triticum aestivum l.) orgĀnu attĪstĪbu...
TRANSCRIPT
Daugavpils Universitāte
Ekoloģijas institūts
Daugavpils University
Institute of Ecology
MARINA SAVICKA
KARSTUMA STRESA IETEKME UZ KVIEŠU DĪGSTU
(TRITICUM AESTIVUM L.) ORGĀNU ATTĪSTĪBU UN
OKSIDATĪVO PROCESU IZMAIŅĀM
THE INFLUENCE OF HEAT STRESS ON DEVELOPMENT AND
OXIDATIVE PROCESSES IN THE ORGANS OF WHEAT
SEEDLINGS (TRITICUM AESTIVUM L.)
Promocijas darba
KOPSAVILKUMS
bioloģijas doktora zinātniskā grāda (Dr. biol.) iegūšanai
(ekoloģijas apakšnozarē)
SUMMARY
Of Doctoral thesis
For obtaining of Doctor of Biology (Dr.biol.) scientific degree
in sub-branch of Ecology
Zinātniskais vadītājs: Dr.biol., asoc. profesore Nataļja Škute
Scientific adviser: Dr. biol., asoc. professor Nataļja Škute
Daugavpils 2013
2
Promocijas darbs izstrādāts: Daugavpils Universitātes Ekoloģijas institūta laika periodā no
2006. līdz 2012. gadam.
Ieguldījums tavā nākotnē!
Promocijas darbu atbalstīja: Šis darbs ir izstrādāts ar Eiropas Sociālā fonda atbalstu projektos
„Atbalsts doktorantūras studijām un pēcdoktorantūras pētījumiem dabas zinātnēs un informācijas
tehnoloģijās” (Vienošanās Nr. 2004/VPD1/ESF/PIAA/04/NP/3.2.3.1/0003/0065) un
„Starpdisciplinārās zinātniskās grupas izveidošana jaunu fluorescentu materiālu un metožu
izstrādei un ieviešanai” (Vienošanās Nr. 2009/0205/1DP/1.1.1.2.0/09/APIA/VIAA/152)
Darba raksturs: promocijas darbs bioloģijas nozares ekoloģijas apakšnozarē.
Promocijas darba zinātniskais vadītāja:
Dr. biol., Nataļja Škute (Daugavpils Universitāte, Latvija)
Recenzenti:
Dr. habil. biol., Ģederts Ieviņš (Latvijas Universitāte)
Dr.biol., Inese Kokina (Daugavpils Universitāte)
PhD., Tatjana Krama (Daugavpils Universitāte)
Promocijas padomes priekšsēdētājs: Dr. biol., profesors Arvīds Barševskis
Promocijas darba aizstāvēšana notiks: Daugavpils Universitātes Bioloģijas Promocijas
padomes atklātajā sēdē 2013. gada 17. aprīlī, plks. 13.00, Vienības ielā 13, 311. Auditorijā,
Daugavpils Universitātē, Daugavpilī.
Ar promocijas darbu un tā kopsavilkumu var iepazīties Daugavpils Universitātes bibliotēkā,
Vienības 13, 116. auditorijā, Daugavpilī un http://du.lv/lv/zinatne/promocija/darbi
Atsauksmes sūtīt: Promocijas padomes sekretārei, Vienības iela 13-209, Daugavpils, LV-5401;
mob. +37126002593; e-pasts: [email protected].
Padomes sekretāre: Dr. biol., Jana Paidere, Daugavpils Universitātes pētniece.
3
Doctoral thesis elaborated at Institute of Ecology, Daugavpils University in time period from
2006 to 2012.
Ieguldījums tavā nākotnē!
The promotion thesis has been supported by the European Social Fund within the projects Nr.
2004/VPD1/ESF/PIAA/04/NP/3.2.3.1/0003/0065 and
Nr. 2009/0205/1DP/1.1.1.2.0/09/APIA/VIAA/152
Character of the paper: Doctoral thesis in the branch of Biology, sub-branch of Ecology.
Scientific adviser of the Doctoral Thesis:
Dr. biol., Nataļja Škute (Daugavpils University, Latvia)
Reviewers:
Dr. habil.biol., Ģederts Ieviņš (University of Latvia)
Dr.biol., Inese Kokina (Daugavpils University)
PhD, Tatjana Krama (Daugavpils University)
Chairman of the Promotion Council: Dr. biol., professor Arvīds Barševskis
Defence of Doctoral thesis will take place in the open meeting of Daugavpils University
Promotion Council of Biology in 17th
April, 2013, Vienības street 13, 311 room in Daugavpils.
The thesis and summary is available at the Library of Daugavpils University, Vienības street 13,
116 room, Daugavpils and http://du.lv/lv/zinatne/promocija/darbi
Comments are welcome. Send them to the secretary of the Promotion Council, Vienības street
13-209, Daugavpils, LV-5401, mob. +37126002593, e-mail: [email protected].
Secretary of the Promotion Council: Dr.biol., Jana Paidere, Daugavpils University.
4
SATURS/CONTENTS
IEVADS ..................................................................................................................................................... 5
MATERIĀLI UN METODES ................................................................................................................... 9
REZULTĀTI ............................................................................................................................................11
DISKUSIJA..............................................................................................................................................27
SECINĀJUMI ..........................................................................................................................................35
INTRODUCTION ....................................................................................................................................37
MATERIALS AND METHODS .............................................................................................................41
RESULTS ................................................................................................................................................44
DISCUSSION ..........................................................................................................................................61
CONCLUSIONS ......................................................................................................................................70
REFERENCES/ LITERATŪRAS SARAKSTS ......................................................................................71
5
IEVADS
Pētījuma aktualitāte
Klimatiskās stabilitātes izmaiņas un anomālo laika apstākļu varbūtība padara par aktuālu augu
pielāgošanās reakciju pētījumus. Viena no klimata izmaiņām ir paaugstināta vidējā temperatūra.
Karstuma stresa problēma tiek prognozēta arī nākotnē. Pēc meteorologu prognozēm vidējā
temperatūra pasaulē paaugstināsies par 1,5°C līdz 4,5°C nākamo 50 gadu laikā (Bengtsson,
1994). Turklāt daudzi reģioni piedzīvos neraksturīgas karstuma stresa epizodes (dažu dienu
temperatūras paaugstināšanos līdz 35-40°C) gada laikā (Wrigley, 2006). Tas paaugstinās
karstuma stresa izraisīto bojājumu intensitāti daudzām mērenā klimata zonas augu sugām
(Huang, 2006).
Viena no pirmajām auga atbildēm uz stresa faktora iedarbību, tajā skaitā uz karstuma stresu, ir
pastiprināta aktīvā skābekļa formu (ASF) produkcija un rezultātā membrānu lipīdu peroksidācijas
procesu aktivācija (Dat et al., 1998). Lipīdu peroksidācijas paaugstināšanās izraisa būtiskus
membrānu bojājumus (Барабой и др., 1991). Oksidatīvo procesu apvaldīšanai ir nepieciešama
antioksidantu sistēmas iejaukšanās. Antioksidantu sistēmas aktivitāte var paaugstināties stresoru
darbības laikā. Tas novērš oksidatīvos membrānu bojājumus un šūnu bojāeju (Goyal, Asthir,
2010). Augu izturību pret karstuma stresu nosaka attiecība starp lipīdu peroksidācijas līmeni un
antioksidantu sistēmas aktivitāti. Tāpēc, lai noskaidrotu auga un atsevišķu orgānu reakciju uz
konkrēta vides faktora iedarbību, nepieciešams izpētīt katru vides faktoru atsevišķi. Augu atbildes
mehānismu stresa apstākļos un izturības iegūšanas noskaidrošanai ir milzīga praktiska nozīme.
