DEL GEN A LA PROTEÍNA.EXPRESIÓN GÉNICA.

Antes de Watson y Crick, lo que se conocía sobre los genes era muy poco:

1. Los genes estaban asociados a caracteres específicos.

2. La teoría un gen – un enzima ya se había propuesto.

3. Los genes se localizaban en los cromosomas.

4. Los cromosomas se componían de ADN y proteínas.

5. Griffith y Avery apuntaron ya que el material genético era el ADN.

Pero de todos estos datos a demostrar que el material encargado de transmitir los caracteres hereditarios era el ADN hubo que realizar unos cuantos experimentos, ya clásicos en la biología molecular.

EXPERIMENTO DE FREDERICK GRIFFITH. EXPERIMENTO DE TRANSFORMACIÓN (1928)

La bacteria Streptococcus pneumoniae provoca neumonía humana y suele ser letal para los ratones. Griffith utilizó dos cepas: un tipo virulento normal (S) y otro mutante no virulento (R).

EXPERIMENTO DE OSWALD AVERY, COLIN MACLEOD, Y MACLYN MCCARTY (1944).

Estos tres investigadores retomaron el experimento de Griffith. Separaron los distintos tipos demoléculas que se encuentran en las células S muertas y estudiaron su capacidad de transformación por separado. Llegaron a la conclusión de que el factor transformante de las células R era el ADN.

HIPÓTESIS

1. La cepa S, muerta por el calor, fue reanimada o resucitó.

2. La cepa R viva fue modificada por algún "factor de transformación" (transforming factor).

EXPERIMENTO DE ALFRED D. HERSHEYY MARTHA CHASE (1952) (I).

1. Cultivaron E. coli en medios ricos en P32 y S35, de modo que tras varias infecciones por el fago, su ADN y sus proteínas quedaban marcadas con estos isótopos.

2. Infectaron la bacteria Escherichia coli con muchas partículas de virus marcados por cada célula.

3. Dando tiempo para que tuviera lugar la infección, separaron las cápsulas vacías de los fagos y midieron la radiactividad de bacterias infectadas y de cápsulas.

EXPERIMENTO DE ALFRED D. HERSHEYY MARTHA CHASE (1952) (II).

EXPERIMENTO DE ALFRED D. HERSHEYY MARTHA CHASE (1952) (III).

Con fagos P32, casi toda la radiactividad terminaba en las bacterias: el ADN viral entraba en las células.

Con fagos S35 la radiactividad aparecía en las cápsulas: la cápsula no entraba en la célula.

Definitivamente, el ADN era la

molécula hereditaria.

LA TRANSCRIPCIÓN.DEL ADN AL ARNm

La ARN-polimerasa se une a una secuencia llamada promotor que normalmente está delante de la secuencia que especifica el RNA. El primer nucleótido que está e el RNA (incluido en el promotor) es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto de referencia, delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.

CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES DE LOS GENES PARA LA TRANSCRIPCIÓN.

TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS

El promotor tiene dos zonas comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada:

•Región -10: TATAAT•Región -35: TTGACA

A veces el mensaje codifica varias órdenes: RNA policistrónico en su mayoría.

ARN POLIMERASA PROCARIOTA

Sólo hay una forma 2‘ formada por cadenas polipeptídicas (holoenzima). Se separa cuando el enzima trabaja. se une a elementos reguladores, tiene el centro activo, ‘ permite unirse al molde, en esa unión participa que es importante para reconocer al promotor.

RNA-POLIMERASAS EUCARIOTAS

Las distintas RNA polimerasas de eucariotas expresan distintos genes:

• I.- RNA precursor de los rRNAs (28s, 5,8s y 18s)

• II.- Genes que codifican para proteínas y 4 RNAs pequeños (snRNAs) implicados en “splicing”

• III.- tRNA, rRNA5s y otros RNAs pequeños (snRNAs)

Está formada por varias subunidades, por lo que hay varias clases de RNA polimerasa.

Seleccionan los nucleótidos según el molde y forma enlace fosfodiéster. Primero localiza el promotor y luego se suelta para dejar el RNA libre.Las ARN polimerasas no tienen necesidad de un cebador para iniciar la transcripción y son incapaces de identificar y de eliminar un nucleótido mal

aparejado dentro de una cadena en síntesis.

LOS DIRERENTES TIPOS DE ARNs

Hay cuatro tipos de ARN, cada uno codificado por sus propios tipos de genes.

