transcriptome introduction aux biopuces et à lanalyse du transcriptome emmanuel prestat
TRANSCRIPT
Transcriptome
Introduction aux biopuces et à l’analyse du transcriptome
Emmanuel Prestat
Transcriptome
Les différentes puces
• Mesures d’expression
• Etude du nombre de copies
• Analyse de polymorphisme
• Puces à tissus, à cellules, à immunoprécipition
Transcriptome
Mesures d’expression
• Biopuces les plus utilisées à ce jour (premières auxquelles on pense, quand on parle de puces à ADN)
• Principe :– les sondes, petits fragments d’ADN (20 à 50 nt)
complémentaires à chaque gène ciblé, sont déposées sur une lame de verre, type lame de microscope ;
– Les cibles, ARNm ou ADNc issus d’ARNm, sont marquées (radioactivité ou fluorescence) puis hybridées avec la lame sur laquelle les sondes sont déposées
Transcriptome
Transcription
QuickTime™ et undécompresseur
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Transcriptome
La technologie des puces bifluorescentes
Transcriptome
Dépôt des sondes (« spotting »)
Transcriptome
Dépôt des sondes (« spotting »)
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Transcriptome
Puces à oligo : pas de « spotting » !
Procédé Affymetrix (et NimbleGene…)
Transcriptome
Particularités des puces Affymetrix
• La fabrication in situ des sondes• Leur ultra-haute densité : jusqu’à 1,3
millions d’objets• Leur design :
– Objets carrés– Pas d’espace entre eux– Concept de probeset– Concept de PM et MM
Transcriptome
Puces Affymetrix
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Transcriptome
Préparation des échantillons (cibles)
• Extraction d’ARNKit
• AmplificationPCR
• Marquage– Radioactivité (S35, P32)– Fluorescence (Cy3 - vert, Cy5 - rouge)
En général réalisé en même temps que l’amplification: utilisation d’une amorce de PCR marquée
• Digestion (λ-exonucléase) ADN simple brin
Transcriptome
L’hybridation• Séchage des cibles et reprise dans un tampon
d’hybridation
• Volume d’hybridation : 3 à 50 μl (entre lame et lamelle) attention à l’évaporation ! à répartir sur l’ensemble de la surface de la puce
• Température d’hybridation45 65°C– + la température ↑, + le signal d’hybridation ↓– + la température ↓, + l’hybridation aspécifique ↑
• Temps d’hybridation1h 12h
dans une chambre d’hybridation
Transcriptome
Le lavage
• Après hybridation, lavage de la lame, pour éviter – L’adsorption de fluorescence sur le support
– Les hybridations aspécifiques
• Conditions de lavage :– Dans des solutions de plus en plus stringentes
• Evaluation de la qualité du lavage (et de l’hybridation)– Témoins positifs et négatifs
– Répartition aléatoire sur la lame
vérification : pas d’effet de localisation, de bord
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Acquisition des images
Extraction des données
Excitation
Amplification du signal (PMT)
Émission
Laser 1 Laser 2
Fluorescence verte
Fluorescence rouge
(Ech 1) (Ech 2)
Transcriptome
Acquisition des imagesEtat excité
Etat stable
Spectre d’excitation&
Spectre d’émission
Transcriptome
Choix des fluorochromes
Fluorescence verte
Fluorescence rouge
Transcriptome
« Vrais » images et images d’« interprétation »
Transcriptome
Pas si simple…
Transcriptome
Pas si simple…
Queues de comètes Bavures
Mauvais blocage du processus pendant la phase d’hybridation
Sondes/Cibles
Spotting ? Lavage ?
Transcriptome
Pas si simple……etc
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Différences avec les puces radioactives
• Marquage radioactif (!)• Une seule condition expérimentale• Le support est une membrane• Maximum : 2400 dépôts par
membrane (on les appelle parfois les macroarrays)
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Transcriptome
Extraction des données à partir de l’image
1. Adressage – Localisation
2. Segmentation
3. Extraction de l’information (pour chaque spot)
- signal d’intérêt
- bruit local (autour de chaque spot)
- morphologie (surface, périmètre…)
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Cercles fixes
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Cercles fixes / rotation & distorsions !
Cercles fixes / variabilité du spot
GenePix Pro 4.0
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Cercles adaptables :
modifier position du cercle
modifier la taille du cerle
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Dérivée seconde
Détection de contours
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Détection de contours vs cercles fixes
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Adams R et Bishof 1994
http://www.ch.embnet.org/…..