Augu izturības veidošanās procesā pret katru vides faktoru ir svarīgas ne tikai specifiskās
reakcijas, kas ir atkarīgas no faktora iedarbības īpatnībām un auga sugas, bet arī nespecifiskās
šūnu reakcijas, kas rodas jebkuru nelabvēlīgo faktoru rezultātā. Dīgstu stadija ir visjūtīgākais un
viskritiskākais periods augu ontoģenēzē, īpaši pret apkārtējās vides stresiem (Çavusoglu &
Kabar, 2012).
Augu mitohondrijiem ir liela nozīme atbildes laikā uz stresu, par to liecina mitohondriālās
homeostāzes izjukšana un rezultātā mitohondriālā ASF veidošanās. Mitohondriālo caurlaidību
regulējošo poru atvēršanos var iniciēt daudzi faktori, piemēram, šūnas bojājumi, oksidatīvais
stress u.c. (Lord et al., 2011). Ciklosporīns A (CsA) ir atgriezenisks mitohondriālo poru
atvēršanās inhibitors ne tikai dzīvnieku šūnās, bet arī augu šūnās. Tas bloķē mitohondriālo poru
atvēršanos un kavē šūnas nāvi (Arpagaus et al., 2002). Tika parādīts, ka CsA ir spēcīgs oksidatīvā
stresa inducētājs dzīvnieku šūnās. Tas piedalās ASF veidošanā un rezultātā var mainīt lipīdu
6
peroksidācijas līmeni dzīvnieku audos (Nagaraja et al., 2009). Ir arī daži dati, ka CsA kavē ASF
veidošanos augu šūnās stresa laikā (Lin et al., 2006). Tomēr literatūrā gandrīz nav datu par CsA
ietekmi uz augu šūnu oksidatīvo stāvokli un antioksidantu sistēmas darbību stresa faktoru
iedarbības laikā. Sakarā ar to, izraisa lielu interesi dzīvnieku šūnu oksidatīvo procesu modulatora
CsA ietekmes pētījumi uz lipīdu peroksidāciju un antioksidantu sistēmas aktivitāti dažādos augu
orgānos karstuma stresa iedarbības laikā.
Pētījuma novitāte
Pētījumu rezultāti būtiski papildina un paplašina esošo priekšstatu par karstuma stresa lomu
oksidatīvo procesu attīstībā funkcionāli dažādos augu orgānos.
Pirmo reizi tika veikta morfo-fizioloģisko parametru (garums, relatīvā sausā masa, vasas/saknes
attiecība, relatīvais ūdens saturs) kompleksa analīze karstuma stresa laikā. Līdz šim daudzi
morfo-fizioloģiskie parametri tika izmantoti kā ūdens deficīta un sāļu stresa rādītāji, bet karstuma
stresa pētījumos gandrīz netika pielietoti, piemēram, saknes/vasas attiecība, relatīvā sausā masa,
relatīvais augšanas indekss u.c.
Pirmo reizi tika veikti karstuma stresa inducēto antioksidantu fermentu elektroforētiskās
aktivitātes izmaiņas pētījumi funkcionāli dažādos kviešu dīgstu orgānos dažādās dīgstu attīstības
stadijās
Pirmo reizi tika izpētīta dzīvnieku mitohondriālo poru atvēršanās inhibitora Cs A ietekme uz
funkcionāli dažādiem kviešu dīgstu orgāniem dažādās dīgstu attīstības stadijās karstuma stresa
laikā
Pirmo reizi tika salīdzināta atbildes reakcija uz karstuma stresa iedarbību funkcionāli dažādos
kviešu dīgstu orgānos, kas atrodas dažādās ontoģenēzes stadijās.
Galvenās hipotēzes
1. Karstuma stresa iedarbība kavē augšanu un attīstību, veicina oksidatīvo procesu attīstību
un samazina antioksidantu sistēmas aktivitāti dīgstu attīstības stadijā.
2. Cikolsporīna A klātbūtne pastiprina karstuma stresa ietekmi uz oksidatīvo procesu
attīstību dīgstu attīstības stadijā.
Darba mērķis:
Analizējot kviešu dīgstu orgānu morfo-fizioloģiskās un bioķīmiskās izmaiņas, kuras izraisītas ar
īslaicīga un ilglaicīga karstuma stresa iedarbību dažādās dīgstu attīstības stadijās, noskaidrot
funkcionāli dažādu kviešu dīgstu orgānu atbildi uz oksidatīvo procesu izmaiņām
7
Galvenie uzdevumi:
1. Izpētīt īslaicīga un ilglaicīga karstuma stresa ietekmi uz etiolēto kviešu dīgstu augšanu un
attīstību agrīnajā un vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā funkcionāli dažādos orgānos.
2. Izpētīt morfo-fizioloģisko parametru (garums, relatīvā sausā masa, vasas/saknes attiecība,
relatīvais ūdens saturs) izmaiņas etiolēto kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības
laikā.
3. Izpētīt membrānu lipīdu peroksidācijas procesu un membrānu stabilitātes izmaiņas dažāda
ilguma karstuma stresa iedarbības rezultātā kviešu dīgstu orgānos.
4. Analizēt atsevišķo kviešu dīgstu orgānu aizsargreakcijas, nosakot antioksidantu fermentu
elektroforetisko aktivitāti.
5. Izpētīt proteīnu kvalitatīvās izmaiņas kviešu dīgstu orgānos dažāda ilguma karstuma stresa
iedarbības laikā.
6. Izpētīt mitohondriālo caurlaidību regulējošo poru atvēršanās inhibitora ciklosporīna A ietekmi
uz lipīdu peroksidācijas, membrānu stabilitātes un antioksidantu fermentu elektroforētiskās
aktivitātes izmaiņām etiolēto kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības laikā.
Promocijas darba aprobācija
Par promocijas darba rezultātiem ziņots 11 starptautiskajās zinātniskajās konferencēs un 1
vietējas nozīmes zinātniskajā konferencē:
5th Baltic Congress of Genetics (Kaunas, Lithuania, 19.-22.2012): ‘The Synthesis of
Different Isoforms of Antioxidant Enzymes as a Reaction on Heat Stress in Different
Wheat Organs (Triticum aestivum L.)’
Development and Application of New Fluorescent Materials and Methods (Daugavpils,
Latvia, 12.09.2012): ‘The Influence of High Temperature on Oxidative Processes and
Accelerated Senescence in Wheat Seedling (Triticum aestivum L.) Coleoptile’
V International Conference of Young Scientists ‘Biodiversity. Ecology. Adaptation.
Evolution.’ (Odesa, Ukraine, 13. – 17.06.2011): Impact of Heat Stress on Development of
Senescent Organs of Wheat Seedlings (Triticum aestivum L.): Biochemical and
Morphological Changes.
6th International Conference „Research and Conservation of Biological Diversity in
Baltic Region” (Daugavpils, Latvia 28.-29.04.2011): ‘High-temperature Injury in Relation
to Membrane Lipid Peroxidation in Different Organs of Wheat Seedlings (Triticum
aestivum L.)’
