translocation des protéines
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PHYSIQUE CELLULAIRE- 4 -
TRANSLOCATION DES PROTÉINES
Jean-Pierre HENRY21 Mars 2008
Hypothèse de travail:
Au niveau : reticulum endoplasmique,mitochondries, bactéries, chloroplastes
la translocation est linéaire• La spécificité est donnée par une
préséquence (souvent clivée aprèstranslocation)
• La protéine (précurseur) passe linéairement• Le passage s’effectue au niveau d’un pore
aqueux
Description biochimique rapide:Mitochondrie
H+ADP ATP
H+
ATP synthase
Respiratorychain
Presequence
Importation mitochondriale:description biochimique (2)
• Importation post-traductionnelle: synthèsecytoplasmique sur polysomes
• Préséquence :– En N-terminal– Environ 20 résidus, avec résidus basiques et jamais acides
• La préséquence greffée en N-ter d’une protéinepassagère (DHFR) la dirige vers la mitochondrie
• Il existe des compartiments multiples : rôle de lapréséquence
Importation mitochondriale:description biochimique (3)
PrécurseurProtéineclivée
Mitochondries 0 + +
Protéinase K 0 0 +
• L’importation est signée par: i) la protection contre la protéinase K; ii) laperte de la préséquence
• L’importation requiert: i) de l’ATP mitochondrial et cytosolique; ii) un ΔΨ
Importation dans le reticulum endoplasmique:description biochimique rapide
•L’importation est co-traductionnelle•Elle nécessite une préséquence en N-ter (séquence leader), àcaractère essentiellement hydrophobe•La préséquence est généralement clivée après l’importation
LA TRANSLOCATION A LIEU ÀTRAVERS UN CANAL AQUEUX
Mise en évidence sur le reticulumendoplasmique
La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (1)
Principe: mettre une sondefluorescente à des endroitsdéfinis pour sonderl’environnement
• mARN de longueur définiepour avoir une protéineconnue (1)
• tARN lysine modifié sur NH2par NBD pour avoir unmarqueur à des positionsdéfinies (2)
• Analyse par temps de vie defluorescence (3)
Crawley et al, Cell(1994) 78, 461; Hamman
et al, Cell (1997) 89, 535
• la terminaison de lasynthèse requiert descodons spécifiques
• en leur absence, lachaîne reste attachée ausite P du ribosome
• l’élongation se fait parun tARN chargé par unacide aminé
• on peut modifier le NH2en position ε d’un tARNchargé par le NBD
Données biologiques
La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (2)
Résultats:• Ribosomes sans membrane:
– NBD dans l’eau– Accessible à KI (quencher)
• Ribosomes + Membrane– NBD dans l’eau– Accessible à KI après perméabilisation
(SLO), seulement si > 70 résidus– D’après la taille des quenchers, le
canal aurait 40 Å de diamètre
La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (3)
Conclusions;• La préséquence et la chaîne sont dans un
environnement aqueux, inaccessible à partir ducytoplasme
• Le ribosome et la membrane forment un canalcontinu
• Une longueur minimale est nécessaire pour émergerdu canal
Durant la translocation dans le reticulum, laprotéine est dans une conformation allongée (1)
• On utilise le même protocole:protéine de longueur variablefixée au ribosome (pas determinaison)
• On ajoute un site de N-glycosylation et on cherche lalongueur minimale permettant laglycosylation
• Comme témoin, on ajoute de lapuromycine: libération duribosome et glycosylation
RM: membrane de reticulum
Durant la translocation dans le reticulum, laprotéine est dans une conformation allongée (2)
Résultats:• La glycosylation nécessite 65
résidus entre le ribosome (siteP) et l’enzyme OST
• La microscopie électroniqueindique que cette distance estde 200 Å (ribosome 150 Å +membrane 50Å)
• Soit 200 Å/65 = 3,1 Å/résiduHélice α: 1,5 Å/résiduConformation étendue: 3,5 Å
MISE EN ÉVIDENCEÉLECTROPHYSIOLOGIQUE DU PORE
• Cas du reticulum• Cas de la mitochondrie
– Membrane externe : le PSC– (Membrane interne : TIM23)
Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (1)
• On utilise l’approche bicouches planes: mesure du courant entre 2compartiments à potentiel imposé
• On fusionne des microsomes (vésicules de reticulum rugueux) avec labicouche préformée
Simon and Blobel, Cell (1991) 65, 371
Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (2)
• A V = 0, après la fusion, aucun courant: le pore serait obstruépar les chaînes en croissance bloquées au site P
• La puromycine est une drogue qui force la terminaison: elleinduit le relargage des chaînes et libère le pore.
Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (3)
• Conductances mesurées après addition de 100 ou 0,3 µM depuromycine
• A 0,3 µM, on distingue des évènements quantiques, d’unevaleur unitaire d’environ 200 pS dans les conditions ioniquesutilisées (canal de grande taille)
Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (4)
• L’addition de KCl à 300mM de concentration finaledécroche les ribosomes dela membrane microsomiale
• On observe alors unefermeture du canal
LE SYSTÈME D’IMPORTATION DE LAMEMBRANE EXTERNE DE LA
MITOCHONDRIE (TOM)
Le « Peptide Sensitive Channel »PSC
La méthode d’observation initiale
Une autre méthode d’observation:le « dip-tip »
• Le bain contient des fragmentsmembranaires (vésicules) avecdes canaux; une monocouche seforme en surface
• Une pipette de patch-clamp estsortie du bain: formation d’unemonocouche à la pointe
• La pipette est rentrée dans lebain : apposition desmonocouches
Thieffry et al (1988) EMBO J ,7, 1449
• Activité rapide
• Canal de grande taille;220 pS
• Structure dimérique
• Faible sélectivitécationique
• Dépendance vis-à-visdu potentiel
Le PSC de mitochondries de corticosurrénales
Dépendance (/potentiel) de la probabilitéd’observation des 3 états
Etat 3 (dimère)
Etat 2 (monomère)
Etat 1 (fermé)
Caractéristiques du PSC
• Le PSC est présent sur toutes les mitochondriestestées
• Il peut prendre des formes différentes: chez la levure,il n’y a pas les fermetures longues
• Il est présent uniquement sur la membrane externedes mitochondries
• Il est observable par d’autres techniques comme lesbicouches planes ou le patch-clamp de vésiculesgéantes
Le PSC est inhibé par des peptides basiquescomme les préséquences mitochondriales
NOTRTGAECKQTMLTQRpRIHBYESNKGCIKRCIHPKIVHRKCNCKIReduced MCDYESYGGFLRRGFKVVTDynorphin B
PEPTIDES
YESMLSKLASLQTVAALRRGLRTSVASATSVATKKTE
(1-34) p-Ornithineaminotransferase
YESMLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRpL4(1-22)YESMLSLRQSIRFFKPATRpL4(1-16)
YESMLSLRQSIRFFKYpL4(1-12)YCyt c oxidase subunit4PRESEQUENCES
PSCINHIBITION
SEQUENCEPEPTIDES
Effet de préséquences sur le PSC de levure
• Le canal est observé parDip-tip, puis transféré dansun bain contenant le peptide
• (haut) Fermetures induitespar une préséquence de 16résidus; l’effet est maximal à+ 10 mV
• A - 50 mV, les fermeturessont plus nombreuses, maisleur durée est plus courte
• (bas) Durée des fermeturespour le peptide de 16 résiduset pour un peptide de 13résidus
Interprétation du blocage
• A V > 0, le peptide cationique estfaiblement attiré dans le canal :blocages peu nombreux
• Quand V diminue, le nombre maisaussi la durée des blocage augmentent
• A V = 10 mV, l’attraction est suffisantepour que le peptide franchisse le canal :la durée des blocages diminue
• A V < 0, le nombre des blocagescontinue à augmenter et leur durée àdiminuer
• Les peptides d’adressage passent àtravers le PSC
Les fermetures proviennent d’interactions avecdes peptides
• Le transfert d’un PSC de levure maintenu à - 30 mV dans un bain contenantune préséquence de 22 résidus montre des fermetures rapides (passage dupeptide) et après lavage, des fermetures longues, mimant le PSC demammifère
• L’opération peut être répétée : les « portes » ne sont pas covalentes
Schéma d’interprétation des fermetures du PSC
Trypsin
Cytosol
Intermembrane spacePSC
Presequence Modèle:
• le système detranslocation comportedes sites de liaison surles 2 faces
• Chez les mammifères,on isole le PSC avec despeptides-signal liés
• Ces peptides donnentdes fermetures
Energétique et vectorialité du transportmitochondrial
• Pour une protéine de la matrice, transport à travers 2 membranes; lessystèmes d’importation sont couplés de manière dynamique
