trichoderma harzianum rifai...

131
(1) การคัดเลือก กลไกการเป็นปฏิปักษ์และการประยุกต์ใช้เชื ้อรา Trichoderma harzianum Rifai เพื ่อควบคุมโรครากขาวของยางพารา Screening, Antagonistic Mechanisms and Applications of Trichoderma harzianum Rifai to Control White Root Disease of Rubber Trees พรทิพย์ แย้มสุวรรณ Porntip Yamsuwan วิทยานิพนธ์นี้เป็ นส่วนหนึ ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญา วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาโรคพืชวิทยา มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Plant Pathology Prince of Songkla University 2557 ลิขสิทธิ ์ของมหาวิทยาลัยสงขลานครินทร

Upload: others

Post on 07-Jul-2020

2 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(1)

การคดเลอก กลไกการเปนปฏปกษและการประยกตใชเชอรา Trichoderma harzianum Rifai เพอควบคมโรครากขาวของยางพารา

Screening, Antagonistic Mechanisms and Applications of Trichoderma harzianum Rifai to Control White Root Disease of Rubber Trees

พรทพย แยมสวรรณ Porntip Yamsuwan

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Master of Science in Plant Pathology Prince of Songkla University

2557 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

Page 2: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(2)

ชอวทยานพนธ การคด เลอก กลไกการเปนปฏปกษและการประยกต ใ ช เ ช อ รา Trichoderma harzianum Rifai เพอควบคมโรครากขาวของยางพารา

ผเขยน นางสาวพรทพย แยมสวรรณ สาขาวชา โรคพชวทยา

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร อนมตใหนบวทยานพนธฉบบน เปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา

………………………………………. (รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ)

คณบดบณฑตวทยาลย

อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม

….…………………………………….. (ดร.ปฏมาพร ปลอดภย)

อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก

…………………………………………. (รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน)

คณะกรรมการสอบ

.……………………………….ประธานกรรมการ (ดร.ชนนนท พรสรยา)

…………………….............................กรรมการ (ดร.ภวกา บณยพพฒน)

….………………................................กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร. วสนณ เพชรรตน)

…………………….............................กรรมการ (ผชวยศาสตราจารยเสมอใจ ชนจตต) ..……..…………….............................กรรมการ (ดร.ปฏมาพร ปลอดภย)

อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม

………………………………………… (ผชวยศาสตราจารยเสมอใจ ชนจตต)

Page 3: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(3)

ขอรบรองวา ผลงานวจยนเปนผลมาจากการศกษาวจยของนกศกษาเอง และขอแสดงความขอบคณบคคลทมสวนเกยวของ

ลงชอ…………………………………… (รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน) อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

ลงชอ…………………………………… (นางสาวพรทพย แยมสวรรณ)

นกศกษา

Page 4: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(4)

ขอรบรองวา ผลงานวจยนไมเคยเปนสวนหนงในการอนมตปรญญาในระดบใดมากอน และไมไดถกใชในการยนขออนมตปรญญาในขณะน

ลงชอ…………………………………… (นางสาวพรทพย แยมสวรรณ)

นกศกษา

Page 5: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(5)

ชอวทยานพนธ การคดเลอก กลไกการเปนปฏปกษและการประยกตใ ชเ ช อ รา Trichoderma harzianum Rifai เพอควบคมโรครากขาวของยางพารา

ผเขยน นางสาว พรทพย แยมสวรรณ

สาขาวชา โรคพชวทยา

ปการศกษา 2556

บทคดยอ

การคดเลอก และศกษากลไกการเปนปฏปกษและการประยกตใ ชเช อรา

Trichoderma spp. ในการควบคมโรครากขาวของยางพารา โดยแยกเชอรา Trichoderma spp. จากดนบรเวณรากตนยางพารา 86 ตวอยาง ไดเชอรา 356 ไอโซเลท ทดสอบประสทธภาพในการควบคมเชอรา Rigidoporus microporus ดวยวธ dual culture plate พบวา เชอรา Trichoderma spp. ChM1.1 และ NL2.2 จ านวน 2 ไอโซเลท มประสทธภาพสงสด จงจ าแนกชนดโดยการศกษาลกษณะทางสณฐานวทยา สรรวทยา และชวโมเลกล จ าแนกไดคอ เชอรา T. harzianum จากการศกษากบกลไกการเปนปฏปกษของเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ตอเชอรา R. microporus พบวา เชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 แกงแยงสารอาหาร และพนทของเชอรา R. microporus เมอเลยงรวมกนเสนใยของเชอรา T. harzianum เปนปรสตตอเชอรา R. microporus เมอศกษาภายใตกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ผลตเอนไซม chitinase ท าลายผนงเซลลของเชอรา R. microporus ผลตสารอนทรยระเหย และไมระเหยยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ซงเมอวเคราะหสารประกอบอนทรยระเหยของเชอรา Trichoderma harzianum ทง 2 ไอโซเลท โดย Gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS) พบวา สารระเหยหลกของ เชอรา T. harzianum ChM1.1 อยในกลมแอลกอฮอล ขณะทเชอรา T. harzianum NL2.2 เปนกลมแอลกอฮอล และสารปฏชวนะ นอกจากนเมอทดสอบประสทธภาพเบองตนของน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 พบวา เชอรา T. harzianum ChM1.1 สามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus แตน าเลยงเชอรา T. harzianum NL2.2 ไมสามารถยบยงไดจงสกดสารจากน าเลยงเชอของเชอรา T. harzianum ChM1.1 เมอทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทยบยง และความเขมขนต าสดทฆาเชอรา R. microporus เทากบ 500 และ1,000 mgml-1 ตามล าดบ และผลการทดสอบดวยวธ bioautography บนแผน Thin-layer chromatography

Page 6: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(6)

พบวา สารทมฤทธตานเชอรามคา Rf อยในชวง 0.22-0.4 เมอวเคราะหสารประกอบอนทรยทไมระเหย ของเชอรา T. harzianum ChM1.1 โดย GC-MS พบวา เปนสารกลมแอลกอฮอล และสารปฏชวนะ

การเตรยมสตรส าเรจชนดแกรนล และผงจากสปอรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ทดสอบความมชวตรอด และประสทธภาพของสตรส าเรจทงสอง พบวา ลดลงเพยงเลกนอยในชวง 6 เดอนของการเกบรกษา และจากนนน าสตรส าเรจชนดแกรนล 1 เปอรเซนต มาเพมปรมาณในมลไก มลวว และป ยอนทรย (ซพ หมอดน) บมเปนเวลา 15 วน พบวา เมอนบจ านวนโคโลนตอกรม ตงแตเรมตน ถง 15 วน พบวา เชอรา T. harzianum NL2.2 เจรญดในป ยอนทรย เมอน ามาใชในการควบคมโรครากขาวของยางพาราในสภาพเรอนกระจกผลการศกษา พบวา ทกกรรมวธมประสทธภาพในการควบคมโรครากขาวแตกตางทางสถตอยางมนยส าคญกบชดควบคม

Page 7: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(7)

Thesis Title Screening, Antagonistic Mechanisms and Applications of Trichoderma harzianum Rifai to Control White Root Disease of Rubber Trees

Author Miss Porntip Yamsuwan Major Program Plant Pathology Academic Year 2013

ABSTRACT

Screening, antagonistic mechanisms and applications of Trichoderma spp. to control white root disease of rubber trees were studied. A total of 356 Trichoderma spp. isolates were isolated from 86 rhizosphere soil samples of rubber trees. All isolates were screened for their ability to control Rigidoporus microporus in dual culture plates. Two promising isolates, ChM1.1 and NL2.2 were selected and were later identified as T. harzianum by morphological, physiological and molecular studies. In Vitro study on biocontrol mechanisms of T. harzianum ChM1.1 and NL2.2 against R. microporus revealed that both isolates compete for nutrients and space on dual culture plates, hypha of T. harzianum parasitize R. microporus, which was observed under scanning electron microscope (SEM), produced chitinase which can degrade the R. microporus cell wall, produced volatile and non-volatile organic compounds that inhibit R. microporus mycelial growth. Volatile organic compounds (VOCs) of each T. harzianum isolate was analysed by gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS). The main VOCs of T. harzianum ChM1.1 was a compound class of alcohol, while T. harzianum NL2.2 was alcohol and antibiotic groups. From preliminary testing, culture filtrate of T. harzianum ChM1.1 inhibited R. microporus mycelial growth but T. harzianum NL2.2 did not. Hence, the crude extract of T. harzianum ChM1.1 was prepared and studied. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) of the extract in inhibiting R. microporus mycelial growth were 500 and 1000 mgml-1, respectively. Bioautography assay on Thin-layer

Page 8: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(8)

chromatography with R. microporus displayed high antifungal activity with Rf value of 0.22-0.44. The analysis of non-volatile organic compounds of T. harzianum ChM1.1 in crude by GC-MS showed that it was the compound classes of alcohol and antibiotics.

Spores of T. harzianum NL2.2 were prepared and formulated into granules and powder. Viability of spores and efficacy of both products slightly decreased during six months of storage. One percent of granule formulate was applied onto chicken and cow manure and organic fertilizer (CP Mordin) and incubated for 15 days. Enumerating the colony forming unit of T. harzianum indicated that organic fertilizer supported good growth of T. harzianum NL2.2. This organic fertilizer containing T. harzianum was applied to control white root disease of rubber trees in greenhouse conditions. The result revealed that it was effective to suppress the disease and significantly different from the control treatment.

Page 9: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(10)

สารบญ

สารบญ หนา บทคดยอ (5) Abstract (7) กตตกรรมประกาศ (9) สารบญ (10) รายการตาราง (11) รายการตารางภาคผนวก (12) รายการภาพ (15) บทท

1. บทน า บทน าตนเรอง 1 ตรวจเอกสาร 2 วตถประสงค 19

2. วสดอปกรณ และวธการ วสดอปกรณ 20 วธการวจย 23

3. ผล และวจารณผลการทดลอง 37 4. สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ 74

เอกสารอางอง 77 ภาคผนวก 86 ประวตผ เขยน 116

Page 10: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(11)

รายการตาราง

ตารางท หนา 1 ตวอยางสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma spp. ทผลตในเชงการคา 15 2 สวนประกอบของสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp. 31 3 การเจรญของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 44

บนอาหารเลยงเชอ PDA ท pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน 4 การเจรญของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 47

บนอาหารเลยงเชอ PDA ทอณหภมตาง ๆ หลงการบม เปนเวลา 2 วน 5 ปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ 62

หลงการผลต เปนเวลา 24 ชวโมง 6 ปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ 64

หลงจากการเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน 7 เปอรเซนตการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus 65

ในสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 หลงจากการเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน

8 การยบยงการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus 69 ในดนปลก หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

9 ประสทธภาพของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 72 ในการควบคมโรครากขาวของตนกลายางพาราในเรอนกระจก หลงการทดสอบ เปนเวลา 4 เดอน

Page 11: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(12)

รายการตารางภาคผนวก

ตารางภาคผนวกท หนา 1 รหสของเชอรา Trichoderma spp. ทแยกจากตวอยางดน 91

จ านวน 86 ตวอยาง ดวยวธ dilution spread plate บนอาหาร TSM

2 เปอรเซนตการยบยงการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus 95

โดยเชอรา Trichoderma spp. 3 ประสทธภาพของสารระเหยของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 99

และ NL2.2 ตอการยบยงการเจรญเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus หลงบมการทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

4 องคประกอบสารระเหยทสกดไดจากเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 100

5 องคประกอบสารระเหยทสกดไดจากเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 102

6 องคประกอบของสารทสกดไดจากเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 105

7 ปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญในป ยชนดตาง ๆ 106 หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 0, 5, 10 และ 15 วน

8 ปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญในป ยอนทรย 107

ซงความชนทแตกตางกน หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 15 วน

9 วเคราะหความแปรปรวนความสามารถในการเจรญของ 108 เชอรา Trichoderma harziamum ChM1.1 ท pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

10 วเคราะหความแปรปรวนความสามารถในการเจรญของ 108

เชอรา Trichoderma harziamum NL2.2 ท pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

11 วเคราะหความแปรปรวนความสามารถในการเจรญของ 109 เชอรา Trichoderma harziamum ChM1.1 ทอณหภมตาง ๆ หลงการบม เปนเวลา 2 วน

12 วเคราะหความแปรปรวนความสามารถในการเจรญของ 109

เชอรา Trichoderma harziamum NL2.2 ทอณหภมตาง ๆ หลงการบม เปนเวลา 2 วน

Page 12: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(13)

รายการตารางภาคผนวก (ตอ)

ตารางภาคผนวกท หนา 13 วเคราะหความแปรปรวนประสทธภาพของสารระเหยของ 110

เชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 ตอการยบยงการเจรญเสนใย เชอรา Rigidoporus microporus หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

14 วเคราะหความแปรปรวนประสทธภาพของสารระเหยของ 110

เชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ตอการยบยงการเจรญเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

15 วเคราะหความแปรปรวนปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 110 ในสตรส าเรจหลงการผลต เปนเวลา 24 ชวโมง

16 วเคราะหความแปรปรวนปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 111 ในสตรส าเรจ หลงจากเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน

17 วเคราะหความแปรปรวนเปอรเซนตการยบยงการเจรญของเสนใย 111 เชอรา Rigidoporus microporus โดย สตรส าเรจของ เชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 หลงจากการเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน

18 วเคราะหความแปรปรวนปรมาณของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2. 112 ทเจรญในป ยชนดตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 15 วน

19 วเคราะหความแปรปรวนปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 112

ทเจรญในป ยอนทรย ซงความชนทแตกตางกน หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 15 วน

20 วเคราะหความแปรปรวนการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus 112

ในดนปลก หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

21 วเคราะหความแปรปรวนเปอรเซนตลดการเกดโรคของเชอรา 113

Trichoderma harzianum NL2.2 ในดนปลก หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

22 วเคราะหความแปรปรวนดชนการเกดโรครากขาวของตนกลายางพารา 113 ในเรอนกระจก หลงการทดสอบ เปนเวลา 4 เดอน

Page 13: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(14)

รายการตารางภาคผนวก (ตอ)

ตารางภาคผนวกท หนา 23 วเคราะหความแปรปรวนเปอรเซนตลดการเกดโรครากขาวของตนกลายางพารา 113

ในเรอนกระจก หลงการทดสอบ เปนเวลา 4 เดอน

Page 14: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(15)

รายการภาพ

ภาพท หนา 1 การวางเลยงเชอเพอทดสอบประสทธภาพสารระเหยของเชอรา Trichoderma spp. 28

ตอการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus 2 ลกษณะฝาขวดดแรนดดแปลง โดยเจาะฝาขวดใสจกยางแทน 29

เพอสามารถแทงเขมฉดของเครอง GC-MS

3 โคโลนของเชอรา Trichoderma spp. บนอาหารเลยงเชอ TSM 37

หลงการแยกเชอดวยวธ dilution spread plate ทความเขมขนของดน 10-4 เปนเวลา 7 วน

4 โคโลนของเชอรา Trichoderma spp. และเชอรา Rigidoporus microporus 39

บนอาหารเลยงเชอ PDA เมอทดสอบดวยวธ dual culture plate หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

5 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอรา Trichoderma harziamum ChM1.1 41

6 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอรา Trichoderma harziamum NL2.2 42

7 ขนาด PCR products ของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 43

เมอเปรยบเทยบกบ Markers (100 bp ladder) 8 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 บนอาหารเลยงเชอ PDA 45

ทมระดบ pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

9 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 บนอาหารเลยงเชอ PDA 46

ทมระดบ pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

10 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 บนอาหารเลยงเชอ PDA 48 หลงการบมทอณหภมตาง ๆ เปนเวลา 2 วน

11 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 บนอาหารเลยงเชอ PDA 49

หลงการบมทอณหภมตาง ๆ เปนเวลา 2 วน

12 เสนใยเชอรา Rigidoporus microporus แสดงอาการเหยว เกดรพรน และฉกขาด 51

เมอวางเลยงรวมกบเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

Page 15: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(16)

รายการภาพ (ตอ)

ภาพท หนา 13 ลกษณะการสรางวงใสทเกดจากการยอย substrate โดยเอนไซม chitinase 53

บนอาหารเลยงเชอ PDA ทผสม colloidal chitin 2.4 เปอรเซนต หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

14 ประสทธภาพของสารระเหยของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 55

และ NL2.2 ตอเชอรา Rigidoporus microporus หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

15 Total ion chromatrogram ของสารระเหยทสกดไดจาก 56

เชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1

16 Total ion chromatrogram ของสารระเหยทสกดไดจาก 57 เชอรา Trichoderma harzianum NL2.2

17 บรเวณยบยงเชอรา Rigidoporus microporus เมอทดสอบ 59

ดวยวธ Thin-layer chromatography bioautography บนแผน TLC หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน

18 Total ion chromatrogram ของสารทสกดไดจากเชอรา Trichoderma harzianum 60 ChM1.1

19 ลกษณะของสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 61 20 โคโลนเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 บนอาหาร TSM 62

หลงน าสตรส าเรจชนดแกรนล หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

21 จ านวนประชากรของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในป ยชนดตาง ๆ 66 ทนงและไมนงฆาเชอ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 0, 5, 10 และ 15 วน

22 ลกษณะของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญบนป ยอนทรย 67 นงฆาเชอ

23 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญในป ยอนทรย 67

และเชอรา Rigidoporus microporus บนอาหารเลยงเชอ PDA เมอทดสอบดวยวธ dual culture plate หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

Page 16: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

(17)

รายการภาพ (ตอ) ภาพท หนา

24 การยบยงการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus ในดนปลก 70

หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

25 พมใบและรากของตนกลายางพาราหลงทดสอบประสทธภาพของสตรส าเรจ 73

Trichoderma harzianum NL2.2 ในป ยอนทรย ตอการยบยง เชอรา Rigidoporus microporus สาเหตโรครากขาวของยางพาราในเรอนกระจก หลงการทดสอบ เปนเวลา 4 เดอน

Page 17: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

1

บทท 1 บทน ำ

บทน ำตนเรอง ยางพารา (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) เปนพชเศรษฐกจทส าคญของประเทศไทย และภมภาคอาเซยน โดยประเทศไทยเปนผน าในการผลต และสงออกยางธรรมชาตมากทสดในโลก โดยมพนทปลก 18.76 ลานไร ซงเปนพนทปลกทางภาคใตมากทสด รองลงมาเปนภาคตะวนออกเฉยงเหนอ ภาคตะวนออก ภาคกลาง และภาคเหนอตามล าดบ สามารถสรางรายไดใหกบเกษตรกรชาวสวนยางเปนอยางมาก (สถาบนวจยยาง, 2555) แตมปจจยทท าใหผลผลตของยางพาราลดลงเปนอยางมาก คอ โรครากขาวซงเกดจากการเขาท าลายของเชอรา Rigidoporus microporus (Sw.) Overeem (Syn. Rigidoporus lignosus (Klotzsch) Imazeki) ซงท าความเสยหายรนแรงใหกบยางพารา พงษเทพ ขจรไชยกล (2523) ไดส ารวจโรครากขาวในสวนยางสงเคราะหในจงหวดกระบ นราธวาส ปตตาน และยะลา พบวา ตนยางใหมเปนโรครากขาว 12-17 เปอรเซนต และจากการส ารวจพนทเสยหายของภาคใตตอนบน และตอนลางในป 2551-2553 พบวาภาคใตตอนบนมพนทเสยหายจากโรครากขาวทงหมด 1,929 ไร จากพนทส ารวจทงหมด 56,296 ไร คาดวาท าความเสยหายเปนมลคาไมนอยกวา 1,600 ลานบาท (อารมณ โรจนสจตร และคณะ, 2553)

เชอรา R. microporus สามารถเขาท าลายระบบรากของตนยางพารา ท าใหเนอเยอบรเวณรากเกดความเสยหายสงผลกระทบตอกระบวนการดดน า อาหารของยางพารา ซงเปนปจจยในการสงเคราะหแสง ท าใหตนยางพาราแสดงอาการใบเหลอง รวง และยนตนตาย ผวรากมเสนใยสขาวปกคลมจบตวกนแนน ( rhizomorph) เมออายมากขนมลกษณะกลมนนเปลยนเปนสเหลอง และสน าตาล และยนตนตายในทสด เนอไมของรากทเปนโรคมสครม ยย และเบา หากอยในทชนแฉะจะออนนม ในฤดฝนมกพบดอกเหดบรเวณโคนตนทเปนโรค (กรมวชาการเกษตร, 2555) การควบคมโรคกระท าโดยการใชสารเคมซงเปนวธทเกษตรกรนยมใช เนองจากสะดวก และใหผลในการควบคมเรวกวาวธการอน กรมวชาการเกษตร (2555) แนะน าใหใชก ามะถนรองกนหลมส าหรบยางปลกใหม ในแหลงทมการระบาดของโรครากขาวมากอนเพอปรบความเปนกรดดางของดนไมใหเหมาะสมกบการเจรญของเชอสาเหตโรครากขาว หากพบตนทเปนโรคควรขดรากเผาท าลายหรออาจขดลอมบรเวณตนทเปนโรคเพอปองกนการระบาดไปยงตนอน

Page 18: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

2

ในแถวเดยวกน สารเคมทใชในการควบคมโรคได เชน cyproconazole, difenoconazole, fenichonil, hexaconazole, mycloboutanil, propiconazole, prochloraz และ triadimefon ซงอาจใชไดผลในระยะแรกทพชเรมตดเชอโรครากขาว แตการใชสารเคมสนเปลองทนสง และเปนอนตรายตอผใช และสงแวดลอม การควบคมโดยชววธจงเปนอกทางเลอกหนงทควรน ามาใชในการควบคมโรค จงไดวางแผนการทดลองโดยใชสารชวภณฑรวมกบป ยคอกหรออนทรยเพอเพมจลนทรยปฏปกษใหสามารถตงรกรากไดในดน เพอแนะน าเกษตรกรตอไป

ตรวจเอกสำร

1. โรครำกขำว โรครากขาวของยางพาราเกดจากเชอรา Rigidoporus microporus (Sw.) Overeem [Syn : Rigidoporus lignosus (Klozsch) Imazeki ] สามารถจดจ าแนกอนกรมวธาน (Kirk et al., 2008) ดงน

Kingdom Fungi Phylum Basidiomycota

Class Agaricomycetes Subclass Agaricomycetidae

Order Polyporales Family Meripilaceae

Genus Rigidoporus Species R. microporus

1.1 สณฐำนวทยำของเชอรำ Rigidoporus microporus

เชอรา R. microporus จดเปนพวกราชนสงเสนใยมผนงกนแบบ simple septate ไมม clamp connection เสนใยสขาวแตกแขนงจบตวกนแนน ขนาดกวาง 1.5-6 ไมโครเมตร basidiospore มสสมออน เดยว ๆ กลม ใส ผวเรยบ ขนาด 2.5-3 ไมโครเมตร เมอเสนใยแกจะนนสน าตาลออน สรางดอกเหดบรเวณรากหรอตอไมยางพาราเปนแผนครงวงกลมไมมกาน ขนซอนกน ขณะดอกเหดออนผวดานบนมสสมหรอสมแดง ขอบสขาว ผวสมผสลน เมอดอกแกจะแขงกระดางมสน าตาลแดงหรอน าตาลเหลองสลบกน ดานลางมรขนาดเลก (pore) ลกษณะ กลม ร หรอเหลยมกลม กระจายทวแผนดอกเหดยกเวนบรเวณขอบดอกเหด ขนาดดอกเหดไม

Page 19: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

3

แนนอนขนอยกบความชน อาย และสภาพแวดลอมอน ๆ สามารถเจรญไดดทอณหภม 30 องศาเซลเซยส pH 6-7 แตในสภาวะท pH 3 และอณหภมต ากวา 20 องศาเซลเซยสหรอสงกวา 30 องศาเซลเซยส เชอไมสามารถเจรญหรอเจรญไดนอยมาก (อารมณ โรจนสจตร, 2541)

1.2 อำกำรของโรครำกขำว เชอสาเหตโรครากขาวสามารถเขาท าลายระบบรากของตนยางพารา ท าให

เนอเยอบรเวณรากเกดความเสยหายสงผลกระทบตอกระบวนการดดน า อาหารของยางพารา ซงน า และธาตอาหารเปนปจจยในการสงเคราะหแสง หากรากถกท าลายไมสามารถดดน า อาหารไดขาดปจจยในการสงเคราะหแสง ตนยางพาราจะแสดงอาการใบเหลอง รวง และยนตนตาย ผวรากมเสนใยสขาวปกคลมจบตวกนแนน (rhizomorph) เมออายมากขนมลกษณะกลมนนเปลยนเปนสเหลอง และสน าตาลตามล าดบ เนอไมของรากทเปนโรคมสครม ยย และเบา หากอยในทชนแฉะจะออนนมจนเหลวเละ ในฤดฝนมกพบดอกเหดบรเวณโคนตนทเปนโรค (กรมวชาการเกษตร, 2555)

1.3 กำรระบำดของโรครำกขำว

เชอราเจรญ และระบาดอยางรวดเรวในชวงฤดฝน อากาศมความชนสง สามารถแพรกระจายไดสองทางคอ การสมผสกนระหวางรากทเปนโรคกบรากจากตนปกตท าใหเชอเจรญลกลามไปยงตนใกลเคยง และโดยสปอรของเชอราจากดอกเหดปลวไปตามลม ตดไปกบรองเทา หรอลอยไปตามน า ตกบนบาดแผลของตนยางใหม เมอมความชนเพยงพอจะเจรญลกลามไปยงระบบรากกลายเปนแหลงเชอโรคแหลงใหมตอไป ปจจบนพบวาโรครากขาวสามารถแพรระบาดไดทกฤด เนองจากมแหลงเชอทอยในดนจ านวนมาก และกระจายทวไป ดงนนเกษตรกรควรปองกนมใหเชอปนเปอนในดน อายยางทพบการเกดโรคหากปลกครงแรกมกพบในยางอาย 15 ปขนไป ในยางทปลกเปนรอบท 2 และไมไดก าจดตอเกา มกพบเมอยางอาย 1 ถง 5 ป แลวแตการสะสมของเชอในดนในแปลงยางนน ยางรอบท 2 มโอกาสเปนโรครากขาวเรวกวายางรนแรก เนองจากชวงรนแรกทปลกนนเมอมตนยางเปนโรค และไมไดขดรากถอนโคน และเผาทง หรอตดตนทงแลว แตไมไดเผาราก และท าลายดอกเหด เชอจงสะสมอยในสวนยาง เมอปลกยางใหม เชอจงเขาท าลายยางทปลกใหมนนตงแตในปแรก (เสมอใจ ชนจตต, 2555) นอกจากเขาท าลายยางแลว เชอยงมพชอาศยไดแก กระทกรก กาแฟ โกโก ขนน จ าปาดะ ชา ทง ทเรยน นอยหนา เนยงนก ไผ พรกไทย พรกขหน มะเขอเปราะ มะพราว มงคด มนเทศ มนส าปะหลง ลองกอง สม สะเดาเทยม สะเดาบาน ฯลฯ (กรมวชาการเกษตร, 2555)

Page 20: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

4

1.4 กลไกกำรเขำท ำลำยของเชอสำเหตโรครำกขำว จากการศกษาของ Nicole และ Benhamou (1991) พบวาตนยางอายนอย