1. ARN mensajero, que codifica polipéptidos.

2. ARN transferente, que porta los aminoácidos durante la traducción.

3. ARN ribosómico, que constituye los ribosomas.

4. ARN pequeños nucleares (snRNA), que, junto con proteínas, forma complejos que procesan el ARN. Sólo en eucariotas.

5. ARN de interferencia, intervienen en la regulación de la expresión génica.

EL COMPLEJO ARN-POLIMERASA EUCARIOTA1. Hacia arriba de la unidad de transcripción está la caja

TATA.2. A continuación se encuentra el “enhancer”.3. El TFIID se aproxima al ADN y se une al ADn en la caja

TATA por una subunidad denominada TBP.4. TFIIA y TFIIB se unen a la caja TATA y, esta última,

también al TFIID.5. El complejo ARN polimerasa está listo para comenzar la

transcripción.6. Otros factores más pequeños, como TFIIE y TFIIH se unen

al complejo.7. Sólo falta que la hidrólisis de ATP proporcione energía

para el comienzo de la transcripción.

TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

• Todos los genes tienen promotor y término.

• La mayoría son monocistrónicos.• Hacen falta factores de

transcripción (TF), como TFIIA, TFIIF, TFIID, etc.

• Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20, que es una secuencia de inicio de la transcripción del ADN.

• No hay zona en -35. • Muchos genes tienen secuencias

que pueden estar lejos de ellos para reactivar la transcripción (enhancers).

• El mensaje está interrumpido por intrones que en el RNA se pierden.

• Las terminaciones se pierden y aunque no se sabe bien para qué sirven parece que hay un procesamiento del RNA.

• Es muy común que muchos RNA mensajeros terminen en una cola común llamada cola poliA añadida por una endonucleasa posteriormente.

ESTRUCTURA DE UN GEN EUCARIOTA CODIFICANTE DE PROTEÍNA

1. PROMOTOR: secuencia que indica dónde debe comenzar le transcripción.

2. SECUENCIA CODIFICANTE: lleva la información para la síntesis de un péptido.

3. SECUENCIA DE TERMINACIÓN: indica dónde finaliza la transcripción.

FORMACIÓN DEL ENLACE FOSFODIÉSTER

La ARN-polimerasa cataliza la síntesis de ARN en la cadena molde de ADN.El nucleótido trifosfato precursor se aparea con el correspondiente en la cadena molde. Se forma un enlace fosfodiéster entre la cadena de ARN en crecimiento y el precursor.

INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN EN LOS PROMOTORES.

PROCARIOTAS1. El complejo ARn-polimerasa con el

factor-sigma reconoce al promotor y se une a él.

2. Una vez que comienza la transcripción, el factor-sigma se libera y puede intervenir en otro inicio.

3. Sólo hay un tipo de ARN polimerasa para todos los tipos de genes.

4. Muchos procariotas conservan una zona en el promotor rica en AT: caja TATA en las posiciones -10 y -35 (posiciones 10 y 35 hacia arriba).

EUCARIOTAS1. El complejo ARN-polimerasa posee

muchos factores de transcripción (TF).

2. Tras el inicio, algunos TF permanecen en el promotor y otros se liberan.

3. Anteriormente, ya se discutieron los diferentes tipos de ARN-polimerasa. I, II Y III.

4. Cada ARN polimerasa reconoce secuencias promotoras específicas.

5. El primer nucleótido transcrito es una especie de cabeza, tapón ó gorro llamado m7Gppp ó cap (metil-

7-guanosin-trifosfato).

FIN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN LA SECUENCIA TERMINADORA.

LOS TIPOS DE ARNm: PROCARIOTA Y EUCARIOTA

PROCARIOTASLa secuencia de la región codificante es colinear con la secuencia proteica. El ARNm se traduce directamente a péptido.

EUCARIOTASLa secuencia de la región codificante no es colinear con el péptido a sintetizar.El ARNm debe ser procesado para eliminar fragmentos no codificantes denominados intrones y dejar sólo los fragmentos codificantes o exones.

PROCESAMIENTO DEL PRE-ARNm: “SPLICING”

Los pasos en el “splicing” (eliminación de intrones) del pre-ARNm son los siguientes:

1. El intrón forma un “lazo” denominado espliceosoma gracias a la unión de snRNP (ribonucleoproteínas pequeñas nucleares, formadas por snARN y proteínas).

