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Trasduzione dei segnali del TCR
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014
TCR: trasduzione del segnale
• I segnali trasdotti dal TCR inducono l’espressione
coordinata di numerosi geni (silenti nelle cellule naive)
– proliferazione
– differenziamento
– funzioni effettrici
• La trasduzione del segnale del TCR è indotta dalla
stimolazione di più recettori per l’antigene e corecettori
• Il risultato del riconoscimento dell’antigene è
determinato dalla durata e dalla affinità dell’interazione
TCR-complesso peptide MHC
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Gli eventi precoci in risposta al riconoscimento dell’antigene
comportano il raggruppamento di diversi recettori di
membrana, la fosforilazione in tirosina di numerose proteine e
il reclutamento di molecole adattatrici
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I segnali indotti dal recettore per l’antigene attivano
diverse vie di trasduzione
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Eventi di trasduzione del segnale
• attivazione tirosine chinasi/fosfatasi
• coinvolgimento di molecole adattatrici
• generazione di secondi messaggeri – DAG, IP3, Ca2+, cAMP, cGMP
• amplificazione attraverso cascate di enzimi
• attivazione di serina/treonina chinasi/fosfatasi
• attivazione di fattori di trascrizione
• attivazione trascrizione di geni
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• TCR ha una bassa affinità per complessi MHC-peptide – Kd 10-5-10-7 M
– Off rate veloce
• Singoli TCR inducono un segnale debole
• Poche delle molecole MHC espresse da APC presentano peptide riconoscibile da un determinato TCR
• Solo 10-100 complessi MHC-peptide (in un totale di 104-105) necessitano di essere riconosciuti da TCR per indurre attivazione
• Lo stesso TCR può essere attivato più volte
• L’intero processo può durare ore
TCR: trasduzione del segnale
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• Questa prolungata interazione è permessa dalla costituzione della SINAPSI IMMUNOLOGICA nell’area di contatto tra cellula T e APC
• Il raggruppamento di raft è un evento necessario per la formazione della IS
• A seguito di stimolazione TCR monomerici vengono reclutati in raft e formano dei cluster
• Anche molecole adattatrici e di trasduzione del segnale sono reclutate nei raft (ZAP70, Vav, Grb2)
“Sinapsi Immunologica”
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I raft
• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1
• Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale – che sono reclutate nei raft attraverso modifiche post-
traduzionali • aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn
• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras
• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR
• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’IS
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Linfocita T non stimolato
Stimolazione TCR
Stimolazione TCR e CD28
La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i
raft verso il sito di contatto
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• Inizialmente cellula T e APC interagiscono attraverso molecole di adesione
– LFA-1 ICAM
• In questa fase TCR controlla complessi MHC-peptide
– se non riconosce complessi, l’interazione cellula T-APC cessa
• Se TCR riconosce complessi MHC-peptide invia segnale:
– aumento affinità LFA-1 → stabilizzazione interazione
– arresto migrazione (segnale di stop), ritiro uropode
• meccanismo che ritiene cellule T in organi linfatici secondari
Sinapsi Immunologica (3)
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Ruolo di integrine e TCR in
interazione cellule T - APC
TCR non riconosce
complesso Ag-MHC
Dissociazione
APC cellula T
TCR riconosce
Complesso Ag-MHC
Forte adesione
APC cellula T Risposta
funzionale
Adesione debole
Indipendente da Ag
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• Stimolazione di TCR e LFA-1 induce polarizzazione cellula T in direzione della APC
• Riorganizzazione citoscheletro – filamenti di actina e talina sono reclutati nei pressi della IS
– MTOC (MicroTubule Organising Center) si sposta dall’uropode a IS