8
V International Young Scientists’ Conference ‘Biology: from a Molecule up to the
Biosphere’ (Kharkiv, Ukraine, 22.-25.11.2010): ‘Effects of Heat Stress on Oxidative
Damage and Morphological Changes in Wheat Seedlings (Triticum aestivum L.)’
5th International Conference „Research and Conservation of Biological Diversity in
Baltic Region” (Daugavpils, Latvia 22.-24.04.2009): ‘Superoxide Dismutase and Catalase
Electrophoretic Activity and Lipid Peroxidation in Wheat Seedlings (Triticum aestivum
L.) after Heat Stress’
3rd International Young Scientists’ Conference ‘Biology: from a Molecule up to the
Biosphere’ (Kharkiv, Ukraine, 18.-21.11.2008): ‘Lipid Peroxidation and Antioxidant
Activity in Wheat (Triticum aestivum L.) Seedlings in Response to Heat Shock’
International Life-Sciences Conference (Warsaw, Poland 10.-14.09.2008): ‘The Effect of
Heat Stress on the Activity of Antioxidant Enzymes and Lipid Peroxidation in Wheat
(Triticum aestivum L.) Seedlings’
50th International Scientific Conference of Daugavpils University (Daugavpils, Latvia,
05.-17.05.2008): ‘The effect of short-term and long-term influence of heat shock on
production of reactive oxygen species and growth of wheat (Triticum aestivum L.)
seedlings’
IV Baltic Genetical Congress (Daugavpils, Latvia, 09.-12.10.2007): ‘Influence of some
antioxidants on enzyme activity and electrophoretic pattern of isoenzymes of superoxide
dismutase and catalase in wheat seedlings (Triticum aestivum L.)’
World Conference of Stress (Budapest, Hungary, 23.-26.08.2007): ‘Influence of
antioxidants on some stages of oxidative stress in plant cells of wheat and barley
seedlings’
4th International Conference „Research and Conservation of Biological Diversity in
Baltic Region” (Daugavpils, Latvia, 25.-27.04.2007): ‘Some molecular mechanisms of
oxidative stress in plant cells of wheat seedlings’
Darba galvenie rezultāti ir atspoguļoti 4 zinātniskos rakstos:
Savicka M., Škute N. 2012. Some morphological, physiological and biochemical
characteristics of wheat seedling Triticum aestivum L. organs after high-temperature
treatment. Ekologija. 58(1): 9-21.
9
Savicka M., Škute N. 2010. Effects of high temperature on malondialdehyde content,
superoxide production and growth changes in wheat seedlings (Triticum aestivum L.).
Ekologija. 56(1-2): 26-33.
Shkute N., Savicka M. 2009. Influence of mammalian imunodepresant cyclosporin A on
some molecular processes of plant senescence. Acta Biologica Univiversit. Daugavp. 9
(2): 283-290.
Savicka M., Škute N. 2008. The influence of heat shock on production of reactive oxygen
species and growth of wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Proceedings of the 50th
International Scientific Conference of Daugavpils University. 79-88.
Promocijas darba apjoms un struktūra
Darba apjoms ir 169 lpp. Tajā ir 76 attēli un 6 tabulas. Darbā ir citēti 286 literatūras avoti un 1
internēta avots. Darba struktūru veido ievads, literatūras apskats, materiāli un metodes, rezultāti,
diskusija, secinājumi, literatūras saraksts un 3 pielikumi. Darba materiālu un metožu apraksts,
galvenie rezultāti to analīze un secinājumi apkopoti šajā kopsavilkumā.
MATERIĀLI UN METODES
Pētījumu objekts
Kviešu dīgsti ir ērts augu morfoloģijas, fizioloģijas un molekulārās bioloģijas pētījumu modelis,
jo graudaugiem ir raksturīga sinhrona augšana un attīstība visas ontoģenēzes laikā. Pētījumiem
tika izmantoti kviešu šķirnes „Harmonija” etiolēto dīgstu orgāni, t.i., pirmā lapa, koleoptile un
sakne. Kviešu dīgstu saknes tika izmantotas tāpēc, ka augstas temperatūras ietekme uz saknēm
izraisa visa auga novecošanos. Pirmā lapa un koleoptile tika izmantotas tāpēc, ka pirmā lapa ir
attīstošs orgāns, bet koleoptile ir novecojošs kviešu dīgstu orgāns.
Augstas temperatūras un ciklosporīna A (1 mg/l) iedarbība
Karstuma stresa (KS) efekts tika iegūts paaugstinot temperatūru no 26°C līdz 42°C. Kviešu
dīgsti tika pakļauti īslaicīgam (15, 30 un 60 minūšu) un ilglaicīgam (24 stundu) KS agrīnajā un
vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā (četras un septiņas dienas veci dīgsti attiecīgi). Pirmās lapas,
koleoptiles un saknes mērījumiem tika savāktas uzreiz pēc KS un ar 24 stundu intervālu pēc KS.
Tika veikti biometrisko parametru mērījumi, lipīdu peroksidācijas produktu – malondialdehīda
(MDA) un diēnu konjugātu (DK) un elektrolītu noplūdes (EN) noteikšana, summāro proteīnu
daudzuma izmaiņu un antioksidantu enzīmu elektroforētiskās aktivitātes pētījumi.
10
Sākot no 1. dienas kviešu dīgsti audzēti CsA (1 mg/l) klātbūtnē. MDA, EN, summāro proteīnu un
antioksidantu fermentu elektroforētiskās aktivitātes izmaiņas kviešu dīgstu orgānos agrīnajā
dīgstu attīstības stadijā tika pētītas CsA kombinācijā ar dažāda ilguma KS.
Augšanas parametru mērījumi
Pirmās lapas, koleoptiles garums un maksimālais saknes garums tika noteikts milimetros. Visi
rezultāti ir vidējie no trim neatkarīgiem mērījumiem. Kopumā morfometriskie mērījumi tika
veikti 5310 kviešu dīgstiem.
Pirmās lapas, koleoptiles un saknes svaigā (SvM), turgorā (TM) un sausā masa (SM) tika noteikta
uzreiz pēc KS, kā arī ar 24 stundu intervālu pēc KS (Ali et al., 2009).
Relatīvā sausā masa (RSM) tika aprēķināta, izmantojot vienādojumu (Ali et al., 2009):
Saknes/Vasas (S/V) attiecība tika aprēķināta, izmantojot vienādojumu (Worku, Astatkie, 2010):
, kur SSM – saknes SM; LSM – lapas SM; KSM – koleoptiles SM.
Relatīvais augšanas indekss (RAI) tika aprēķināts, izmantojot vienādojumu (Bhattacharjee,
Mukherjee, 2003):
Relatīvais ūdens saturs (RŪS) tika aprēķināts, izmantojot vienādojumu (Turner, 1981):
Elektrolītu noplūdes mērījumi
Kviešu dīgstu orgānu membrānu caurlaidība tika aprēķināta pēc elektrolītu noplūdes (EN) (Guo
et al., 2006), izmantojot vienādojumu:
Lipīdu peroksidācijas produktu noteikšana
MDA daudzums tika noteikts pēc reakcijas ar tiobarbiturskābi (Ali et al., 2005). MDA daudzums
tika noteikts spektrofotometriski 532nm un 600nm viļņa garumos (ɛ = 155mM-1
cm-1
). Lipīdu
peroksidācija tika noteikta pēc DK veidošanās (Recknagel, Ghoshal, 1966). DK daudzums tika
noteikts spektrofotometriski 233nm viļņa garumā (2,2x105 M
-1cm
-1).
