transgen · 2019. 9. 23. · 0 sec 302 nm ultraviolet light ±2.5 1.3 x 108 30 sec 302 nm...

—5分钟快速、高效克隆

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分子克隆的传统方法

Topoisomerase (EASY)克隆原理

EASY 克隆策略

EASY 克隆的几个细节

无缝拼接基因克隆

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分子克隆的传统方法 TRANSGEN

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分子克隆的传统方法

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连接和环化

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• 常规的连接是一个三分子共同反应的过程。

• TA克隆中粘性末端仅有一个碱基，因此较高的DNA浓度和较

高T4连接酶浓度是获得较高连接效率的前提。

• 环化过程恰恰与连接过程相反，过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间相互作用促进串连体(concatemer)形成。

• 通常情况下, 克隆效率（连接产物转化效率，而不是克隆阳性率）低于0.1% 。

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Topoisomerase (EASY)克隆原理 TRANSGEN

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拓扑异构酶的功能

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http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8f/DNA_replication_en.svg

Vaccina Topoisomerase as Cloning Tool

• Specific DNA cleavage and binding by vaccinia virus DNA topoisomerase I. S Shuman and J Prescott . J. Biol. Chem., Vol. 265, Issue 29,

17826-17836, Oct, 1990

• Site-specific interaction of vaccinia virus topoisomerase I with duplex DNA. Minimal DNA substrate for strand cleavage in vitro. S Shuman .

J. Biol. Chem., Vol. 266, Issue 17, 11372-11379, Jun, 1991

• Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. S Shuman J. Biol. Chem., Vol. 269,

Issue 51, 32678-32684, 12, 1994

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连接反应成为一个双分子作用的过程

EASY 克隆原理

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Mary R. Stahley and James T. Stivers Biochemistry.2010 April 6: 49(13):2786-2795 Reversible DNA cleavage and ligation by topoisomerase IB and DNA strand exchange. The native strand (black) is cleaved during the first transesterification

reaction, and can dissociate from the Topo-DNA covalent complex. Another DNA strand with a 5-OH (red) can associate and attack the DNA-protein

phosphotyrosyl bond, resulting in DNA rearrangements.

TOPO载体反应动态平衡

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vector

P

vector

P

PCR product

传统TA载体和TOPO载体稳定性、自连率的比较

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EASY 克隆

利用 Vaccina Virus Topoisomerase (TOPO) ，与载体结合(牛痘病毒的拓扑异构酶)

酶特点由314个氨基酸组成

识别5’-C/TCCTT-3’

具有限制性内切酶(nick enzyme)和连接酶的功能

工作所需缓冲液条件宽泛

不需要外界提供能量

>80%的连接反应在2分钟之内即可完成

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EASY 克隆过程: 三个简单步骤

制备PCR产物 1. 1 ml TOPO载体 + 1~4 ml PCR产物

2. 室温孵育5分钟 3. 转化 TRANSGEN

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TOPO载体的3大优点

操作简单：载体+片段

反应快速：酶本身具有的特性

连接高效：连接反应成为双分子作用过程

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EASY 克隆策略 TRANSGEN

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无杂带无引物二聚体

PCR

产物

无杂带有引物二聚体（纯化） PCR Purification Kit

均有或有杂带（胶回收） Gel Extraction Kit

连接转化

（一）对片段的处理

胶回收 PCR产物回收

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（二）载体的选择 EASY 克隆和T4 DNA Ligase克隆比较（TOPO载体和普通TA载体比较）

EASY 克隆 T4 DNA 连接酶克隆

PCR产物无需纯化可直接用于克隆（若无杂带和引物二聚体）

需要纯化 (PCR缓冲液抑制连接)