2. El intrón se escinde y los exones adyacentes quedan unidos.

3. El ARNm maduro resultante sale del núcleo hacia el citoplasma.

*** Volveremos más adelante sobre las modificaciones postranscripcionales.

MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES DEL ARNm

Procariotas: no sufren procesamiento, funcionales tal y como son sintetizados. Participan en la síntesis de proteínas incluso antes de acabarse de sintetizar.

Eucariotas: sufren diversas modificaciones.1. Ocurre un procesamiento en los extremos de las moléculas, por lo que el mensaje se

interrumpe a veces.2. Mecanismo de “splicing”, ya explicado anteriormente.3. Todos los mRNA son modificados en el 5’ (los 3 fosfatos) y se le añade una guanina que

luego se metila (el extremo 5’ también conocido cono gorra, esencial para ser reconocida por el ribosoma).La modificación 3’: hay secuencia AAUAAA reconocida por la endonucleasa, que corta cerca de ella y añade cola poliA de 200 ó 250 adeninas seguidas (señal de poliadenilación), que no tiene codificación génica. Los ARNm de histonas no tienen poliA ni los ARNm de los cloroplastos o mitocondrias porque provienen de procariotas.

EL OPERÓN LAC: UN EJEMPLO DE REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS (I).

¿Cómo regula una célula todos sus genes? El control de la expresión génica es fundamental para un organismo: cada grupo celular reprime unos genes y expresa otros.El sistema que vamos a analizar es el del metabolismo de la lactosa en E. coli. La figura adjunta presenta un modelo físico de control de las enzimas que actúan en el metabolismo de la lactosa.

El metabolismo de la lactosa requiere dos enzimas:1. Permeasa para introducir la lactosa en la célula (gen lacZ);2. β-galactosidasa (gen lacY);3. Transacetilasa (genA), que no es requerida por este metabolismo.

Las tres proteínas se transcriben en una sóla molécula de ARNm policistrónico: regulando la producción de este ARNm se puede regular la síntesis de las tres enzimas.

4. Represor (gen lacI), que se une a una región de ADN próxima al gen lacZ que se llama operador. Así, el represor impide la progresión de la ARN polimerasa.

lacZ lacY lacAlacI

EL SEGMENTO POZYA DE LA FIGURA CONSTITUYE UN OPERÓN O UNIDAD GENÉTICA DE EXPRESIÓN COORDINADA.

EL OPERÓN LAC: UN EJEMPLO DE REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS (II).

¿Cómo se regula todo este mecanismo?El represor posee dos sitios de unión específicos:1. Uno para el operador.2. Otro para la lactosa (y otros análogos).Cuando existe lactosa en el medio, el represor sufre un cambio conformacional al unirse a

esta, y se libera del operador del ADN, iniciándose la transcripción.En sistemas como lac, la supresión de la represión se denomina inducción.

TABLA DE COMPARACIÓN ENTRE PROCARIONTES Y EUCARIONTES EN LA TRANSCRIPCIÓN DE ADN.

CARACTERÍSTICA PROCARIONTE EUCARIONTE

Cistrón Policistrones Monocistrones

RNA polimerasauna sola, con 5 subunidades distintas

3 ARN polimerasas

EstabilizaciónEl ARN recien transcrito, no tiene.

Contiene, al comienzo de la cadena, 7-metil-guanosina o CAP, y al final de la cadena, una secuencia poli A

ComienzoARN pol, se autoacopla al promotor

ARN pol, necesita la presencia de proteínas de iniciación, que se unan antes que ella al ADN.

Intrones No tiene Tiene y se eliminan con splicings

Lugar de acciónInmediatamente, al ser creado

En el citoplasma.

TEST DE CONCEPTOS

http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/transcription/quiz.html

CON ESTE REPASO FINALIZAMOS LA TRANSCRIPCIÓN.

LA TRADUCCIÓN:DEL ARNm AL PÉPTIDO

EL CÓDIGO GENÉTICO

El lenguaje genético consta de las cuatro bases nitrogenadas, que se agrupan en tripletes. Por tanto, son posible 43 = 64 tripletes diferentes. Cada triplete viene a codificar un aminoácido, y es por esto que se dice que este código genético está degenerado, pues existen más tripletes de los necesario: 64 tripletes para 20 aminoácidos.

TRADUCCIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTAS.VISIÓN GENERAL.

COMPONENTES MOLECULARES DE LA TRADUCCIÓN.