ตดเชองายกวาตนยางอายมาก ซงกระบวนการหรอกลไกการเขาท าลายของเชอรา R. microporus สามารถสรปได 3 ขนตอนคอ 1) ไรโซมอฟของเชอราเจรญอยบนผวรากภายนอก (ectotrophic growth habit) 2) เมอไมมอาหารจากภายนอกเชอราจะเขาท าลายเซลลรากพชโดยไรโซมอฟเปลยนแปลงรปรางเปนเสนใยทมผนงเซลลบางขนเพอการเขาสเนอเยอพช (infectious hyphae) ทางรเปดธรรมชาต เชน รอยแตกของผวทล าตน (lenticels) ทางบาดแผล หรอโดยการสรางเอนไซมเพอยอยเซลลผวรากของพช กระบวนการนเกดขนในสภาพดนขาดออกซเจน (Nandris et al., 1987) ท าใหลกษณะโครงสรางของพชเปลยนไป โดยปลดปลอย extracellular enzymes เขายอยสลายเนอไม 3) เสนใยเจรญอยภายในเซลลพชโดยการยอยผนงเซลลของระบบทอน า ทออาหาร และแพรกระจายสเซลลอนโดยการแทงผานทางชองวาง และทอตาง ๆ ของเซลล จงสามารถพบเสนใยเชอราไดทงระหวางเซลล และผนงเซลล และ พบวา การทเชอราเจรญอยภายในทออาหาร ท าใหน ายางตกตะกอนจบเปนกอนสงผลใหปรมาณน ายางในตนยางลดลงดวย

จากการตรวจสอบเนอไมทเปนโรค พบวาโครงสรางของเซลลถกท าลาย สวนของ middle lamella และผนงเซลลถกยอยสลาย ทงนเกดจากเอนไซมทสามารถยอยสลายโครงสรางของพชได ซงสามารถตรวจพบไดในเนอเยอทถกท าลาย เชน 1. glycosidases (β-glucosidase, α-galactosidase และ β-galactosidase) 2. polysaccharidases (CM-cellulase pectinase และ xylanase) และ 3. phenol oxidases (laccase และ peroxidase) เนอเยอของพชเปนโรคทเกดจากเชอรา R. microporus นนพบการท างานของเอนไซม laccase ในปรมาณมากเปนเอนไซมหลก ในขณะทเชอราท าลายเนอไมชนดอน เชน Phellinus noxius จะสรางเอนไซม glycosidase และ polysaccharidases เปนหลก (Geiger et al., 1986)

1.5 ควำมส ำคญ และควำมเสยหำยทเกดจำกโรครำกขำว

เชอรา R. microporus สาเหตโรครากขาวกอใหเกดความเสยหายใหกบไมผล และไมยนตนหลายชนด โดยเฉพาะยางพาราจดเปนโรคทส าคญพบในพนทปลกยางทวโลก เชน ไทย มาเลเซย ศรลงกา อนโดนเซย อนเดย แอฟรกากลาง แอฟรกาตะวนตก และในบางประเทศ ท าใหเกดความสญเสยมากกวาศตรพชอน ๆ (Jayasuriya and Thennakoon, 2007) ส าหรบมลคาความเสยหายนน Nandris และคณะ (1987) รายงานวา โดยทวไปตนยางมอายเกบเกยว 25 ป หากเชอเขาท าลายจะกอใหเกดความเสยหายเปนมลคาหลายแสนดอลลารตอเฮกแตร

Page 21: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

5

อารมณ โรจนสจตร และคณะ (2553) ไดส ารวจโรคทางรากของยางพารา พบการแพรระบาดของโรค และท าความเสยหายแกพนทปลกยางทวไป พบตนยางเปนโรคตงแตอาย 1-2 ปแรกหลงปลกหรออาย 15-20 ป ท าใหตนทเปนโรคยนตนตาย และเปนแหลงแพรกระจายเชอแกตนยางขางเคยง ทงในแถว และระหวางแถวตอไป ซงท าใหจ านวนตนยาง และผลผลตตอไรลดลง จากการส ารวจ และประเมนความสญเสยทางเศรษฐกจของยางพาราสาเหตจากโรครากขาวในพนทปลกยางป 2551-2553 พบวา พนทปลกยางภาคใตมการระบาดของโรครากขาวกระจายในทกพนท ท าความเสยหายแกแปลงยางทเปนโรคคดเปน 3.4-3.5 เปอรเซนตของพนทปลกยาง สวนในภาคตะวนออก (จงหวดจนทบร ตราด และระยอง) พบนอยมาก ท าความเสยหายแกแปลงยางทเปนโรค 0.05-0.8 เปอรเซนตของพนทปลกยาง หากรวมมลคาความเสยหายโรครากขาวทงหมดในป 2551-2553 คาดวามความเสยหายเปนมลคาไมนอยกวา 1,600 ลานบาท และภายใน 10 ป คาดวาประเทศไทยจะสญเสยรายไดจากยางพาราไมต ากวา 50,000 ลานบาท

1.6 กำรควบคมโรครำกขำว

การใชสารเคมในการปองกนโรคเปนวธทเกษตรกรนยมใช เนองจากสะดวก และใหผลในการควบคมเรวกวาวธการอน กรมวชาการเกษตร (2555) แนะน าใหใชก ามะถนรองกนหลมส าหรบยางปลกใหมในแหลงทมการระบาดของโรครากขาวมากอน เพอปรบความเปนกรดดางของดนไมใหเหมาะสมกบการเจรญของเชอสาเหตโรครากขาว หากพบตนทเปนโรคควรขดรากเผาท าลายหรออาจขดลอมบรเวณตนทเปนโรคเพอปองกนการระบาดไปยงตนอนในแถวเดยวกน สารเคม ทใ ช ในการควบคมโรค ไดแก cyproconazole, difenoconazole, fenichonil, hexaconazole, mycloboutanil, propiconazole, prochloraz และ triadimefon ซงอาจใชไดผลในระยะแรกทพชเรมตดเชอโรครากขาว

ส าหรบการควบคมโดยชววธ โดยใชเชอรา Trichoderma spp. ซงเปนเชอราทเจรญอยางรวดเรว และสามารถยบยงเชอโรคพชหลายกลม รวมทงเชอโรคทเกดจากเชอรากลม Basidiomyctes ซงเปนสาเหตในการยอยเนอไม (Bruce and Highley, 1991) Wijesundera และคณะ (1991) แยกเชอรา Trichoderma spp. จากดนในสวนยางพาราไดจ านวน 7 ไอโซเลท น ามาทดสอบประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอสาเหตโรครากขาว พบวา เชอรา T. hamatum, T. harzianum, T. koningii 4 ไอโซเลท และ T. viridae สามารถยบยงการเจรญของเชอสาเหตโรครากขาวได โดยการสรางสารทมคณสมบตในการยบยงการเจรญของเชอสาเหตโรค เชน

Page 22: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

6

glucanase, chitinase (สามารถยอยสลายเสนใยเชอราสาเหตโรคพช) และเปนปรสตกบเสนใยของเชอราสาเหตโรค

อารมณ โรจนสจตร (2541) รายงานวา เชอรา Trichoderma sp. สามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ทงในจานทดลอง และในดนทบรรจในหลอดทดลอง แตเมอทดสอบในสภาพเรอนทดลองพบวา ไมสามารถควบคมโรครากขาวของกลายางได สวน เชอ Chaetomium sp. ไมสามารถควบคมเชอโรครากขาวในทกการทดลอง

Jayasuriya และ Thennakoon (2007) รายงานวา เชอรา T. harzianum T310 สามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ไดดในหองปฏบตการ และเมอทดสอบในสภาพเรอนทดลอง โดยปลกเชอรา R. microporus ดวยชนสวนของรากยางพาราทแสดงอาการโรครากขาว 25, 50 และ 75 เปอรเซนต และปลกเชอราปฏปกษ T. harzianum พบวา ในระยะแรกกลายางทปลกเชอดวยชนสวนทแสดงอาการโรค 25 เปอรเซนต แสดงอาการเกดโรค 23.6 เปอรเซนตแตเมอตรวจผลท 60 วน กลบพบวา รากพชมลกษณะปกต ไมมการตดเชอ สวนการปลกเชอดวยชนสวนรากทแสดงอาการโรค 50 และ 75 เปอรเซนตพบวา เมอตรวจผลท 90 วน พชแสดงอาการตดเชอ 40 และ 44 เปอรเซนตตามล าดบ

Kaewchai และ Soytong (2010) ศกษาเชอราทมประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ดวยวธ dual culture บนอาหารเลยงเชอ PDA ไดเชอจ านวน 30 ไอโซเลท คอ Acremonium fusidiodes 2 ไอโซเลท Aspergillus niger 2 ไอโซเลท Chaetomium aureum 2 ไอโซเลท Ch. bostrychodes 7 ไอโซเลท Ch. cochliodes 1 ไอโซเลท Ch.cupreum 1 ไอโซเลทCh. fusiforme 5 ไอโซเลท Ch. indicum 2 ไอโซเลท Penicillium canescens 1 ไอโซเลท T. hamatum 2 ไอโซเลท T. harzianum 2 ไอโซเลท T. viride 3 ไอโซเลท ผลการศกษา พบวา เชอ A. niger Ch. bostrychodes, Ch. cochliodes Ch. cupreum, T. hamatum, T. harzianum และ T. viride มเปอรเซนตการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus มากกวา 50 เปอรเซนต และในจ านวนนเชอรา Trichoderma spp. มเปอรเซนตการยบยงสงสด รองลงมาคอ Aspergillus spp. และ Chaetomium spp. ตามล าดบ โดยเชอรา T. hamatum STN07 และ T. viride STN04 และ STN05 มเปอรเซนตการยบยงเทากบ 89.5 เปอรเซนต เมอน าเชอราทมประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus จ านวน 10 ไอโซเลท ไดแก A. niger SN71 และ SN72, Ch. bostrychodes BN08, BN11 และ BS01, Ch. cupreum RY202, T. hamatum STN07 T. harzianum STN01 และ STN02 และ T. viride STN04 มาสกดสารสกดหยาบ และทดสอบความสามารถในการควบคมการเจรญของเช อรา

Page 23: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

7

R. microporus พบวา สารสกดหยาบทสกดดวย hexane จากเชอCh. cupreum RY202 ใหผลดทสดสามารถยบยงได 82 เปอรเซนต รองลงมาเปนสารทสกดดวย methanol จากเชอรา T. hamatum STN07 และสารทสกดดวย ethyl acetate จากเชอ Ch. cupreum RY202 โดยมเปอรเซนตยบยง 80 และ 78 เปอรเซนต ตามล าดบ และยงพบวาประสทธภาพของ Ch. cupreum RY202 รปแบบผง และน ามนสามารถลดการเกดโรครากขาวยางพาราได 60 และ 80 เปอรเซนต ตามล าดบ

ปวณา สงขแกว (2556) ทดสอบประสทธภาพของเชอ Streptomyces sp. โดยแยกเชอ Streptomyces spp. จากตวอยางดนสวนยางในพนทภาคใตของประเทศไทยไดเชอจ านวน 258 ไอโซเลท น ามาทดสอบการเปนปฏปกษกบเชอรา R. microporus ดวยวธ dual culture plate พบวา เชอ Streptomyces sp. S106 และ S110 สามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ไดดทสด โดยมเปอรเซนตการยบยง 83.57 และ 74.29 เปอรเซนต ตามล าดบ จานนนน าเชอ Streptomyces sp. S106 และ S110 มาทดสอบประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ในดนปลกทบรรจในหลอดทดลอง พบวา เชอ Streptomyces sp. S106 มประสทธภาพในการยบยงสงสด และมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเชอ Streptomyces sp. S110 และชดควบคม และเมอน าเชอ Streptomyces sp. S106 มาจ าแนกชนดโดยใชลกษณะทางสณฐานวทยา ชวเคม และการเทยบเคยงโดยใช patial 16S rDNA sequence analysis ไดเปนเชอ S. griseus subsp. formicus จากนนทดสอบผลของเชอ S. griseus subsp. formicus ตอการเปลยนแปลงของเชอรา R. microporus ภายใตกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด พบวา เสนใยของเชอราเหยวยนผดรปราง และเมอน าสารสกดหยาบของเชอ S. griseus subsp. formicus เพอน ามาทดสอบฤทธในการตานเชอรา R. microporus โดยหาคา MIC และ MFC พรอมทงทดสอบดวยวธ Thin-layer chromatography bioautography พบวา สารสกดใหคา MIC และ MFC เทากบ 62.5 และ 125 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ และสารทมฤทธตานเชอรามคา Rf เทากบ 0.06 จากนนไดผลตสตรส าเรจ 4 สตร และคดเลอกสตรส าเรจชนดแกรนลสตรท 3 และชนดผงสตรท 4 เพอใชในการทดสอบประสทธภาพการควบคมโรครากขาวของยางพาราในเรอนกระจก ผลการทดลอง พบวา สตรส าเรจ ทง 2 ชนดสามารถควบคมโรครากขาวได ไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตกบกรรมวธทใชสารเคม

Page 24: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

8

2. เชอจลนทรยปฏปกษ Trichoderma spp. เชอรา Trichoderma spp. เปนจลนทรยปฏปกษทมศกยภาพในการควบคมเชอ

สาเหตโรคพช ซงสายพนธ ทมประสทธภาพในการควบคมโรคพช เชน เชอรา T. harzianum, T. koningi, T. longibrachiatum, T. pseudokoningii, T. virens และ T. viride (Kuhls et al., 1999) จระเดช แจมสวาง 2546 กลาววาเชอรา Trichoderma spp. เปนจลนทรยปฏปกษทดมประสทธภาพในการควบคมโรคพชไดด และกวางขวางนน สาเหตอาจมาจากมการเจรญอยางรวดเรว มการสรางเอนไซมมายอยสารพวก polysaccharide สามารถขยายพนธไดในแหลงคารบอนหลายชนด และเชอรา Trichoderma spp. แตละสายพนธสามารถทนตอสารเคมตางกน นอกจากนยงสามารถสงเสรมการเจรญของพช (plant growth promoter) และสามารถฟนฟสภาพดนทเสอมโทรม ทงนอาจเปนเพราะเชอรา Trichoderma spp. สามารถเจรญตงรกรากรวมกบระบบรากของพชไดดเปนผลท าใหรากพชถกปกปองดวยเชอรา Trichoderma spp. เตมพนทผวรากพช (Harman, 2000; Harman, 2006) เชอสาเหตโรคพชสวนใหญทเชอรา Trichoderma spp. สามารถควบคมไดดเปนเชอทอาศยอยในดน เชน Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis var tritici, Pythium aphanidermatum f.sp. culmorum, Rhizoctonia solani และ Sclerotium rolfsii (Chet and Inbar., 1994) โดยเชอรา Trichoderma spp. สามารถจดจ าแนกอนกรมวธาน (Gagera et al., 2013) ดงน Kingdom Fungi

Phylum Ascomycota Class Pezizomycetes

Order Hypocreales Family Hypocreaceae

Genus Trichoderma

2.1 สณฐำนวทยำของเชอรำ Trichoderma sp.

Rifai (1969) รายงานวา เชอรา Trichoderma sp. มการสรางเสนใยเจรญเรว เรมแรกโคโลนมลกษณะผวหนาเรยบไมมสหรอสขาว ตอมามลกษณะเปนแบบปยฝายฟอยางหลวม ๆ หรออยเปนกระจกหนาแนน การสรางสปอรมลกษณะทส าคญคอบรเวณทเรมมการสรางสปอรมลกษณะเปนวงรอบหรอเปนวงแหวน (ring-like zone) ซงเกดจากอทธพลของแสง และเมอโคโลนมอายมากขนจะมการสรางโคนดโอฟอรขนมาใหมอกรอบ ท าใหเหนการเกดรอบวงหรอ

Page 25: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

9

zonation ส าหรบตวอยางทโคโลนเปนแบบปยฝาย (floccose) การสรางรอบวงสามารถสงเกตไดในขณะทเชอยงมอายนอย สของโคโลนสวนใหญเกดมาจากการสรางสของสปอร ซงมตงแตโคโลนสเขยวอมเหลองจนถงเขยวเขม (dark green) นอกจากสของสปอรทมผลตอสของโคโลนแลวยงมปจจยอน ๆ ทมผลตอสโคโลน คอปรมาณสปอรทสรางขนท าใหโคโลนเขมขนหรอออนลงการสรางผลกสหรอปลอยสออกมาท าใหสของอาหารเลยงเชอเปลยนไปรวมทงชนด และ pH ของอาหารเลยงเชอกมผลตอสของโคโลน การสรางเสนใยทยดตวออก และเปนหมน (sterile hyphal elongation) เหนอกระจกของโคนดโอฟอรท าใหโคโลนมสขาวหรอสเทาเขยว (grayish-green)

2.2 กำรเปนปฏปกษของเชอรำ Trichoderma sp. ตอเชอโรคพช

2.2.1 กำรแขงขนในดำนพนท และสำรอำหำร (competition) เนองจากเชอราสามารถเจรญไดรวดเรว จงสามารถแขงขนในดานการ

ตงรกรากครอบครองพนท และแยงสารอาหารจากเชอสาเหตโรคพช โดยการแกงแยง แขงขน ในการดดซบสารอาหารพวกสารอนทรยตาง ๆ เพอใชในการเจรญ ขยายพนธ (Danielson and Davey, 1973) นอกจากนนเชอรา Trichoderma sp. บางสายพนธยงสามารถผลต siderophores ออกมาดดซบแยงธาตเหลก (Chet and Inbar, 1994) ซงการแขงขนในดานสารอาหารเปนกลไกหลกทท าใหเชอรา T. harzianum มประสทธภาพในการควบคม และมการแขงขนไดดกวาเชอจลนทรยในดน โดยเฉพาะเชอสาเหตโรคพช และเชอชนดอน ๆ การแกงแยงสารอาหารของเชอรา Trichoderma sp. ในดนมากแสดงใหเหนถงอทธพลตอกจกรรมในการควบคมทางชวภาพของเชอรา Trichoderma sp. (Bae and Knudsen, 2005) ตวอยางเชน เชอรา T. koningii สามารถเจรญแกงแยงสารอาหารสงผลใหสามารถครอบครองพนทบรเวณรากของตนหอม และลดการเขาท าลายของเชอรา S. cepivorum สาเหตโรคโคนเนาได (Danielson and Davey, 1973)

2.2.2 กำรเปนปรสตตอเชอรำกอโรคพช (parasitism) โดยจลนทรยชนดหนงหรอหลายชนดสามารถเจรญบนจลนทรยอก

ชนดหนงได เจรญแทงทะลผานผนงเซลลของเชอสาเหตโรคพชเขาไปดดน าเลยง หรอสารอาหารโดยตรงจากเชอสาเหตโรค และขดขวางการเจรญของเชอสาเหตโรคพช (hyphal interference) โดยการพนรดเสนใยหรอโครงสรางตาง ๆ ของเชอสาเหตโรคพช เชน Phytophthora sp., Rhizoctonia sp., Sclerotium sp. และเชอสาเหตโรคพชอน ๆ โดยมผลท าใหเสนใยเชอสาเหตโรคเจรญผดปกต (Weindling, 1934)

เกศณ แกวมาลา (2551) ตรวจหาเชอรา Trichoderma spp. ทตดมากบเมลดพนธถวเหลอง 4 พนธ ไดแก ชม. 60 สจ. 5 MJ9518-2 และ MJ9520-21 โดยวธเพาะบน

Page 26: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

10

กระดาษชนสามารถแยกเชอรา Trichoderma spp. ได 4 ไอโซเลท จากพนธ ชม. 60 สจ. 5 และ MJ 9520-21 เมอน าเชอรา Trichoderma spp. มาทดสอบประสทธภาพการยบยงเชอรา Colletotrichum truncatum สาเหตโรคแอนแทรคโนสของถวเหลอง ดวยวธ dual culture พบวาเชอรา Trichoderma spp. ทง 4 ไอโซเลทใหเปอรเซนตการยบยงสง และเมอน ามาศกษากลไกการเปนปฏปกษโดยวธ slide dual culture พบวา เชอรา Trichoderma sp. แสดงการเปนปรสตโดยการพนรด และแทงเขาไปภายในเสนใยของเชอรา C. truncatum เมอทดสอบประสทธภาพของเชอรา Trichoderma sp. ทง 4 ไอโซเลท เปรยบเทยบกบสารเคม captan ในการควบคมโรคแอนแทรคโนสในระยะตนออนของถวเหลองพนธ ชม. 60 และ สจ.5 ในสภาพโรงเรอน พบวา เชอรา Trichoderma sp. ไอโซเลทท 3 และ 4 และสารเคม captan ลดเปอรเซนตการเกดโรคแอนแทรคโนสในตนออนของถวเหลองได โดย captan ใหประสทธภาพสงกวาการใชเชอรา Trichoderma sp. ไอโซเลทท 3 และ 4 อยางมนยส าคญทางสถต

เสมอใจ ชนจตต และคณะ (2553) ประเมนการใชจลนทรยปฏปกษในการควบคมเชอ P. botryosa และ P. palmivora สาเหตโรคใบรวงของกลายางพารา สามารถแยกเชอจลนทรยปฏปกษ ได 797 ไอโซเลท (Chaetomium spp. 174 ไอโซเลท Trichoderma spp. 168 ไอโซเลท Streptomyces spp. 158 ไอโซเลท และ Bacillius spp. 297 ไอโซเลท) เมอทดสอบการเปนปฏปกษดวยวธ dual culture บนอาหารเลยงเชอ PDA พบวา เชอรา Trichoderma sp. T016-2 สามารถยบยงการเจรญของเสนใยของเชอ P. botryosa และ P. palmivora ได 92.5 และ 92.8 เปอรเซนต ตามล าดบ เมอทดสอบในสภาพเรอนทดลอง พบวา กรรมวธพนสปอรแขวนลอยของเชอรา Trichoderma sp. T016-2 บนใบยางพารา กอนพนซโอสปอรแขวนลอยของเชอ P. botryosa และ P. palmivora สามารถปองกนการเขาท าลายของเชอสาเหตโรคไดดทสด

2.2.3 กำรผลตสำรปฏชวนะ (antibiosis) ชนดทเปนสำรระเหย และชนดทแพรในอำหำร

เชอรา Trichoderma sp. เจรญไดด สามารถดดซบสารอนทรยมาใชเปนอาหารในการเจรญขยายพนธ สราง และปลดปลอยสารพษ หรอสารปฏชวนะ ออกมาภายนอกเซลล ซงสารดงกลาวมคณสมบตในการยบยงหรอท าลายเซลลของเชอสาเหตโรคทอาศยอยบรเวณนน สงผลใหเชอสาเหตโรคพชถกท าลาย ลดจ านวน และลดความสามารถในการเกดโรค (เกษม สรอยทอง, 2551)

Ghisalberti และ Sivasithamparam (1991) รายงานวา การสรางสารทตยภมของเชอรา Trichoderma spp. และสารตานเชอรา ขนอยกบแตละสายพนธ ซงความ

Page 27: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

11

แตกตางของกลมสารประกอบทางเคม แบงได 3 กลม คอ (1) สารประกอบชนดทระเหยได เชน 6-pentyl-a-pyrone (6PP) และอนพนธของ isocyanide (2) สารประกอบทละลายน าได เชน heptelidic acid หรอ koningic acid และ (3) peptaibol เปนโอลโกเพปไทดของกรดอะมโน ซงเปนโครงสรางทางเคมของสารปฏชวนะจากเชอรา Trichoderma sp.

Vinale และคณะ (2008) ศกษาประสทธภาพของสารทตยภมของเชอรา T. harzianum สายพนธ T22 T39 และ A6 และ T. atroviride สายพนธ P1 ในการควบคมโรค และการสงเสรมการเจรญของพช โดยพนสาร harzianolide และ 6PP ซงสกดไดจากเชอรา T. atroviride และ T. harzianum ในตนถว (Pisum sativum) มะเขอเทศ (Lycopersicum esculentum) และผกกาดขาว (Brassica napus) พบวา สารทตยภมเชอรา Trichoderma spp. สามารถยบยงการเจรญของเชอสาเหตโรค และพชมการสราง auxin ทสงเสรมการเจรญ นอกจากนทดสอบการชกน าใหพชเกดความตานทานตอโรค โดยพนดวยสปอรแขวนลอยของเชอรา Botrytis cinerea สาเหตโรคผลเนาของมะเขอเทศ และเชอ Leptosphaeria maculans สาเหตโรคเนาของตนกลา oilseed rape พบวา พชทงสองชนดแสดงอาการโรคทเกดจากเชอทงสองชนดลดลง จงสรปวาสารทตยภมเชอรา Trichoderma spp. สามารถสงเสรมการเจรญของพชและชกน าใหพชเกดความตานทานตอเชอสาเหตโรคพชได

ชมพนท บญราชแขวน (2550) ศกษาอทธพลของสารทตยภมจากเชอรา T. harzianum จ านวน 13 สายพนธ ตอการยบยงการเจรญของเชอรา C. gloeosporioides สาเหตโรคแอนแทรคโนสของพรก พบวา เชอรา T. harzianum สายพนธ T-50 และ PM 9 สามารถสรางบรเวณใสหรอบรเวณยบยงเชอรา C. gloeosporioides ได 61.66 เปอรเซนต และ 52.85 เปอรเซนตตามล าดบ

เชอรา Trichoderma sp. สามารถผลตสารเคมอาจเปนสารปฏชวนะ (antibiotics) สารพษ หรอ เอนไซม (extracellular enzymes) มายบยง ท าลายเสนใย หรอการงอกของสปอรเชอสาเหตโรคพช เชน สารไตรโคเดอรมน (trichodermin) เปนสารปฏชวนะในกลม sequisterpene (Godtfredsen and Vangedal, 1965) สารอะเซทลดฮายด (acetaldehyde) เปนสารปฏชวนะชนดทระเหยได (volatile antibiotic) (Dennis and Webster, 1971) นอกจากน Elad และคณะ (1993) รายงานวาตรวจพบเอนไซม cellulases, chitinase และ glucanase บรเวณทเสนใยของเชอรา T. harzianum เกาะตดพนรดเสนใยของเชอรา Botrytis cinerea สาเหตโรค grey mold ของแตงกวา

Page 28: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

12

2.2.4 ชกน ำใหพชเกดควำมตำนทำน (induced resistance) การชกน าใหพชเกดความตานทานตอเชอสาเหตโรคพชเกดขนกบทก

พช ซงเปนกลไกการตอตานการเกดโรคพชเอง และเกดอยางซบซอน (Harman et al., 2004) การเกดการตานทานของพชอาจเกดเฉพาะแหงหรอกระจายทวทงตน (Pal and Gardener, 2006) เชอรา Trichoderma sp. สามารถกระตนใหพชเกดความตานทานตอเชอสาเหตโรคพชได โดย Harman และคณะ (2004) รายงานวามการคนพบเชอรา T. harzianum T-39 สามารถชกน าให ผกกาดหอม พรกไทย มะเขอเทศ และยาสบ ตานทานตอเชอรา B. cinerea

นอกจากเชอรา Trichoderma sp. มกลไกในการเปนปฏปกษ ตอเชอโรคพชแลว ยงสามารถชวยสงเสรมการเจรญของพช (plant growth regulators) จระเดช แจมสวาง (2547) ศกษาการสงเสรมการเจรญของพชในไมดอกไมประดบทปลกในกระถาง พชผก กลาไมผลทเพาะดวยเมลด กงปกช า และพชหว พบวา สามารถเพมขนาด ความสง น าหนกของตน และชวยเรงการสรางดอก โดยเชอรา Trichoderma sp. สามารถชวยละลายแรธาตใหอยในรปทเปนประโยชนตอพชจงชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของพช

2.3 กำรผลตจลนทรยปฏปกษในรปของสำรชวภณฑ

ในปจจบนมการน าเชอรา Trichoderma sp. มาผลตเปนสารชวภณฑการคามากทสดเมอเทยบกบเชอราปฏปกษชนดอน ทงในรปเชอสด เชอแหง หรอผลตเปนผลตภณฑตาง ๆ อยในรปสารก าจดเชอราสาเหตโรคพชผสมในป ยอนทรยหรอสารปรบสภาพดน (Harman et al., 2004; Harman, 2006 : Vinale et al., 2006) ในตางประเทศมการน าเชอรา Trichoderma sp. มาผลตเชงการคาอยางแพรหลาย ดงแสดงในตารางท 1 Ramanujam และคณะ (2010) รายงานวา การผลตสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp. เชงการคาในรปแบบตาง ๆ เพอใหงาย และสะดวกในการใชควบคมเชอสาเหตโรคพช (Fusarium sp., Phytophthora sp., Sclerotium sp. และเชอสาเหตโรคพชทอาศยอยในดน) อกทงสามารถใชรวมกบระบบการปลกพชแบบตาง ๆ โดยมการผลตออกมาหลายรปแบบ เชน ผงฝ น (dusts) ผงเปยกน า (wettable powder) น ามนผสมน า (emulsions) และเมด (granules) Wijesinghe และคณะ (2010) ศกษาการใชสตรส าเรจของเชอรา T. asperellum รปแบบน ามนผสมน าในการควบคม เชอ Thielaviopsis paradoxa สาเหตโรคเนาด าของสบปะรด ผลการทดสอบ พบวา สามารถยบยงการเจรญของเสนใยเชอ Th. paradoxa ได 92.7 เปอรเซนต และ Batta (2007) ศกษาการใชสตรส าเรจเชอรา T. harzianum รปแบบน ามนผสมน า โดยเปรยบเทยบระหวางการใชสตรส าเรจทมเชอรา T. harzianum และสตรส าเรจทไมมเชอรา T. harzianum ในสวนผสม เพอควบคมโรคหลงการเกบเกยวของผล แพร พช สตรอ

Page 29: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

13

เบอรร และแอปเปล ซงเกดจากการเขาท าลายของเชอ Rhizopus stolonifer สายพนธ RS1 โดยวดขนาดของแผล จากการศกษาพบวา สตรส าเรจทมเชอรา T. harzianum สามารถลดการเกดโรคได 86 เปอรเซนต นอกจากน Dubey และคณะ (2009) ศกษา และพฒนาสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma spp. เพอใชในการควบคมโรครากเนาแหงของถวเขยว (Vigna radiate) ซงเกดจากเชอ Rhizoctonia bataticola พบวา สตรส าเรจ Pusa 5 seed (ประกอบดวย peat powder (47.75 เปอรเซนต) Sabudana powder (Manihot esculenta) (47.75 เปอรเซนต) และ carboxymethyl cellulose (5 เปอรเซนต)) สามารถลดการเกดโรค 87.2 เปอรเซนต และเพมการงอกของเมลด 43 เปอรเซนต เพมความยาวของราก 37 เปอรเซนต นอกจากนยงมอายการเกบรกษานาน 25 เดอน เมอเปรยบเทยบกบสตรส าเรจอน ๆ จ านวน 31 สตร

ส าหรบในประเทศไทยมการวจยคนควาจ านวนมากเกยวกบการใชเชอรา Trichoderma sp. เพอใชในการควบคมโรคพช อยางไรกตามการผลตเปนสารชวภณฑยงมขอจ ากด เนองจากเชอรา Trichoderma sp. บางสายพนธมประสทธภาพดในหองปฏบตการ แตเมอทดสอบในสภาพแปลงทดลอง พบวา มประสทธภาพลดลง และแมจะมการผลตเชงการคา แตกมขอจ ากดในการใชเนองจากความสามารถในการควบคมโรคในแปลงยงไดผลนอย เมอเทยบกบสารเคมก าจดศตรพช (สายทอง แกวฉาย, 2555) และมปญหาเกยวกบการมชวตรอดของเชอราปฏปกษในขณะเกบรกษา (Kaewchai et al., 2009) อยางไรกตามมการศกษาการผลตเชอรา Trichoderma sp. เพอผลตเปนการคา เชน การศกษาเพอผลตเชอรา Trichoderma sp. ในรปแบบผง ใชควบคมโรคราเมลดผกกาดของมะเขอเทศ และพฒนาการผลตเชอรา Trichoderma sp. รปแบบผงในเชงพาณชย พบวา สามารถพฒนาไดโดยพจารณาทตนทนการผลต และก าไรทไดซงความเปนไปไดขนอยกบราคาขาย ความตองการใชผงเชอรา Trichoderma sp. และประสทธภาพในการควบคมโรคเปนตน (สมาล สนตพลวฒ, 2536) มการสงเสรมใหเกษตรกรไดรจก และใชเชอรา Trichoderma sp. ควบคมโรคพชโดยการผลตเชอรา Trichoderma sp. ชนดสด ซงมการเลยงบนเมลดขางฟางทผานการนงฆาเชอแลว อยางไรกตามการผลตเชอสดยงไมเพยงพอกบความตองการของเกษตรกร และยงมปญหาเกยวกบการปนเปอนของจลนทรยอน ๆ อายการเกบรกษาสน การเสอมหรอกลายพนธท าใหประสทธภาพของเชอดอยลง (จระเดช แจมสวาง, 2546) และการผลตเชอรา Trichoderma sp. โดยน าเมลดขาวหงสกหรอเมลดขาวฟางตมสกบรรจในถงพลาสตกแลวใสเชอรา Trichoderma sp. ลงไป ปดถง บมทอณหภมหองประมาณ 7 วน เชอเจรญเตมถงมสเขยวน าไปผสมร าละเอยด ป ยหมกหรอป ยอนทรย โรยกนหลมหรอรอบโคนตน และรดน าตามปกตไมควรใชรวมกบป ยเคม นอกจากนส านกเทคโนโลยชวภาพทางดน

Page 30: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

14

(ม.ป.ป.) ไดน าเชอรา Trichoderma sp. มาผลตเปนสตรส าเรจบรรจในซองเพอแจกจายแกเกษตรกร และผสนใจ และใหชอวาสารเรงซปเปอรพด. 3 วธการใชจะตองผสมกบน า ราดลงในกองป ยหมกหมกไวประมาณ 7 วนหลงจากนนจงสามารถน าไปใชได ส าหรบการใชเชอรา Trichoderma sp. จระเดช แจมสวาง (2547) ไดกลาวไวดงน 1) คลกเมลดพชหรอสวนขยายพนธดวยเชอรา Trichoderma sp. ชนดเชอสดทเจรญอยบนเมลดขาวฟางหรอขาวสกในอตรา 1 ชอนโตะตอเมลด 1 กโลกรม 2) ใสเชอลงในดนโดยผสมเชอรา Trichoderma sp. ร าละเอยด และป ยหมกอตรา 1 : 5 : 50 และ 3) น าเชอสดไปผสมน ากรองเอาแตน าไปใช อตราการใชเชอสด 1 กโลกรมตอน า 100-200 ลตร แลวฉดพน จระเดช แจมสวาง และคณะ (2543) ศกษาและพฒนาการผลต และการประยกตใชสารชวภณฑจากเชอรา Trichoderma sp. CB-Pin-01 ในรปแบบผงแหง (ยนกรน ยแอน-1) เพอใชในการควบคม เชอรา Sclerotium rolfsii สาเหตโรคโคนเนาของถวฝกยาว พบวา ตนถวฝกยาวมอตราการรอดจากการเขาท าลายของเชอรา S. rolfsii 92.5-97.8 เปอรเซนต และสามารถลดปรมาณเมด Sclerotium ได 60.9-73.6 เปอรเซนต เมอเปรยบเทยบกบชดควบคม และไดมการจดสทธบตรหรออนสทธบตรเกยวกบเชอรา Trichoderma sp. เชน สทธบตรกรรมวธการผลตชวภณฑเชอรา Trichoderma sp. ในรปผงแหง โดย ส านกงานพฒนาวทยาศาสตร และเทคโนโลยแหงชาต (2552) เลขทสทธบตร 9913 และอนสทธบตรกรรมวธการใชเชอรา T. harzianum T9 โดย มหาลยขอนแกน (2551) เลขทสทธบตร 0803000959

Page 31: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

ตำรำงท 1 ตวอยางสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma spp. ทผลตในเชงการคา ชอการคา สายพนธ โรคพช/เชอสาเหตโรค รปแบบผลตภณฑ ผผลต

Bineb T Pellet®, Bineb T WG®

T. harzianum ATCC 20476 T. polysporum ATCC 20475

fungi causing wilt, root rot

granule, wettable powder

Innovation, Sweden

Bioderma® Bioderma-H®

T. harzianum T. viride

Cercospora, Colletotrichum, Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia solani, Pythium, Sclerotinium

wettable powder Biotech Internation, India

Biofunus® Trichoderma spp. Fusarium, Rhizoctonia solani, Pythium, Sclerotinia, Verticillium

granules, wettable powder

Grondortsmettingen De Cuester, Belgium

15

Page 32: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

ตำรำงท 1 (ตอ) ชอการคา สายพนธ โรคพช/เชอสาเหตโรค รปแบบผลตภณฑ ผผลต

Bioten WP® Remedier WP® Tenet WP®

T. asperellum strain ICC 012, T. gamsii strain ICC 080

Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Sclerotium

wettable powder Isagro USA.

Bio-Trek®, Plant Shield®, Root Shield® T-22® T-22HB®

T. harzianum (1295-22)

Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Sclerotium

wettable powder Bioworks Inc, Geneva, USA.

Fungi-killer® T. harzianum

Fusarium oxyspora, Phytophthora

powder Bangkok Organic Compost Ltd, Thailand

SARDAR ECO GREEN ® T. harzianum damping off, root and stem rots, wilts blights, leaf and spots, downy, powdery mildews, white rust, smut

wettable powder Zhejiang NetSun Co., Ltd. India

16

Page 33: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

ตำรำงท 1 (ตอ) ชอการคา สายพนธ โรคพช/เชอสาเหตโรค รปแบบผลตภณฑ ผผลต

Trichoma® T. viride

fungi causing wilt, root rot powder, liquid V. J. AGRO, Co., Ltd. India

UNIGREEN UN-1® T. harzianum

Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Sclerotium rolfsii, Pythium aphanidermatum

powder Kasetsart J.2.Office of Agricultural Research and Development, Region 6, Department of Agriculture of Thailand.

17

Page 34: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

18

2.4 สำรประกอบส ำหรบเตรยมสตรส ำเรจ ในการเตรยมสตรส าเรจเพอควบคมโรคพชนน นอกจากจะมเชอจลนทรย

ปฏปกษแลวยงประกอบดวยสารชวย (excipients) ซงท าหนาทตางกน ไดแก สารเพมปรมาณ (fillers หรอ diluents) สารยดเกาะ (binders) สารชวยแตกกระจายตว (disintegrants) และสารชวยไหล (glidants)ซงองคประกอบเหลานเปนตวเสรมใหเชอจลนทรยปฏปกษสามารถมชวตรอด และประสทธภาพมากขน (ทดทรง ทวทพย, 2535; ปราโมทย ทพยดวงตา, 2539 )

2.4.1 สำรเพมปรมำณ เปนสารทเตมลงไปในสตรส าเรจ เพอเพมขนาดหรอน าหนกของแกรนล

โดยสารเพมปรมาณตองมคณสมบตสามารถเขากนไดกบตวยา และสารประกอบอนในสตรส าเรจ ไมกอใหเกดปฏกรยาใด ๆ มความคงตว ไมดดความชน มการไหลทด ราคาไมสง และท าใหแกรนลมความแขงทเหมาะสม มการแตกตวด ตวอยางสารเพมปรมาณ ไดแก Ca3(PO4)2, calcium, CaSO4, cellulose, dextrose, lactose, mannitol, microcrystalline, phosphate, sorbitol, starch และtribasicsucrose เปนตน (มนตชล นตพน, 2534)

2.4.2 สำรยดเกำะ เปนสารทเพมแรงเกาะกนของผง ท าใหเกดการเกาะกนเปนแกรนล

ภายใตแรงตอกท าใหอดกนเปนเมดได และท าใหไดแกรนลสม าเสมอ มความแขงเพยงพอ และเหมาะสมในการตอก โดยคณสมบตของสารยดเกาะทดตองสามารถเขากนไดกบสารตวอนในสตรส าเรจ ใหแรงยดเกาะเพยงพอในการท าใหผงจลนทรยผานกระบวนการตาง ๆ ในการผลตได สารยดเกาะทใชมหลายชนด ทงทเปนพวกน าตาล และสารประกอบเชงซอนประเภททไดจากธรรมชาต เชน acacia, gelatin, glucose, gum, starch, sucrose และ tragacanth และสารทไดจากการสงเคราะห เชน methyl cellulose และ poly vinyl pyrolidone (PVP) เปนตน (มนตชล นตพน, 2534)

2.4.3 สำรชวยแตกกระจำยตว เปนสารชวยใหแกรนลเกดการแตกตวหรอกระจายตวไดในเวลาอน

สมควร เมอแกรนลสมผสกบสารละลายหรอน าการผสมสารชวยในการแตกตวอาจท าไดโดยผสมในขนตอนกอนท าเปนแกรนลหรอผสมในขนตอนเปนแกรนลแลว หรออาจแบงผสมทงสองขนตอน ตวอยางของสารทชวยในการแตกตว เชน

-alginate เปนสารชวยในการแตกตว อยในกลม hydrophilic colloid substances มจ าหนายในรปของ alginic acid หรอเกลอของ alginic acid โดยเฉพาะในรปของ

Page 35: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

19

เกลอ sodium มคณสมบตในการชอบน ามากกวาพวกแปง ปรมาณทใชในสตรนนส าหรบ alginic acid ใชในปรมาณ 1-5 เปอรเซนต สวน sodium alginate อยท 2.5-10 เปอรเซนต

-gum เปนสารทมคณสมบตในการพองตวในน าได รวมทงเปนตวชวยยดเกาะทด ปรมาณทใช 1-10 เปอรเซนตของน าหนกเมดยา ตวอยางของสารกลมน ไดแก agar, guar, pectin และ tragacanth เปนตน (จกรพนธ ศรธญญาลกษณ, 2538)

-starch นยมใชกนมาก โดยทวไปถาหากมปรมาณของ starch ในสตรมาก มกท าใหมการแตกตวทเรวขน แตปญหาทตามมาคอการเกาะตวกน และความแขงของแกรนลจะลดนอยลง

2.4.4 สำรชวยไหล เปนสารทใสลงไปในสตรส าเรจ เพอเพมการไหลโดยการลดแรงเสยด

ทานระหวางอนภาค ท าใหแกรนลไหลจาก hopper ลงมาสเบาไดอยางสม าเสมอ ท าใหแกรนลทมน าหนกสม าเสมอ สารทใชในการชวยไหล เชน calcium phosphate, colloidal silicon dioxide, silicate, starch และ talc (มนตชล นตพน, 2534) ซงสารทชวยในการไหลตองไมท าใหความคงตวทงทางดานกายภาพ และทางเคมของแกรนลเปลยนแปลงไป (จกรพนธ ศรธญญาลกษณ, 2538)

วตถประสงคของงำนวจย

1. เพอใหได เ ช อรา Trichoderma spp. ทมประสทธภาพในการควบคมเช อรา R. microporus 2. เพอทราบกลไกการยบยงของเชอรา Trichoderma spp. ตอเชอรา R. microporus

3. เพอผลตสตรส าเรจจากเชอรา Trichoderma sp. และประยกตใชจลนทรยปฏปกษรวมกบป ยอนทรยส าหรบควบคมโรครากขาวของยางพารา

Page 36: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

20

บทท 2 วสด อปกรณ และวธการ

วสด และอปกรณ

อปกรณ 1. กลองจลทรรศน ชนด compound และ stereo binocular 2. กลองถายรป (camera) 3. เครอง Gas chromatography-mass spectrometer 4. เครอง UV transilluminator 5. เครองเขยาผสม (Vortex mixture) 6. เครองชงไฟฟาละเอยด (analytical balance) 7. เครองเทอรมอไซเคลอร (thermocycler หรอ PCR machine) 8. เครองผสมแปง 9. เครองแรงแกรนล 10. เครองหมนเหวยง (centrifuge) 11. เครองอเลคโตรโฟรซส (electrophoresis) 12. ตปลอดเชอ (laminar air-flow cabinet) 13. ตแช (refrigerator) 14. ตอบลมรอน (hot air oven) 15. ไมโครเวฟ (microwave) 16. หมอนงความดน (autoclave) 17. อางน าควบคมอณหภม (water bath) 18. อปกรณ และเครองแกว ไดแก cork borer, cover slip, glass bead, micropipette, Pasture’s pipettes, Thin-layer chromatography silica gel 60 F 254 กระบอกตวง ขวดรปชมพ จานเลยงเชอ แทงแกวสามเหลยม บกเกอร แผนสไลด หลอดทดลอง 19. อปกรณในการแยกเชอ ไดแก เขมเขย ตะเกยงแอลกอฮอล ปากคบ และอน ๆ

Page 37: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

21

อาหารเลยงเชอจลนทรย 1. Potato dextrose agar (PDA) 2. Potato dextrose broth (PDB) 3. Trichoderma selective medium (TSM)

วสดส าหรบเตรยมสตรส าเรจ 1. ดนพช (peat powder) 2. แปงมนส าปะหลง (cassava powder) 3. แปงสาล (wheat powder)

วสดเกษตร 1. กระถางพลาสตก ขนาดเสนผานศนยกลาง 12 นว 2. กอนเชอเหด 3. แกลบ 4. ขาวฟาง 5. ดนผสม อตราสวน ดน : แกลบ 10 : 1 6. ตนกลายาง พนธ RRIM 600 อาย 8 เดอน 7. ปายพลาสตก 8. ป ยคอก (มลไก, มลวว) 9. ป ยอนทรย ซพ หมอดน สารเคมทใชในการทดลอง

สารเคมทวไป 1. Agar 2. Carboxin 3. Captan 4. Chloramphenical 5. Congo red 6. Dextrose

Page 38: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

22

สารเคมทวไป (ตอ) 7. Dimethyl sulfoxide 8. Ethanol 9. Ethyl acetate 10. Glucose 11. HCl 12. Hexane 13. K2HPO4 14. KCl 15. Lactophenol cotton blue 16. Methanol 17. MgSO4.7H2O 18. NaCl 19. NH4NO3 20. Rose benga

สารเคมส าหรบการวเคราะหดวยวธทางชวโมเลกล 1. Agarose 2. Chloroform isopropyl alcohol 3. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB buffer) 4. DI water 5. Dream Taq green PCR mastermix 6. Ethidium bromide 7. Forward primer 8. Isopropyl alcohol 9. Loading dye 10. Marker (100 bp ladder) 11. Reverse primer

Page 39: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

23

วธการวจย 1. การคดเลอกจลนทรยปฏปกษทมประสทธภาพในการยบยงเชอรา Rigidoporus microporus

1.1 การเกบตวอยางดน และแยกเชอรา Trichoderma spp. เกบตวอยางดนระหวางเดอนกมภาพนธ-มนาคม พ.ศ. 2555 ในพนทจงหวด

กระบ ชมพร ตรง นครศรธรรมราช พงงา พทลง ภเกต ระนอง สงขลา และสราษฎรธาน โดยสมเกบตวอยางดนบรเวณรอบโคนตนยางพาราในแปลงปลกทมการระบาดของโรครากขาว และแปลงไมมการระบาดของโรครากขาว เลอกเกบดนจากผวดนลก 15 เซนตเมตร แปลงละ 5 จด ๆ ละ 200 กรม ผสมกนเปน 1 ตวอยาง ทงหมด 86 ตวอยาง แลวน ามาแยกเชอรา Trichoderma spp.

แยกเชอรา Trichoderma spp. จากตวอยางดน ดวยวธ dilution spread plate โดยชงดนจ านวน 1 กรม ใสในหลอดเลยงเชอทมน ากลนนงฆาเชอ 9 มลลลตร เขยาดวยเครองเขยาผสม (vortex mixer) เจอจางเปนล าดบสบ (10-fold dilution) ไดดนแขวนลอยเจอจางท 10-3-10-5 ดดดนแขวนลอย ปรมาตร 100 ไมโครลตร หยดลงบนอาหาร Trichoderma selective medium (TSM) เกลยใหทวหนาอาหาร บมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน เลอกเกบโคโลนเชอรา Trichoderma spp. ทมลกษณะเสนใยเรมแรกสขาวขนาดเฉลยประมาณ 0.5-1 เซนตเมตร เมอมอายมากขนมสเขยวคอนขางเหลองจนถงเขยวเขม วางเลยงบนอาหาร Potato dextrose agar (PDA) ทอณหภมหอง จากนนเขยปลายเสนใยของเชอรา Trichoderma spp. เลยงบนอาหาร PDA อกครง จนไดเชอบรสทธ แลวจงเกบเชอลงในหลอดอาหารเลยงเชอ PDA บมทอณหภมหอง เพอใชทดสอบตอไป

การใหรหสเ ช อรา Trichoderma spp. แตละไอโซเลท โดยอกษรภาษาองกฤษพมพใหญตวแรก มาจาก ชอจงหวดทเกบตวอยางดน อกษรภาษาองกฤษพมพใหญตวทสองมาจาก อ าเภอ และตวทสามเปนหมายเลขตวอยางดน ตามดวยล าดบทของไอโซเลท เชน เชอรา Trichoderma spp. ChM1.1 หมายถง เชอทแยกไดจากตวอยางดนในจงหวดชมพร อ าเภอเมอง ตวอยางดนแหลงท 1 และเปนไอโซเลทท 1

1.2 การคดเลอกเชอรา Trichoderma spp. ทมประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus

ทดสอบประสทธภาพของเชอรา Trichoderma spp. ในการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus ดวยวธ dual culture plate (Skidmore and Dickinson, 1976)

Page 40: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

24

โดยเตรยมเชอรา Trichoderma spp. และเชอรา R. microporus เลยงบนอาหารเลยงเชอ PDA บมทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน ใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 มลลเมตร เจาะบรเวณขอบโคโลนของเชอรา Trichoderma spp. และ R. microporus วางหางจากขอบจานอาหารเลยงเชอ PDA 2 เซนตเมตร ในแนวตรงขามกน สวนกรรมวธชดควบคมวางเชอรา R. microporus อยางเดยวหางจากขอบจานอาหารเลยงเชอ 2 เซนตเมตร ท าการทดสอบ 4 ซ า บมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน วดรศมการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus และค านวณหาเปอรเซนตการยบยง (Morton and Stroube, 1955) จากสตร

(R1 - R 2) R1

เมอ R1 คอ รศมเฉลยของโคโลนเชอราสาเหตโรคทเจรญบนอาหารเลยงเชอในกรรมวธควบคม R2 คอ รศมเฉลยของโคโลนเชอราสาเหตโรคทเจรญบนอาหารเลยงเชอในกรรมวธทดสอบ

คดเลอกเชอรา Trichoderma spp. ทมประสทธภาพสงสดในการยบยงเชอ

รา R. microporus จ านวน 2 สายพนธ เพอใชในการศกษาตอไป 2. จ าแนกชนด และศกษาลกษณะทางสรระของเชอรา Trichoderma spp.

2.1 จ าแนกชนดเชอรา Trichoderma spp. ดวยลกษณะทางสณฐานวทยา

น าเชอรา Trichoderma spp. ซงมประสทธภาพในการยบยงเชอรา R. microporus โดยเลยงบนอาหารเลยงเชอ PDA เปนเวลา 3 วน ทอณหภมหอง เตรยม slide culture โดยตดชนวนอาหารเลยงเชอ PDA ใหมขนาดกวางยาว 1x1 เซนตเมตร วางบน แผนสไลดฆาเชอ แลวใชเขมเขยฆาเชอเขยปลายเสนใยเชอรา Trichoderma spp. ทเลยงไว เปนเวลา 3 วน แตะทขอบชนวนทง 4 ดาน แลวปดดวย cover slip ฆาเชอ วางบนชนอาหาร บมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน ศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอรา ไดแก ลกษณะเสนใย กานชสปอร (conidiophore) และไฟอะไลด (phialide) โคน เดย (conidia) คลามายโดสปอร (chlamydospore) ดวยกลองจลทรรศนแบบ stereo และ compound ตามวธการของ Rifai (1969); Gams และ Bissett (1998) และ Anees และคณะ (2010)

X 100 เปอรเซนตการยบยง =

Page 41: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

25

2.2 จ าแนกชนดของเชอรา Trichoderma spp. ดวยวธทางชวโมเลกล 2.2.1 การเตรยมเชอรา Trichoderma spp. และการสกด DNA

การสกด DNA ดดแปลงตามวธการของ Gupta และคณะ (2011) โดยเลยงเชอรา Trichoderma spp. ในอาหารเลยงเชอ PDA บมทอณหภมหองเปนเวลา 2 วน จากนนขดเสนใยใสหลอด centrifuge บดเสนใยใหละเอยด เตม CTAB buffer ปรมาตร 200 ไมโครลตร แลวบดเสนใยใหละเอยดอกครง บมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท (เขยาทก 10 นาท) เตม Chloroform isopropyl alcohol ปรมาตร 400 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวยเครองเขยาผสมสาร 1-2 นาท หมนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท ปเปตเอาเฉพาะสวนใส (supernatant) ใสหลอดใหม แลวลางตกตะกอนดวย isopropyl alcohol ปรมาตร 400 ไมโครลตร เขยาเบา ๆ น าไปหมนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท เทสวนใสทง เหลอตะกอน DNA ผงใหแหงทอณหภมหอง เปนเวลา 24 ชวโมง แลวละลายตะกอน DNA ดวยน า DI ปรมาตร 20 ไมโครลตร เกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

2.2.2 การวเคราะห DNA ตรวจสอบ DNA ทไดโดยการแยกดวยวธอเลกโทรโฟรซสใน agarose gel ความเขมขน 1เปอรเซนต โดยผสม DNA ปรมาตร 0.5 ไมโครลตร กบ 6X loading dye ปรมาตร 2.5 ไมโครลตร ใชปเปตดดใสลงในชองเจลวางอยในเครองอเลกโทรโฟรซสทม TAE buffer ความเขมขน 1 เทา ใชกระแสไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท ยอมเจลดวย ethidium bromide เปนเวลา 15 นาท แลวตรวจสอบ DNA ดวยเครอง UV transiluminator

2.2.3 การเพมปรมาณสวน internal transcribed spacers (ITS) โดยปฏกรยา PCR เพมปรมาณสวน ITS ของ rRNA โดยใช universal fungal primer (Neuvéglise et al., 1994) ไดแก Pn3 (forward) และ Pn16 (reverse)

2.2.4 การเตรยมสวนผสมของ PCR (PCR mixture) ผสมปฏกรยาของ PCR (ปรมาตรรวม 50 ไมโครลตร) ประกอบดวย DNA ปรมาตร 2 ไมโครลตร forward primer (Pn3) ปรมาตร 1 ไมโครลตร reverse primer (Pn16) ปรมาตร 1 ไมโครลตร DI water 21 ไมโครลตร และ Dream Taq Green PCR Mastermix ปรมาตร 25 ไมโครลตร

Page 42: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

26

2.2.5 การท าปฏกรยา PCR เมอผสมสวนผสมตาง ๆ เรยบรอยแลว จากนนท าปฏกรยาดวยเครอง Thermocycler โดยมปฏกรยาแตละขนตอนดงน Hot start 95 องศาเซลเซยส 3 นาท Denature 95 องศาเซลเซยส 30 วนาท Annealing 50 องศาเซลเซยส 30 วนาท Extension 72 องศาเซลเซยส 1 นาท Final extension 72 องศาเซลเซยส 5 นาท

2.2.6 การตรวจ PCR product ตรวจสอบ PCR product ทไดโดยการแยกดวยวธอเลกโทรโฟรซสใน

agarose gel ความเขมขน 1เปอรเซนต โดยผสม PCR product ปรมาตร 5 ไมโครลตร กบ 6X loading dye ปรมาตร 1 ไมโครลตร ใชปเปตดดใสลงในชองเจลทวางอยในเครองอเลกโทรโฟรซสทม TAE buffer ความเขมขน 1 เทา ใชกระแสไฟฟา 50 โวลต เปนเวลา 100 นาท ยอมเจลดวย ethidium bromide เปนเวลา 15 นาท แลวตรวจสอบ PCR product ดวยเครอง UV transiluminator

2.2.7 การอานล าดบเบส DNA (DNA sequencing) สงตวอยาง PCR products เพออานล าดบเบส DNA ทศนยเครองมอวทยาศาสตรมหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตหาดใหญ อ าเภอหาดใหญ จงหวดสงขลา

2.3 ศกษาลกษณะทางกายภาพของเชอรา Trichoderma spp. 2.3.1 ทดสอบความเปนกรด-ดาง (pH) ทเหมาะสมตอการเจรญของ