反应时间/温度 5分钟/室温 (20oC～37oC) 过夜（12～16小时)/12～16oC

操作载体 + 片段载体 + 片段 + 缓冲液

+ T4 连接酶 + 水

克隆阳性率 ++++ ++/+++

克隆数 ++/+++ ++++

连接大片段 +/++,++++(T5) ++/+++

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T粘性末端克隆载体

适合粘性末端PCR产物（Taq扩增）的连接

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适合平末端PCR产物（Pfu扩增）的连接

平末端克隆载体

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零背景克隆载体

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通过自杀基因表达与否筛选阳性重组子。

当载体与片段连接成功，自杀基因无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长。

当载体与片段连接不成功，自杀基因正确表达，包含载体的细胞无法生长，即“Zero”背景。

简单：只需加入片段即可；

快速：仅需要5分钟反应时间；

高效：阳性率接近于100%；

无需蓝白斑筛选；

适用于长片段克隆 —— 目前已成功的最长片段为10 kb

零背景克隆载体

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EASY 克隆的几个细节 TRANSGEN

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（一）外源片段的准备

引物设计：引物不能磷酸化。

PCR注意事项

延伸设置为72℃ 10～20分钟。

目的：保证扩增片段完整,有效降低扩增背景；

使用Taq系列DNA聚合酶扩增时,该步骤为加A反应；

Taq系列DNA聚合酶扩增(如EasyTaq, TransTaq-T等)，使用TA克隆载体；

Pfu系列DNA聚合酶扩增(如EasyPfu, FastPfu等)，使用Blunt克隆载体；

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胶回收片段

EB和紫外照射（UV短波长）对dsDNA造成损伤导致克隆效率降低, 阳性率减少, 突变率增加

建议

使用新鲜电泳液

尽量减少紫外照射时间

不用短波紫外线(254 nm), 用长波紫外线(366 nm)

使用EB替代染料[但有些替代品会使迁移率发生变化]

Most translumonators use 302 nm

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Gel stained with EB (for UV Light) or SYBR Green I (for Blue Light)

紫外照射降低克隆数

Treatment Colony Forming(Unit/mg pUC19) Fold Decrease

None (control) 3.4 ± 1.4 x 108

0 sec 302 nm Ultraviolet Light 2.5 ± 1.3 x 108

30 sec 302 nm Ultraviolet Light 7.5 ± 1.5 x 106 33

60 sec 302 nm Ultraviolet Light 5.0 ± 1.6 x 105 500

120 sec 302 nm Ultraviolet Light 6.1 ± 1.4 x 103 41,000

0 min 480 nm Blue Light 3.2 ± 1.3 x 108




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（二）克隆反应设置

摩尔比：EASY 克隆DNA的工作浓度广泛

通常产物在琼脂糖凝胶上可见时，

加入1 μl 即可

反应温度：TOPO酶的工作温度为20℃～37℃，

最适反应温度为25℃

反应时间：5~30分钟

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（三）克隆感受态细胞的选择名称适用范围

Trans10

（Top10）适用于毒基因的克隆具有硫链霉素抗性

Trans5α

（DH5α）普遍使用

Trans1-T1

（Mach1-T1）具有T1、T5噬菌体抗性，在液体培养基中生长速度快

Trans109

（JM109）同源重组率低，适合含有重复序列的基因克隆

Trans110

（JM110）不会对质粒进行甲基化修饰

Trans1-Blue

（XL1-Blue）适合转化去甲基化的DNA

Trans2-Blue

（XL10-Gold）

适用于大质粒DNA和重组产物的转化降低片段大小的偏爱性，可用于文库构建

具有四环素、氯霉素抗性

TransStbl3

（Stbl3）适用于慢病毒及其它逆转录病毒载体的复制

TransDB3.1

(DB3.1) 适用于转化和扩增包含ccdB基因的质粒载体

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（四）其它注意事项

基因特殊结构

原因

具有高AT、高GC、反向重复序列的基因不容易连接

建议

调整、摸索连接体系和条件；

尝试不同的载体（不同的骨架对片段偏好性不同）

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Easy 克隆常见问题及解决方法

• 克隆数少（感受态细胞效率正常范围内） • 菌落多为淡蓝色或Fish Eye（白边蓝芯） • 克隆阳性率低 • PCR鉴定重组子失败

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克隆数少

• PCR产物不新鲜 • DNA浓度低 • 胶回收片段 • 基因特殊结构 • 毒基因 • 载体过期

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（1）PCR产物不新鲜： Why:

3`-A 容易脱落, 导致T/A克隆效率低

Suggestion:

PCR产物立即使用效果最好; 或将PCR产物置于4℃，保存1～2天内使用; 不要冷冻PCR产物

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（2）目的片段浓度很低：

Why:无法保证有效碰撞

Suggestion: 浓缩DNA

（3）克隆胶回收片段

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（4）毒基因： Why:

其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 Suggestion:

选用正确的载体使用Top10 鉴定不同大小的克隆

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菌落多为淡蓝色或 Fish Eye Why:

插入片段没有影响LacZ基因读码框

a. 插入片段小(小于400 bp）

b. 插入片段的结构特殊

Suggestion:

不要丢弃平板！

进行进一步鉴定

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克隆阳性率低 (or 多数克隆不正确)

阳性率低:有引物二聚体多数克隆不正确: 有杂带等

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PCR鉴定重组子失败用GSP引物鉴定时没有条带；用通用引物鉴定时, 扩产物既无目的带又无载体自连带；

Suggestion:

预变性95℃10 min

(彻底裂解菌体、释放DNA)

最好用通用引物鉴定

（可判断症结）

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无缝拼接基因克隆 TRANSGEN

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pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit

• 原理：类似于同源重组

• 使用条件：引物设计时在片段末端引入重叠序列

• 应用：可将任意方法线性化后的载体与片段连接

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引物设计方式

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无缝拼接在线引物设计

软件网址：http://soft.transgen.com.cn/

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输入载体序列

选择是否保留酶切位点

输入插入片段的序列

选择插入片段个数

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输入载体序列

选择是否保留酶切位点

选择插入片段个数

输入插入片段的序列

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几种载体构建方法的比较

方法 T4连接酶介导的克隆 EASY克隆同源重组

原理利用限制性内切酶切割载体、片段，产生相匹配的末端，然后用T4连接酶连接起来，或使用T4连接酶进行TA克隆

利用拓扑异构酶的双重活性，实现快速连接

利用重组酶，将任意片段与任意载体连接

特点

载体构建连接具有方向性克隆数多

可用于克隆，也可载体构建只能进行TA克隆需要酶切位点阳性率较低

步骤繁琐，需要回收片段耗时费力

简单、快速、高效可以进行平末端克隆

只能连接特定载体（多用于克隆）

连接无方向性克隆数较少

无法进行文库构建

简单、高效、灵活连接具有方向性

一次可连接多个片段拓展功能强大

引物合成成本高

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• 24种内切酶

• 包括：AvrII、BamHI、BglII、BsgI、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PstI、PvuI、SacI、SacII、ScaI、SalI、SmaI、SpeI、SphI、XbaI、XhoI、XmaI

限制性内切酶介绍

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产品特点

One Buffer：FlyCutTM Buffer

5 minute高效酶切

单酶切：1 μl 酶，3 μg 质粒或PCR产物，5-10 min，50 μl体系

无星号活性

无核酸酶活性

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R.Enzyme Transgen’s Enzymes NEB’s Enzymes Thermo’s Enzymes

Transgen NEB Thermo NEB Transgen Thermo Transgen

AvrII + + + + + + + + + +

BamHI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

BglII + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EagI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EcoRI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EcoRV + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

HindIII + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

KpnI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

NcoI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

NdeI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

NheI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

NotI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

PstI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

PvuI + + + + + + + + + + + + + + + + + +

SacI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

SacII + + + + + + + + + +

SalI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

ScaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

SmaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

SpeI + + + + + + + + + +

SphI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

XbaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

XhoI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

XmaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

不同Buffer中酶活对比

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Star Activity R.Enzyme Trans NEB Thermo

BamHI N N N

BglII N N N

EagI N N N

EcoRI N N N

EcoRV N N N

HindIII N N N

NcoI N N N

NdeI N N N

NheI N N N

NotI N N Y

PstI N N N

SalI N N N

SmaI N N N

SphI N N N

XbaI N N N

XhoI N N N

XmaI N N N

除了Trans-NotI，其他酶在NEB CutSmart Buffer和Thermo Fast Digest Buffer中皆没有*号活性。 TR

ANSGEN

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基因定点突变

• 利用PCR实现点突变的传统方法

• Fast Mutagenesis System

• 多点突变简介 TRANSGEN

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• Fast Mutagenesis System是基于PCR原理实现点突变, 它们与传统方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选

• 筛选原理：降解甲基化质粒模板

• 筛选依据：

来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化；

PCR产物没有甲基化。

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筛选方法

体外切割： DpnI 识别序列5’-GmATC-3’(在 DNA序列中, 一般每256 bp 出现一次). 甲基

化模板可被 DpnI 识别、切割，而扩增产物 (发生突变的产物)不会被切割。

体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌(DH5α-T1，即 DMT)降解,

而扩增产物(发生突变的产物)不会被降解。

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Fast Mutagenesis System

♠ 引物部分重叠, 指数扩增.

♠ 两条引物上均有突变点, 高突变率.

♠ 双重筛选: DpnI 体外降解 + DMT体内降解.

PCR with

mutated primers DpnI Transformation

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TransGen:

Fast Mutagenesis System

• Fast Mutagenesis System：

使用FastPfu Fly酶——

扩增速度比Taq更快(4 kb/min)、保真性比Pfu更高(EasyPfu酶的6x), 扩增10 kb左右的质粒只需2个小时！

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Fast MultiSite Mutagenesis System

• 基于无缝连接原理的多点突变试剂盒。

• 本质仍然是无缝连接，只是在扩增片段时，在接头（即序列重叠区）引入突变位点。

• 将≤6个片段无缝拼接。

• 产品组成： 2×TransStart ® FastPfu PCR SuperMix 2×Assembly Mix DMT Enzyme DMT Compenent Cell ddH2O

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多点突变原理

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Summary TOPO载体的优点:简单，快速，高效；

EASY 克隆：片段，克隆反应，感受态细胞；

常见问题分析

无缝拼接基因克隆

内切酶

定点突变

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transgen · 2019. 9. 23. · 0 sec 302 nm ultraviolet light ±2.5 1.3 x 108 30 sec 302 nm...

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