Transgene Tiere:Genmodifikation in der Maus

Gentechnik und Genomics WiSe 2007/2008

Kristian M. Müller

Institut für Biologie III

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

Nobelpreis Physiologie und Medizin 2007

Positiv/Negativ-Selection

Homologe Rekombination

Herstellung eines Targeting Vektors und transformation

(Elektroporation) in ES Zellen

Gene targeting in Embryonalen Stamm (ES) Zellen

Herstellung der „Knockout“-Mäuse

Transfer der modifizierten ES Zellen in Blastocysten und Implantierung in

pseudoschwangere Leihmütter

Kreuzung der Chimäre, um reinerbige Linien zu erhalten

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Der Anfang: Embyonale Carcinoma (EC) Zellen

• Aus testikulärem Terato-Karzinomen einer bestimmten Mauszelline konnten Zellen gewonnen und kultiviert werden, die sich in viele Zelltypen differenzieren konnten.

• Diese Zellen werden als Embyonale Carcinoma (EC) Zellen bezeichent.

• Implantierung der EC Zellen in Balstocysten und Einsetzen derselben in Leihmütter ergab chimäre Kinder.

• Evans charakterisierte mit monoklonalen Antikörpern Oberflächenmoleküle der EC Zellen und definierte Marker der frühen Differenzierung.

• Auch aus gesunden Tieren konnten dann Zellen mit embryonalen Eigenschaften gewonnen werden.

Die ersten embryonalen Stammzellen in der Maus

Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6.

Embryonale Stammzellen verhalten sich wie EC Zellen und können Chimäre erzeugen.

Es Zellen könne in die Keimbahn eingehen

Bradley A, Evans M, Kaufman MH, Robertson E.Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.Nature. 1984 May 17-23;309(5965):255-6

ES Zellen könne mit einem rekombinanten Retrovirus infiziert und dann eingebaut werden

Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M.Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.Nature. 1986 Oct 2-8;323(6087):445-8

Lokaler Bezug: Gossler A, Doetschman T, Korn R, Serfling E, Kemler R. Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Dec;83(23):9065-9

Microinjektion der DNA (Capecchi)

Capecchi MR.High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.Cell. 1980 Nov;22(2 Pt 2):479-88.

Homologe Rekombination in

Eukaryonten

Folger KR, Wong EA, Wahl G, Capecchi MR.Patterns of integration of DNA microinjected into cultured mammalian cells: evidence for homologous recombination between injected plasmid DNA molecules.Mol Cell Biol. 1982 Nov;2(11):1372-87.

Gen Targeting und Korrektur eines Gens

Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR.High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome.Cell. 1986 Feb 14;44(3):419-28.

Homologe Rekombination (Smithies)

Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS.Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globinlocus by homologous recombination.Nature. 1985 Sep 19-25;317(6034):230-4.

Selektion der IntegrationMansour SL, Thomas KR, Capecchi MR.Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.Nature. 1988 Nov 24;336(6197):348-52.

Konditionaler Knockout: „Floxed“ Gene

(Bilder von Dr Eve Lutz, UK)

Genkonstrukt mit 3 loxPStellen wird durch homologe Rekombination in ES Zellen eingebaut

• Typ I Systemische Deletion -Knockout mit Elemination der Neo- und HSV-TK-Kassette (keine Beeinflussung der Expresssion)

• Typ II Konditioneller Knockout• Typ III ungewünschte Deletion,

Gegenselektion mit Ganciclovir

Kreuzung einer „floxed Gen“-Maus mit einer „Cre“-Maus

Kreuzung von floxed Gen und Cre tragende Mäusen erlaubt die Generierung Konditionaler Knockout-Mäuse

Cre kann unter einem induzierbaren Promotor angeschaltet werden (zeitliche Kontrolle). z.B. mit Tetrazyklin oder Tamoxifen Promotor

Cre kann unter einem Gewebespezifischen Promotor exprimiert werden (räumliche Kontrolle), z.B. T-Zellen (lckPromotor), Epithelien (Cytokeratin Promotor)