เชอรา Trichoderma spp. เตรยมอาหารเลยงเชอ PDA นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส

ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท ปรบ pH 4, 5, 6, 7 และ 8 จากนนเทอาหารใสจานเลยงเชอ รอจนอาหารแขงตว ตดปลายเสนใยเชอรา Trichoderma spp. อาย 3 วน ดวย cork borer ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร วางกลางจานอาหารเลยงเชอ บมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน ตรวจผลโดยการวดขนาดของโคโลน

35 รอบ

Page 43: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

27

2.3.2 ทดสอบอณหภมทเหมาะสมตอการเจรญของเชอรา Trichoderma spp. เลยงเชอรา Trichoderma spp. บนอาหารเลยงเชอ PDA เปนเวลา 3

วน แลวใช cork borer ตดปลายเสนใย ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร วางกลางจานอาหารเลยงเชอ PDA บมทอณหภมตงแต 20, 25, 30, 35 และ 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 วน ตรวจผลโดยการวดขนาดของโคโลน 3. ศกษากลไกการยบยงของเชอรา Trichoderma spp. ตอเชอรา Rigidoporus microporus สาเหตโรครากขาวของยางพารา

3.1 ศกษาลกษณะทางโครงสรางทเปลยนแปลงของเชอรา Rigidoporus microporus ศกษากลไกการเปนปฏปกษตอเชอรา R. microporus ตามวธการทดดแปลงจาก Pathan และคณะ (2010) โดยตดเสนใยของเชอรา R. microporus และเชอรา Trichoderma spp. วางตรงกนขามบนชนวน PDA ขนาด 1x1 เซนตเมตร บมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน จากนนน าตวอยางมาแชในสารละลาย glutaraldehyde ความเขมขน 2.5 เปอรเซนต ทละลายใน phosphate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร pH 7.3 บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ท าการ dehydrated ดวย graded ethanol series (50, 60, 70, 80, 90 และ 100 เปอรเซนต) ความเขมขนละ 2 ครง ๆ 15 นาท จากนนท าตวอยางใหแหงดวยเครอง critical point drying แลวน าตวอยางตดบนแทนวางตวอยาง (stub) และฉาบดวยทองค า ดวยเครอง sputter coater ศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอราดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด (scanning electron microscope, SEM)

3.2 ศกษาความสามารถในการสรางเอนไซม chitinase ของเชอรา Trichoderma spp. จากเชอรา Trichoderma spp. อาย 3 วน ใช cork borer ตดปลายเสนใย

ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร วางกลางจานอาหารเลยงเชอ PDA ทผสม colloidal chitin ความเขมขน 2.4 เปอรเซนต (นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท) (ดดแปลงจากวธการของ Roberts และ Selitrenkoff, 1985) บมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน ตรวจผลโดย เท congo red ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต ใหทวมผวหนาอาหาร เปนเวลา 30 นาท เททง แลวราดดวยสารละลาย NaCl ความเขมขน 1 โมลาร เปนเวลา 30 นาท เททง ลางดวยน ากลน สงเกตการเกดวงใส หากมวงใสรอบ ๆ ขอบโคโลนของเชอรา Trichoderma spp. แสดงวาเชอสามารถสรางเอนไซม chitinase ออกมายอย chitin ได อานผล

Page 44: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

28

เปนบวก แตถาไมเกดวงใสแสดงวาไมสามารถสรางเอนไซม chitinase ออกมายอย chitin อานผลเปนลบ

3.3 ศกษาประสทธภาพของสารปฏชวนะชนดทระเหยไดของเชอ รา Trichoderma spp. ตอการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus ทดสอบการสรางสารปฏชวนะชนดทระเหยไดของเชอรา Trichoderma spp. ตามวธการทดดแปลงจาก Parizi และคณะ (2012) และ Li และคณะ (2012) โดยเลยงเชอราปฏปกษ Trichoderma spp. บนอาหารเลยงเชอ PDA เปนเวลา 3 วน ใช cork borer เสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร ตดชนวนทมปลายเสนใย น าไปเลยงในขาวฟางนงฆาเชอ (นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท) ทบรรจในขวดดแรนขนาด 200 มลลลตร จ านวน 4 ชนตอขาวฟางน าหนก 250 กรม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 14 วน เตรยมเชอรา R. microporus อาย 3 วน ใช cork borer ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร ตดปลายเสนใย วางกลางจานอาหารเลยงเชอ PDA (สวนตวจานเลยงเชอ) แลวน าเชอรา Trichoderma spp. ทเลยงในขาวฟาง เปนเวลา 14 วน ใสลงจานเลยงเชอ (สวนตวจานเลยงเชอ) น าหนก 25 กรม จากนนน าเชอรา R. microporus ทเลยงบนอาหารเลยงเชอ PDA (สวนตวจานเลยงเชอ) เขาประกบกนกบตวของจานเลยงเชอทมเชอรา Trichoderma spp. เลยงในขาวฟาง ปดใหสนทดวยแผนพาราฟลม (ภาพท 1) สวนชดควบคมมเชอรา R. microporus และขาวฟางนงฆาเชอเพยงอยางเดยวบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน ค านวณหาเปอรเซนตการยบยง

ภาพท 1 การวางเลยงเชอเพอทดสอบประสทธภาพสารระเหยของเชอรา Trichoderma spp. ตอ

การเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus

แผนพาราฟลม

R. microporus

Trichoderma spp. เจรญบนขาวฟาง

ตวจานเลยงเชอ

PDA

Page 45: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

29

จากนนน าเชอรา Trichoderma spp. ทสามารถสรางสารระเหยยบยงเชอรา R. microporus วเคราะหเพอจ าแนกกลมของสารออกฤทธ ดวยเครอง Gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS) ทศนยเครองมอมหาวทยาลยสงขลานครนทรวทยาเขตหาดใหญ อ าเภอหาดใหญ จงหวดสงขลา โดยเตรยมเชอรา Trichoderma spp. อาย 3 วน ใช cork borer ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร ตดปลายเสนใยเลยงในขาวฟางนงฆาเชอ (อณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท) ทบรรจในขวดดแรน ขนาด 200 มลลลตร จ านวน 4 ชนตอขาวฟาง 250 กรม (ฝาขวดดแรนจดท าเปนพเศษ เพอใหสามารถแทงเขมฉดของเครอง GC-MS ดงภาพท 2) บมทอณหภมหอง เปนเวลา 14 วน แลวจงน าไปวเคราะห ภาพท 2 ลกษณะฝาขวดดแรนดดแปลง โดยเจาะฝาขวดใสจกยางแทน เพอสามารถแทงเขมฉด

ของเครอง GC-MS

3.4 ศกษาการสรางสารปฏชวนะชนดทแพรในอาหารของเช อ รา Trichoderma sp. ตอการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus

3.4.1 การสกดสารปฏชวนะจากเชอรา Trichoderma sp. เนองจากในการคดเลอกเชอรา Trichoderma spp. ตอการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ไดจ านวน 2 สายพนธ หนงในจ านวนนน พบวา ผลของน าเลยงเชอมประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus จงท าการสกดสารจากน าเลยงเชอรา Trichoderma sp. ดดแปลงจากวธการของ Jang และคณะ (2009) โดยเลยงเชอรา Trichoderma sp. บนอาหารเลยงเชอ PDA เปนเวลา 3 วน ใช cork borer ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร ตดปลายเสนใยไปเลยงในอาหารเหลว Potato dextrose broth (PDB) (นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท) ปรมาตร 250 มลลลตร จ านวน 5 ชน บมทอณหภมหอง เปนเวลา 30 วน กรองเอาสวนของตวเซลล และสปอรของเชอรา Trichoderma sp. ทง น าเฉพาะสวนน าเลยงมาสกดสาร โดยใช ethyl acetate เปนตว

ฝาขวดดแรน (พลาสตก)

เจาะฝาขวดใสจกยาง

Page 46: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

30

ท าละลาย เขยาใหเขากนตงทงไวใหแยกชน เปนเวลา 48 ชวโมง น าสวน ethyl acetate ท าใหแหงดวยเครอง rotary evaporator

3.4.2 การหาคา minimum inhibitory concentration (MIC) และminimum fungicidal concentration (MFC) ดวยวธ broth microdilution น าสารสกดหยาบมาทดสอบฤทธตานเชอรา R. microporus ดวยวธ broth microdilution ตามวธของ CLSI (2008) เลยงเชอรา R. microporus บนอาหารเลยงเชอ PDA บมทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน เตรยมเสนใยแขวนลอย เท 0.85 เปอรเซนต NaCl บนผวหนาโคโลนเชอรา R. microporus ขดเสนใยเทใสหลอดทดลองปราศจากเชอ ปรบความเขมขนใหได 0.4-0.5x104 โคโลนตอมลลลตร ดวยอาหาร Roswell Park Memorial Institute 1640

เตรยมสารสกดจากเชอรา Trichoderma sp. ดวยตวท าละลาย dimethyl sulfoxide (DMSO) และสารก าจดเชอรา carboxin ดวยน ากลนนงฆาเชอ เพอใชในการทดสอบหาคา MIC ท าการดดสารสกดทมความเขมขน 4,000, 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.50 และ 31.25 ตามล าดบ และสารก าจดเชอรา carboxin ทมความเขมขน 250, 125, 62.50, 31.25, 15.63, 7.81, 3.91 และ 1.95 ตามล าดบ (เจอจางสารสกด และสารก าจดเชอราแบบล าดบสอง (serial 2 fold dilution) ใหไดความเขมขน 8 ความเขมขน) ใสลงใน 96-well microtiter plates หลมละ 50 ไมโครลตร เตมเสนใยแขวนลอยของเชอรา R. microporus ปรมาตร 50 ไมโครลตร บมทอณหภมหอง เปนเวลา 72 ชวโมง บนทกความเขมขนต าสดของสารสกดทเชอราไมสามารถเจรญได อานผลเปนคา MIC

การทดสอบหาคา MFC โดยดดเชอราจากหลมทไมสามารถเจรญไดปรมาตร 100 ไมโครลตร เลยงบนอาหารเลยงเชอ PDA บมทอณหภมหอง เปนเวลา 72 ชวโมง บนทกความความเขมขนต าสดของสารสกด และสารเคมทเชอราไมสามารถเจรญได อานผลเปนคา MFC

3.4.3 ทดสอบฤทธตานเชอรา Rigidoporus microporus ดวยวธ Thin-layer chromatography bioautography ทดสอบฤทธตานเชอรา R. microporus ดวยสารสกดเชอรา Trichoderma sp. บนแผน TLC ตามวธการของ Zhao และคณะ (2008) โดยหยดสารสกดจากเชอรา Trichoderma sp. ทละลายดวย ethyl acetate ลงบนแผน TLC จากนนดงสารดวย hexane : ethyl acetate อตราสวน 8 : 1(ปรมาตรตอปรมาตร) แลวคว าแผน TLC อบดวยแสง UV เปนเวลา 12 ชวโมง จากนนหงายแผน TLC ขนแลวเทอาหารเลยงเชอ PDA ลงบนแผน TLC บาง ๆ รอจนอาหารแขง แลวจงวางเชอรา R. microporus ขนาดเสนผาศนยกลาง 5 มลลเมตร รอบ

Page 47: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

31

แผน TLC สวนชดควบคมวางเชอรา R. microporus ไมหยดสารสกดลงบนแผน TLC บมทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน สงเกตเหนวงใส ซงเปนบรเวณทสารสกดสามารถยบยงเชอรา R. microporus ได และค านวณหาคา rate of flow (Rf) ดงน Rf = A/B, A=ระยะทางทสารเคลอนทจากจดเรมตน และ B = ระยะทางทตวท าละลายเคลอนทจากจดเรมตนถงจดสงสด

จากนนน าสวนบรเวณทเกดการยบยงเชอรา R. microporus ไปวเคราะหดวยเครอง GC-MS เพอจ าแนกกลมของสารออกฤทธ 4 สตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp. เตรยมสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp. จ านวน 1 สายพนธ โดยคดเลอกจากสายพนธทมเปอรเซนตยบยงเชอรา R. microporus สง เจรญและสรางสปอรอยางรวดเรว มาผลตสตรส าเรจในรปแบบสตรแกรนล และแบบผง (ดดแปลงตามวธการของ Dubey และคณะ, 2009) ดงตารางท 2 ตารางท 2 สวนประกอบของสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp.

สตรแกรนล ผสมสวนประกอบตาง ๆ เขาดวยกนดวยเครองผสมจนเปนเนอ

เดยวกน น าสวนผสมทไดผานเครองแรงแกรนลเบอร 8 และผงใหแหงทอณหภมหอง เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนน ามาผานเครองแกรนลแรงเบอร 6 เพอใหไดแกรนลทมขนาดสม าเสมอเกบรกษาสตรส าเรจท อณหภม 4 องศาเซลเซยส

สตรผง ผสมสวนประกอบตาง ๆ เขาดวยกนดวยเครองผสมจนเปนเนอเดยวกน ผงใหแหงทอณหภมหอง เปนเวลา 24 ชวโมง แลวบดใหเปนผงละเอยด เกบรกษาสตรส าเรจทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

สวนประกอบ สตรส าเรจ

สตรแกรนล สตรผง Peat powder 40 กรม 40 กรม Cassava powder - 40 กรม Wheat powder 40 กรม สปอรเชอรา Trichoderma sp. (ความเขมขน 1010โคโลนตอมลลลตร)

15 มลลลตร 15 มลลลตร

Page 48: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

32

4.1 การประเมนผลสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp. 4.1.1 การทดสอบความสม าเสมอ และการกระจายตวของเชอรา Trichoderma sp. ในสตรส าเรจ สมสตรส าเรจ จ านวน 5 จด ๆ ละ 1 กรม ตรวจนบปรมาณเชอราดวยวธ dilution spread plate โดย ท าการทดสอบความเขมขนละ 4 ซ า หาคาเฉลยจ านวนเชอรา Trichoderma sp. ในสตรส าเรจนน ๆ

4.1.2 การทดสอบความเปนกรด-ดาง (pH) เตรยมสารแขวนลอยของสตรส าเรจทความเขมขน 1 เปอรเซนต วดคา pH ดวย pH meter โดยวด 5 ครง หาคาเฉลย

4.1.3 ความสามารถในการละลายน า ชงสตรส าเรจ 1 กรม ใสในน ากลน 99 มลลลตร แลวน ามาละลายโดย

ใชแทงแมเหลกคน ตงความเรวรอบ 200 รอบตอนาท จนกระทงสตรส าเรจละลายน า บนทกระยะเวลาในการละลายน าแตละสตรส าเรจ ท าการทดลอง 4 ซ า แลวหาคาเฉลย 4.1.4 ทดสอบการมชวตรอดของเชอรา Trichoderma sp. ในสตรส าเรจ โดยตรวจนบปรมาณเชอราในสตรส าเรจทนทหลงผลตได เปนเวลา 24 ชวโมง และนบทกเดอนหลงจากการเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอนดวยวธ dilution spread plate บนอาหาร TSM ท าการทดสอบ 4 ซ า และหาคาเฉลยของแตละสตร 4.1.5 ทดสอบประสทธภาพการยบยงเชอรา Rigidoporus microporus ของเชอรา Trichoderma sp. ในสตรส าเรจ โดยทดสอบประสทธภาพของสตรส าเรจตอการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus โดยวธ dual culture plate หลงผลตได เปนเวลา 24 ชวโมง และทกเดอน เปนเวลา 6 เดอน วดขนาดเสนผาศนยกลางเปรยบเทยบกบชดควบคม หาเปอรเซนตการยบยง

Page 49: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

33

5 ศกษาการเพมปรมาณของเชอรา Trichoderma sp. สตรส าเรจในปย ความชนตาง ๆและทดสอบประสทธภาพตอการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus

เพอใหเชอรา Trichoderma sp. เจรญ และสามารถตงรกรากในดนไดดยงขน จงไดศกษาผสมสตรส าเรจกบป ยคอก (มลไก และมลวว) และป ยอนทรย ดงน

5.1.ทดสอบการเพมปรมาณของเชอรา Trichoderma sp. ในปยคอก (มลไก มลวว) และปยอนทรย การเตรยมมลไก มลวว และป ยอนทรย โดยชงตวอยางละ 100 กรม ปรบใหมความชน 25 เปอรเซนต แบงดนเปน 2 สวน สวนแรก น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท แลวจงผสมสตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp. น าหนก 1 กรม

สวนทสอง ไมนงฆาเชอ น าผสมสตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp. น าหนก 1 กรม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 15 วน เปรยบเทยบรอยละการเจรญ ทก 0, 5, 10 และ 15 วน เพอศกษาการเพมจ านวนของเชอรา Trichoderma sp. ในป ยคอก (มลไก และมลวว) และป ยอนทรย โดยวธ dilutions spread plate บนอาหาร TSM ท าการทดสอบ 4 ซ า และหาคาเฉลย 5.2 ทดสอบการเพมปรมาณของเชอรา Trichoderma sp. ในปยทปรบใหมความชนตางกน

น าป ยทผานคดเลอกการเพมปรมาณเชอรา Trichoderma sp. ปรบความชนของป ย เปน 25, 30 และ 35 เปอรเซนต โดยการเตรยมความชนจะเรมชงน าหนกเรมแรกของดน อบทอณหภม 105 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง ชงน าหนกแหง ค านวณหาเปอรเซนตความชน จากสตร

น าหนกเรมแรก-น าหนกแหง

6.

จากนนน ามานงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท แลวน าสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma sp. เลยงในป ย อตราสวน

เปอรเซนตความชน = X100 น าหนกแหง

Page 50: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

34

0.1 : 50 กรม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 15 วน เปรยบเทยบรอยละการเจรญ ศกษาการเพมจ านวนของเชอรา Trichoderma sp. ในป ยดวยวธ dilutions spread plate บนอาหาร TSM ท าการทดสอบ 4 ซ า และหาคาเฉลย 5.3 ทดสอบประสทธภาพของสตรส าเรจในปยตอการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus

น าป ยทมเชอรา Trichoderma sp. เจรญอยมาทดสอบการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus ดวยวธ dual culture plate วดขนาดเสนผาศนยกลางเปรยบเทยบกบชดควบคม ค านวณหาเปอรเซนตการยบยง 6 ทดสอบการยบยงการเจรญของเชอราสาเหตโรครากขาวในดนปลก

ทดสอบการยบยงการเจรญของเชอราสาเหตโรครากขาวในดนปลกโดยดดแปลงจากวธการของ Fox (1977)

6.1 การเต รยมเช อรา Rigidoporus microporus โดยเล ย ง เ ช อ รา R. microporus บนอาหารเลยงเชอ PDA ปรมาตร 5 มลลลตร ทบรรจในหลอดทดลองขนาด 2.5 X 15 เซนตเมตร (นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท) บมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

6.2 การเตรยมดน เปนดนทใชในการปลกยาง โดยบดดนใหรวนผสมแกลบอตราสวน 10 : 1 คลกเคลาใหเขากน ปรบใหมความชน 25 เปอรเซนต โดยเตรยมความชนเชนเดยวกบขอ 5.2 แลวจงแบงดนเปน 2 สวน

6.2.1 สวนแรก น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 20 นาท แลวจงผสมป ยอนทรยทมสตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp. เจรญอยในอตราสวน 10 : 1 กรม 6.2.2 สวนทสอง เปนดนทไมนงฆาเชอผสมป ยอนทรยทมสตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp. ในอตราสวน 10 : 1 กรม

6.3 การทดสอบ บรรจดนจากขอ 6.2.1 และ 6.2.2 ในหลอดทเตรยมไวในขอ 6.1 หลอดละ 15 กรม สวนชดควบคม ใสดนผสมแกลบ และผสมกบป ยอนทรยทไมมเชอรา

Page 51: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

35

Trichoderma sp. เตรยมชดทดสอบละ 4 ซ า บมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน บนทกผล โดยวดความสงของเสนใยเชอรา R. microporus ทเจรญ เปรยบเทยบกบชดควบคม ค านวณหาเปอรเซนตการยบยง

7. ประเมนศกยภาพของรา Trichoderma sp. ในปยคอกหรอปยอนทรยตอการควบคมโรครากขาวในเรอนกระจก

7.1 การเตรยมเชอรา Rigidoporus microporus เตรยมโดยเลยงเชอรา R. microporus ในถงเพาะเหดปราศจากเชอทมสวนผสมของ ขเลอยยางพารา : ร า : น าตาลทราย : น า อตราสวน 100 : 3 : 2 : 50 (โดยน าหนก) ถงละ 400 กรม บมเลยงทอณหภมหอง เปนเวลา 4 เดอน (อารมณ โรจนสจตร, 2541)

7.2 การเตรยมดน ใชดนไมนงฆาเชอ มาจากพนทเดยวกน ผสมดนกบแกลบ อตราสวน 10 : 1 ใหสม าเสมอกน กระถางละ 1.5 กโลกรม

7.3 การปลกเชอ และการปลกตนยาง ใชตนกลายางพนธ RRIM 600 อาย 8

เดอน ปลกในกระถางขนาดเสนผานศนยกลาง 12 นว กระถาง ละ 3 ตน และปลกเชอโดยฝงกอนเชอลงกลางกระถาง ๆ ละ 1 กอน

7.4 การใสปยคอกหรอปยอนทรยสตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp. ใสป ย

บรเวณโคนตนยาง กระถางละ 125 กรม คลกเคลาใหเ ขากน วางแผนการทดลองแบบ Completely Randomized Design 6 กรรมวธ 10 ซ า ซ าละ 3 ตน ดงน

กรรมวธท 1 ดน+สตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp.+ป ยอนทรย+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus

กรรมวธท 2 ดน+สตรส าเรจเชอรา Trichoderma sp.+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus

กรรมวธท 3 ดน+สารก าจดเชอรา carboxin 2 กรม+ตนกลายาง+ เชอรา R. microporus

กรรมวธท 4 ดน+ป ยอนทรย+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus กรรมวธท 5 ดน+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus

Page 52: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

36

กรรมวธท 6 ดน+ตนกลายาง ประเมนระดบความรนแรงของโรคโดยใหระดบความรนแรงของโรคตาม

วธการทดดแปลงจาก Wattanasilakorn และคณะ (2012) ระดบ 0 ไมแสดงอาการ ระดบ 1 แสดงอาการเหยว ระดบ 2 แสดงอาการใบเหลอง ระดบ 3 แสดงอาการใบรวง ระดบ 4 แสดงอาการตนตาย น าคาจากการประเมนระดบความรนแรงในการเกดโรคมาค านวณเปอรเซนต

ลดการเกดโรค และดชนการเกดโรค จากสตร

เปอรเซนตลดการเกดโรค =100-

วเคราะหผลทางสถตดวยวธ Duncan´s Mutiple Range Test พรอมทงทดสอบ

คณสมบตบางประการ เชน Total N, Avaliable P, Avaliable K และ pH ของดนปลกยางพารา

หลงสนสดการทดลอง เปนเวลา 4 เดอน

ความรนแรงของโรคในกรรมวธทดสอบ

ความรนแรงของโรคในกรรมวธควบคม

ดชนการเกดโรค = ผลรวมการเกดโรคแตละระดบ

จ านวนตนยาง x ระดบการเกดโรคสงสด X 100

X 100

Page 53: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

37

บทท 3 ผล และวจารณผลการทดลอง

1. การคดเลอกเชอรา Trichoderma spp. มประสทธภาพในการยบยงเชอรา Rigidoporus microporus

1.1 การเกบตวอยางดน และแยกเชอรา Trichoderma spp. แยกเชอรา Trichoderma spp. จากตวอยางดนจ านวน 86 ตวอยาง (ตาราง

ภาคผนวกท 1) ดวยวธ dilution spread plate บนอาหาร TSM โดยคดเลอกจากโคโลนทมลกษณะการสรางเสนใยทเจรญเรว ไดจ านวน 356 ไอโซเลท ในระยะแรกโคโลนมเสนใยสขาวหลงจากนนมการสรางสปอรสเขยว เรยงเปนวงรอบหรอเปนวงแหวน (ภาพท 3) ทงน Rifai (1969) และ Bissett (1991) รายงานวา ลกษณะทางสณฐานวทยาของ เชอรา Trichoderma spp. สามารถใชคดแยกความแตกตางในกลม Hyphomycete ออกจากเชอรากลมอน แตไมสามารถแยกความแตกตางระหวางสายพนธออกจากกนไดใชเปนเพยงขอสงเกตเบองตนในการจ าแนกเชอรา Trichoderma spp. ซงการเจรญรวดเรวเปนความโดดเดนทมประโยชนอยางมากส าหรบการระบโดยทวไปวาเชอรา Trichoderma spp. แตไมเพยงพอในการจ าแนกชนดของเชอรา โดยทวไปเชอรา Trichoderma spp. สรางสปอรสเขยว แตในบางกรณอาจเปนสขาวหรอสเหลองหรอสเทาขนอยกบสายพนธ

ภาพท 3 โคโลนของเชอรา Trichoderma spp. บนอาหารเลยงเชอ TSM หลงการแยกเชอดวยวธ dilution spread plate ทความเขมขนของดน 10-4 เปนเวลา 7 วน

Page 54: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

38

1.2 การคดเลอกเชอรา Trichoderma spp. ทมประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus

เมอน าเชอรา Trichoderma spp. ทแยกไดมาทดสอบประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ดวยวธ dual culture plate พบวา เชอรา Trichoderma spp. ทง 356 ไอโซเลท สามารถยบยงเชอรา R. microporus ได 48.57-91.43 เปอรเซนต (ตารางภาคผนวกท 2) โดยไอโซเลท NL2.2 และ ChM1.1 สามารถยบยงไดดทสด มเปอรเซนตการยบยงเทากบ 91.43 และ 88.57 เปอรเซนต ตามล าดบ (ภาพท 4) Gaiera และคณะ (2013) รายงานวา เชอรา Trichoderma spp. มกลไกการยบยงเชอสาเหตโรคพชหลายวธ แบงเปนกลไกทางตรง และทางออม กลไกทางตรง เชน การเปนปรสตของเชอสาเหตโรคโดยใชเสนใยพนรด และแทงเขาเสนใยของเชอสาเหตโรคพช ดดกนสารอาหารภายในเซลลของเชอสาเหตโรคพช แลวท าใหเกดความผดปกตไมสามารถเจรญตามปกตได และกลไกทางออม เชน การแขงขนในดานการครอบครองพนท และสารอาหาร การสรางสารปฏชวนะชนดตาง ๆ และเหนยวน ากลไกใหพชเกดความตานทานตอเชอสาเหตโรคพช ซงกลไกเหลานท าใหเชอรา Trichoderma spp. มความโดดเดนในการเปนจลนทรยปฏปกษเพอใชควบคมโรคพชโดยชววธทน ามาใชกนอยางกวางขวาง สอดคลองกบการรายงานของ Harman (2000) ทรายงานวา การเปนปรสตของเชอสาเหตโรคพช การสรางสารปฏชวนะ การแขงขนในดานการครอบครองพนท และสารอาหาร และชกน าใหพชเกดความตานทานตอเชอสาเหตโรคพชเปนกลไกทส าคญทท าใหเชอรา Trichoderma spp. สามารถเปนจลนทรยปฏปกษทมศกยภาพในการควบคมโรคพช

Page 55: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

39

ภาพท 4 โคโลนของเชอรา Trichoderma spp. และเชอรา Rigidoporus microporus บนอาหาร

เลยงเชอ PDA เมอทดสอบดวยวธ dual culture plate หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

ก. เชอรา Trichoderma sp. ChM1.1 (ซาย)+เชอรา R. microporus (ขวา) ข. เชอรา Trichoderma sp. NL2.2 (ซาย)+เชอรา R. microporus (ขวา) ค. เชอรา R. microporus อยางเดยว (ชดควบคม)

T R

T R

R

Page 56: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

40

2. จ าแนกชนดของเชอรา Trichoderma spp.