– questi eventi favoriscono il reclutamento di recettori e molecole di trasduzione alla IS
• LFA-1 migra verso la porzione esterna dello SMAC mentre i TCR muovono al centro – il blocco nella formazione di questo cluster centrale blocca
l’attivazione dei linfociti T
• La riorganizzazione è in parte condizionata dalle dimensioni dei complessi recettori-ligandi
Sinapsi Immunologica (4)
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MHC B7 ICAM
CD58 ICAM
CD2 TCR CD28 LFA-1 LFA-1
15 nm
Linfocita T
APC
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Supra-Molecular Activation Cluster
LFA-1 TCR
cSMAC
pSMAC
Overlay CD28
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A seguito di attivazione
PKCq è reclutata nella IS
A seguito di attivazione
CD45 non è reclutata nella IS
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Complesso del TCR
• CD3
– catene g, d, e
• omologhe l’una con l’altra
• singolo dominio Ig
– 1 eterodimero e/d
– 1 eterodimero g/e
• catena z
– omodimero z/z
• in 90% CD3
– eterodimero z/h
• in 10% CD3
• h splicing alternativo z
• le catene z sono associate
anche ad altri recettori
• durante la maturazione dei timociti le
proteine del CD3 e z sono espresse
prima del TCR ma saranno presenti
sulla membrana cellulare solo dopo il
corretto assemblaggio con le catene
a/b del TCR
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Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
ITAM
• ITAM: Tyr-x-x-Leuxxxxxx(xx)Tyr-x-x-Leu
• 1 ITAM in catene g, d, e
• 3 ITAM in catene z
• Le sequenze ITAM del CD3/catene z collegano funzionalmente il riconoscimento dell’antigene avvenuto con il TCR alla trasduzione del segnale
ITAM in altre molecole
ITAM
• La fosforilazione delle ITAM del CD3 e delle catene z avviene pochi secondi dopo la stimolazione del TCR
• Due famiglie di PTK fosforilano e interagiscono con le ITAM – Src e Syk
• Inibitori delle PTK inibiscono gli effetti della stimolazione del TCR
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TCR CD4
Membrana cellulare
linfocita T
Membrana cellulare
APC
Il corecettore CD4
• Composto da 1 catena
• 4 domini Ig extracellulari
• riconosce dominio b2 di MHC II
• CD4 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica
• Topi KO per CD4 non hanno linfociti T ristretti da MHC II
– se transfettati con CD4 normale sviluppano linfociti T ristretti da MHC II
– se transfettati con CD4 privo del sito di legame per p56lck mancano di linfociti T ristretti da MHC II
• Espresso da timociti, linfociti Tab periferici (ca. 65%), alcune cellule dendritiche
MHC II
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Il corecettore CD8
• Composto da 2 catene legate da ponte disolfuro
– eterodimero CD8a/CD8b
– omodimero CD8a/CD8a
• 1 dominio Ig extracellulare/catena
• riconosce dominio a3 di MHC I
• CD8 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica
• Topi KO per CD8 non hanno linfociti T ristretti da MHC I
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La Src chinasi p56lck
• “Unique”, sequenza caratteristica della famiglia, lega CD4 e
CD8
• SH3, lega sequenze specifiche ricche in prolina
• SH2, lega P-Tyr all’interno di specifiche sequenze
• Kinase, dominio catalitico
• R, dominio regolatorio
N-terminale C-terminale
Unique SH3 SH2 Kinase R
Y Y
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Dominio SH2
• SH2, Src Homology 2
• Dominio proteico
strutturalmente conservato
contenuto in Src ed altre
proteine che trasducono
segnali
• SH2 lega residui di Tyr
fosforilati nel contesto di
specifcihe sequenze
peptidiche
NH2
COOH
Dominio SH2 di p56 Lck
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L’attività catalitica di Lck è regolata da
cambiamenti conformazionali
• Fosforilazione di Y in dominio catalitico induce cambiamento conformazionale che permette accesso del substrato
• La fosforilazione della Tyr nel dominio regolatorio induce una conformazione chiusa – SH2 interagisce con il C-terminale
SH3
SH2
Dominio catalitico Dominio regolatorio Y
Y P
Y
Y P Y Stimolazione TCR
PTPase
CD45
Csk
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La Syk chinasi ZAP-70
• z chain-associated protein 70
• Espressa esclusivamente in linfociti T e NK
• 2 domini SH2 legano ITAM fosforilate con affinità elevata