Kviešu dīgstu orgānu proteīnu pētījumi
Pirmās lapas, koleoptiles un saknes paraugi tika fiksēti proteīnu pētījumu veikšanai, sākot no 4.
dīgstu attīstības dienas pēc 15, 30 un 60 minūšu KS un sākot no 5. dīgstu attīstības dienas pēc 24
11
stundu KS, kā arī trīs dienas pēc KS ar 24 stundu intervālu. Paraugi tika homogenizēti 50mM K-
fosfāta buferšķīdumā (pH 7,8).
Summārais proteīnu daudzums tika noteikts pēc „Invitrogen” protokola, izmantojot Quant – iT™
proteīnu noteikšanas komplektu ar Qubit™ fluorimetra (Invitrogen™) palīdzību.
Antioksidantu fermentu elektroforetiskā aktivitāte
SOD, CAT un POD izoenzīmu paraugi tika identificēti izmantojot elektroforēzi 15%, 7,5% un
12% poliakrīlamīda gēlā attiecīgi. Noteikts proteīnu daudzums (20 μg) tika izmantots katram
paraugam.
Nātrija dodecilsulfāta – poliakrilamīda gēlā elektroforēze (SDS-PAGE)
Kopējo proteīnu sadalīšanai elektriskā laukā tika izmantota SDS-PAGE metode (Laemmli, 1970)
ar modifikācijām.
Datu statistiskā apstrāde un analīze
Pētījumu rezultātu statistiskai analīzei izmantotas šādas datorprogrammas: Microsoft Excel 2010
un Statistica 7.0. Visi rezultāti ir vidējie no trim neatkarīgiem mērījumiem (izņemot
elektroforētiskos pētījumus). Visiem pētījumu rezultātiem tika aprēķinātas standartnovirzes un
standartkļūdas (SE). Rezultātiem tika veikta dispersijas analīze (One-Way ANOVA) un tika
noteikta to p-vērtība (p < 0,05).
REZULTĀTI
Augsnes un gaisa temperatūru izmaiņas Latvijā no 2004. gada līdz 2011. gadam
Tika analizēti novērojumu staciju dati par maksimālo gaisa temperatūru izmaiņām Latvijā pēdējo
astoņu gadu laikā (2004. – 2011. gg.), kā arī augsnes virskārtas temperatūras vasaras mēnešos
(LVĢMC). Vidējās maksimālās gaisa temperatūras vasaras mēnešos variē no 24˚C līdz 32˚C.
Augsnes virskārtas temperatūras pārsvarā variē no 20˚C līdz 50˚C. Vairāk nekā 60% no
temperatūru sadalījuma reģistrēti diapazonā 20-40˚C. Vairāk nekā 10% no visu augsnes
virskārtas temperatūru vasaras mēnešos ir diapazonā 40-50˚C, bet pētāmā perioda viskarstākajos
gados sasniedz pat 33% (2006. gadā).
12
Morfo-fizioloģisko parametru izmaiņas kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības
rezultātā
Relatīvā ūdens satura (RŪS) izmaiņas
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā graujošs ūdens zudums tika novērots koleoptilēs pēc ilglaicīga
karstuma stresa (KS) iedarbības, t.i., uzreiz pēc KS – par 6,3% un 5. dienā par – 49% (p<0,05).
Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā uzreiz pēc ilglaicīga KS iedarbības pirmo lapu RŪS pazeminājās
par 5% (p>0,05), taču 4. dienā pēc stresa – par 45% (p<0,001). Koleoptiles ūdens zudums bija
atkarīgs no KS ilguma, t.i., uzreiz pēc 15 minūšu – 21%, pēc 60 minūšu – 40% un pēc 24 stundu
– 50%. 5. dienā pēc KS koleoptiļu RŪS pakāpeniski samazinājās vairāk nekā par 50% (p<0,01)
salīdzinājumā ar kontroli (1. un 2. attēls).
1. attēls
RŪS (%) izmaiņas koleoptilēs pēc īslaicīga KS (42°C) iedarbības agrīnajā (A) un vēlīnajā (B)
kviešu dīgstu attīstības stadijās. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
2. attēls
RŪS (%) izmaiņas koleoptilē pēc ilglaicīga KS (42°C) iedarbības agrīnajā (A) un vēlīnajā (B)
kviešu dīgstu attīstības stadijās (*-stresa iedarbības sākuma diena). Rezultāti ir vidējie ± SE no 3
neatkarīgiem mērījumiem.
13
Kviešu dīgstu orgānu garuma izmaiņas karstuma stresa iedarbības rezultātā
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērota būtiska pirmās lapas augšanas garumā inhibēšana
5. dienā pēc 15, 30 un 60 minūšu KS (par 16% (p<0,05), 35% (p<0,001) un 27% (p<0,01)
attiecīgi). Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā uzreiz pēc 15 minūšu un 24 stundu iedarbības pirmās
lapas gandrīz pārtrauc savu augšanu (p<0,001), bet uzreiz pēc 30 un 60 minūšu KS lapu augšana
tika inhibēta par 19% un 17% attiecīgi un 5. dienā pēc stresa – par 28% un 26% attiecīgi (p<0,05)
(3. attēls). Uzreiz pēc ilglaicīga KS pirmās lapas garums tika inhibēts gan agrīnajā, gan vēlīnajā
dīgstu attīstības stadijā (par 23% un 29% attiecīgi; p<0,001), bet pētāmā perioda beigās par 55%
un 31% attiecīgi.
KS izraisīja būtisku maksimālā sakņu garuma inhibēšanu (p<0,001) visās dīgstu attīstības
stadijās. Pēc stresa periodā KS inhibējošā ietekme pastiprinājās gan agrīnajā (>50%; p<0,001),
gan vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā (>40%; p<0,001). Koleoptilēs, kas tika pakļautas KS
iedarbībai, izmaiņas bija nenozīmīgas (p>0,05).
3. attēls
Pirmās lapas garuma (mm) izmaiņas pēc īslaicīga KS (42°C) iedarbības agrīnajā (A) un vēlīnajā
(B) kviešu dīgstu attīstības stadijās (KS1 – 4 dienas veci dīgsti; KS2 – 7 dienas veci dīgsti).
Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
Relatīvās sausās masas (RSM) izmaiņas
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā RSM palielināšanās kviešu dīgstiem pēc 15 minūšu iedarbības
(no 8% (p<0,01) līdz 15% (p<0,05)) notiek pārsvarā pirmo lapu un koleoptiļu RSM
palielināšanās dēļ. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā pēc 15 minūšu KS tika novērota dīgstu RSM
samazināšanās visā pētāmā perioda laikā no 1% līdz 21%. Uzreiz pēc 30 minūšu KS agrīnajā un
vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā RSM palielinājās par 4% un 6% attiecīgi (p<0,05), tomēr pētāmā
perioda beigās RSM paaugstinājās par 10% un 12% attiecīgi (p>0,05) salīdzinājumā ar kontroli.