2.1 จ าแนกเชอรา Trichoderma spp. ทางสณฐานวทยา จากการน าเชอรา Trichoderma spp. ChM1.1 และ NL2.2 ซงสามารถ

ยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ไดสงสดมาจ าแนกทางสณฐานวทยา พบวา ทง 2 ไอโซเลท มลกษณะตรงกบ เชอรา T. harzianum โดยเชอรา T. harzianum ChM1.1 มการเจรญอยางรวดเรวในอาหารเลยงเชอ PDA โดยในระยะแรกเสนใยมสขาว และมการเจรญอยางรวดเรวภายใน 2 วน หลงจากนนมการสรางสปอรสเขยวจ านวนมากมายภายใน 7 วน โดยกลมสปอรมสเขยวออน ลกษณะคอนขางกลม ผวเรยบ มขนาด 2.5-2.7x2.5-2.8 ไมโครเมตร กานชสปอรจะแตกกงกานสาขาจ านวนมาก และสรางสารบางอยางแพรในอาหารเลยงเชอ PDA ปรากฏเปนสเหลอง (ภาพท 5) ส าหรบเชอรา T. harzianum NL2.2 พบวา มการเจรญอยางรวดเรวในอาหารเลยงเชอ PDA เชนกน โดยในระยะแรกเสนใยมสขาวเจรญขน หลงจากนนมการสรางสปอรสเขยวภายใน 5 วน โดยมกลมสปอรส เขยวออน ลกษณะคอนขางกลม ผวเ รยบ มขนาด 2.5-3.5x2.1-2.8 ไมโครเมตร กานชสปอรจะแตกกงกานสาขาจ านวนมาก (ภาพท 6) ซงจากการจดจ าแนกเชอรา T. harzianum ตรงกบท Bissett (1991) รายงานวา โคโลนของเชอรา T. harzianum เจรญเรว กานชสปอรแตกกงกานมากมาย สปอรคอนขางกลม หรอเปนวงร มขนาดเลกกวา 2.5-3.5x2.1-3.0 ไมโครเมตร เมอแกเตมทจะเปนสเขยวออน จนถงเขยวเขม

Page 57: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

41

ภาพท 5 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอรา Trichoderma harziamum ChM1.1

ก. โคโลน อาย 7 วน บนอาหารเลยงเชอ PDA ข. conidiophores, phialide และ phialospores ค. phialospores

conidiophores

phialospores

phialide

2.5 µm

2.5 µm ค

Page 58: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

42

ภาพท 6 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอรา Trichoderma harziamum NL2.2

ก. โคโลน อาย 7 วน ข. conidiophores, phialide และ phialospores ค. phialospores

conidiophores

phialospores

phialide

2.5 µm

2.5 µm ค

Page 59: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

43

2.2 จ าแนกชนดของเชอรา Trichoderma harziamum. ChM1.1 และ NL2.2 ดวยวธทางชวโมเลกล

จากการน าเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ซงสามารถยบยงเชอรา R. microporus ไดสงสดมาจ าแนกชนดทางชวโมเลกล โดยการเพมปรมาณ DNA ในสวน ITS1-5.8S-ITS2 ดวย primer Pn3 (forward) และ Pn16 (reverse) แลวสง PCR products (ภาพท 7) เพออานล าดบเบส DNA ทศนยเครองมอวทยาศาสตรมหาวทยาลยสงขลานครนทร ท าการตรวจสอบล าดบเบสบน DNA จากนนน าล าดบเบส DNA ทได ตรวจสอบโดยโปรแกรม BLAST search จากฐานขอมลใน GenBank ของ National Center for Biotechology Information (NCBI) เพอคนหาสายพนธ เ ชอราทมความสมพนธใกลเคยงกนมากทสด พบวา เชอรา Trichoderma spp ทง 2 ไอโซเลท มความสมพนธใกลเคยงกนกบเชอรา T. harzianum มากถง 99 เปอรเซนต

ภาพท 7 ขนาด PCR products ของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 เมอ

เปรยบเทยบกบ Markers (100 bp ladder)

NL2.2

Marke

rs

ChM1

.1

2072 1500

600

100

650

Page 60: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

44

2.3 ศกษาลกษณะทางกายภาพของเชอรา Trichoderma harziamum ChM1.1 และ NL2.2

2.3.1 ทดสอบความเปนกรด-ดาง (pH) ทเหมาะสมตอการเจรญของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2

จากการศกษา พบวา เชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 สามารถเจรญไดในทก pH ตงแต 4-8 โดย เชอรา T. harzianum ChM1.1 สามารถเจรญไดดใน pH 6-7 รองลงมาใน pH 8, 5 และ 4 ตามล าดบ (ตารางท 3 และ ภาพท 8) สวนเชอรา T. harzianum NL2.2 สามารถเจรญไดดใน pH 6-8 รองลงมาใน pH 5 และ pH 4 ตามล าดบ (ตารางท 3 และ ภาพท 9) สอดคลองกบรายงานของ Kolli และคณะ (2012) ทศกษาความสามารถในการเจรญของเชอรา Trichoderma spp. ใน pH ตาง ๆ ไดแก pH 4.5 5.5 6.5 และ 7.5 จากการศกษา พบวา เชอรา Trichoderma spp. จ านวน 25 ไอโซเลท สามารถเจรญไดดทสดท pH 7.5 รองลงมาคอ pH 5.5 และ 6.5 ตามล าดบ สวนท pH 4.5 สามารถเจรญไดนอยทสด อยางไรกตามเมอเปรยบเทยบเฉพาะเชอรา T. harzianum เพยงสายพนธ เดยว พบวา สามารถเจรญไดดใน pH 7.5, 6.5, 5.5 และ 4.5

ตารางท 3 การเจรญของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 บนอาหารเลยง

เชอ PDA ท pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

** แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

pH ขนาดเสนผาศนยกลาง (เซนตเมตร) ChM1.1 NL2.2

4 6.03±0.10d1/ 6.25±0.35b 5 7.45±0.05c 6.30±0.35b 6 8.03±0.12ab 7.58±0.05a 7 8.35±0.09a 7.68±0.05a 8 7.93±0.22b 7.92±0.33a

F-test ** ** C.V. (%) 3.25 1.43

Page 61: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

45

ภาพท 8 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 บนอาหารเลยงเชอ PDA ทมระดบ pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน ก. pH 4 ข. pH 5 ค. pH 6 ง. pH 7 จ. pH 8

ก ข

ค ง

Page 62: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

46

ภาพท 9 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 บนอาหารเลยงเชอ PDA ทมระดบ

pH ตาง ๆ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน ก. pH 4 ข. pH 5 ค. pH 6 ง. pH 7 จ. pH 8

ง ค

ข ก

Page 63: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

47

2.3.2 ทดสอบ อณหภม ท เ หมาะสม ตอการ เ จ รญของ เช อ ร า Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 สามารถเจรญไดดทสด

จากการทดสอบความสามารถในการเจรญทอณหภมทแตกตางกน ตงแต 20, 25, 30, 35 และ 40 องศาเซลเซยส พบวา เชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 สามารถเจรญไดดในอณหภม 20-25 องศาเซลเซยส เจรญลดลงทอณหภม 30 และ 35 องศาเซลเซยส และไมสามารถเจรญทอณหภม 40 องศาเซลเซยส (ตารางท 4 และ ภาพท 10) และ (ตารางท 4 และ ภาพท 11) สอดคลองกบการทดลองของ Yates และคณะ (2008) ทรายงานวา เชอรา Trichoderma spp. สามารถทนและเจรญไดดในอณหภม 15-35 องศาเซลเซยส นอกจากน จากการศกษาของ Anees และคณะ (2010) ซงไดทดสอบความสามารถในการเจรญของเชอรา Trichoderma spp. ในอณหภม 20, 25, 30, 35 และ 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 72 ชวโมง พบวา เชอรา Trichoderma spp. มการเจรญเปนปกตทอณหภม 25-30 องศาเซลเซยส เจรญลดลงทอณหภม 35 องศาเซลเซยส และไมสามารถเจรญทอณหภม 40 องศาเซลเซยส

ตารางท 4 การเจรญของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 บนอาหารเลยง

เชอ PDA ทอณหภมตาง ๆ หลงการบม เปนเวลา 2 วน

** แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

อณหภม (องศาเซลเซยส) ขนาดเสนผาศนยกลาง (เซนตเมตร)

ChM1.1 NL2.2 20 9.00±0.00a1/ 9.00±0.00a

25 9.00±0.00a 9.00±0.00a 30 3.13±0.05b 5.20±0.00b 35 0.96±0.08c 2.28±0.08c 40 0.50±0.00d 0.50±0.00d

F-test ** ** C.V. (%) 0.035 0.025

Page 64: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

48

ภาพท 10 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 บนอาหารเลยงเชอ PDA หลง

การบมทอณหภมตาง ๆ เปนเวลา 2 วน ก. 20 องศาเซลเซยส ข. 25 องศาเซลเซยส ค. 30 องศาเซลเซยส ง. 35 องศาเซลเซยส จ. 40 องศาเซลเซยส

ก ข

ค ง

Page 65: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

49

ภาพท 11 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 บนอาหารเลยงเชอ PDA หลงการ

บมทอณหภมตาง ๆ เปนเวลา 2 วน ก. 20 องศาเซลเซยส ข. 25 องศาเซลเซยส ค. 30 องศาเซลเซยส ง. 35 องศาเซลเซยส

จ. 40 องศาเซลเซยส

Page 66: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

50

3. ศกษากลไกการยบยงของเชอรา Trichoderma harzianum. ChM1.1 และ NL2.2 ตอเชอรา Rigidoporus microporus สาเหตโรครากขาวของยางพารา

3.1 ศ ก ษ า ล กษณะท า ง โค ร งส ร า ง ท เ ป ล ยนแป ล งขอ ง เ ช อ ร า Rigidoporus microporus จากการศกษาลกษณะทางโครงสราง ท เปลยนแปลงไปของเช อรา R. microporus เมอเลยงรวมกบเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด พบวา เสนใยของเชอรา R. microporus มลกษณะผดปกต โดยเกดเปนรพรน และฉกขาด เมอเปรยบเทยบกบชดควบคมซงเลยงเชอรา R. microporus อยางเดยว (ภาพท 12) อาการผดปกตของเสนใยเชอรา R. microporus ทเกดขน เปนผลมาจากเสนใย และสปอรของเชอรา Trichoderma spp. สมผสกบเสนใยของเชอรา R. microporus แลวผลตสารบางอยางออกมาท าใหผนงเซลลผดปกต ทงน Collmer และ Keen (1986) ไดรายงานวา เชอรา Trichoderma spp. ยบยงการเขาท าลายของเชอสาเหตโรคพช โดยเสนใยเขาไปสมผส พนรด และเจาะเสนใยของเชอสาเหตโรคพช ท าใหโครงสรางเซลลผดปกตไป เกษม สรอยทอง (2551) กลาววา เชอรา Trichoderma spp. สามารถสรางสารพษปลดปลอยออกภายนอกเซลล สารดงกลาวมคณสมบตในการยบยงหรอท าลายเซลลของเชอสาเหตโรคทอาศยอยบรเวณนน สงผลใหเชอสาเหตโรคพชถกท าลาย นอกจากน Intana (2003) รายงานวา จากการเลยงเชอรา T. harzianum รวมกบเชอ Pythium aphanidermatum ดวยวธ dual culture เปนเวลา 4 วน และ 6 วน พบวา จากการเลยงรวมกนเปนเวลา 4 วน เสนใยของเชอรา T. harzianum มการพนรด และปลอยสารบางอยางออกมาท าใหเสนใยของเชอ P. aphanidermatum ผดปกต ในขณะทการเลยงรวมกนเปนเวลา 6 วน พบวา เชอรา T. harzianum มการสรางสปอรเพมมากขน และเมอเสนใยของเชอ P. aphanidermatum สมผสกบสปอรของเชอรา T. harzianum จะมลกษณะเหยว และเปนรพรน สงผลใหเสนใยถกท าลาย

Page 67: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

51

ภาพท 12 เสนใยเชอรา Rigidoporus microporus แสดงอาการเหยว เกดรพรน และฉกขาด เมอ

วางเลยงรวมกบเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน

ก.และ ค. เชอรา R. microporus รวมกบ เชอรา T. harzianum ChM1.1 ข. และ ง. เชอรา R. microporus รวมกบ เชอรา T. harzianum NL2.2 จ. เชอรา R. microporus (ชดควบคม) มลกษณะเสนใยปกต Conidia of Trichoderma spp. =Tc, R. microporus=R และ hole=ho

R Tc ho Tc R Tc ก

ก ข

ค ง

R

Tc

Tc

R

R

Tc

ho

Tc R

R

Page 68: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

52

3.2 ศกษาความสามารถในการสรางเอนไซม chitinase ของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2

จากการศกษาการสราง chitinase ของเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 โดยสงเกตการเกดวงใสรอบโคโลน พบวา เชอรา Trichoderma spp. ทง 2 ไอโซเลท สามารถสรางเอนไซม chitinase ออกมายอย colloidal chitin ในอาหารเลยงเชอได จงใหผลเปนบวก (ภาพท 13) Agrawal และ Kotasthane (2012) กลาววา chitin เปนองคประกอบทส าคญในผนงเซลลของเชอรา การทเชอรา Trichoderma spp. สามารถผลตเอนไซม chitinase ซงสามารถยอยสะลาย chitin จงท าใหมคณสมบตในยบยงเชอสาเหตโรคพชทเกดจากเชอราได จงจดเปนกลไกส าคญในการควบคมโรคพชของเชอรา Trichoderma spp. สอดคลองกบการทดลองของ Tokimoto (1982) Sivan และ Chet (1986) Kubicek และคณะ (2001) ทรายงานวาผนงเซลลของเชอรามโครงสรางหลกสวนใหญเปน chitin, glucan และ proteins การทเชอรา Trichoderma spp. มกลไกการปรสตตอเชอสาเหตโรคพช และผลตเอนไซมทสามารถยอยสลายองคประกอบเหลานกจะชวยสงเสรมประสทธภาพของกลไกหลกในการยบยงเชอราสาเหตโรคพช Haran และคณะ (1996) และ Balasubramanian (2003) รายงานวา เชอรา T. flavofuscum, T. harzianum และ T. viride เปนจลนทรยปฏปกษทมการใชในการควบคมโรคพชโดยชววธมากทสด กลไกทสามารถควบคมเชอราโรคพชสวนใหญ คอ การผลต antibiotics และเปนปรสตของพชโดยตรง สามารถเขาท าลายแลวหลงเอนไซม เชน cellulase, chitinase, β-1,3-glucanase และ proteases โดยเอนไซมเหลาน สามารถท าลายสวนของผนงเซลลเชอราสาเหตโรคพช ซงมองคประกอบเปน cellulose, chitin, glucan และ proteins (Lorito et al., 1994; Carsolio et al., 1999) ท าใหเชอราสาเหตโรคพชหยดการเจรญ

Page 69: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

53

ภาพท 13 ลกษณะการสรางวงใสทเกดจากการยอย substrate โดยเอนไซม chitinase บนอาหาร

เลยงเชอ PDA ทผสม colloidal chitin 2.4 เปอรเซนต หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 วน ก. วงใสทเกดจากการยอย chitin โดยเอนไซม chitinase ของเชอรา T. harzianum

ChM1.1 ข. วงใสทเกดจากการยอย chitin โดยเอนไซม chitinase ของเชอรา T. harzianum

NL2.2 3.3 ศ กษา การส ร า งสา ร ปฏ ช ว นะช น ด ท ร ะ เหยไ ด ของ เ ช อ ร า Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ตอการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus จากการศกษาประสทธภาพของสารระเหยของเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ตอการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus พบวา มประสทธภาพในการยบยงไดเทากนคอ 94.4 เปอรเซนต (ตารางภาคผนวกท 3 และ ภาพท 14) และเมอวเคราะหองคประกอบหลกของสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 โดยใชเครอง GC-MS พบวา องคประกอบหลกของสารระเหยของเชอรา T. harzianum ChM1.1 ไดแก 3-octanone, benzeneacetaldehyde, 3-octanyl acetate, pentadecane, 4-heptanol,4-ethyl-2,6-dimethyl-, Hexadecane, 2,6,10,14-tetramethyl และ Hydroxymethylcyclododecane (ตารางภาคผนวกท 4 และ ภาพท 15) โดย พบวา มสาร 3-octanone ปรมาณมากทสด 29.82 เปอรเซนตของสารทวเคราะหไดทงหมด โดย 3-octanone เปนสารทจดอยในกลมของแอลกอฮอลมฤทธในการยบยงเชอราสาเหตโรคพช โดยมผลไปท าลายสวน

ก ข

Page 70: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

54

ของโปรตนของเชอสาเหตโรค ซงโปรตนเปนองคประกอบพนฐานในเซลลของสงมชวตทกชนด และมหนาทส าคญภายในเซลลเชน เอนไซมทท าใหเกดปฏกรยาทางเคมตาง ๆ ของสงมชวต โปรตนทมโครงสรางซบซอนจะมความส าคญมากในกระบวนการตาง ๆ ภายในเชลล แตหากโปรตนถกท าลายเสยสภาพ (denaturation) ท าใหไมสามารถท าหนาทนน ๆ ได โครงสรางของโปรตนถกท าลายเมอพนธะทใชยดโครงสรางถกท าลายดวยสารกลมแอลกอฮอล โดยสารกลมแอลกอฮอลจะไปสลายพนธะไฮโดรเจนในสวนทเชอมโยงอะตอมไฮโดรเจนและออกซเจน ซงตอกนเหมอนลกโซ ท าใหโมเลกลของโปรตนสญเสยรปรางมผลตอการท างานของโปรตน (นรนาม, 2556) และองคประกอบหลกของสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T. harzianum NL2.2 ไดแก 1-butanol 3-methyl-, benzeneethanol, à-bergamotene, 1-methyl-4(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-methylbenzene, 6 amyl à pyrone, zingibereneá, à-bisabolene, á-sesquiphellandrene และ 2(1H)-naphthalenone4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-8a-methyl-, trans- (ตารางภาคผนวกท 5 และ ภาพท 16 ) โดยพบวา มสาร 6 amyl à pyrone และสาร benzeneethanol ปรมาณการผลตมากทสด 14.72 และ 13.16 เปอรเซนต ของสารทวเคราะหไดทงหมด ตามล าดบ โดยสาร benzeneethanol จดอยในกลมแอลกอฮอลเปนสารทมฤทธแบบเดยวกนกบสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T. harzianum ChM1.1 สวนสาร 6 amyl à pyrone มคณสมบตเปนสารปฏชวนะ จงมฤทธในการยบยงเชอราสาเหตโรค Pezet และคณะ (1999) รายงานวา สาร 6-pentyl-a-pyrone ทสกดไดจากสายพนธของเชอรา Trichoderma spp. มคณสมบตเปนสารปฏชวนะสามารถยบยงการเจรญของเสนใย และการงอกของสปอรของเชอรา Botrytis cinerea สอดคลองกบการศกษาของ Claydon และคณะ (1987) ทศกษาประสทธภาพของสารระเหย 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one และ 6-n-pentenyl-2H-pyran-2-one ของเชอรา T. harzianum 2 สายพนธ พบวา มคณสมบตในการยบยง และลดอตราการเขาท าลายของเชอรา Rhizoctonia solani สาเหตโรค damping off ในตนกลาผกกาดหอม

Page 71: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

55

ภาพท 14 ประสทธภาพของสารระเหยของเชอรา Trichoderma harzianum ChM1.1 และ

NL2.2 ตอเชอรา Rigidoporus microporus หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

ก. เชอรา T. harzianum ChM1.1 ทเจรญบนเมลดขาวฟาง (ดานลาง) ปลอยสารระเหยมายบยงการเจรญของเชอรา R. microporus (ดานบน)

ข. เชอรา T. harzianum NL2.2 ทเจรญบนเมลดขาวฟาง (ดานลาง) ปลอยสารระเหยมายบยงการเจรญของเชอรา R. microporus (ดานบน)

ค. เชอรา R. microporus เจรญไดด เนองจากไมมสารระเหยจากเชอรา Trichoderma spp. มายบยง (ชดควบคม)

Page 72: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

56

ภาพท

15 T

otal io

n chr

omatr

ogra

m ของสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T

richo

derm

a har

zianu

m Ch

M1.1

Hexadecane, 2,6,10,14-tetramethyl-

pentadecane

3-octanyl acetate

benzeneacetaldehyde

3-octanone

4-heptanol,4-ethyl-2,6-dimethyl-

Hydroxymethylcyclododecane

Page 73: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

57

ภาพท

16 T

otal io

n chr

omatr

ogra

m ของสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T

richo

derm

a har

zianu

m NL

2.2

à-bisabolene zingibereneá

6 amyl à pyrone 1-methyl-4(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-

methylbenzene

à-bergamotene

benzeneethanol

1-butanol 3-methyl-

á-sesquiphellandrene

2(1H)-naphthalenone4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-8a-methyl-, trans-

Page 74: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

58

3.4 ก า รส ร า ง ส า รป ฏ ช ว น ะ ช นด ท แพ ร ใ นอ า หา รข อ ง เ ช อ ร า Trichoderma harzianum ChM1.1 ตอการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus

จากการทดสอบประสทธภาพเบองตนของน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 พบวา น าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 มประสทธภาพในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus จงสกดสารปฏชวนะจากน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 เพอหาคา MIC และ MFC ดวยวธ broth microdilution พบวา เชอรา T. harzianum ChM1.1 มคา MIC และ MFC เทากบ 500 และ 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ สวนสารก าจดเชอรา carboxin มคา MIC และ MFC เทากบ 0.49 และ 0.98 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ ทดสอบฤทธตานเชอรา R. microporus ของสารสกดดวยวธ Thin-layer chromatography bioautography พบวา สารสกดมฤทธตานเชอรา R. microporus โดยเหนบรเวณยบยง (clear zone) เมอเปรยบเทยบกบชดควบคม ซงเสนใยของเชอรา R. microporus เจรญทวผวหนาอาหาร ซงมคา Rf อยในชวง 0.22-0.4 (ภาพท 17) และเมอน าสารไปวเคราะหองคประกอบดวยเครอง GC-MS พบวา องคประกอบหลก ไดแก acetic acid, 1,3-Diamio-2-propanol, 2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one, octadecanoic acid, octadec-9-enoicacid, 9-octadecenamide และ chrysophanol ซงสารเหลานเปนสารทอยในกลมของแอลกอฮอล ส าหรบการออกฤทธของสารปฏชวนะ เชน สาร 1-Hydroxy-3-methyl-5,10-anthraquinone (ตารางภาคผนวกท 6 และ ภาพท 18) Fuzellier และคณะ (1982) รายงานวา สารในกลม anthraquinone (rheinemodin และ aloe-emodin) มคณสมบตเปนสารปฏชวนะสามารถยบยงเชอจลนทรยได เชน เชอราสาเหตโรคผวหนง (กลาก และเกลอน) ไดแก เชอ Candida albicans, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum, Pityrosporum sp. และอน ๆ นอกจากนยงมรายงานวา เชอรา T. harzianum Th-R16 สามารถผลตสาร 1,5-dihydroxy-3-hydroxymethyl-9,10-anthraquinones ซ ง เ ป นสาร ท ม ฤ ท ธ ต าน เ ช อ รา และแบคทเรย (Ghisalberti and Sivasithamparam, 1991)

Page 75: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

59

ภาพท 17 บรเวณยบยงเชอรา Rigidoporus microporus เมอทดสอบดวยวธ Thin-layer

chromatography bioautography บนแผน TLC หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน

ก. ชดทดสอบ (หยดสารสกด) ข. ชดควบคม (หยดตวท าละลาย ethyl acetate) R1-4 คอ จ านวนซ าของการทดลอง

ก ข

clear zone No, clear zone

R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4

Page 76: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

60

ภา

พท 1

8 To

tal io

n chr

omatr

ogra

m ของสารทสกดไดจากเชอรา

Tric

hode

rma h

arzia

num

ChM1

.1

1-Hydroxy- 3-methyl-5,10-anthraquinone

chrysophanol

9-octadecenamide

octadec-9-enoicacid

octadecanoic acid

acetic acid

2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one

1,3-Diamio-2-propanol

Page 77: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

61

4. สตรส าเรจของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ผลตสตรส าเรจชนดแกรนล และผงจากเชอรา T. harzianum NL2.2 เนองจากเชอรา T. harzianum NL2.2 มการเจรญ ขยายพนธรวดเรว และมเปอรเซนตยบยงเชอรา R. microporus สงกวาเชอรา T. harzianum ChM1.1 สตรส าเรจชนดแกรนล มสน าตาลเขมขนาดใกลเคยงกน ลกษณะอดตวกนแนน และแขง สวนสตรส าเรจชนดผงมสน าตาลเขม ละเอยด และเปนเนอเดยวกน (ภาพท 19)

ภาพท 19 ลกษณะของสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2

ก. สตรส าเรจชนดแกรนลผานเครองแรงเบอร 6 ข. สตรส าเรจชนดผง

4.1 การประเมนผลสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2

4.1.1 การทดสอบความสม าเสมอ และการกระจายตวของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ

เมอน าสตรส าเรจชนดแกรนล และผงมาตรวจนบปรมาณเชอดวยวธ dilution spread plate บนอาหาร TSM พบวา สตรส าเรจชนดแกรนล มปรมาณเชอมากกวาสตรส าเรจชนดผง ซงในแตละสตรมปรมาณเชอเฉลย 6.13 และ 5.60 โคโลนตอกรม ตามล าดบ (ตารางท 5 และ ภาพท 20) สอดคลองกบรายงานของอจฉรา อทศวรรณกล (2536) รายงานวาสตรส าเรจชนดแกรนลเปนสตรทมความคงตวของเชอจลนทรยสง เนองจากมพนทผวสมผสกบอากาศนอย จงสามารถชวยยดอายการเกบรกษาของสตรส าเรจ

ก ข

Page 78: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

62

ตารางท 5 ปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจหลงการผลต เปนเวลา 24 ชวโมง ปรมาณเชอรา T. harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ ( x107 โคโลนตอกรม) จดท สตรส าเรจชนดแกรนล สตรส าเรจชนดผง

1 6.60±2.04a1/ 5.60±1.50 2 6.58±1.44a 5.35±0.87 3 6.38±1.75a 5.55±0.87 4 5.58±1.03b 5.75±0.65 5 5.50±0.91b 5.75±2.06

คาเฉลย 6.13±1.26 5.60±0.62 F-test ** ns

C.V. (%) 14.96 12.91 ns ไมแตกตางทางสถต **แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

ภาพท 20 โคโลนเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 บนอาหาร TSM หลงน าสตรส าเรจชนด

แกรนล หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

Page 79: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

63

4.1.2 การทดสอบความเปนกรด-ดาง (pH) และความสามารถในการละลายน าของสตรส าเรจ เตรยมสารแขวนลอยของสตรส าเรจทความเขมขน 1 เปอรเซนต แลววดความเปนกรด-ดาง ดวย pH meter พบวา สตรส าเรจชนดแกรนล และผง มคา pH อยในชวง 6.41-6.57 และ 6.06-6.29 ตามล าดบ และมความสามารถในการละลายน า อยในชวง 1.8-2.5 และ 2.53-3.50 วนาท ตามล าดบ ทงนสตรส าเรจทงสองชนดมคาความเปนกรด-ดางเปนกรดออน ซงเปนผลมาจากสวนประกอบของสตรส าเรจทไดจากดนพช โดยดนพชทน ามาผลตสตรส าเรจมคาความเปนกรด-ดาง ประมาณ 5.38-5.46 4.1.3 ทดสอบการมชวตรอดของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ จากการตรวจนบปรมาณเชอในสตรส าเรจทนทหลงผลต 24 ชวโมง และตรวจนบทกเดอนหลงจากการเกบรกษาในอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน ดวยวธ dilution spread plate บนอาหาร TSM พบวา จ านวนประชากรของเชอทมชวตรอดในแตละเดอนตงแตเดอนแรกจนถงเดอนท 6 ลดลงเพยงเลกนอย ทงนอาจเปนเพราะในอณหภม 4 องศาเซลเซยส ซงใชในการเกบรกษาเชอเปนอณหภมเหมาะสม จงสามารถยดระยะเวลาอายการเกบรกษาเชอรา T. harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจนานออกไป (ตารางท 6) สอดคลองกบรายงานของ ปวณา สงขแกว (2556) ไดศกษาโดยเกบรกษาสตรส าเรจของเชอ Streptomyces griseus subsp. formicus ในอณหภมหอง (28-32 องศาเซลเซยส) และทอณหภม 4 องศาเซลเซยส พบวา ในอณหภม 4 องศาเซลเซยส มอายการเกบรกษานานกวาอณหภมหอง โดยมปรมาณของเชอมากกวา และประสทธภาพในการยบยงเชอสาเหตโรคดกวาเชนกน