• Des chaperons cytosoliques maintiennent la protéine déroulée à l’extérieur• Le potentiel facilite le passage de la préséquence• Des chaperons mitochondriaux capturent la protéine importée, biaisent le
mouvement brownien et facilitent la renaturation
Principe du cliquet brownien
• La chaîne déroulée est soumise aumouvement brownien au cours deson passage à travers le pore
• Dés leur translocation, lesséquences sont prises en chargepar des chaperons ou des enzymes
• Ces liaisons ou modificationsempêchent le retour de la chaîne etdonnent la directionalité
• Dans le reticulum, le ribosomepousse la chaîne synthétisée et elleest prise en charge en trans
Remarque: au niveau du reticulum, il existe aussi des protéines transportéespost-traductionnellement. Chez les bactéries, le mode post-traductionnel estdominant
Biochimie simplifiée des systèmesd’importation mitochondriaux
• Les 2 systèmes TOM et TIM ontété purifiés et reconstitués enmembrane
• Les activités « canal » de TOM etTIM sont portées par,respectivement, TOM40 et TIM23
• TOM purifié et reconstitué al’activité PSC (Kunkele et al(1998) J Biol Chem 273, 31032)
Vision biochimique plus complète
• TOM: le canal (TOM40, PSC)s’associe avec des récepteursdifférents selon la protéine etsa destination
• TIM: il existe un secondsystème, responsable del’insertion dans la membraneinterne
• TIM23: il existe tout unsystème ATP-dépendant pour« tirer » sur la protéine
Morphologie du système TOM purifié
• TOM purifié à partir de mitochondries de Neurospora• Présence de 2 dépressions avec des diamètres de 20 Â ,
compatibles avec la conductance du PSC• Le PSC, comme TOM, a une structure dimérique
Kunkele et al (1998) Cell, 93, 1009
UN SYSTÈME DE LA MEMBRANEINTERNE (TIM)
Activité canal de TIM23
Activité canal de TIM23
TIM23 (levure), purifié et reconstituéen bicouche, est un canal
• Grande taille (> 150 pS)• Cationique (sélectivité PK+/PCl- = 16)• Ouverture induite symétriquement
par le potentiel• Fermeture à temps longs
Truscott et al (2001) Nature Struc Biol, 8, 1074
Le canal de TIM23 est bloqué par despréséquences
• Activité testée par une rampede potentiel, milieuasymétrique en KCl (gradient x10, bicouches planes)
• L’addition de préséquence ducôté espace intermembranaire(KCl faible) entraîne unefermeture (a)
• Addition du côté matriciel, peud’effet (b)
Effet d’une préséquence et de TIM50
Activité de TIM23, bicouche plane, V =0, gradient de KCl
• TIM23 seul, courant dû au gradientde K+
• La partie soluble du partenaire TIM50présent dans l’espaceintermembranaire ferme le canal
• La présequence mise du même côtéavec TIM50 donne des ouverturesrapides
• L’activité canal est régulée par unpartenaire: ouvertures brèvespermettant le maintien du Δµ H+
Meinecke et al (2006) Science, 312, 1523
TRANSLOCATION DANS LERETICULUM ENDOPLASMIQUE
Rôle central de Sec61:• Trouvé dans les microsomes de chien et de levure• Homologue de SecY permettant la sécrétion des
protéines chez E coli• Possède des résidus hydrophiles dans des segments
transmembranaires
Rôle de Sec61: Biochimie
• Purification à partir des microsomes de chien– Solubilisation(digitonine) de membranes avec des
ribosomes– Détachement des ribosomes par la puromycine– Purification
• Membranes déplétées en Sec61: perte du transport;la reconstitution restaure le transport
• Purification des autres activités pour avoir le systèmeminimal
• Activité minimale : Sec61, Récepteur de SRP(SRPr),et , pour certaines protéines TRAM
Gorlich and Rapoport (1993) Cell, 615-630
DONNÉES STRUCTURALES
Structure atomique d’un analogue de Sec 61:Le canal de translocation des protéines d’une
Archeubactérie
Organisation générale
• Le complexe est équivalent à Sec61 ; 3 sous-unités: α avec 10 TM, β et γchacun 1 TM
• (à gauche) vue depuis le cytosol; (à droite) vue en coupe• (à gauche) forme générale d’un carré, limité sur 3 côtés par βγ• (à droite) partie importante dans la membrane; dans le cytosol, on trouve les
extrèmités et 2 boucles d’ancrage du ribosomeVan den berg et al (2004)Nature,427, 36
Pseudo-axe de symétrie
• Il y a un pseudo axe de symétrie dans le plan de la membrane• Les TM 1-5 et 6-10 occupent des positions symétriques• On distingue une face avant (à gauche) susceptible de s’ouvrir
Eléments importants de la structure
• En coupe, structure en sablier hydrophile au milieu de la membrane• Le TM2 a une structure originale: 2 demi-hélices avec TM2a fermant la
structure (plug)• TM2a pourrait se coller contre γ dans la forme ouverte• Au milieu de la membrane, rétrécissement (pore ring) de 20-25 Å à 5-8 Å;
anneau hydrophobe (presse-étoupe)
Vue synthétique
Le schéma met en évidenceles points importants:
• La structure en sablier• L’existence d’un anneau
central au niveau durétrécissement
• La présence d’unbouchon obstruant lepore central
• Le canal au repos estfermé
Le canal au repos est fermé (1)
• La protéine purifiée est inséréedans un dispositif debicouches planes (sanssolvant)
• Pas d’ouverture de canaux (onestime qu’il y a plus de 106
protéines dans la membrane)• Le contrôle est la membrane
seule• Le canal fermé est
imperméant aux ions et à H20
Saparov et al (2007) Mol Cell 26, 501
Le canal au repos est fermé (2)
• Des cystéines sont introduites en position 67 et 120• En présence de l’oxydant, un pont disulfure se
forme, qui bloque le canal dans la position ouverte• Avec le réducteur, re-fermeture.
Ouverture latérale du canal (1)
• La structure est capable de s’ouvrir sur sa face avant, entre TM2b et TM7: ily aurait une « respiration » du complexe
• La préséquence hydrophobe se collerait sur l’interface TM2b/TM7; pendantune ouverture; elle passerait dans la phase membranaire
Ouverture latérale du canal (2)
• Modélisation moléculaire(10-20 ns)
• L’ouverture nécessite uneforce de 2-3 nN
• Cette force estprincipalement due àl’interaction avec les lipides
• Durant l’ouverture, il n’y apas d’influx de lipides
• La relaxation est spontanée
Gumbart and Schulten(2007)Biochemistry 46, 11147
Schéma de translocation des protéinessolubles (1)
• La préséquence (hydrophobe) selie à l’interface TM2/7, à l’avant
• La structure s’ouvre mettant lapréséquence dans les lipides
• Ce mécanisme déclenche lemouvement de TM2a et l’ouverturedu pore
• La préséquence est clivée et lachaîne rentre dans la lumière
• Le pore se referme
Schéma de translocation des protéinessolubles (2); dynamique moléculaire
Le peptide (bleu) est (Ala)10
Gumbart and Schulten (2006) Biophys J, 90, 2356
INSERTION DES PROTÉINESMEMBRANAIRES
Rôle de Sec61
Insertion des protéines membranaires
• Le système Sec61 joue un rôle important dansl’insertion des protéines membranaires en hélice α
• Le segment transmembranaire joue le rôle deséquence-signal nonclivée
• Dans le cas des protéines polytopiques (plusieurssegments transmembranaires), l’insertion se faitsegment transmembranaire après segmenttransmembranaire
Sec61 et l’insertion des protéines membranaires
• La séquence-signal pourrait se fixer sur le site hydrophobe dans les 2orientations (selon la séquence)
• Si la séquence n’est pas clivée, on aura une insertion selon les 2orientations
• Dans les 2 cas, la chaîne doit sortir du canal ribosomial
Sec61 et l’insertion des protéines membranairesprotéines polytopiques
• Les séquences TM àinsérer servent deséquence-signalinternes non clivées
• A chaque fois, on doitavoir l’ouverture ducomplexe Sec61 etl’ouverture du canalribosomial