1. ARNm. Su lectura comienza en el extremo 5’, con un triplete iniciador AUG próximo a la caperuza 5’. Este triplete va precedido de la secuencia AGGAGG (secuencia de Shine-Dalgarno ) que es la zona de unión con el ribosoma.

2. Ribosomas. En eucariotas, la subunidad pesada es 60S y contiene ARNr 28S, 5.8S, y 5S, además de cerca de 50 proteínas ribosomales.. La subunidad pequeña es 40S y contiene ARNr 18S y cerca de 30 proteínas.

3. ARN transferente (ARNt), con un extremo 3’- CCA de unión al aminoácido, y con una zona de unión complementaria al codón de ARNm denominada anticodón. En ambos casos se trata de tripletes de bases nitrogenadas. Una enzima denominada ARNt-aminoacil-sintetasa une el aminoácido correspondiente a su ARNt en función de su anticodón.

ETAPAS EN LA TRADUCCIÓN

1. INICIACIÓN. El ARNm se une al ribosoma. 2. ELONGACIÓN. El ribosoma progresa a través de

toda la cadena de ARNm, añadiendo los aminoácidos en función del código genético.

3. TERMINACIÓN. Finaliza la síntesis tras unas señales de STOP.

4. MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES.

1. INICIACIÓN.

Comienza con metionina en eucariotas y N-formil-metionina en procariotas, codificada por el codón AUG.

Continua asociación y disolución de las subunidades ribosomales gracias a factores de iniciación (IF-1, IF-2 e IF-3). La secuencia de formación de un ribosoma 70S es como sigue:

1. En primer lugar la subunidad 30S forma un complejo con el IF-3, que se une al ARNm;

2. A este complejo se le adiciona una molécula de IF-1.

3. Entonces, el ARNt que lleva la N-formil-metionina y GTP se une al IF-2, y el complejo resultante se une con el complejo anterior de subunidad 30S, IF-3, ARNm e IF-1, rindiendo el llamado complejo de iniciación.

4. Este complejo se une con la subunidad 50S formando el ribosoma completo; en este proceso el GTP se hidroliza en GDP y P y los tres factores de iniciación se disocian del ribosoma.

El ARNt queda posicionado en el sitio P.

2. ELONGACIÓN.El ARNt iniciador se une al centro peptidilo,

centro P, permaneciendo libre el llamado centro A. Tres fases.

1. Fase 1: unión del aminoacil-ARNt entrante. El ARNt entrante se une en el citoplasma a una proteína que en procariotas se llama factor de prolongación T (EF-T en procariotas y EF-1 y EF-2 en eucariotas), llevando GTP. El ARNt se sitúa en el centro A con su anticodón unido al correspondiente codón del ARNm. El GTP es hidrolizado.

2. Fase 2: formación del enlace peptídico. Se forma el primer enlace peptídico entre el grupo amino del ARNt entrante y el grupo carboxilo del ARNt iniciador (el N-formil-metionina). Esta reacción es catalizada por la peptidil transferasa. El producto es un dipeptidil-ARNt unido al centro A, mientras que un ARNt descargado permanece en el centro P.

3. Fase 3: transposición. El ribosoma se traslada al nuevo codón del ARNm y simultáneamente cambia al peptidil-ARNt del centro A al centro P. Para este proceso se requiere el factor de prolongación (EF-G) y GTP, de modo que queda el centro A libre para la entrada de un nuevo ARNt.

3. TERMINACIÓN.

Tres codones especiales: UAG, UAA y UGA.

Una vez que el último resto carboxílico se ha unido a la cadena polipeptídica, esta cadena todavía se encuentra unida al ARNt en el centro A.

La liberación del polipéptido es mediada por tres factores de liberación (R1, R2 y R3). Se unen al ribosoma para provocar un desplazamiento del peptidil-ARNt desde el centro A al P. El enlace éster entre el ARNt y el péptido se hidroliza.

Una vez liberado el polipéptido, el último ARNt y el ARNm abandonan el ribosoma. El ribosoma 70S libre se disocia en sus dos subunidades, proceso que requiere de uno de los factores de iniciación, pudiendo iniciarse un nuevo proceso de síntesis.

LOS POLISOMAS

RECURSOS INTERNET

http://www2.uah.es/biomodel/inicio.htmhttp://vcell.ndsu.nodak.edu/~christjo/vcell/animationSite/transcription/movie.htmhttp://www.phschool.com/science/

biology_place/biocoach/index.htmlpcR:

http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/PCR/PCR.html

Recopilado por tusclasesdeapoyo.com