Page 80: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

64

ตารางท 6 ปรมาณเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ หลงจากการเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน ปรมาณเชอรา T. harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ (x107 โคโลนตอกรม) เดอนท สตรส าเรจชนดแกรนล สตรส าเรจชนดผง

24 ชวโมง หลงผลต 6.13±1.26cd1/ 5.60±0.62de 1 6.85±1.26bc 6.53±4.70bc 2 7.63±0.95a 7.18±1.18ab 3 6.08±3.20cd 5.53±3.20de 4 5.13±1.60ef 4.53±3.54f 5 4.45±2.72fg 3.75±2.66hi 6 4.58±2.66f 3.55±2.53i

F-test ** C.V. (%) 9.03

** แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

4.1.4 ทดสอบประสทธภาพการยบยงเชอรา Rigidoporus microporus ของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส าเรจ ทดสอบประสทธภาพของสตรส าเรจตอการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus โดยวธ dual culture plate หลงจากเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน พบวา สตรส าเรจทงสองชนดสามารถยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus ได ไมแตกตางกนทางสถต (ตารางท 7)

Page 81: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

65

ตารางท 7 เปอรเซนตการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา Rigidoporus microporus ในสตรส าเรจของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 หลงจากการเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 เดอน

เดอนท เปอรเซนตการยบยงเชอรา Rigidoporus microporus สตรส าเรจชนดแกรนล สตรส าเรจชนดผง

24 ชวโมง หลงผลต 83.57±0.71a1/ 82.14±1.36a 1 81.07±1.07a 81.79±2.95a 2 81.07±0.69a 80.36±1.80a 3 83.21±1.07a 82.50±2.14a 4 80.36±1.35a 81.07±2.42a 5 81.07±0.68a 81.07±2.14a 6 82.14±1.23a 82.50±2.14a

ชดควบคม 0.00±0.00b 0.00±0.00b F-test **

C.V. (%) 3.92 ** แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test 5. ศกษาการเพมปรมาณของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 สตรส าเรจในปยคอก (มลไก และมลวว) และปยอนทรย ตรวจนบปรมาณเชอรา T. harzianum NL2.2 ซงเลยงในมลไก มลวว และป ยอนทรย (ผานการนงฆาเชอ และไมนงฆาเชอ) ความเขมขน 1 เปอรเซนต พบวา เมอเปรยบเทยบระหวางป ยนงฆาเชอ และไมนงฆาเชอ เชอรา T. harzianum NL2.2 สามารถเพมปรมาณไดดในป ยทผานการนงฆาเชอ แตหากเปรยบเทยบระหวางชนดป ย พบวา เชอรา T. harzianum NL2.2 สามารถเพมปรมาณไดดทสดในป ยอนทรย (หมอดน ซพ) รองลงมาคอ มลวว และมลไก ตามล าดบ ซงแตกตางทางสถตอยามนยส าคญยง (ตารางภาคผนวกท 7 และ ภาพท 21 และ 22) ศกษาความชนทเหมาะสมในการเพมปรมาณเชอ โดยน าสตรส าเรจของเชอรา T. harzianum NL2.2 คลกเคลาในป ยอนทรย ปรบความชน 25, 30 และ 35 เปอรเซนต บมท

Page 82: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

66

อณหภมหอง เปนเวลา 15 วน พบวา เชอรา T. harzianum NL2.2 สามารถเจรญไดดทสดทความชน 25 เปอรเซนต โดยมปรมาณเชอ 2.82x108 โคโลนตอกรม (ตารางภาคผนวกท 8) และเมอน าป ยอนทรยทมสตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 เจรญอยมาทดสอบประสทธภาพการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus โดยวธ dual culture plate พบวา มเปอรเซนตการยบยง เทากบ 85.43 เปอรเซนต (ภาพท 23) สอดคลองกบการรายงานของกรมสงเสรมการเกษตร (2556) ทกลาววา หากผสมเชอรา Trichoderma sp. ชนดสดกบป ยอนทรย (เกาหรอหมกดแลว) โดยไมใสร าขาว สามารถเกบป ยไวไดไมเกน 1 เดอน บรรจกระสอบหรอกองไวในทรม และควรคลมดวยพลาสตกหรอกระสอบ เพอรกษาความชนในเนอป ยเอาไวใหอยทประมาณ 25-30 เปอรเซนต

ภาพท 21 จ านวนประชากรของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในป ยชนดตาง ๆ ทนง

และไมนงฆาเชอ หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 0, 5, 10 และ 15 วน ก. T1 จ านวนประชากรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในมลไก (นงฆาเชอ) ข. T2 จ านวนประชากรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในมลวว (นงฆาเชอ) ค. T3 จ านวนประชากรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในป ยอนทรย (นงฆาเชอ) ง. T4 จ านวนประชากรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในมลไก (ไมนงฆาเชอ) จ. T5 จ านวนประชากรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในมลวว (ไมนงฆาเชอ) ฉ. T6 จ านวนประชากรของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในป ยอนทรย (ไมนงฆาเชอ)

0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.80

0 5 10 15

log. C

FU/g

ระยะเวลา (วน)

T1 T2

T3 T4

T5 T6

ns **

**

**

Page 83: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

67

ภาพท 22 ลกษณะของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญบนป ยอนทรยนงฆาเชอ

ภาพท 23 โคโลนของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญในป ยอนทรยและเชอรา Rigidoporus microporus บนอาหารเลยงเชอ PDA เมอทดสอบดวยวธ dual culture plate หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

ก. ป ยอนทรยสตรส าเรจเ ชอรา T. harzianum NL2.2 (ซาย )+เช อรา R. microporus (ขวา) ข. เชอรา R. microporus (ชดควบคม)

ก ข

T R R

Page 84: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

68

6. ทดสอบประสทธภาพการยบยงการเจรญของเชอโรครากขาวในดนปลก เมอน าเชอรา T. harzianum NL2.2 ทผานการผลตเปนสตรส าเรจ และศกษาการ

เพมปรมาณ มาทดสอบความสามารถในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ในดนบรรจหลอดทดลอง (ซงเปนการจ าลองสภาพแวดลอมใหมสภาพใกลเคยงกบธรรมชาต) โดยการทดลองแบงเปน 2 ชดดน ชดแรกเปนชดดนนงฆาเชอ และชดทสองไมนงฆาเชอ พบวา สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 ในป ยอนทรย รวมกบดนนงฆาเชอ และดนไมนงฆาเชอสามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ได 90.63และ 89.38 เปอรเซนต ไมแตกตางกนทางสถต (ตารางท 8 และ ภาพท 24) ขณะทชดควบคมซงเปนชดดนทไมนงฆาเชอสามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus เทากบ 26.46 เปอรเซนต เนองจากดนในธรรมชาตมทงจลนทรยทมประโยชน และเปนโทษรวมกนในแตละแหลง เกดปฏสมพนธรวมกนมากมาย อานฐ ตนโช (2549) กลาววา การท าเกษตรธรรมชาต จะมงเนนความหลากหลายของจลนทรย โดยเนนการควบคมกนเองของจลนทรยในหวงโซอาหาร ซงมผลตอชนด และปรมาณของจลนทรยในระบบนเวศ การทพช และสตวแสดงอาการโรคสวนหนงอาจเปนผลสบเนองมาจากความไมสมดลของความหลากหลายของจลนทรยในหวงโซอาหารของระบบนเวศนน ๆ ท าใหเกดการระบาดของจลนทรยทเปนโทษในการผลตพช และสตว

Page 85: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

69

ตารางท 8 การยบยงการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus ในดนปลก หลงการบมทอณหภมหอง เปนเวลา 7 วน

กรรมวธ การเจรญของเชอรา

R. microporus (เซนตเมตร)

เปอรเซนตการยบ ยงเชอรา

R. microporus สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2+ป ยอนทรย+ดนนงฆาเชอ

1.13±0.08a1/ 90.63±3.92a

สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2+ป ยอนทรย+ดนไมนงฆาเชอ

1.28±0.16a 89.38±1.04a

ชดควบคมดนนงฆาเชอ 12.00±0.00c 0.00±0.00c ชดควบคมดนไมนงฆาเชอ 8.83±0.12b 26.46±0.98b F-test ** ** C.V. (%) 1.17 9.77

** แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

Page 86: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

70

ภาพท 24 การยบยงการเจรญของเชอรา Rigidoporus microporus ในดนปลก หลงการบมท

อณหภมหอง เปนเวลา 7 วน ก. สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2+ป ยอนทรย+ดนนงฆาเชอ ข. สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 +ป ยอนทรย+ดนไมนงฆาเชอ

ค ชดควบคมดนนงฆาเชอ ง ชดควบคมดนไมนงฆาเชอ 7. ประเมนศกยภาพของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในปยอนทรยตอการควบคมโรครากขาวในเรอนกระจก

ทดสอบประสทธภาพของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในป ยอนทรยตอการควบคมโรครากในเรอนกระจก เปรยบเทยบกบกรรมวธทไมใสป ยอนทรย กรรมวธทใสป ยอนทรยแตไมใสสตรส าเรจ กรรมวธทใชสารเคม กรรมวธทใสสตรส าเรจ และป ยอนทรย และกรรมวธทปลกตนยางอยางเดยว เมอประเมนระดบความรนแรงของการเกดโรค พบวา ทกกรรมวธสามารถลดการเกดโรครากขาวได ไมแตกตางกนทางสถต โดยมเปอรเซนตลดการเกดโรค 77.60, 76.58, 79.05 และ 55.95 เปอรเซนต ตามล าดบ ในขณะทดชนการเกดโรคมความแตกตางทางสถตกบกรรมวธชดควบคมทปลกเชอรา R. microporus เพยงอยางเดยว (ตารางท 9 และ ภาพท 25) และเมอน าดนทใชในการทดลอง (กอน และหลงการทดลอง) มาทดสอบคณสมบตบางประการ พบวา ดนหลงการทดลองมธาตอาหารหลก (ไนโตรเจน (N) ฟอสฟอรส (P) โพแทสเซยม (K)) เพมมากขน

ก ข

Page 87: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

71

เมอเปรยบเทยบกบดนกอนการทดสอบ (ตารางท 9) ทงนอาจเปนเพราะแกลบทใชเปนสวนผสมในการปลกเชอรา R. microporus ถกยอยสลายโดยจลนทรยทอาศยอยในดน และปลดปลอยธาตอาหารออกมา (ธงชย มาลา, 2546) ซงธาตอาหารภายในแกลบมปรมาณ ไนโตรเจน ฟอสฟอรส ฟอสฟอรส และมอนทรยคารบอน รอยละ 0.36, 0.09, 1.08 และ 54,00, 72 9 ตามล าดบ (ปรชญา ธญญาด และคณะ, 2540) นอกจากน Saravanakumar และคณะ (2013) ศกษาความสามารถในการละลายฟอสเฟต ของเชอรา Trichoderma spp. ทแยกไดจากรากของตนแสม และโกงกาง บรเวณปาชายเลน พบวา สามารถละลาย tricalcium phosphate (Ca3 (PO4) ซงเปนฟอสเฟตทไมละลายน า ใหอยในรปทพชน าไปใชประโยชนได

Page 88: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

ตารางท 9 ประสทธภาพของเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในการควบคมโรครากขาวของตนกลายางพาราในเรอนกระจก หลงการทดสอบ เปนเวลา 4 เดอน

กรรมวธ ดชนการเกดโรค

เปอรเซนตลดการเกดโรค

คณสมบตของดน Total N (g/kg)

Avaliable P (mg/kg)

Avaliable K (mg/kg)

pH

ดนกอนการทดลอง - - 0.04 9.51 37.72 6.39 ดน+สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2+ป ยอนทรย+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus

25.83±12.51bc 77.60±9.51a 0.08 202.45 248.08 5.50

ดน+สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 ตนกลายาง+เชอรา R. microporus

25.00±12.23bc 76.58±10.60a 0.06 70.77 166.83 5.50

ดน+สารก าจดเชอรา carboxin 2 กรม+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus

23.33±12.47b 79.05±10.82a 0.06 63.48 140.09 5.76

ดน+ป ยอนทรย+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus 55.83±14.17bc 55.95±10.36a 0.06 103.28 196.21 5.09 ดน+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus 70.83±6.94a 0.00±0.00 0.05 102.19 161.63 5.61 ดน+ตนกลายาง 0.00±0.00 0.00±0.00 0.05 52.55 172.29 5.10 F-test ** ** C.V. (%) 57.36 44.46

** แตกตางทางสถตท P < 0.01 1/ คาเฉลยในคอลมนเดยวกนตามดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวาไมมแตกตางทางสถตทระดบความเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

72

Page 89: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

73

ก1 ก2 ข1 ข2

ง2

จ2 จ1 ฉ1 ฉ2

ภาพท 25 พมใบและรากของตนกลายางพาราหลงทดสอบประสทธภาพของสตรส าเรจเชอรา Trichoderma harzianum NL2.2 ในป ยอนทรย ตอการยบยงเชอรา Rigidoporus microporus สาเหตโรครากขาวของยางพาราในเรอนกระจก หลงการทดสอบ เปนเวลา 4 เดอน ก1 และ ก2 กรรมวธท 1 ดน+สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2+ป ยอนทรย+ตนกลายาง+

เชอรา R. microporus ข1 และ ข2 กรรมวธท 2 ดน+สตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 ตนกลายาง+เชอรา

R. microporus ค1 และ ค2 กรรมวธท 3 ดน+สารก าจดเชอรา carboxin 2 กรม+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus ง1 และ ง2 กรรมวธท 4 ดน+ป ยอนทรย+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus จ1 และ จ2 กรรมวธท 5 ดน+ตนกลายาง+เชอรา R. microporus ฉ1 และ ฉ2 กรรมวธท 6 ดน+ตนกลายาง

ง1 ค1 ค2

Page 90: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

74

บทท 4 สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ

สรปผลการทดลอง

แยกเชอรา Trichoderma spp. จากตวอยางดนจ านวน 86 ตวอยางดวยวธ dilution spread plate บนอาหาร TSM ไดเชอรา จ านวน 356 เมอน าเชอรา Trichoderma spp. ทดสอบประสทธภาพการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ดวยวธ dual culture plate พบวา เชอรา Trichoderma spp. ทง 356 ไอโซเลท สามารถยบยงเชอรา R. microporus ได 48.57-91.43 เปอรเซนต ไอโซเลททยบยงสงสดคอ ChM1.1 และ NL2.2 จงน ามาใชในการศกษาตอ จ าแนกเชอรา Trichoderma sp. ChM1.1 และ NL2.2 ทางสณฐานวทยา พบวา มลกษณะตรงกบเชอรา T. harziamum และจ าแนกทางชวโมเลกล พบวา เชอรา Trichoderma sp. ChM1.1 และ NL2.2 มความสมพนธใกลเคยงกนกบเชอรา T. harzianum มากถง 99 เปอรเซนต นอกจากนเมอศกษาลกษณะทางกายภาพของเชอทง 2 สายพนธ พบวา สามารถเจรญไดดใน pH 6-8 และอณหภม 20-25 องศาเซลเซยส ศกษาลกษณะทางโครงสรางทเปลยนแปลงไปของเชอรา R. microporus ซงเลยงรวมกบเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด พบวา เสนใยของเชอรา R. microporus ผดปกตไป โดยมลกษณะ เหยว เกดเปนรพรน และฉกขาด เมอเปรยบเทยบกบชดควบคมซงเลยงเชอรา R. microporus เพยงอยางเดยว และเมอทดสอบการสรางเอนไซม chitinase ของเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 พบวา สามารถสรางเอนไซม chitinase ยอย chitin ได เชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ทง 2 ไอโซเลท สามารถผลตสารระเหยทมประสทธภาพในการยบยงเชอรา R. microporus เทากนคอ 94.4 เปอรเซนต เมอวเคราะหองคประกอบหลกของสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 โดยเครอง GC-MS พบวา องคประกอบหลกของสารระเหยจากเชอรา T. harzianum ChM1.1 เปนสารกลมแอลกอฮอล และองคประกอบหลกของสารระเหยทสกดไดจากเชอรา T. harzianum NL2.2 พบวา อยในกลมแอลกอฮอล และสารปฏชวนะ จงไดคดเลอกเชอรา T. harzianum ChM1.1 ศกษาตอเนองจากเมอทดสอบประสทธภาพเบองตนของน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 พบวา น าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 มประสทธภาพในการยบยง

Page 91: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

75

การเจรญของเชอรา R. microporus จงสกดสารปฏชวนะจากน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 ผลการทดสอบประสทธภาพของสารสกดจากน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 โดยทดสอบหาคา MIC และ MFC พบวา มคา เทากบ 500 และ 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ เปรยบเทยบสารก าจดเชอราคารบอกซนซงมคา MIC และ MFC เทากบ 0.49 และ 0.98 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ เมอสกดสารจากน าเลยงเชอรา T. harzianum ChM1.1 มาทดสอบดวยวธ bioautography บนแผน TLC พบวา สารทมฤทธตานเชอราเกดเปนบรเวณยบยงเชอรา R. microporus มคา Rf อยในชวง 0.22-0.4 และเมอน าสารไปวเคราะหองคประกอบดวยเครอง GC-MS พบวา เปนสารกลมแอลกอฮอล และสารปฏชวนะ เมอเปรยบเทยบคณสมบตของเชอรา T. harzianum ChM1.1 และ NL2.2 พบวามการเจรญ ขยายพนธรวดเรว และมเปอรเซนตยบยงเชอรา R. microporus สงกวาเชอรา T. harzianum ChM1.1 จงไดคดเลอกเชอรา T. harzianum NL2.2 เพอผลตสตรส าเรจ

จากการผลตสตรส าเรจชนดแกรนล และผงจากเชอรา T. harzianum NL2.2 และประเมนคณสมบตทางกายภาพ และชวภาพ พบวา สตรส าเรจชนดแกรนลเหมาะสมตอการน าไปใชทดสอบการเพมปรมาณในป ยคอก และป ยอนทรย และการยบยงโรครากขาวในเรอนกระจก

ศกษาการเพมปรมาณของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในป ยคอก และป ยอนทรย พบวา เชอรา T. harzianum NL2.2 สามารถเพมปรมาณไดดในป ยอนทรย ทมความชน 25 เปอรเซนต และเมอน าป ยอนทรย T. harzianum NL2.2 ทดสอบประสทธภาพการยบยงการเจรญของเสนใยเชอรา R. microporus พบวา มเปอรเซนตการยบยง เทากบ 85.43 เปอรเซนต

เมอน าเชอรา T. harzianum NL2.2 ทผานการท าสตรส าเรจ และศกษาการเพมปรมาณ มาทดสอบความสามารถในการยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ในดนบรรจหลอดทดลอง พบวา ป ยอนทรยเชอรา T. harzianum NL2.2 รวมกบดนนงฆาเชอ และดนไมนงฆาเชอสามารถยบยงการเจรญของเชอรา R. microporus ไดไมแตกตางกนทางสถต

การทดสอบประสทธภาพของเชอรา T. harzianum NL2.2 ในป ยอนทรยตอการควบคมโรครากในเรอนกระจก เปรยบเทยบกบการใชสตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 สารก าจดเชอราคารบอกซน และป ยอนทรยเพยงอยางเดยว เมอประเมนระดบความรนแรงของการเกดโรค พบวา ทกกรรมวธมประสทธภาพในการควบคมโรครากขาวแตกตางทางสถตอยางมนยส าคญกบชดควบคม

Page 92: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

76

ขอเสนอแนะ การควบคมโรครากขาวของยางพารา ควรใชกรรมวธทมสตรส าเรจเชอ รา

T. harzianum NL2.2 รวมดวย เนองจากมดชนการเกดโรคต า เเละมเปอรเซนตการยบยงโรคสง โดยใชสตรส าเรจเชอรา T. harzianum NL2.2 กอนปลกยางพารา อาจเปนการรองกนหลมกอนปลกตนกลายางพารา ซงเชอรา T. harzianum NL2.2 สามารถเจรญตงรกรากในดนบรเวณรอบ ๆ รากของตนยางพาราซงจะชวยปองกนการเกดโรครากขาวของตนยางพาราได

Page 93: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

77

เอกสารอางอง กรมวชาการเกษตร. 2555. ขอมลวชาการยางพารา. กรงเทพฯ : กระทรวงเกษตร และสหกรณ. กรมสงเสรมการเกษตร. 2556. การใชเชอราไตรโคเดอรมาควบคมโรคพช (ออนไลน) สบคนจาก http://esc.agritech.doae.go.th/webpage/e-book/trai-cro-der-ma.pdf [15 ธนวาคม 2556]. เกศณ แกวมาลา. 2551. ประสทธผลของเชอราปฏปกษ Trichoderma spp. ตอการควบคมโรค แอนแทรคโนสของถวเหลองในระยะตนออน . วทยานพนธ วทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยเชยงใหม. เกษม สรอยทอง. 2551. การควบคมโรคพชโดยชววธ. กรงเทพฯ : คณะเทคโนโลยเกษตร สถาบน เทคโนโลยพระจอมเกลาเจาคณทหารลาดกระบง. จกรพนธ ศรธญญาลกษณ. 2538. ยาเมด : การผลต วจย และพฒนา. เชยงใหม : ภาควชา เทคโนโลยเภสชกรรม คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม. จระเดช แจมสวาง. 2546. การควบคมโรคพช และแมลงศตรพชโดยชววธ. โครงการเกษตรก ชาต โครงการถายทอดเทคโนโลยชวภาพ และชวภณฑในการจดการศตรพชเพอทดแทน สารเคมสงเคราะห. นครปฐม : ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. จระเดช แจมสวาง. 2547. การควบคมโรคผกโดยชววธ. เอกสารประกอบการฝกอบรมหลกสตร การควบคมศตรพชโดยชววธในการปลกผกระบบไมใชดนและภายในโรงเรอง วนท 13 กมภาพนธ 2527 ณ. อาคารเจาคณทหาร คณะเทคโนโลยการเกษตร สถาบนเทคโนโลย พระจอมเกลาเจาคณทหารลาดกระบง. กรงเทพฯ. จระเดช แจมสวาง วรรณวไล อนทน และถวลย ค มชาง. 2543. ประสทธภาพของเชอรา Trichoderma harzianum สตรส าเรจตาง ๆ ในการควบคมโรคโคนเนาของถวฝกยาวท เกดจากเชอรา Sclerotium rolfsii. รายงานการประชมทางวชาการมหาวทยาลยเกษตร ศาสตร ครงท 39 ณ สาขาพชศาตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ 1-4 กมภาพนธ 2543 หนา 236-242. ชมพนช บญราชแขวน. 2550. อทธพลของสารทตยภมจากเชอ Trichoderma harzianum ตอการ ยบยงการเจรญของเชอรา Colletotrichum gloeosporioides และการควบคมโรคแอน แทรคโนสของพรก. วทยานพนธ วทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. ทดทรง ทวทพย. 2535. ยาเมด. กรงเทพฯ : โอ. เอส. พรนตงเฮาส.

Page 94: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

78

ธงชย มาลา. 2546. ป ยอนทรย และป ยชวภาพ : เทคนคการผลต และการใชประโยชน. กรงเทพฯ : ส านกพมพมหาลยเกษตรศาสตร. นรนาม. 2556. กลไกการออกฤทธของแอลกอฮอล (ออนไลน) สบคนจาก http://www.wisegeek.

org/why-is-alcohol-a-good-antiseptic.htm [26 ธนวาคม 2556]. ปราโมทย ทพยดวงตา. 2539. ยาเมด. เชยงใหม : คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม. ปรชญา ธญญาด เมธ มณวรรณ และพรชฌา วาสนกล. 2540. กลมอนทรยวตถ และวสดเหลอ ใช. กรงเทพฯ : กองอนรกษดน และน า กรมพฒนาทดน กระทรวงเกษตร และสหกรณ ปวณา สงขแกว. 2556. สตรส าเรจของจลนทรยปฏปกษ Streptomyces griseus subsp. formicus ส าหรบการยบยงโรคราขาวของยางพารา . วทยานพนธ วทยาศาสตรมหา บณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. พงษเทพ ขจรไชยกล. 2523. โรค และศตรยางพาราในประเทศไทยป 2522. ว. ยางพารา 10 : 12- 19. มนตชล นตพน. 2534. ยาเมด. กรงเทพฯ : โอ.เอส. พรนตงเฮาส. มหาวทยาลยขอนแกน. 2551. อนสทธบตรกรรมวธการใชเชอรา Trichoderma harzianum ไอโซ เลต T9 (ออนไลน) สบคนจาก www.champa.kku.ac.th/sc/sarsc 51/result/..QA/../In dex_4.4.2.doc‎ [21 กมภาพนธ 2556]. สถาบนวจยยาง. 2555. ขอมลวชาการยางพารา. กรงเทพฯ : สถาบนวจยยาง กรมวชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ. สายทอง แกวฉาย. 2555. การใชไตรโคเดอรมาในการควบคมโรคพช. ว. มหาวทยาลยนราธวาส ราชนครนทร 3 : 108-123. ส านกงานพฒนาวทยาศาสตร และเทคโนโลยแหงชาต 2552. สทธบตรกรรมวธการผลตชวภณฑ เชอราไตรโคเดอรมาในรปผงแหง. (ออนไลน) สบคนจาก http://www.nstda.or.th/home [21 กมภาพนธ 2556]. ส านกเทคโนโลยชวภาพทางดน. ม. ป. ป. การผลตเชอจลนทรยควบคมเชอสาเหตโรคพชโดยใช สารเรงซปเปอรพด. 3. กรงเทพฯ : กรมพฒนาทดน กระทรวงเกษตร และสหกรณ. สมาล สนตพลวฒ. 2536. การศกษาความเปนไปไดในเชงเศรษฐศาสตรในการใชผงเชอราไตรโค เดอรมาในการควบคมโรคราเมลดผกกาดของมะเขอเทศ. ว.เกษตรศาสตร (สงคมศาสตร) 14 : 61-70.