Détection de régions (graines ou agrégation de pixels)
Transcriptome
Méthodes de segmentation
Détection de régions : seuillage (ou histogrammes)
Détection de régions (Watershed Function) Morphologie mathématique
Transcriptome
Mesure du bruit de fond
Transcriptome
Quelques chiffresDiamètre des spots : 100-600 µmCapacité totale : 30000 spots / lame ; 2-10 ng ac.nucl./spotDistance entre les spots : 100 µm – 600 µm
Durée de conservation : 9 moisConditions optimum de conservation : 2 – 8 °CDurée totale de préparation : 3 joursPréparation d’un échantillon : 2 joursHybridation : 16 heuresLavage : 1 heureScan : 5 - 15 minutes
Transcriptome
Normalisation de biopuces : pourquoi ?
«Traitement visant à ajuster les données selon les effets des variations dues à la technologie plutôt qu’à des différences biologiques » Yang et al. 2002
Transcriptome
Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Transcriptome
Normalisation de biopuces : pourquoi ?
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Effet microplaque (ou aiguille)
Transcriptome
Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Transcriptome
Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Après normalisation qui tient compte de la variabilité due aux différentes aiguilles du « spotter ».
Rmq : la normalisation inter-lames observe le même principe
Transcriptome
Analyse de données
• Identification de gènes DE– Fold change– Tests statistiques
• Identification de gènes DE (plus de 2 conditions)
• Répétitions (quel type, combien ?)
Transcriptome
Fold change
• Avantage : sens pour un biologiste• Fold Change =expression value sample 1/ expression value
sample 2
• Décision :– Quel seuil ?– Même pour tous les gènes
• Inconvénients– Seulement les valeurs moy, sans tenir compte de la
variabilité sont considérées– Les gènes ayant une expression très variable, ont plus de
chance de dépasser le seuil aléatoirement
Transcriptome
Tests à un facteur
Transcriptome
Tests à un facteur
• Paramétriques– Condition de normalité
Transormation Log
=> Transformer les données !
Transcriptome
Tests à un facteur
• Tests non paramétriques– Ne supposent pas la normalité– Ne supposent pas l’homoscédasticité– L’utilisation des rangs à la place des
valeurs d’intensité :• Diminue l’effet des outliers• Ne sont pas affectés par la log-transformation
– Pas recommandés si les échantillons ont peu de répétitions
Transcriptome
Volcano plot• Combine les p-values et fold
changes• Qu’est-ce qui est
biologiquement important ?– La significativité des
différences– Leur valeur
• Quels seuils ?– Combien veut-on identifier de
gènes ?– Où sont les contrôles ?
• Le t-test modéré fait quelque-chose de similaire
Transcriptome
Quel seuil de p-value choisir ?• Dépend du type d’erreur
– Type 1• Faux positifs
• => identifie des gènes différentiellement exprimés alors qu’ils ne le sont pas
– Type 2• Faux négatifs
• => ne détecte pas certains gènes pourtant différentiellement exprimés dans la réalité
Transcriptome
Correction des tests multiples
• Le problème…– Ho = l’expression moyenne du gène X est la même pour
toutes les populations comparées– Identification des gènes DE : autant de tests à faire que de
gènes considérés– Nombre moyen de faux positifs : G.
• Exemple– G = 25000 gènes = 0.05
=> G. = 1250 faux positifs…
Transcriptome
Correction des tests multiples
• Méthodes de correction des p-values– Correction FWER (Family-Wise Error Rate)
• FWER = proba- d’obtenir au moins 1 faux positif• Méthodes utilisées :
– Bonferroni– Bonferroni step-down (Holm)– Westfall and Young permutation
– Correction FDR (False Discovery Rate)• FDR = taux attendu de faux positifs• Méthode utilisée
– Benjamini et Hochberg
Transcriptome
Lequel utiliser ?
• FWER: ne tolère pas de faux positifs (Ho est difficilement rejeté) => procédure très conservative
• FDR : moins conservatif, on estime le pourcentage de FP parmi les gènes « appelés »
• Aucun : le pourcentage de FP est estimé sur l’ensemble des gènes testés
Transcriptome
Tests bi-facteurs
• ANOVA– Comme un t-test avec + de deux conditions– Mesure les effets de différents facteurs ainsi que leurs
interactions– ANOVA 2
• Test deux facteurs
• 3 tests– Temps– Traitement– Interaction entre les 2 (additif ? Multiplicatif ?)
Transcriptome
Importance des répétitions
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Transcriptome
Classification
• But :Regrouper une collection d’objets de façon à
ce que les objets d’une partition soient plus liés entre eux qu’avec les objets d’une autre partition
• Analyse discriminante (classification supervisée) : les classes sont définies
• Classification (non-supervisée) : on ne connaît pas les classes
Transcriptome
Classification
• Exemples :– Traitement/contrôle, malade/normal,
thérapie efficace/sans succès,…– Si on a des informations sur la façon de
classer les échantillons, elles devraient être intégrées dans la méthode
Transcriptome
Les données
Genes(thousands)
Experimental conditions (from tens up to no more than a few houndreds)
A B C
Expression profile of a gene across the experimental conditions
Expression profile of all the genes for a experimental condition (array)
Different classes of experimental conditions, e.g. Cancer types, tissues, drug treatments, time survival, etc.