• La fosforilazione di Y292 ad opera della stessa ZAP-70 inibisce l’attività catalitica
– autoregolazione negativa
• La fosforilazione di Y493 nel dominio catalitico attiva l’enzima
– Y493 fosforilata da p56lck
N-terminale C-terminale
493 292
SH2 Kinase SH2
Y Y
• ZAP-70 si lega alle ITAM fosforilate attraverso 2 domini SH2
ZAP
• p56lck fosforila le ITAM di CD3 e z
• p56lck fosforila Y493 di ZAP-70
• CD4 avvicina Lck a TCR-CD3
• MHCII-Ag, TCR e CD4 interagiscono
CD4
MHCII-Ag
TCR
CD3
zz
TCR
CD3
CD4
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LAT, Linker for Activation of T cells (1)
• Molecola adattatrice che permette di reclutare enzimi e altri adattatori
• Permette l’attivazione di almeno3 vie di trasduzione
– Ras Raf Mek Erk Elk Fos
– SLP76 Vav Rac Mekk JNK Jun
– PLCg1
• IP3 Ca2+
• DAG PKC
• Localizzato nei raft attraverso modifica post-traduzionale (palmitoilazione)
• Viene fosforilato da ZAP70
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• In assenza di LAT molti degli eventi indotti dalla trasduzione del segnale del TCR sono compromessi:
– flusso di calcio
– attivazione ERK e altre MAP chinasi
– attivazione NF-AT
– attivazione AP-1
– produzione IL-2
• LAT è richiesto anche per lo sviluppo dei linfociti T nel timo
• Topi LATKO non producono cellule T mature
LAT, Linker for Activation of T cells (2)
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CD3
abTCR CD4
PIP2
DG
IP3
LA
T
PKCq
PL
C
LAT PLCg1
lck
ZAP
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ZAP lck
CD3
abTCR
PL
C
CD4
PIP2 DG
IP3
LA
T
Ca2+
PKCq
CRAC
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ras
Attivazione
fattori
trascrizione
LATPLCg1Ca2+
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L’aumento di Ca2+ libero
intracitoplasmatico è transiente
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CD3
abTCR CD4
LA
T lck
ZAP
LATSOSRasMAP chinasi
Grb2
Sos
Shc
Raf
MEK
ERK Attivazione
fattori
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CD3
abTCR CD4
LA
T
PL
C
lck
ZAP
vav
CD28
LAT SLP76 VAV
Attivazione
fattori
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Attivazione fattori di trascrizione
• De novo sintesi
– c-Fos
• componente di AP-1
• trascrizione indotta da stimolazione TCR
• Assemblaggio
– dimerizzazione STAT
• fosforilazione da parte di Jak
• Modificazioni covalenti
• Localizzazione
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Attivazione di fattori trascrizione U
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013/2
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Famiglia NFkB
• Primo sito di legame individuato in gene catena
leggera k
• Presente come dimero
– omodimero
– eterodimero
• rel homology domain (RHD)
• Membri di NFkB espressi in tutte le cellule
– RelB espresso in linfociti e poche altre cellule
• In cellule quiescenti dimeri NFkB sono legati a
inibitori di kb (IkB)
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Famiglia c-Rel/NF-kB
RelA
c-Rel
RelB
P105/p50
P100/p52
NFkB1
NFkB2
p65
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Famiglia I-kB
IkBa
BCL3
IkBb
IkBe
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NF-kB Induttori dell’attivazione di NF-kB
TCR/CD28
TNFa, IL-1
LPS
Mitogeni
dsRNA
H2O2
Nitric Oxide
…
Geni inducibili da NF-kB
(coinvolti in risposte immunitarie)
TNFa, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12…
IL2Ra
ICAM-1, VCAM-1, E-selectin…
MHC classe I e II
…
IkBa P P Ub Ub
IKK
p50 RelA
IkBa p50 RelA
IkBa P P
P P Ub Ub
fosforilazione
poliubiquitinazione
trascrizione p50 RelA
NLS
degradazione (proteasoma)
p50 RelA
Ub
Ub Ub Ub Ub Ub
RelA
IkBa
p50
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• IKK, IkB Kinase
– IKKa, IKKb
• attività chinasica
– IKKg
• attività regolatoria
• NEMO
– NFkB essential
modulator
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Cinetica di espressione in
linfociti stimolati da antigene
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• Geni immediati
• c-fos, c-jun, nf-at, c-myc, nf-kb < 30’
• Geni precoci
• IFNg < 1h
• IL-3, IL-2Ra 1-2 h
• IL-6 4-6 h
• GM-CSF 20 h
• Geni tardivi
• VLA-4 4 g
• VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-5 7-14 g
Geni espressi dopo attivazione
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