Page 95: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

79

เสมอใจ ชนจตต วสนณ เพชรรตน พรศลป จนทวเมอง และปวณา สงขแกว. 2553. การประเมน การใชเชอจลนทรยปฎปกษในการควบคมโรคใบรวง Phytophthora ของกลายางพารา. รายงานการประชมวชาการศนยวจยควบคมศตรพชโดยชวนทรยแหงชาต (ภาคใต) ณ โรงแรมเมธาวลย ชะอ ารสอรท เพชรบร. 1-3 กนยายน 2553 หนา 46. เสมอใจ ชนจตต. 2555. โรคพชส าคญทางเศรษฐกจ. สงขลา : คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. อานฐ ตนโช. 2549. เกษตรธรรมชาตประยกต : หลกการ แนวคด เทคนคปฏบตในประเทศไทย. ปทมธาน : ส านกพมพพมพลกษณ. อารมณ โรจนสจตร. 2541. โรครากขาว (Rigidoporus lignosus (Klotzsch) Imazeki) ของ ยางพารา และแนวทางการควบคมโดยชววธ . วทยานพนธ วทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. อารมณ โรจนสจตร อไร จนทรประทน พเยาว รมรนสขารมณ นรสา จนทรเรอง สโรชา กรธาพล วนเพญ พฤกษววฒน สเมธ พฤกษวรณ วลยพร ศศประภา ปราโมทย คาพทธ และ ประภา พงษอธา. 2553. ประเมนความสญเสยทางเศรษฐกจของยางพาราสาเหตจากโรค รากขาวในพนทปลกยางของประเทศไทย. กรงเทพฯ : กรมวชาการเกษตร กระทรวงเกษตร และสหกรณ. อจฉรา อทศวรรณกล. 2536. รปแบบเภสชภณฑ. กรงเทพฯ : ส านกพมพจฬาลงกรณ มหาวทยาลย. Agrawal, T. and Kotasthane, A. S. 2012. Chitinolytic assay of indigenous Trichoderma isolates collected from different geographical locations of Chhattisgarh in central India. Springerplus. 10 : 1-10. Anees, M., Tronsmo, A., Edel-Hermann, V., Hjeljord, L. G., Héraud, C. and Steinberg, C. 2010. Characterization of field isolates of Trichoderma antagonistic against Rhizoctonia solani. Fungal Biol. 114 : 691-701. Bae, Y. S. and Knudsen, G. R. 2005. Soil microbial biomass influence on growth and biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum. Biol. Control 32 : 236-242. Balasubramanian, N. 2003. Strain Improvement of Trichoderma spp. by Protoplast Fusion for Enhanced Lytic Enzymes and Biocontrol Potential. Ph. D. Dissertation. University of Madras Chennai, India.

Page 96: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

80

Batta, Y. A. 2007. Control of postharvest diseases of fruit with an invert emulsion formulation of Trichoderma harzianum Rifai. Postharvest Biol. Technol. 43 : 143- 150. Bissett, J. 1991. A revision of the genus Trichoderma: II. Infrageneric classification. Can. J. Bot. 69: 2357-2372. Bruce, A. and Highley, L. T. 1991. Control of growth of wood decay Basidiomycetes by Trichoderma spp. and other potentially antagonistic fungi. Forest Prod. J. 41 : 63-76. Carsolio, C., Benhamou, N. Haran, S., Cortes, C., Gutierrez, A., Chet, I. and Herrere, E. A. 1999. Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene, ech42, in mycoparasitism. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 929-935. Chet, I. and Inbar, J. 1994. Biological control of fungal pathogens. Appl. Biochem. Biotechnol. 48 : 37-43. Claydon, N., Allan, M., Hanson, J. R. and Avent, A. G. 1987. Antifungal alkyl pyrones of Trichoderma harzianum. Trans. Br. Mycol. Soc. 88 : 503-513. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard. 2nd CLSI Document M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Collmer, A. and Keen, N. T. 1986. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol. 24 : 383-409. Danielson, R. M. and Davey, C. B. 1973. Carbon and nitrogen nutrition of Trichoderma Soil Biol. Biochem. 5 : 505-515. Dennis, C. and Webster, J. 1971. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. II. Production of volatile antibiotics. Trans. Br. Mycol. Soc. 57 : 41- 48.

Page 97: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

81

Dubey, S. C., Bhavani, R. and Sigh, S. 2009. Development of Pusa 5 SD for seed dressing and Pusa biopellet 10G for soil application formulations of Trichoderma harzianum and their evaluation for integrated management of dry root rot of mungbean (Vigna radiata). Biol. Control 50 : 231-242. Elad, Y., Zimand, G., Zaqs, Y., Zuriel, S. and Chet, I. 1993. Use of Trichoderma

harzianum in combination or alternation with fungicides to control cucumber

grey mould (Botrytis cinerea) under commercial greenhouse conditions. Plant

Pathol. 42: 324-332.

Fox, R. A. 1977. The impact of ecological, cultural and biological factors on the strategy and costs of controlling root diseases in tropical plantation crops as exemplified by Hevea brasiliensis. Jl. Rubb. Res. Inst. Sri Lanka. 54 : 329-362. Fuzellier, M. C., Mortier, F. and Lectard, P. 1982. Antifungal activity of Cassia alata L. Ann. Pharm. Fr. 40 : 357-363. Gajera, H., Domadiya, R., Patel, S., Kapopara, M. and Golakiya, B. 2013. Molecular mechanism of Trichoderma as bio-control agents against phytopathogen system-a review. Cur. Res. Microbiol. Biotech.1 : 133-142. Gams, W. and Bissett, J. 1998. Morphology and identification of Trichoderma. In : Trichoderma and Gliocladium Vol. I. Basic Biology, Taxonomy and Genetics. (ed. Kubicek, C. P. and Harman, G.E.) Ontario : Taylor & Francis Inc. Geiger, J. P., Rio, B., Nicole, M. and Nandris, D. 1986. Biodegradation of Hevea brasiliensis wood by Rigidoporus lignosus and Phellinus noxius. Eur. J. For. Pathol. 16 : 147-155. Ghisalberti, E. L. and Sivasithamparam, K. 1991. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. Soil Biol. Biochem. 23 : 1011-1020. Godtfredsen, W. O. and Vangedal, S. 1965. Trichodermin, a new sequiternpene antibiotic. Acta. Chem. Scand. 19 : 1088-1120 Gupta, A. K., Harish, Rai, M. K., Phulwaria, M. and Shckhawat, N. S. 2011. Isolation of genomic DNA suitable for community analysis from mature trees adapted to arid environment. Gene 487 : 156-159.

Page 98: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

82

Haran, S., Schickler, H. and Chet, I. 1996. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biocontrol activity of Trichoderma harzianum. Microbiol. 142 : 2321-2331. Harman, G. E. 2000. Myths and dogmas of biocontrol Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Dis. 84 : 377-393. Harman, G. E. 2006. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. Phytopathol. 96 : 190-194. Harman, G. E., Howell, C.R., Viterbo, A., Chet, I. and Lorito, M. 2004. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts. Nat. Rev. Microb. 2 : 43-56. Intana, W. 2003. Selection and Development of Trichoderma spp. for High Glucanase, Antifungal Metabolite Producing and Plant Growth Promoting Isolates for Biological Control of Cucumber Damping-off Caused by Pythium spp. Ph. D. Dissertation. Kasetsart University Bangkok, Thailand. Jayasuriya, K. E. and Thennakoon, B. I. 2007. Biological control of Rigidoporus microporus, the cause of white root disease in rubber. Cey. J. Sci. (Bio. Sci.) 36 : 9-16. Jang, S. G., Jeon, K. S., Lee, E. H., Kong, W. S. and Cho, J. Y. 2009. Isolation of 1', 3'- dilinolenoyl'-2'-linoleoylglycerol with tyrosinase inhibitory activity from Flammulina velutipes. J. Microb. Biotech. 19 : 681-684. Kaewchai, S. and Soytong, K. 2010. Application of biofungicides against Rigidoporus microporus causing white root disease of rubber trees. J. Agric. Technol. 6 : 349-363. Kaewchai, S., Soytong, K. and Hyde, K. D. 2009. Mycofungicides and fungal biofertilizers. Fungal Divers. 38 : 25-50. Kirk, P. M., Cannon, P. F., Minter, D. W. and Stalpers, J. A. 2008. Ainsworth and Bisby , s Dictionary of the fungi. 10th ed. Wallingford, UK: CAB International Press. Kolli, S. C., Nagamani, A. and Ratnakumari, Y. R. 2012. Growth response of Trichoderma isolates against varying pH levels. Int. J. Environ. Biol. 4 : 180-182.

Page 99: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

83

Kubicek, C. P., Mach, R. L., Peterbauer, C. K. and Lorito, M. 2001. Trichoderma : from genes to biocontrol. J. Plant Pathol. 83 : 11-23. Kuhls, K., Lieckfeldt, E. Borner, T. and Gueho, E. 1999. Molecular reidentification of human pathogenic Trichoderma isolates as Trichoderma longibrachiatum and Trichoderma citrinoviride. Med. Mycol. 37 : 25-33. Li, Q., Ning, P., Zheng, L., Huang, J., Li, G. and Hsiang, T. 2012. Effects of volatile substances of Streptomyces globisporus JK-1 on control of Botrytis cinerea on tomato fruit. Biol. Control 61 : 113-120. Lorito, M., Hayes, C. K., Pietro, A. D., Woo, S. L. and Harman, G. E. 1994. Purification,

characterization and synergistic activity of a glucan 1,3-β-glucosidase and an N-acetyl-β -glucosaminidase from Trichoderma harzianum. Phytopathol. 84 : 398-405. Morton, D. J. and Stroube, W. H. 1955. Antagonistic and stimulatory effects of soil microorganisms upon Sclerotium rolfsii. Phytopathol. 45 : 417-420. Nandris, D., Nicole, M. R. and Geiger, J. P. 1987. Root rot diseases of rubber trees. Plant Dis. 71 : 298-306. Neuvéglise, C., Brygoo, Y., Vercambre, B. and Riba, R. 1994. Comparative analysis of molecular and biological characteristics of strain of Beauveria brongniartii isolated from insects. Mycol. Res. 98 : 322-328. Nicole, M. R. and Benhamou, N. 1991. Cytochemical aspect of cellulose breakdown during the infection process of rubber tree roots by Rigidoporus lignosus. Cytol. Histol. 81 : 1412-1420. Pal, K. K. and Gardener, B. M. 2006. Biological control of plant pathogens. Plant Health Instruc. 10 : 1094-1117 Parizi, T. E., Ansari, M. and Elaminejad, T. 2012. Evaluation of the potential of Trichoderma viride in the control of fungal pathogens of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) in vitro. Microb. Pathog. 52 : 201-205. Pathan, A. K., Bond, J. and Gaskin, R. E. 2010. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Mat. Today 12 : 32-43.

Page 100: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

84

Pezet, R., Pont, V. and Tabacchi, R. 1999. Simple analysis of 6-pentyl-α-pyrone, a major antifungal metabolite of Trichoderma spp., useful for testing the antagonistic activity of these fungi. Phytochem. Anal. 10 : 285-288. Ramanujam, B., Prasad, R. D., Sriram, S. and Rangeswaran, R. 2010. Mass production, formulation, quality control and delivery of Trichoderma for plant disease management. J. Plant Protect. Sci. 2 : 1-8. Rifai, A. M. 1969. A revision of the Genus Trichoderma. Mycol. Pap. 116 : 1-56. Roberts, A. and Selitrenkoff, N. 1985. Colloidal chitin preparations. J. Gen. Microb. 134 : 169-176. Saravanakumar, K., Arasu, V. S. and Kathiresan, K. 2013. Effect of Trichoderma on soil phosphate solubilization and growth improvement of Avicennia marina. Aqua. Bot. 104 : 101-105. Sivan, A. and Chet, I. 1986. Biological control of Fusarium spp. in cotton, wheat and muskmelon by Trichoderma harzianum. Phytopathol. 116 : 38-47. Skidmore, A. M. and Dickinson, C. H. 1976. Colony interactions and hyphal interference between Septoria nodorum and phylloplane fungi. Trans. Br. Mycol. Soc. 66 : 57-64. Tokimoto, K. 1982. Lysis of the mycelium of Lentinus edodes caused by mycolytic enzymes of Trichoderma harzianum when the two fungi were in an antagonistic state. Trans. Mycol. Soc. Japan 23 : 13-20. Vinale, F., Marra, R., Scala, F., Ghisalberti, E. L., Lorito, M. and Sivasithamparam, K. 2006. Major secondary metabolites produced by two commercial Trichoderma strains active against different phytopathogens. Letters App. Microb. 43 : 143-148. Vinale, F., Sivasithamparam, K., Ghisalberti, E. L. and Marra, R. 2008. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants. Physiol. Mol. Plant Pathol. 72 : 80-86.

Page 101: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

85

Wattanasilakorn, S., Sdoodee, S., Nualsri, C. and Chuenchit, S. 2012. Screening of rubber (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) rootstocks for the white root disease resistance. J. Agric. Technol. 8 : 2385-2395. Weindling, R. 1934. Studies on a lethal principle effective in the parasitic action of Trichoderma lignorum on Rhizoctonia solani and other soil fungi. Phytopathol. 24 : 1153-1179. Wijesinghe, C. J., Wijeratnam, R. S. W., Samarasekara, J. K. R. R. and Wijesundera, R. L. C. 2010. Biological control of Thielaviopsis paradoxa on pineapple by an isolate of Trichoderma asperellum. Biol. Control 53 : 285-290. Wijesundera, R. L. C., Jeganathan, S. and Liyanage, N. S. 1991. Some effects of isolates of Trichoderma on Rigidoporus lignosus. Rubb. Res. Inst. Sri Lanka 2 : 42-47. Yates, I. E., Bush, C. L. S., Samuels, G. J. and Sparks, D. 2008. Growth rate and temperature tolerance of diverse Trichoderma koningiopsis isolates. American Phytopathol. 6 : 26-30. Zhao, J., Xu, L., Huang, Y. and Zhou, L. 2008. Detection of antimicrobial components from extracts of the endophytic fungi associated with Paris polyphylla var. yunnanensis using TLC-bioautography-MTT assay. Nat. Prod. Res. Dev. 20 : 28- 32.

Page 102: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

86

ภาคผนวก

Page 103: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

87

ภาคผนวก ก

อาหารเลยงเชอ

1. Potato dextrose agar (PDA)

Potato 200 กรม

Dextrose 20.0 กรม

Agar 15.0 กรม

น ำมนฝรงทปอกเปลอกแลวลำงน ำใหสะอำด ตดออกเปนชนเลก ๆ สเหลยมจตรส

ขนำดประมำณ 1 ลกบำศกเซนตเมตร ตมกบน ำกลน 500 มลลลตร จนมนฝรงสก ตมตอไปอก

สกครจงน ำมำกรองดวยผำขำวบำงเอำเนอมนฝรงออกเตมน ำตำล dextrose 20.0 กรม ตม และ

คนจนน ำตำล dextrose ละลำยจงน ำสวนผสมน ำกบวนละลำยในน ำ 500 มลลลตร ผสมเขำกน

เตมน ำกลนแทนน ำทขำดหำยไป ใสขวดหรอหลอดอำหำรเลยงเชอน ำไปนงฆำเชอทอณหภม 121

องศำเซลเซยส ควำมดน 15 ปอนดตอตำรำงนว เปนเวลำ 15-20 นำท

2. Potato dextrose broth (PDB)

Potato 200 กรม

Dextrose 20.0 กรม

น ำมนฝรงทปอกเปลอกแลวลำงน ำใหสะอำด ตดออกเปนชนเลกๆ สเหลยมจตรส

ขนำดประมำณ 1 ลกบำศกเซนตเมตร ตมกบน ำกลน 1000 มลลลตร จนมนฝรงสก ตมตอไปอก

สกครจงน ำมำกรองดวยผำขำวบำงเอำเนอมนฝรงออกเตมน ำตำล dextrose 20.0 กรม ตม และ

คนจนน ำตำล dextrose ละลำย ผสมเขำกนใสฟำสดน ำไปนงฆำเชอทอณหภม 121 องศำ

เซลเซยส ควำมดน 15 ปอนดตอตำรำงนว เปนเวลำ 15-20 นำท

Page 104: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

88

3. Trichoderma Selective Medium (TSM)

MgSO4.7H2O 0.20 กรม K2HPO4 0.90 กรม KCl 0.15 กรม NH4NO3 1.00 กรม glucose 3.00 กรม chloramphenical 0.25 กรม terrachlor 75 %WP 0.20 กรม rose bengal 0.15 กรม agar 20.00 กรม distilled water 1,000 มลลลตร *captan 20.00 ไมโครกรม ใสหลงนงฆำเชอแลว

ละลำยสวนประกอบทงหมดลงในน ำกลนปรมำตร 1,000 มลลลตร น ำไปนงฆำเชอทอณหภม 121 องศำเซลเซยส 20 นำท

4. Carboxyl methyl cellulose (CMC) agar C4H12N2O6 5 กรม KH2PO4 1 กรม MgSO4.7H2O 0.5 กรม Yeast extract 0.1 กรม CaCl2.2H2O 0.001 กรม Carboxyl methyl cellulose 20 กรม Agar 16 กรม Distilled water 1,000 มลลลตร

ละลำยวนในน ำกลน 500 มลลลตร ตมใหละลำยละลำยสวนประกอบในน ำกลน 500 มลลลตร ตมใหละลำยผสมสำรละลำยทงสองเขำดวยกนเตมน ำกลนใหครบ 1 ลตร น ำไปนงฆำเชอทอณหภม 121 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 15-20 นำท

Page 105: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

89

สารเคมส าหรบการวเคราะหทางชวโมเลกล

1. CTAB buffer ปรมาตร 100 มลลลตร

PVP-4 1.0 กรม

NaCl 8.12 กรม

0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) 62.5 กรม

1.0 M Tris-HCl (pH 8.0) 10.0 มลลลตร

เตมน ำกลนใหไดปรมำตร 100 มลลลตร แลวจงเตม CTAB ปรมำตร 2 กรม และ

บมทอณหภม 60 องศำเซลเซยส จนกวำสำรละลำยจนหมด น ำไปนงฆำเชอทอณหภม 121 องศำ

เซลเซยส ควำมดน 15 ปอนดตอตำรำงนว เปนเวลำ 15 นำท และเตมสำร β-mercaptoethanol

เขมขน 2 เปอรเซนต กอนน ำไปใช

2. CIA (chloroform-isoamyl alcohol)

Chloroform 24 มลลลตร isoamyl alcohol 1.0 มลลลตร

3. TE buffer ปรมาตร 500 ml

1.0 M Tris-HCL (pH 7.5) 500 ไมโครลตร

0.25 M Na2EDTA (pH 7.0) 200 ไมโครลตร

เตมน ำกลนใหไดปรมำตร 500 มลลลตร น ำไปนงฆำเชอทอณหภม 121 องศำ

เซลเซยส ควำมดน 15 ปอนดตอตำรำงนว เปนเวลำ 15 นำท

4. TAE buffer เขมขน 50 เทา

Tris-Base 121.1 กรม

Acetic acid 28.5 มลลลตร

0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) 50.0 มลลลตร

Page 106: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

90

เตมน ำกลนใหไดปรมำตร 500 มลลลตร เจอจำงควำมเขมขนเปน 1 เทำ น ำไปนง

ฆำเชอทอณหภม 121 องศำเซลเซยส ควำมดน 15 ปอนดตอตำรำงนว เปนเวลำ 15 นำท

5. TBE buffer เขมขน 5 เทา

Tris-Base 216.0 กรม

Boric Acid 110.0 กรม

0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) 80.0 มลลลตร

เตมน ำกลนปรมำตร 4 ลตร เจอจำงควำมเขมขนเปน 1 เทำ น ำไปนงฆำเชอ ท

อณหภม 121 องศำเซลเซยส ควำมดน 15 ปอนดตอตำรำงนว เปนเวลำ 15 นำท

6. Agarose gel ความเขมขน 2 เปอรเซนต

ชง agarose 2 กรม ใสใน TAE buffer 100 มลลลตร น ำไปละลำยดวยไมโครเวฟ แลวจง

เท agarose ลงในถำดทเตรยมไว ทงให agarose แขงประมำณ 45 นำท

Page 107: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

91

ภาคผนวก ข

ตารางภาคผนวกท 1 รหสของเชอรำ Trichoderma spp. ทแยกจำกตวอยำงดนจ ำนวน 86 ตวอยำง ดวยวธ dilution spread plate บนอำหำร TSM

ตวอยำงดน รหสไอโซเลท จ ำนวนไอโซเลท แหลงเกบตวอยำง 1 ChL1.1- ChL1.4 4 อ.หลงสวน จ.ชมพร 2 ChL2.1- ChL2.3 3 อ.หลงสวน จ.ชมพร 3 ChLa1.1- ChLa1.5 5 อ.ละแม จ.ชมพร 4 ChLa2.1- ChLa2.6 6 อ.ละแม จ.ชมพร 5 ChLa3.1- ChLa3.5 5 อ.ละแม จ.ชมพร 6 ChM1.1- ChM1.5 5 อ.เมอง จ.ชมพร 7 ChM2.1- ChM2.3 3 อ.เมอง จ.ชมพร 8 ChP1.1- ChP1 4 อ.พะโตะ จ.ชมพร 9 ChP2.1- ChP2.2 2 อ.พะโตะ จ.ชมพร 10 ChP3.1- ChP3.5 5 อ.พะโตะ จ.ชมพร 11 KA1.1- KA1.7 7 อ.อำวลก จ.กระบ 12 KA2.1- KA2.6 6 อ.อำวลก จ.กระบ 13 KA3.1- KA3.4 4 อ.อำวลก จ.กระบ 14 KA4.1- KA4.5 5 อ.อำวลก จ.กระบ 15 KA5.1- KA5.4 4 อ.อำวลก จ.กระบ 16 KK1.1- KK1.5 5 อ.คลองทอม จ.กระบ 17 KM1.1- KM1.3 3 อ.เมอง จ.กระบ 18 KM2.1- KM2.3 3 อ.เมอง จ.กระบ 19 NCh1.1- NCh1.2 2 อ.ชะอวด จ.นครศรธรรมรำช 20 NCh2.1- NCh2.2 2 อ.ชะอวด จ.นครศรธรรมรำช 21 NJ1.1- NJ1.4 4 อ.จฬำภรณ จ.นครศรธรรมรำช 22 NJ2.1- NJ2.6 6 อ.จฬำภรณ จ. นครศรธรรมรำช 23 NL1.1- NL1.4 4 อ.ลำนสกำ จ. นครศรธรรมรำช 24 NL2.1- NL2.4 4 อ.ลำนสกำ จ.นครศรธรรมรำช

Page 108: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

92

ตารางภาคผนวกท 1 (ตอ) ตวอยำงดน รหสไอโซเลท จ ำนวนไอโซเลท แหลงเกบตวอยำง

25 NN1.1- NN1.5 5 อ.นำบอน จ.นครศรธรรมรำช 26 NN2.1- NN2.3 3 อ.นำบอน จ.นครศรธรรมรำช 27 NN3.1- NN3.5 5 อ.นำบอน จ.นครศรธรรมรำช 28 NN4.1- NN4.5 5 อ.นำบอน จ.นครศรธรรมรำช 29 NP5.1- NP5.5 5 อ.พรหมคร จ.นครศรธรรมรำช 30 NP6.1- NP6.5 5 อ.พรหมคร จ.นครศรธรรมรำช 31 NT1.1- NT1.3 3 อ.ทงใหญ จ.นครศรธรรมรำช 32 NT2.1- NT2.5 5 อ.ทงใหญ จ.นครศรธรรมรำช 33 NT3.1- NT3.4 4 อ.ทงใหญ จ.นครศรธรรมรำช 34 NTs1.1- NTs1.2 2 อ.ทงสง จ.นครศรธรรมรำช 35 NTs2.1- NTs2.4 4 อ.ทงสง จ.นครศรธรรมรำช 36 NTs3.1- NTs3.4 4 อ.ทงสง จ.นครศรธรรมรำช 37 NTs4.1.1 1 อ.ทงสง จ.นครศรธรรมรำช 38 PhaB1.1- PhaB1.6 6 อ.บำงแกว จ.พงงำ 39 PhaT1.1- PhaT1.6 6 อ.ทบปด จ.พงงำ 40 PhaTa1.1- PhaTa1.5 5 อ.ตะกวทง จ.พงงำ 41 PhaTa2.1- PhaTa2.7 7 อ.ตะกวทง จ.พงงำ 42 PhaTa3.1- PhaTa3.4 4 อ.ตะกวทง จ.พงงำ 43 PhatB1.1 1 อ.บำงแกว จ.พทลง 44 PhatB2.1- PhatB2.4 4 อ.บำงแกว จ.พทลง 45 PhatM1.1- PhatM1.5 5 อ.เมอง จ.พทลง 46 PhatM2.1- PhatM2.4 4 อ.เมอง จ.พทลง 47 PhatM3.1- PhatM3.4 4 อ.เมอง จ.พทลง 48 PhatM4.1- PhatM4.4 4 อ.เมอง จ.พทลง 49 PhatP1.1- PhatP1.3 3 อ.ปำบอน จ.พทลง 50 PhatP2.1- PhatP2.3 3 อ.ปำบอน จ.พทลง 51 PhatP3.1- PhatP3.4 4 อ.ปำบอน จ.พทลง

Page 109: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

93

ตารางภาคผนวกท 1 (ตอ) ตวอยำงดน รหสไอโซเลท จ ำนวนไอโซเลท แหลงเกบตวอยำง

52 PhuK1.1- PhuK1.7 7 อ.กระท จ. ภเกต 53 PhuK2.1- PhuK2.5 5 อ.กระท จ.ภเกต 54 PhuM1.1- PhuM1.3 3 อ.เมอง จ.ภเกต 55 PhuT1.1- PhuT1.4 4 อ.ถลำง จ.ภเกต 56 PhuT2.1- PhuT2.3 3 อ.ถลำง จ.ภเกต 57 RK1.1- RK1.5 5 อ.กระบร จ.ระนอง 58 RK2.1- RK2.3 3 อ.กระบร จ.ระนอง 59 RK3.1- RK3.3 3 อ.กระบร จ.ระนอง 60 RK4.1- RK4.5 5 อ.กระบร จ.ระนอง 61 RL1.1- RL1.4 4 อ.ละอน จ.ระนอง 62 RL2.1- RL2.3 3 อ.ละอน จ.ระนอง 63 RM1.1 1 อ.เมอง จ.ระนอง 64 RM2.1- RM2.4 4 อ.เมอง จ.ระนอง 65 RM3.1- RM3.3 3 อ.เมอง จ.ระนอง 66 SKlo.1- SKlo.15 5 อ.คลองหอยโขง จ.สงขลำ 67 SNa.1- SNa.7 7 อ.นำหมอม จ. สงขลำ 68 SuK1.1- SuK1.7 7 อ.กำญจนดษฐ จ.สรำษฎรธำน 69 SuK2.1- SuK2.6 6 อ.กำญจนดษฐ จ.สรำษฎรธำน 70 SuK3.1- SuK3.5 5 อ.กำญจนดษฐ จ.สรำษฎรธำน 71 SuK4.1- SuK4.4 4 อ.กำญจนดษฐ จ.สรำษฎรธำน 72 SuM1.1- SuM1.5 5 อ.เมอง จ.สรำษฎรธำน 73 SuM2.1- SuM2.2 2 อ.เมอง จ.สรำษฎรธำน 74 SuM3.1- SuM3.2 2 อ.เมอง จ.สรำษฎรธำน 75 SuN1.1- SuN1.3 3 อ.นำเดม จ.สรำษฎรธำน 76 SuN2.1- SuN2.5 5 อ.นำเดม จ.สรำษฎรธำน 77 SuP1.1- SuP1.4 4 อ.พระแสง จ.สรำษฎรธำน 78 SuP2.1- SuP2.3 3 อ.พระแสง จ.สรำษฎรธำน

Page 110: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

94

ตารางภาคผนวกท 1 (ตอ) ตวอยำงดน รหสไอโซเลท จ ำนวนไอโซเลท แหลงเกบตวอยำง

79 SuT1.1- SuT1.4 4 อ.ทำชนะ จ.สรำษฎรธำน 80 SuT2.1- SuT2.3 3 อ.ทำชนะ จ.สรำษฎรธำน 81 SuT3.1- SuT3.4 4 อ.ทำชนะ จ.สรำษฎรธำน 82 SuW1.1- SuW1.2 2 อ.เวยงสระ จ.สรำษฎรธำน 83 SuW2.1- SuW2.4 4 อ.เวยงสระ จ.สรำษฎรธำน 84 TM1.1- TM1.6 6 อ.เมอง จ.ตรง 85 TN1.1- TN1.5 5 อ.นำโยง จ.ตรง 86 TS1.1- TS1.5 5 อ.สเกำ จ.ตรง

Page 111: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

95

ตารางภาคผนวกท 2 เปอรเซนตกำรยบยงกำรเจรญของเชอรำ Rigidoporus microporus โดย เชอรำ Trichoderma spp. เปอรเซนตกำรยบยง จ ำนวนไอโซเลท 90.00-100 NL2.2 (91.43%) รวม 1 ไอโซเลท 80.00-89.99