• La plupart des gènes sont non-informatifs pour le trait étudier
• Le nombre de variables est plus important (plusieurs ordres de magnitude) que le nombre d’expériences
Caractéristiques
Transcriptome
Classification : corrélations et distances
• Corrélations :– Pearson : corrélation entre les valeurs– Sperman : corrélation de rangs (réduit l’effet des variations
extrèmes)=> Prend en compte les tendances
• Spearman confidence (mesure de similarité) = 1 - p-value
• Distance euclidienne => différences entre coordonnées
• Distance de manhattan (somme des différences absolues pour toutes les coordonnées du vecteur) => plus robuste
Transcriptome
Classification hiérarchique
• Arbre des gènes
• Arbre des conditions
Exemple : UPGMA
Alizadeh et al., Nature 2000
Transcriptome
Classification non-hiérarchique
• K-means : minimisation de la variance intra-classe (le nombre de classes est une instance)
• ACP : rotation de la base maximisant les variances
• SOM (Self Organising Maps)
Transcriptome
Classification supervisée = « class prediction »
• Quelques méthodes:– Bayes– Analyse discriminante linéaire– Les k plus proches voisins (k-NN)– Les arbres de classification (CART)
Transcriptome
Autre type de puce analysant le transcriptome
• Puces à exons :
Analyse de l’épissage
Transcriptome
Principe du CGH
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Transcriptome
Analyse des puces CGH
Transcriptome
Objectifs de l’étude statistiques
Transcriptome
Analyse de polymorphisme
• Les Single Nucleotide Polymorphims (S.N.P) désignent des variations d'une seule paire de base du génome, entre individus d'une même espèce (e.g. 1/1000 paire de bases dans le génome humain).
• On parlera de formes alléliques synonymes dans le cas où plusieurs formes d'un SNP mènent à la même séquence polypeptidique, et de formes non-synonymes dans le cas où les séquences produites diffèrent.
• Les SNP qui se retrouvent dans des régions non-codantes peuvent avoir des conséquences sur l'épissage, les facteurs de transcription, ou sur les séquences d'ARN non-codant
Transcriptome
Une séquence d'ADN contenant un site SNP. Les allèles A et G sont illustrés.
Une région chromosomique où seuls les SNP sont montrés. Trois haplotypes sont illustrés. Les deux SNP colorés suffisent à identifier (marquer) chacun des haplotypes. Par exemple, si les deux sites SNP marqueurs du chromosome portent les allèles A et T, on peut déduire qu'il s'agit du premier haplotype.
Les SNP
Transcriptome
Puces SNP
• Exemple : Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.01.8 million markers for genetic variation
• 900 000 single nucleotide polymorphisms (SNPs)
• 946,000 probes for the detection of copy number variation
Transcriptome
ChIP-on-Chip (étude des points de contacts entre une protéine et tout le génome)
Transcriptome 64
Problématique biologique du TP• Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la
majorité des pucerons. L’association est très ancienne (250 Ma). Les partenaires sont devenus dépendants.
• Buchnera possède un génome de taille très réduite (400 à 600 kb), très riche en bases A et T et incluant de nombreuses mutations délétères
(adaptatives ?). -> Bon modèle d’étude à un niveau théorique (simple)-> très difficile à manipuler expérimentalement (incultivable)
• Le génome de Buchnera est « dégénéré »-> Comment Buchnera régule-t-elle l’expression des ces gènes ?-> Comment Buchnera s’adapte-t-elle aux variations des besoins
nutritionnels de l’hôte ?
Transcriptome 65
La puce Buchnera
aiguille1
aiguille2
aiguille3
aiguille4
= =
bloc (12 x 16)
Contrôles (+ et -)
Doublets de spotsOligo 5’
Oligo 3’
3ème oligo
Superposition des 2 images (R et G)
Transcriptome 66
• Approche comparative (non cinétique)
– Expérience Naas (16 lames) :
Milieu équilibré Milieu déséquilibré
en AA en AA
riche en saccharose A B
pauvre en sacharose C D
2 répétitions indépendantes de 8 lames :
A/B, B/C, C/D, D/A, A/C, B/D, D/B, C/A
A B
CD
-> Les données ont été acquises par N. Reymond (expérience naas.tri analysée en TP)
Plan expérimental du TP