14
Turklāt agrīnajā dīgstu attīstības stadijā dīgstu RSM palielināšanās notika visu kviešu dīgstu
orgānu RSM palielināšanās dēļ, bet vēlīnajā stadijā – galvenokārt virszemes dīgsta daļas RSM
palielināšanās dēļ. Dīgsta RSM izmaiņas pēc 60 minūšu KS iedarbības tika novērotas tikai
vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā, t.i., dīgstu RSM samazināšanās par 13% pētāmā perioda beigās,
kas notika koleoptiles (19%) un saknes (13%) RSM samazināšanās rezultātā. Agrīnajā dīgstu
attīstības stadijā dīgstu RSM samazināšanās uzreiz pēc ilglaicīga KS (7%; p<0,001) notiek sakņu
RSM samazināšanās dēļ (43%; p<0,05) un pētāmā perioda beigās (20%; p<0,001) samazinājās
pirmo lapu un koleoptiļu RSM (26% un 38% attiecīgi; p<0,01), bet RSM palielinājums līdz
kontroles līmenim vēlīnajā stadijā – paaugstinātas pirmās lapas RSM dēļ (27%; p<0,05).
Saknes/vasas (S/V) attiecības izmaiņas
15 minūšu un 24 stundu KS iedarbība izraisa viskrasāko S/V attiecības samazināšanos (p<0,05),
t.i., uzreiz pēc KS iedarbības par 28% un 73% attiecīgi agrīnajā dīgstu attīstības stadijā un par
44% un 40% attiecīgi – vēlīnajā stadija (4. attēls). Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā pēc ilglaicīga
stresa perioda S/V attiecība palielinājās un sasniedza kontroldīgstu līmeni. Agrīnajā dīgstu
attīstības stadijā pēc īslaicīga KS S/V attiecība samazinājās un 5. dienā pēc 15 minūšu stresa tā
bija par 56% (p<0,001), pēc 30 minūšu – par 19% (p<0,05), bet pēc 60 minūšu – 47%; (p<0,001)
mazāka nekā kontroldīgstiem. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā pēc īslaicīga KS S/V attiecība
samazinājās un 5. dienā pēc 15 minūšu stresa tā bija par 64% (p<0,001), pēc 30 minūšu – par
51% (p<0,01), bet pēc 60 minūšu – par 28%; (p<0,001) mazāka nekā kontroldīgstiem.
4. attēls
S/V attiecības izmaiņas kviešu dīgstiem pēc KS (42°C) iedarbības agrīnajā (KS1) un vēlīnajā
(KS2) kviešu dīgstu attīstības stadijās. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
15
Relatīvā augšanas indeksa (RAI) izmaiņas
RAI ir atkarīgs ne tikai no KS iedarbības ilguma, bet arī no orgāna, uz kuru iedarbojas KS (6.
tabulā). Viskritiskākais KS ilgums ir 24 stundas, bet vislabvēlīgākais – 30 minūtes. Visjūtīgākās
pret KS izrādījās saknes (6. tabulā).
5. dienā pēc 15, 30 un 60 minūšu KS agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika konstatēta pirmās lapas
RAI samazināšanās (apmēram par 35%; p<0,05), vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā RAI
samazinājās vairāk nekā par 20% (p<0,05). Koleoptiles RAI palielinājums tika konstatēts trīs
dienas pēc īslaicīga stresa perioda agrīnajā dīgstu attīstības stadijā (p<0,05), tomēr 5. dienā pēc
30 un 60 minūšu KS RAI bija zemāks par 23% un 33% attiecīgi (p<0,05), bet pēc 15 minūšu KS
– kontroles līmenī. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā periodā pēc stresa tika novērota koleoptiļu
RAI pakāpeniska samazināšanās, visos dīgstos, kas tika pakļauti īslaicīgai KS iedarbībai.
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērota pakāpeniska sakņu RAI samazināšanās un 5. dienā
pēc 15, 30 un 60 minūšu stresa RAI samazinājās par 62%, 42% un 65% attiecīgi (p<0,001).
Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā tika konstatēta agrīnajai stadijai līdzīga pakāpeniska sakņu RAI
samazināšanās (p<0,001).
Turpmākajās dienās pēc 24 stundu KS agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērots straujš
kviešu dīgstu orgānu RAI kritums (p<0,001), vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā RAI saglabājās
nemainīgi zems (>50%; p<0,05).
6. Tabula
RAI (%) izmaiņas kviešu dīgstiem pēc dažāda ilguma KS (42°C) iedarbības agrīnajā (KS1 – 4
dienas veci dīgsti) un vēlīnajā (KS2 – 7 dienas veci dīgsti) kviešu dīgstu attīstības stadijās
KS
iedarbības
ilgums
RAI (%)
Pirmā lapa Koleoptile Sakne
KS1 KS2 KS1 KS2 KS1 KS2
0 min 100 100 100 100 100 100
15 min 125±0,05*** 89±0,56** 119±1,78** 100±0,05 100±0,05 42±2,22**
30 min 100±0,05* 112±0,69** 120±13,19 125±0,05*** 100±0,08 84±6,11
60 min 100±0,02* 135±2,08** 102±2,96 85±5,45 80±0,10*** 79±1,11**
24 st. 71±0,01*** 54±4,17** 104±4,35 50±10,00* 27±1,79*** 33±7,50**
*- p<0,05; **- p<0,01; ***- p<0,001. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
16
Lipīdu peroksidācijas izmaiņas kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības rezultātā
Malondialdehīda daudzuma izmaiņas
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā pēc īslaicīgas KS iedarbības tika novērota MDA daudzuma
samazināšanās pirmajās lapās (p<0,001) (5. attēls). Piektajā dienā pēc 15 minūšu KS agrīnajā
dīgstu attīstības stadijā MDA līmenis bija zemāks par 48%, bet pēc 30 un 60 minūšu KS
iedarbības par 59% (p<0,001). Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā uzreiz pēc 15, 30 un 60 minūšu
KS pirmo lapu MDA līmenis samazinājās par 48%, 54% un 57% attiecīgi salīdzinājumā ar
kontroldīgstu pirmo lapu. Tomēr 4. dienā pēc īslaicīga stresa MDA līmenis līdzinājās kontrolei,
tāpēc ka kontroldīgstu pirmās lapas MDA līmenis samazinājās (p<0,05).
5. attēls
MDA daudzuma izmaiņas kviešu dīgstu pirmajā lapā pēc īslaicīga KS (42˚C) iedarbības agrīnajā
(KS1) un vēlīnajā (KS2) dīgstu attīstības stadijās.
Pēc īslaicīgas KS iedarbības agrīnajā dīgstu attīstības stadijā MDA līmenis koleoptilēs sāka
pakāpeniski paaugstināties, sākot no 2. dienas pēc stresa. 5. dienā pēc 15 minūšu stresa MDA
līmenis koleoptilēs paaugstinās 2,5 reizes (p<0,001), bet pēc 30 un 60 minūšu stresa bija 4 reizes
augstāks (p<0,05), nekā kontroldīgstu koleoptilēs. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā īslaicīgs KS
izraisa spēcīgu MDA līmeņa paaugstināšanos koleoptilēs, t.i., uzreiz pēc 15 minūšu – 2,5 reizes
(p<0,05), pēc 30 minūšu – 4,5 reizes un pēc 60 minūšu – 3,3 reizes (p<0,001) salīdzinājumā ar
kontroli. 2. un 3. dienā pēc stresa koleoptilēs tika reģistrēta MDA līmeņa paaugstināšanās, t.i.,
pēc 15 minūšu – 7 reizes (p<0,05), pēc 30 un 60 minūšu – 4 un 3,5 reizes attiecīgi (p<0,001). 4.
dienā pēc stresa MDA daudzums bija 3 reizes augstāks nekā kontrolē (p<0,001).