ChM1.1(88.57%),NL2.1(87.14%),NN4.3(87.14%),NN4.4(87.14%),NP5.2(87.14%),PhaT1.1(87.14%),PhaT1.5(87.14%),PhaTa1.1,(87.14%),PhaTa2.7(87.14%),ChL1.2(85.71%),ChM2.2(85.71%),NCh2.1(85.71%),NN4.1(85.71%),NP6.4(85.71%),NTs3.3(85.71%),PhaB1.5(85.71%),PhaTa1.4(85.71%),PhuK1.4(85.71%),PhuK1.7(85.71%),PhuK2.5(85.71%),RK3.1(85.71%),RK3.2(85.71%),RK4.4(85.71%),RM3.1(85.71%),SuN1.2(85.71%),SuN1.3(85.71%),SuT1.3(85.71%),SuT1.4(85.71%),TN1.2(85.71%),TS1.2(85.71%),KA2.3(84.29%),NL1.3(84.29%),NL1.6(84.29%),NL2.4(84.29%),NN1.1(84.29%),NT2.1(84.29%),NT3.3(84.29%),NTs1.1(84.29%),PhaTa2.4(84.29%),PhaTa3.2(84.29%),PhatB2.4(84.29%),PhatP3.3(84.29%),PhuK2.2(84.29%),PhuT2.3(84.29%),RK1.3(84.29%),RK4.5(84.29%),RM2.3(84.29%),SuK1.1(84.29%),SuK3.1(84.29%),SuM1.2(84.29%),SuP2.1(84.29%),TS1.3(84.29%),ChLa3.4(82.86%),KA2.5(82.86%),NL1.1(82.86%),NL1.4(82.86%),NT1.2(82.86%),NT1.3(82.86%),NT2.3(82.86%),NT3.2(82.86%),NT3.4(82.86%),NTs2.1(82.86%),NTs3.4(82.86%),PhaB1.1,(82.86%),PhaB1.4(82.86%),PhaTa2.3(82.86%),PhaTa3.1(82.86%),PhatM1.2(82.86%),PhuK2.1(82.86%),PhuK2.3(82.86%),PhuT1.1(82.86%),PhuT1.2(82.86%),PhuT1.3(82.86%),PhuT1.4(82.86%),PhuT2.1(82.86%),RK2.1(82.86%),RK2.2(82.86%),RK3.3(82.86%),RK4.3(82.86%),RL1.1(82.86%),RL1.4(82.86%),RM3.3(82.86%),SKlo1.1(82.86%),SKlo1.3(82.86%),SNa1.6(82.86%),SuK1.3(82.86%),SuK1.6(82.86%),SuK2.1(82.86%),SuK3.4(82.86%),SuK4.2(82.86%),SuM1.4(82.86%)

Page 112: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

96

ตารางภาคผนวกท 2 (ตอ) เปอรเซนตกำรยบยง จ ำนวนไอโซเลท 80.00-89.99

SuM3.1(82.86%),SuM3.2(82.86%),SuN2.3(82.86%),SuP2.3(82.86%),SuT1.1(82.86%),SuW2.1(82.86%),SuW2.4(82.86%),TN1.3(82.86%),TS1.1(82.86%),TS1.4(82.86%),KA5.5(81.43%),KM1.3(81.43%),KM2.3(81.43%),NCh2.2(81.43%),NL1.2(81.43%),NL1.5(81.43%),NN4.2(81.43%),NN4.5(81.43%),NT1.1(81.43%),PhaTa2.2(81.43%),PhatM2.3(81.43%),PhatP2.1(81.43%),PhatP2.2(81.43%),PhuK1.5(81.43%),RK1.2(81.43%),RK1.4(81.43%),RK1.5(81.43%),RL1.2(81.43%),RL2.1(81.43%),SNa1.1(81.43%),SNa1.2(81.43%),SuK1.5(81.43%),SuK3.3(81.43%),SuK4.1(81.43%),SuK4.4(81.43%),SuP1.2(81.43%),SuW2.2(81.43%),TM1.2(81.43%),TS1.5(81.43%),ChL2.2(80.57%),KK1.4(80.57%),KA1.4(80.00%),KA2.6(80.00%),NN1.2(80.00%),NN1.3(80.00%),NN2.1(80.00%),NN2.3(80.00%),NN2.5(80.00%),NP5.1(80.00%),NP5.3(80.00%),NTs1.2(80.00%),NTs3.2(80.00%),PhaB1.6(80.00%),PhaTa1.2(80.00%),PhatM1.3(80.00%),PhatM3.2(80.00%),PhatM4.3(80.00%),PhatP1.2(80.00%),PhatP3.2(80.00%),RK2.3(80.00%),RL1.3(80.00%),RM3.2(80.00%),SNa1.7(80.00%),SuN2.4(80.00%),SuP2.2(80.00%),SuT3.2(80.00%),TM1.3(80.00%) 159 ไอโซเลท

70.00-79.99

ChLa2.2(78.57%),KK1.2(78.57%),KK1.3(78.57%),NN2.4(78.57%),PhatP3.1(78.57%),PhatP3.4(78.57%),PhuK1.1(78.57%),PhuK1.6(78.57%),PhuK2.4(78.57%),PhuM1.1(78.57%),PhuM1.3(78.57%),PhuT2.2(78.57%),RK1.1(78.57%),RK4.1(78.57%),SKlo1.5(78.57%),SuK2.3(78.57%),SuK2.4(78.57%),SuT3.3(78.57%),SuT3.4(78.57%),SuW2.3(78.57%),TM1.4(78.57%),TM1.5(78.57%),TN1.4(78.57%)

Page 113: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

97

ตารางภาคผนวกท 2 (ตอ)

เปอรเซนตกำรยบยง จ ำนวนไอโซเลท 70.00-79.99

,ChL1.3(77.14%),PhatM4.4(77.14%),SKlo1.4(77.14%)SNa1.3(77.14%),SuK2.2(77.14%),SuK2.6(77.14%),SuN2.5(77.14%),SuP1.4(77.14%),SuT3.1(77.14%),SuW1.1(77.14%),TM1.6(77.14%),ChLa1.4(75.71%),ChLa2.5(75.71%),KA4.3(75.71%),KA5.1(75.71%),NN1.4(75.71%),NT2.4(75.71%),PhaB1.2(75.71%),PhatP1.1(75.71%),PhuK1.2(75.71%),PhuK1.3(75.71%),SKlo1.2(75.71%),SNa1.5(75.71%),SuK1.4(75.71%),SuK1.7(75.71%),SuK3.5(75.71%),SuK4.3(75.71%),SuM1.5(75.71%),SuP1.3(75.71%),SuW1.2(75.71%),TM1.1(75.71%),TN1.1(75.71%),NT2.5(75.00%),SuM2.1(75.00%),KA2.2(74.29%),KA2.4(74.29%),KA3.2(74.29%),KK1.1(74.29%),NT3.1(74.29%),NTs2.4(74.29%),NTs3.1(74.29%),PhatB2.3(74.29%),PhatP2.3(74.29%),RM2.1(74.29%),SuM2.2(74.29%),SuN2.1(74.29%),SuT2.1(74.29%),NL2.3(72.86%),RL2.2(72.86%),RL2.3(72.86%),RM1(72.86%),RM2.2(72.86%),SuK2.5(72.86%),KA3.4(71.43%),KA3.6(71.43%),KA4.4(71.43%),KM2.2(71.43%),PhatM2.4(71.43%),RK4.2(71.43%),TN1.5(71.43%),ChLa2.3(70.00%),ChM1.5(70.00%),KM1.2(70.00%),PhaTa2.5(70.00%) รวม 87 ไอโซเลท

60.00-69.99

ChLa1.5(68.57%),ChLa2.1(68.57%),NJ1.1(68.57%),NJ1.2(68.57%),NJ2.3(68.57%),PhaTa1.5(68.57%),PhaTa2.1(68.57%),PhatM2.1(68.57%),ChLa2.4(67.14%),KA4.2(67.14%),NJ2.2(67.14%),NP6.5(67.14%),PhatM3.1(67.14%),PhatP1.3(67.14%),ChLa1.3(65.71%),KM1.5(65.71%),ChL1.1(64.29%),ChM2.3(64.29%),ChP1.1(64.29%),KA2.1(64.29%),KA2.7(64.29%),KA3.3(64.29%),NCh1.1(64.29%),NCh1.2(64.29%),NCh1.3(64.29%),NJ2.1(64.29%),NP6.1(64.2

Page 114: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

98

ตารางภาคผนวกท 2 (ตอ)

เปอรเซนตกำรยบยง จ ำนวนไอโซเลท 60.00-69.99

9%),NT2.2(64.29%),NTs2.3(64.29%),PhatM2.2(64.29%),SuK1.2 (64.29%),SuK3.2(64.29%),SuM1.3(64.29%),KA1.3(62.86%)PhaT1.6(61.43%),PhaTa1.3(61.43%),PhatM4.1(61.43%),ChL2.1(61.43%),ChP2.1(61.43%),KA1.5(61.43%),ChL2.3(60.00%),ChLa3.2(60.00%),ChP1.2(60.00%),KA4.1(60.00%),NN2.2(60.00%),PhatB2.1(60.00%),PhatB2.2(60.00%),PhatM1.5(60.00%),PhatM3.3(60.00%)รวม 49 ไอโซเลท

50.99-50.99

PhaB1.3(57.14%),ChLa2.6(57.14%),ChLa3.3(57.14%),ChLa3.5(57.14%),ChP1.3(57.14%),ChP3.3(57.14%),KA3.1(57.14%),KA5.3(57.14%),PhaTa2.6(57.14%),PhaTa3.4(57.14%),PhatB1(57.14%),PhatM1.1(57.14%),PhatM3.4(57.14%),PhatM4.2(57.14%),PhuM1.2(57.14%),NJ2.4(55.17%),SuN1.1(55.17%),SuP1.1(55.17%),SuT1.2(55.17%),ChLa1.1(54.29%),ChLa1.2(54.29%),ChM1.3(54.29%),ChP3.1(54.29%),ChP1.4(52.86%),ChP3.2(52.86%),NN3.2(52.86%),NN3.3(52.86%),PhatM1.4(52.86%),NTs2.2(52.57%),NP5.4(52.57%),ChM1.2(51.43%),KA5.4(51.43%),KM1.1(51.43%),KM1.4(51.43%),PhaT1.3(50.00%),PhaT1.4(50.00%),ChL1.4(50.00%),ChP3.4(50.00%),ChP3.5(50.00%),KA1.1(50.00%),NP5.5(50.00%),NP6.3(50.00%),SNa1.4(50.00%) รวม 44 ไอโซเลท

40.00-49.99

ChLa3.1(48.57%),ChM2.1(48.57%),ChP2.2(48.57%),KA1.2(48.57%),KA3.5(48.57%),KA5.2(48.57%),KM2.1(48.57%),NN3.1(48.57%),NP6.2(48.57%),NTs3.5(48.57%),PhaT1.2(48.57%),PhaTa3.3(48.57%),RM2.4(48.57%),SuM1.1(48.57%),SuT2.3(48.57%),ChM1.4(48.57%) รวม 16 ไอโซเลท

Page 115: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

99

ตารางภาคผนวกท 3 ประสทธภำพของสำรระเหยของเชอรำ Trichoderma harzianum ChM1.1 และ NL2.2 ตอกำรยบยงกำรเจรญเสนใยเชอรำ Rigidoporus microporus หลงบมกำรท อณหภมหอง เปนเวลำ 2 วน

กรรมวธ ขนำดเสนผำศนยกลำง

(เซนตเมตร) เปอรเซนตกำรยบยง เชอรำ R. microporus

T. harzianum ChM1.1 0.50±00a 94.4±00a1/ T. harzianum NL2.2 0.50±00a 94.4±00a ชดควบคม 9.00±00b 0±00b F-test ** ** C.V.(%) 00 00

**แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 1/ คำเฉลยตำมดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวำไมมแตกตำงทำงสถตทระดบควำมเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

Page 116: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

100

ตารางภาคผนวกท 4 องคประกอบสำรระเหยทสกดไดจำกเชอรำ Trichoderma harzianum ChM1.1

Retention time (min)

% Relative peak area

Possible compounds Formula Molecular

mass 11.40 0.48 2-Heptenal, (E)- C7H12O 112 15.57 29.82 3-Octanone C8H16O 128 16.28 2.08 3-Octanol C8H18O 130 19.68 4.51 Benzeneacetaldehyde C8H8O 120 24.45 5.11 3-Octanyl acetate C10H20O2 170 29.56 0.65 Tetradecane C14H30 198 30.51 0.67 Undecane, 4,6-dimethyl- C13H28 184 31.10 0.46 Dodecane, 4-methyl C13H28 184 32.28 0.82 Tetradecane C14H30 198 33.13 0.82 Dodecane, 4-methyl C14H30 198 33.76 1.62 Tetradecane C14H30 198 34.52 6.04 Pentadecane C15H32 212 35.07 0.75 Hexadecane, 2,6,10,14-

tetramethyl- C20H42

282

35.50 2.18 4-Heptanol, 4-ethyl-2,6-dimethyl-

C11H24O 172

37.62 1.40 Pentadecane C15H32 212 43.56 1.38 Heptadecane C17H36 240 44.01 2.46 à-Guaiene C15H24 204 44.28 0.95 á-Cedrene C15H24 204 44.48 1.09 à-Copaene C15H24 204 47.50 2.20 Acoradiene C15H24 204 47.97 5.24 Hexadecane, 2,6,10,14-

tetramethyl- C20H42 282

Page 117: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

101

ตารางภาคผนวกท 4 (ตอ) Retention time (min)

%Relative peak area

Possible compounds Formular Molecular

mass 49.69 2.07 Spiro[5.5]undeca-1,8-diene,

1,5,5,9-tetramethyl-, (R)- C15H24 204

50.71 0.97 Hexadecane, 2,6,10,14-tetramethyl

C20H42 282

55.93 0.42 Eicosane C20H42 282 58.81 1.81 5-Isocedranol C15H26O 222 59.27 3.13 Hydroxymethylcyclododecane C13H26O 198 59.60 0.91 Hexadecane, 2,6,10,14-

tetramethyl- C20H42 282

59.69 0.79 1,4-Cis-1,7-Cis-acorenone C15H24O 220 62.49 0.70 Cembrene C20H32 272

Page 118: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

102

ตารางภาคผนวกท 5 องคประกอบสำรระเหยทสกดไดจำกเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2

Retention time (min)

%Relative peak area

Possible compounds Formular Molecular

mass 3.26 0.54 Acetic acid C2H4O2 60 4.27 4.84 1-Butanol, 3-methyl-

(impure) C5H12O 88

14.08 0.29 Cyclohexanone, 4-methyl- C7H12O 112 15.80 0.65 3-Heptanone, 6-methyl- C8H16O 128 17.85 0.20 Benzene, 1-methoxy-3-

methyl- C8H10O 122

19.70 0.26 Benzeneacetaldehyde C8H8O 120 21.75 1.18 3-Ethylcyclopent-2-en-1-

one C7H10O 110

24.48 13.16 Benzeneethanol C8H10O 122 27.31 0.97 Octanal, 3,7-dimethyl C10H20O 156 29.36 1.04 2-Heptyl furan C11H18O 166 34.49 1.07 pentadecane C15H32 212 36.37 0.53 2-Undecanone C11H22O 170 37.61 0.31 pentadecane C15H32 212 38.41 0.61 2-Methoxy-4-ethyl-6-

methylphenol C10H14O2 166

41.49 1.07 Benzene, 4-ethenyl-1,2-dimethoxy-

C10H10O2 164

44.88 4.52 à-Bergamotene C15H24 204 45.96 1.57 1-Methyl-4(1,5-dimethyl-4-

hexenyl)-methylbenzene C15H24 204

Page 119: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

103

ตารางภาคผนวกท 5 (ตอ) Retention time (min)

%Relative peak area

Possible compounds Formular Molecular

mass 46.42 3.28 1-Methyl-4(1,5-dimethyl-4-

hexenyl)-methylbenzene C15H24 204

46.86 0.90 (3S,3aS,7R)-3a,4,5,6,7a-Tetrahydro-3,6-dimethylbenzofuran-2(3H)-one

C10H14O2 166

47.27 14.72 6 Amyl à pyrone C10H14O2 166 47.73 2.40 ç-curcumene C15H24 204 48.89 10.78 Zingiberene C15H24 204 49.59 2.88 á-Bisabolene C15H24 204 50.58 5.39 á-Sesquiphellandrene C15H24 204 51.13 2.13 2(1H)-Naphthalenone,

4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-8a-methyl-, trans-

C11H16O 164

56.48 1.31 á-Guaiene C15H24 204 56.90 1.17 zingiberenol C15H26O 222 58.55 1.81 5,6,6-Trimethyl-3,4-

undecadien-2,10-dione C14H22O2 222

60.10 0.52 Acetic acid, 10,11-dihydroxy-3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6-dienyl ester

C17H30O4 298

61.50 0.95 2-Amino-6-methyl-6,7-dihydro-9H-5-oxa-9-azabenzocyclohepten-8-1

C10H12N2O2 192

Page 120: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

104

ตารางภาคผนวกท 5 (ตอ) Retention time (min)

%Relative peak area

Possible compounds Formular Molecular

mass 65.52 0.97 Verticellol C20H34O 290 66.05 0.31 Verticellol C20H34O 290 68.59 0.19 Cyclopenta[a,d]cycloocten-

5-one, 1,2,3,3a,4,5,6,8,9,9a C20H30O 286

Page 121: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

105

ตารางภาคผนวกท 6 องคประกอบของสำรทสกดไดจำกเชอรำ Trichoderma harzianum ChM1.1 Retention time (min)

%Relative peak area

Possible compounds Formular Molecular

mass 6.93 2.25 Acetic acid (CAS) C2H4O2 60 11.03 18.29 1,3-Diamio-2-propanol C3H10N20 90 11.62 0.9 3-Furanol, tetrahydro- C4H8O2 88 12.15 1.73 2,3-Dihydro-3,5-

dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one

C6H8O4 144

13.68 0.62 2-Furancarboxaldehyde 5-(hydroxymethyl)-

C6H6O3 126

18.54 0.76 Hexadecanoic acid C16H32O2 256 21.22 1.26 Octadecanoic acid C18H36O2 284 22.27 1.54 Octadec-9-enoic acid C18H34O2 282 25.19 1.93 9-Octadecenamide C18H35NO 281 26.29 53.19 1-Hydroxy-3-methyl-

5,10-anthraquinone C15H10O3 238

30.88 7.82 Chrysophanol C15H10O4 254

Page 122: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

106

ตารางภาคผนวกท 7 ปรมำณเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญในป ยชนดตำง ๆ หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 0, 5, 10 และ 15 วน

ns ไมแตกตำงทำงสถต **แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 1/ คำเฉลยในคอลมนเดยวกนตำมดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวำไมมแตกตำงทำงสถตทระดบควำมเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

จ ำนวนประชำกร (x108 โคโลนตอกรม)

ชนดป ย ระยะเวลำบมเลยงเชอ (วน)

0 5 10 15

นงฆำเชอ

มลไก 0.003±0.000a 0.163±0.000b 0.135±0.000e 0.144±0.000e

มลวว 0.003±0.000a 0.115±0.000d 0.550±0.004c 0.732±0.000c

อนทรย ซพ 0.003±0.000a 0.175±0.000a 1.370±0.004a 1.650±0.004a

ไมนงฆำเชอ

มลไก 0.003±0.000a 0.06±0.000f 0.105±0.000e 0.140±0.004e

มลวว 0.003±0.000a 0.092±0.000e 0.336±0.001d 0.435±0.000d

อนทรย ซพ 0.003±0.000a 0.118±0.000c 0.918±0.400b 1.290±0.147b

F-test ns ** ** **

CV. (%) 00 00 0.14 00

Page 123: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

107

ตารางภาคผนวกท 8 ปรมำณเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2 ทเจรญในป ยอนทรย ซงควำมชนทแตกตำงกน หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 15 วน

กรรมวธ จ ำนวนโคโลนตอกรม (x108)

ควำมชน 25 2.82±0.63a1/

ควำมชน 30 2.00±0.41b

ควำมชน 35 1.57±1.50c

F-test **

C.V. (%) 16.18

** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 1/ คำเฉลยในคอลมนเดยวกนตำมดวยตวอกษรทเหมอนกนแสดงวำไมมแตกตำงทำงสถตทระดบควำมเชอมน 99 เปอรเซนต โดยวธ Duncan´s Mutiple Range Test

Page 124: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

108

ภาคผนวก ค

ตารางภาคผนวกท 9 วเครำะหควำมแปรปรวนควำมสำมำรถในกำรเจรญของเชอ รำ Trichoderma harziamum ChM1.1 ท pH ตำง ๆ หลงกำรบมท อณหภมหอง เปนเวลำ 2 วน

Source DF SS MS F Treatment 4 13.667 3.342 51.019** Error 15 0.982 0.065 Total 19 14.349

C.V. 1.27 % ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 10 วเครำะหควำมแปรปรวนควำมสำมำรถในกำรเจรญของเชอรำ

Trichoderma harziamum NL2.2 ท pH ตำง ๆ หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 2 วน

Source DF SS MS F Treatment 4 10.357 2.589 9.048** Error 15 4.292 0.286 Total 19 14.649

C.V.2.67 % ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01

Page 125: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

109

ตารางภาคผนวกท 11 วเครำะหควำมแปรปรวนควำมสำมำรถในกำรเจรญของเชอรำTrichoderma harziamum ChM1.1 ทอณหภมตำง ๆ หลงกำรบม เปนเวลำ 2 วน

Source DF SS MS F Treatment 4 281.657 70.414 1.006E4** Error 15 0.105 0.007 Total 19 281.762

C.V.0.42% ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 12 วเครำะหควำมแปรปรวนควำมสำมำรถในกำรเจรญของเชอรำ

Trichoderma harziamum NL2.2 ทอณหภมตำง ๆ หลงกำรบม เปนเวลำ 2 วน

Source DF SS MS F Treatment 4 235.303 58.826 1.177E4** Error 15 0.075 0.005 Total 19 235.378

C.V.0.35 ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01

Page 126: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

110

ตารางภาคผนวกท 13 วเครำะหควำมแปรปรวนประสทธภำพของสำรระเหยของเชอรำ Trichoderma harzianum ChM1.1 ตอกำรยบยงกำรเจรญเสนใยเชอรำ Rigidoporus microporus หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 2 วน

Source DF SS MS F Treatment 2 190.919 95.459 1.002E5** Error 9 0.009 0.001 Total 11 190.927

C.V.0.26% ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 14 วเครำะหควำมแปรปรวนประสทธภำพของสำรระเหยของเชอรำ

Trichoderma harzianum NL2.2 ตอกำรยบยงกำรเจรญเสนใยเชอรำ Rigidoporus microporus หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 2 วน

Source DF SS MS F Treatment 4 473.500 118.375 13.226** Error 15 134.250 8.950 Total 19 607.750

C.V.14.96% ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 15 วเครำะหควำมแปรปรวนปรมำณเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2

ในสตรส ำเรจหลงกำรผลต เปนเวลำ 24 ชวโมง Source DF SS MS F Treatment 4 44.000 11.000 1.165ns Error 15 100.000 6.667 Total 19 144.000

C.V.12.91%

nsไมแตกตำงทำงสถต

Page 127: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

111

ตารางภาคผนวกท 16 วเครำะหควำมแปรปรวนปรมำณเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2 ในสตรส ำเรจ หลงจำกเกบรกษำทอณหภม 4 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 6 เดอน

Source DF SS MS F Treatment 13 8329.804 640.754 25.057** Error 42 1074.000 25.571 Total 55 9403.804

C.V.9.03 ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 17 วเครำะหควำมแปรปรวนเปอรเซนตกำรยบยงกำรเจรญของเสนใยเชอรำ

Rigidoporus microporus โดยสตรส ำเรจของเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2 หลงจำกกำรเกบรกษำทอณหภม 4 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 6 เดอน

Source DF SS MS F Treatment 13 52.223 4.017 0.833ns Error 42 202.551 4.823 Total 55 254.774

C.V.3.92% nsไมแตกตำงทำงสถต

Page 128: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

112

ตารางภาคผนวกท 18 วเครำะหควำมแปรปรวนปรมำณของเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2. ทเจรญในป ยชนดตำง ๆ หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 15 วน

Source DF SS MS F Treatment 2 2530.500 1265.250 337.400** Error 9 33.750 3.750 Total 11 2564.250

C.V. 16.14% ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 19 วเครำะหควำมแปรปรวนปรมำณเชอรำ Trichoderma harzianum NL2.2

ทเจรญในป ยอนทรย ซงควำมชนทแตกตำงกน หลงกำรบมทอณหภมหอง เปน เวลำ 15 วน

Source DF SS MS F Treatment 2 323.167 161.583 43.410** Error 9 33.500 3.722 Total 11 356.667

C.V.16.18% ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 20 วเครำะหควำมแปรปรวนกำรเจรญของเชอรำ Rigidoporus microporus

ในดนปลก หลงกำรบมทอณหภมหอง เปนเวลำ 7 วน Source DF SS MS F Treatment 3 359.687 119.896 3.405E3** Error 12 0.422 0.035 Total 15 360.109

C.V.1.17 ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01

Page 129: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

113

ตารางภาคผนวกท 21 วเครำะหควำมแปรปรวนเปอรเซนตลดกำรเกดโรคของเชอ รำ Trichoderma harzianum NL2.2 ในดนปลก หลงกำรบม ทอณหภมหอง เปนเวลำ 7 วน

Source DF SS MS F Treatment 3 24978.255 8326.085 3.405E3** Error 12 29.340 2.445 Total 15 25007.595

C.V.9.77 ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 22 วเครำะหควำมแปรปรวนดชนกำรเกดโรครำกขำวของตนกลำยำงพำรำใน

เรอนกระจก หลงกำรทดสอบ เปนเวลำ 4 เดอน Source DF SS MS F Treatment 5 32492.213 6498.443 5.486** Error 54 63964.906 1184.535 Total 59 96457.119

C.V.57.36 ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01 ตารางภาคผนวกท 23 วเครำะหควำมแปรปรวนเปอรเซนตลดกำรเกดโรครำกขำวของตนกลำ

ยำงพำรำในเรอนกระจก หลงกำรทดสอบ เปนเวลำ 4 เดอน Source DF SS MS F Treatment 5 73280.292 14656.058 20.596** Error 54 38425.657 711.586 Total 59 111705.949

C.V.44.46 ** แตกตำงทำงสถตท P < 0.01

Page 130: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

114

ภาคผนวก ง

ล ำดบเบสของเชอรำ Trichoderma sp. ChM1 ซงมควำมเหมอนกบล ำดบเบสของเชอรำ

Trichoderma harzianum (GenBank accession number gb|KC330218.1|) ซงมควำมเหมอน

(homology) เทำกบรอยละ 99 (655/664 bp)

ACCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGG

ACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTTATAA

TCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT

TGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA

ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCAT

TTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCT

CCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGC

GCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCAACTTCTGAAATGTTGACTCGGACAGGTAGGAATACCCGC

TGAACTTAAGCATATCAATTAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCCAGTAACGGCGAGT

GAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCTAGGGCCGAGTTGTAATTTGTA

Page 131: Trichoderma harzianum Rifai เพื่อควบคุมโรครากขาวของยางพาราkb.psu.ac.th/psukb/bitstream/2016/10516/1/396687.pdf · T. harzianum

115

ล ำดบเบสของเชอรำ Trichoderma sp. NL2.2 ซงมควำมเหมอนกบล ำดบเบสของเชอรำ

Trichoderma harzianum (GenBank accession number gb|KC330218.1|) ซงมควำมเหมอน

(homology) เทำกบรอยละ 99 (640/648 bp)

GAAGTGTTGAAGGTAAAAACCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCG

GGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCC

TCGCGGGTTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAA

CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTG

AATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGC

ATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTC

CCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTT

GCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCAACTTCTGAAATGTTGACCTC

GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGG

GATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAATCTGGCCCTA