.320 36
H 0.266 0.249 0.2245 0.247 0
Curva de calibracion: H2O2
Abs por triplicado (600nm)
Pozo 1 2 3 Promedio Conc (μg/μL)
A 3.585 3.602 3.579 3.589 1
B 3.458 3.441 3.469 3.456 0.5000
C 3.234 3.255 3.218 3.236 0.2500
D 1.923 1.941 1.952 1.939 0.1250
E 0.827 0.833 0.812 0.824 0.0625
F 0.386 0.403 0.379 0.389 0.0313
G 0.227 0.214 0.209 0.217 0.0156
H 0.066 0.078 0.049 0.064 0.0078
Curva de calibracion: HRPO
Abs por triplicado (492nm)
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DISCUSIÓN
La fagocitosis es el principal mecanismo de
defensa contra las infecciones, y son los
neutrófilos una de las células responsables de tal
mecanismo de defensa. La función fagocítica
puede ser puesta en evidencia usando diferentes
métodos como lo es la reducción del NBT, el cual
pone en evidencia la presencia de intermediarios
de especies reactivas de oxigeno (ROIs), así como
la detección de la presencia de MPO y la fusión
fago-lisosomal que son mecanismos que el
neutrófilo usa para eliminar o matar a los
microorganismos que fagocita. Además de esto, se
comprobó que la opsonización de los
microorganismos, en este caso S. cerevisiae, hace
que la fagocitosis se lleve a cabo de manera más
eficiente, esto puesto de manifiesto por una mayor
intensidad observada en la presencia de NBT
reducido, MPO y orto-dianisidina.
NETosis se caracteriza por la descondensación de
la cromatina intracelular y la desintegración de la
envoltura nuclear, lo que permite la mezcla de la
cromatina con moléculas antimicrobianas
catiónicas procedentes de los gránulos. Además, la
exposición de las histonas nucleares y las
actividades proteolíticas fuera del núcleo podrían
incluso generar productos más potentes de
eliminación antimicrobiana.
PMA induce características típicas de NETosis, las
Fig. 2 y 3 muestran neutrófilos teñidos con DAPI
a 1 y 2 horas después de ser estimulados con PMA
que se caracterizan por la permeabilización de la
membrana plasmática y porque la cromatina des
condensada se libera.
S. aureus también induce características típicas de
NETosis, las Fig. 4 y 5 muestran neutrófilos
teñidos con DAPI 1 y 2 horas después de ser
estimulados con S. aureus, que se caracterizan por
la permeabilización de la membrana plasmática y
porque la cromatina des condensada se libera.
En conclusión, se demuestra que S. aureus y PMA
inducen NETosis, esto comparado con neutrófilos
que no son estimulados y que muestran núcleos
teñidos con morfología normal.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Oscar Rojas Espinosa del Departamento de
Inmunología de la ENCB, por su apoyo en la
realización de los diferentes ensayos
experimentales.
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REFERENCIAS
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