Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)Facultad de Ciencias Biológicas Curso: GENÉTICA MOLECULAR

Semana 2TRANSCRIPCIÓN DEL ADN

Gustavo A. Sandoval, MScPhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB)UNALM – 20090549@lamolina.edu.pe

Bases :A = adeninaT = timinaG = guaninaC = citosina

CromosomaNúcleo

Célula

ADN

TGAGTCAACG

ADNmt

El genoma:nuclear ymitocondrial

Doble hélice Antiparalelismo

0.34 nm

Surco menor

Surco mayor

Flujo de la información genética

Transcripción y traducción. Los nucleótidos del ARNm son ensamblados para formar una copia complementaria a partir de una cadena de ADN. Cada grupo de tres es un codón el cual es complementario a un grupo de tres nucleótidos en la región del anticodón de una molécula específica de ARNt. Cuando ocurre el apareamiento de bases, un aminoácido llevado al otro extremo de la molécula de ARNt es añadida a la cadena proteica creciente.

Transcripción(ADN ARN)

ARN polimerasa

Condiciones para la transcripción

codificadoracadena molde

• NTP (ATP, CTP, GTP, UTP).• Complejos proteicos: polimerasa de ribonucleótidos + factores de transcripción• Señales de reconocimiento: (en secuencia de ADN): inicio, elongación, final.

Promotor procariote

TATATTGACA

Promotores: secuencias de reconocimiento en el ADN y fijación de la ARN polimerasa.

Sitio de inicio de la transcripción (eucariotes)

Amplificadores o silenciadores

Caja CAAT

Expresión regulada Expresión basal

Gen estructural

-75 -25

s

Principales subunidades de las ARN Polimerasas

Estudios bioquímicos de la ARN polimerasa bacteriana

1. Ensayo de unión al ADN“DNase I footprinting” para la búsqueda de secuencias promotoras.

1. Rol de las subunidades individualesDisociación de la holoenzima por cromatografía en columna

“DNase I footprinting”: una técnica común para la identificación de sitios de unión a proteínas en el ADN.

1. Un fragmento de ADN es marcado en un extremo con 32P (punto rojo).

2. La muestra es luego digerida con DNase I en la presencia y ausencia de una proteína que se une a la secuencia específica en el fragmento.

3. Se emplea una baja concentración de DNase I de forma que cada molécula de ADN sea clivada sólo una vez (flechas verticales).

4. Luego, las muestras de ADN son separadas de las proteínas y sometidas a electroforesis. El gel resultanto es analizado por autoradiografía, detectando sólo las cadenas marcadas y se procede a la identificación de los fragmentos clivados por la DNase I

Cromatografía de intercambio iónico

Dissociación de RNAP y purificación de σ por cromatografía de intercambio iónico

α

αβ’

βσ

ω [NaCl]

[proteina]

Número de fracción

σ α

αβ’

β

ω

Carboxymethyl- (-CO2-2) or

phospho- (-PO3-2) cellulose

La subunidad sigma disociable le confiere la especificidad a la ARN polimerasa procariota (RNAP)

α

αβ’

βσ

Core enzimático

+α

αβ’

βσ

Holoenzima

Unión inespecífica al promotor; (Kd ~5 x 10-12 M)

Unión específica al promotor; (Kd ~10-7 M); encuentra al promotor 10,000 veces más rápido.

ωω

Secuencias consenso de la región promotora

Otros tipos de promotores

Regiones de la subunidad σ (región 2.3)

Las subunidades σ y α reclutan a la ARN polimerasa hacia el promotor

Posición del ADN dentro y fuera del complejo de transcripción

Transcripción en eucariotes

• Tres polimerasas, muchas subunidades, factores y elementos reguladores

• ARN pol I: ARNr (28S, 18S y 5.8S)• ARN pol II: ARNm• ARN pol III: ARNt, ARNr 5S.

• Procesos: Iniciación, elongación, terminación, procesamiento.

Promotores de la ARN polimerasa II

Transcripción de ARNr

45 S ARNPol I

CH3 CH3 CH3

Transcripción de ARNt y ARNsn (eucar.)

RNA Pol III

TFIIICTFIIIB

TFIIICTFIIIB

Ensamblaje del complejo de iniciación de ARN Pol II:

A) Reconocimiento del promotor

B) Estabilización de complejos

C) Reclutamiento de Holoenzima ARN Pol II + TFs

TFIIA

(TBP y TAFs)

D) Unión de complejos

E) Inicio de la transcripción

Amplificadores (enhancers)

• Aumentan la velocidad de la transcripción (regulan actividad del promotor)• Se localizan en corriente arriba/abajo o ser parte del gen que controlan.• Algunos TFs (enhancer-binding protein) pueden unirse a regiones DNA distantes a miles de nucleótidos.

• Enhancer β-Locus Control Region (LCR) contiene elementos que son reconocidos por proteinas TFs (activadores)

• LCR regulaexpresión de 5 genes:ε en periodo embrionario,γ en fetal, β y δ en la adultez.

Cluster de genes globinas

“Motivos” proteicos

N CDominio de uniónal DNA

Dominio de uniónal ligando

Dominio de activación

(63 aa)

Receptor glucocorticoide

Interacción entre “dedos de Zn2+” y el ADN

Burbuja de Transcripción

Terminación dependiente de secuencia

Terminación de la transcripción

Terminación dependiente de Rho