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā MDA līmenis saknēs uzreiz pēc 30 un 60 minūšu stresa tika
reģistrēts zemāks nekā kontrolē MDA līmenis (16% un 46% attiecīgi; p<0,05). Turpmāko dienu
17
laikā MDA līmenis saknēs paaugstinājās un 5. dienā pēc īslaicīga stresa MDA līmenis saknēs bija
vairāk nekā 3 reizes (p<0,05) augstāks nekā kontrolē. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā 15, 30 un
60 minūšu KS iedarbība izraisīja MDA līmeņa paaugstināšanos (par 88%, 48% un 3 reizes
attiecīgi; p<0,05). Īslaicīgam stresam pakļautajās saknēs MDA līmenis saglabājās vairāk nekā 3
reizes augstāks nekā kontroldīgstu sakņu MDA līmenis visu pētāmo periodu (p<0,01).
Būtiska MDA daudzuma samazināšanās (p<0,001) tika reģistrēta pirmajās lapās uzreiz pēc
ilglaicīga KS iedarbības agrīnajā (48%) un vēlīnajā (32%) dīgstu attīstības stadijā salīdzinājumā
ar kontroli (6. attēls). Pirmo lapu MDA līmenis pēc ilglaicīgas KS iedarbības bija zemāks nekā
kontroldīgstu lapu MDA līmenis visu pētāmā perioda laiku un pētāmā perioda beigās tas bija par
56% zemāks (p<0,001) agrīnajā dīgstu attīstības stadijā un par 17% (p<0,01) mazāks nekā
kontroldīgstu pirmās lapas MDA līmenis vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā. Agrīnajā dīgstu
attīstības stadijā uzreiz pēc 24 stundu KS iedarbības koleoptilēs tika reģistrēts kontrolei līdzīgs
MDA līmenis. Turpmākajās dienās pēc ilglaicīga stresa MDA līmenis paaugstinājās un pētāmā
perioda beigās tas bija vairāk nekā 2 reizes augstāks (p<0,001) nekā kontroldīgstu koleoptilēs.
Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā MDA līmenis koleoptilēs paaugstinājās par 51% (p<0,05) uzreiz
pēc ilglaicīga KS iedarbības un 4. dienā pēc stresa iedarbības MDA līmenis paaugstinājās 65%
(p<0,001). MDA līmenis saknēs samazinājās dīgstu attīstības laikā. Tomēr uzreiz pēc ilglaicīga
KS iedarbības agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērota MDA daudzuma samazināšanās
salīdzinājumā ar kontroli (34%; p<0,01), 4. dienā pēc stresa iedarbības MDA līmenis bija
kontroldīgstu sakņu līmenī. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadija tika reģistrēta MDA līmeņa
paaugstināšanās saknēs uzreiz pēc 24 stundu karstuma stresa (54%; p<0,01), tomēr pētāmā
periodā beigās samazinājās līdz kontroldīgstu līmenim.
6. attēls
MDA daudzuma izmaiņas pirmajā lapā pēc ilglaicīga KS (42˚C) iedarbības agrīnajā (KS1) un
vēlīnajā (KS2) dīgstu attīstības stadijās. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
18
Diēnu konjugātu daudzuma izmaiņas
Visos pētītos etiolēto kviešu dīgstu orgānos tika novēroti trīs DK veidošanās maksimumi agrīnās
ontoģenēzes laikā Tomēr pirmajās lapās un saknēs DK daudzums samazinājās etiolēto kviešu
dīgstu agrīnās ontoģenēzes laikā, bet koleoptilēs tika novērota strauja DK daudzuma
palielināšanās dīgstu attīstības laikā (p<0,05).
Pirmais DK veidošanās maksimums pirmajā lapā pēc 15, 30 un 60 minūšu KS iedarbības agrīnajā
dīgstu attīstības stadijā sakrita ar kontroli, t.i., 1. dienā pēc stresa iedarbības, tomēr bija par 20%,
23% un 12% attiecīgi (p<0,05) mazāks (7. attēls). Otrais DK veidošanās maksimums 15, 30 un
60 minūšu stresam pakļautajās lapās bija nobīdīts par vienu dienu agrāk nekā kontroldīgstu
pirmajā lapā, t.i., 3. dienā pēc stresa un bija 34%, 2 reizes un 62% attiecīgi augstāks (p<0,05).
Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā DK veidošanās maksimumi pirmajās lapās, kas tika pakļautas 15,
30 un 60 minūšu KS tika konstatēti uzreiz pēc īslaicīgas KS iedarbības (augstāki par 74%, 28%
un 88% attiecīgi; p<0,05) un 3. dienā pēc stresa iedarbības (sakrita ar kontroldīgstu pirmās lapas
DK līmeni).
7. attēls
DK daudzuma izmaiņas kviešu dīgstu pirmajā lapā pēc īslaicīga KS (42˚C) iedarbības agrīnajā
(KS1) un vēlīnajā (KS2) dīgstu attīstības stadijās. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem
mērījumiem.
Pēc īslaicīga KS iedarbības agrīnajā un vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā DK veidošanās
maksimumi koleoptilē ir nobīdīti vienu dienu iepriekš salīdzinājumā ar kontroldīgstu
koleoptilēm, t.i., uzreiz pēc stresa temperatūras iedarbības un 3. dienā pēc karstuma stresa
iedarbības. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā koleoptiļu DK maksimumi pēc sava lieluma bija
19
vairāk nekā 3 reizes augstāki nekā kontrolē (p<0,01). Agrīnajā un vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā
kviešu dīgstu saknēs tika konstatēti divi DK veidošanās maksimumi pēc īslaicīga KS, t.i., uzreiz
pēc KS un 3. dienā pēc stresa. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā saknēs tika konstatēta būtiska DK
daudzuma palielināšanās uzreiz pēc 15, 30 un 60 minūšu KS iedarbības par 99%, 2,5 reizes un
par 48% attiecīgi (p<0,05).
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā ilglaicīga KS iedarbība neizraisīja statistiski būtisku DK līmeņa
izmaiņu pirmajās lapās salīdzinājumā ar kontroli, tomēr vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā,
neskatoties uz kontroldīgstu pirmajai lapai līdzīgu DK veidošanās raksturu, tika novērota
ievērojama DK daudzuma palielināšanās (apmēram 50%; p<0,01), kas saglabājās visu pēc stresa
perioda laiku (8. attēls).
8. attēls
DK daudzuma izmaiņas kviešu dīgstu pirmajā lapā pēc ilglaicīga KS (42˚C) iedarbības agrīnajā
(KS1) un vēlīnajā (KS2) dīgstu attīstības stadijās. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem
mērījumiem.
Būtiska DK līmeņa paaugstināšanās tika reģistrēta koleoptilēs visās dīgstu attīstības stadijās.
Uzreiz pēc ilglaicīgas KS iedarbības koleoptilē DK līmenis paaugstinājās agrīnajā un vēlīnajā
dīgstu attīstības stadijā par 30% un 43% attiecīgi (p<0,05) salīdzinājumā ar kontroli. Otrais DK
veidošanās maksimums tika reģistrēts 3. dienā pēc ilglaicīga KS visās dīgstu attīstības stadijās un
bija 3 reizes augstāks (p<0,01) nekā kontroldīgstu koleoptiles DK līmenis.
Uzreiz pēc ilglaicīgas KS iedarbības saknēs tika novērots DK daudzuma palielinājums agrīnajā
un vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā par 17% un 39% attiecīgi (p<0,05). Tomēr pētāmā perioda
beigās ilglaicīgam stresam pakļauto sakņu DK līmenis paaugstinājās agrīnajā un vēlīnajā dīgstu
attīstības stadijā (103% un 89% attiecīgi; p<0,05).
20
Membrānu caurlaidības izmaiņas kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības
rezultātā
Īslaicīgais KS samazina membrānu caurlaidību pirmajā lapā. Uzreiz pēc 15 minūšu karstuma
stresa elektrolītu noplūde (EN) pirmajā lapā samazinājās par 7% (p>0,05), pēc 30 minūšu – par
1% (p>0,05) un pēc 60 minūtēm – par 33% (p<0,05) salīdzinājumā ar kontroldīgstu EN. Arī 5.
dienā pēc 15, 30 un 60 minūšu stresa agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērota statistiski
būtiska (p<0,05) membrānu caurlaidības samazināšanās pirmajā lapā par 49%, 39% un 47%
attiecīgi (9. attēls). Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā 15, 30 un 60 minūšu KS nelabvēlīgi ietekmē
pirmās lapas membrānu stāvokli, par ko liecina paaugstināta EN uzreiz pēc karstuma stresa
iedarbības (par 35%, 33% un 66% attiecīgi; p<0,05) (9. attēls). Turpmākajās dienās pēc 15 un 30
minūšu stresa EN līmenis lapās samazinājās un pētāmā perioda beigās bija kontroldīgstu līmenī.
Tomēr pirmajās lapās, kuras tika pakļautas 60 minūšu KS 5. dienā tika novērota strauja
membrānu caurlaidības paaugstināšanās par 95% (p<0,05).
Nemainīgi augsts EN līmenis tika novērots pirmajā lapā pēc ilglaicīga karstuma stresa iedarbības
visā pētāmā perioda laikā salīdzinājumā ar kontroldīgstu pirmo lapu (10. attēls). Kaut gan
vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā pirmās lapas membrānu caurlaidība pēc stresa temperatūras
iedarbības ir augstāka (apmēram četras reizes; p<0,05) nekā agrīnajā dīgstu attīstības stadijā
(apmērām trīs reizes; p<0,05) salīdzinājumā ar kontroli.
9. attēls
EN (%) izmaiņas kviešu dīgstu pirmajā lapā pēc īslaicīga KS (42˚C) iedarbības agrīnajā (KS1) un
vēlīnajā (KS2) dīgstu attīstības stadijās.
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā EN koleoptilēs paaugstinājās ar KS iedarbības laiku (p<0,05),
t.i., uzreiz pēc 15 minūšu KS – par 35%, pēc 30 minūšu– par 88%, pēc 60 minūšu– 2 reizes un
21
pēc 24 stundu – 4 reizes. Turpmākajās dienās pēc īslaicīga karstuma stresa koleoptiļu membrānu
caurlaidība samazinājās un saglabājās zemāka nekā kontrolē visu pētāmā perioda laiku, bet pēc
ilglaicīgas KS iedarbības palika nemainīgi augsta (p<0,01). Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā KS
būtiski paaugstināja EN koleoptilēs (p<0,01) uzreiz pēc KS iedarbības, t.i., uzreiz pēc 15 minūšu
KS par 96%, pēc 30 minūšu – par 103%, pēc 60 minūšu – par 87% un pēc 24 stundu– četras
reizes. Paaugstināts EN līmenis koleoptilēs saglabājās arī perioda beigās, t.i., 2 reizes augstāks
pēc 15 minūtēm, par 33% - pēc 30 minūtēm, par 74% - pēc 60 minūtēm un par 32% - pēc 24
stundām salīdzinājumā ar kontroli (p<0,05).
10. attēls
EN (%) izmaiņas pirmajās lapās pēc ilglaicīgas KS (42˚C) iedarbības agrīnajā (KS1) un vēlīnajā
(KS2) dīgstu attīstības stadijās. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā uzreiz pēc 60 minūšu iedarbības EN līmenis saknēs samazinājās
(22%; p<0,05), bet pēc 24 stundu KS paaugstinājās (10%; p<0,05). Turpmākajās pēc KS dienās
EN līmenis saknēs saglabājās kontroldīgstu sakņu līmenī. Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā EN
līmenis saknēs pēc īslaicīga KS iedarbības bija zemāks nekā kontroldīgstu saknēs un šāda
tendence saglabājās visu pētāmā perioda laiku. Tomēr pēc ilglaicīga KS vēlīnajā dīgstu attīstības
stadijā EN saknēs bija augsta visu pētāmā perioda laiku salīdzinājumā ar kontroli, t.i., uzreiz pēc
KS paaugstinājās par 34% (p<0,05), bet pētāmā perioda beigās pusotras reizes augstāka (p<0,05).
Oksidatīvo procesu izmaiņas kviešu dīgstu orgānos CsA (1mg/l) klātbūtnē
Agrīnajā dīgstu attīstības stadijā CsA klātbūtnē samazinājās MDA daudzums koleoptilēs
(p<0,05), tomēr novecošanās laikā CsA izraisīja nenozīmīgu MDA daudzuma palielināšanos.
CsA klātbūtne ievērojami samazināja MDA daudzumu etiolēto kviešu dīgstu saknēs agrīnajā
22
dīgstu attīstības stadijā, tomēr, sākot no 6. dīgstu attīstības dienas MDA līmenis sāka pakāpeniski
paaugstināties un palika augstāks nekā kontroldīgstu saknēs (p<0,05).
CsA klātbūtne samazināja MDA līmeni pirmajās lapās uzreiz pēc 15 un 30 minūšu KS iedarbības
par 17% un 35% attiecīgi salīdzinājumā ar kontroli un paaugstināja vairāk nekā par 50% (p<0,05)
salīdzinājumā ar dīgstiem, kas tika audzēti bez CsA. Trešajā diena pēc īslaicīgas KS iedarbības
MDA līmenis bija līdzīgs kontrolei. Kaut gan MDA līmenis bija augstāks (p<0,001)
salīdzinājumā ar lapām, kas tika audzētas bez CsA. 15 minūšu KS iedarbība izraisa MDA līmeņa
paaugstināšanos koleoptilēs neatkarīgi no CsA klātbūtnes (42%; p<0,001). Pēc 30 minūšu KS
iedarbības koleoptilēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē, MDA līmenis pakāpeniski paaugstinājās
(p<0,01) un pētāmā perioda beigās MDA līmenis bija par 74% (p<0,01) augstāks nekā
kontroldīgstu koleoptilēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē. Uzreiz pēc 60 minūšu KS iedarbības
MDA daudzums palielinājās (p<0,01) par 85% salīdzinājumā ar kontroli un par 67%
salīdzinājumā ar stresam pakļautajām koleoptilēm, kas tika audzētas bez CsA. Turpmākajās
dienās pēc 60 minūšu karstuma stresa MDA līmenis samazinājās līdz kontroldīgstu koleoptiles
līmenim.
CsA klātbūtne samazināja (p<0,05) MDA līmeni saknēs pēc īslaicīga KS.
Pēc ilglaicīgas KS iedarbības MDA daudzums pirmajās lapās, kas tika audzētas CsA klātbūtnē,
bija kontroldīgstu pirmo lapu MDA līmenī, tomēr paaugstinājās (p<0,05) salīdzinājumā ar
ilglaicīgām KS pakļautajām pirmajām lapām, kas tika audzētas bez CsA. Tikai 3. dienā pēc
ilglaicīga KS iedarbības MDA daudzums samazinājās salīdzinājumā ar kontroli (43%), kas tika
audzētas bez CsA. Ilglaicīga KS iedarbība izraisa graujošu MDA līmeņa paaugstināšanos (vairāk
nekā 4 reizes; p<0,001) koleoptilēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē. Šāds MDA daudzums
koleoptilēs tika novērots visu pētāmā perioda laiku (p<0,001). Etilēto kviešu dīgstu saknēs, kas
tika audzētas CsA klātbūtnē, netika novērotas MDA daudzuma izmaiņas pēc 24 stundu karstuma
stresa. Tomēr MDA daudzums bija lielāks (p<0,05) nekā saknēs, kas tika audzētas bez CsA.
Membrānu caurlaidības izmaiņas kviešu dīgstu orgānos CsA (1mg/l) klātbūtnē pēc
karstuma stresa iedarbības
CsA klātbūtne nemaina elektrolītu noplūdes (EN) raksturu kviešu dīgstu orgānos pētāmā perioda
laikā (11. attēls). CsA klātbūtne neietekmē koleoptiļu membrānu caurlaidību, tomēr būtiski
samazina EN saknēs, t.i., 4. dīgstu attīstības dienā ar CsA audzēto dīgstu EN saknē samazinās par
29% (p<0,01), bet 8. dienā – par 72% (p<0,001) salīdzinājumā ar kontroli.
23
Uzreiz pēc 24 stundu KS iedarbības tika konstatēta 2 reizes augstāka (p<0,05) EN pirmajās lapās,
kas tika audzētas CsA klātbūtnē, tomēr EN bija zemāka (32%; p<0,05) nekā pirmajās lapās, kas
tika audzētas bez CsA. Turpmākajās dienās pēc KS, CsA klātbūtnē audzētiem kviešu dīgstiem,
tika novērota pirmās lapas membrānas caurlaidības samazināšanās līdz kontroldīgstu līmenim
(12.(a) attēls). Pēc ilglaicīgas KS iedarbības koleoptilēs tika novērota 4 reizes lielāka (p<0,05)
EN salīdzinājumā ar kontroli neatkarīgi no CsA klātbūtnes (12.(b) attēls). Uzreiz pēc ilglaicīga
KS EN līmenis saknēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē, bija zemāks (18%) nekā saknēs, kas tika
audzētas bez CsA, tomēr 2 reizes (p<0,01) augstāks nekā kontrolē (12.(c) attēls).
11. attēls
EN (%) izmaiņas kviešu dīgstu orgānos agrīnās ontoģenēzes laikā dīgstiem, kas tika audzēti CsA
(1 mg/l) klātbūtnē. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
12. attēls
EN izmaiņas pirmajā lapā (A), koleoptilē (B) un saknē (C) pēc ilglaicīga KS iedarbības uz
dīgstiem, kas tika audzēti CsA klātbūtnē. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
CsA klātbūtne samazināja pirmās lapas membrānu caurlaidību uzreiz pēc 15 un 30 minūšu KS
iedarbības par 47% un 54% attiecīgi (p<0,05) salīdzinājumā ar kontroli un par 52% un 60%
attiecīgi (p<0,05) salīdzinājumā ar dīgstiem, kas tika audzēti bez CsA klātbūtnes (13. attēls).
24
Tomēr uzreiz pēc 60 minūšu KS iedarbības tika novērota EN palielināšanās par 54% pirmajās
lapās, kas tika audzētas CsA klātbūtnē salīdzinājumā ar kontroli un par 97% (p<0,05)
salīdzinājumā ar pirmajām lapām, kuras tika audzētas bez CsA. 3. dienā pēc īslaicīgas KS
iedarbības EN līmenis bija līdzīgs kontrolei.
CsA klātbūtne samazina membrānu caurlaidību koleoptilēs uzreiz pēc 15 un 30 minūšu KS
iedarbības (39% un 36% attiecīgi; p<0,05) salīdzinājumā ar kontroli, šāds nemainīgi zems EN
līmenis (līdz 20%) saglabājās turpmāko dienu laikā. Tomēr CsA klātbūtne paaugstināja EN
līmeni uzreiz pēc 60 minūšu KS iedarbības 3 reizes (p<0,001) salīdzinājumā ar kontroli un par
25% (p<0,05) salīdzinājumā ar dīgstiem, kas tika audzēti bez CsA klātbūtnes. EN līmenis
koleoptilēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē, 5. dienā pēc stresa tas sasniedza kontroles līmeni.
CsA samazināja EN eksperimentālajās saknēs un neskatoties uz to, ka membrānu caurlaidība 3.
dienā pēc īslaicīga stresa (15, 30 un 60 minūtes) bija daudz augstāka (4, 3 un 2 reizes attiecīgi;
p<0,05) nekā kontroldīgstu saknēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē, EN līmenis bija zemāks
(p<0,05) nekā saknēs, kas tika audzētas bez CsA.
13. attēls
Elektrolītu noplūdes izmaiņas kviešu dīgstu pirmajā lapā pēc īslaicīga KS1 iedarbības uz
dīgstiem, kas tika audzēti CsA klātbūtnē. Rezultāti ir vidējie ± SE no 3 neatkarīgiem mērījumiem.
Summāro šķīstošo proteīnu daudzuma izmaiņas kviešu dīgstu orgānos CsA (1mg/l)
klātbūtnē pēc karstuma stresa iedarbības
CsA klātbūtne izmainīja summāro šķīstošo proteīnu daudzumu etioleto kviešu dīgstu orgānos.
Pirmajās lapās, kas tika audzētas CsA klātbūtnē, palielināja proteīnu daudzumu: 4. un 6. dīgstu
attīstības dienā, t.i., par 11% un 28% attiecīgi (p<0,05). CsA klātbūtne samazināja proteīnu
daudzumu koleoptilē, tomēr saknēs CsA inhibējošā ietekme netika novērota.
25
Īslaicīga KS iedarbība neietekmēja etiolēto kviešu dīgstu orgānu proteīnu daudzumu. Tomēr
pirmajās lapās CsA klātbūtne pēc 15 un 30 minūšu KS pilnīgi reducēja otro proteīnu daudzuma
palielināšanās maksimumu. Kviešu dīgstu koleoptilēs un saknēs proteīnu daudzuma izmaiņa pēc
īslaicīgas KS netika novērota neatkarīgi no CsA klātbūtnes.
Pirmajā dienā pēc ilglaicīga stresa proteīnu daudzums samazinājās (16%) etiolēto kviešu dīgstu
pirmajās lapās, kas tika audzētas CsA klātbūtnē. Tomēr palika kontroldīgstu līmenī pirmajās
lapās, kas tika audzētas bez CsA klātbūtnes. Ilglaicīgs KS stimulēja proteīnu daudzuma
palielināšanos (13%; p<0,05) koleoptilēs neatkarīgi no CsA klātbūtnes, un samazināja proteīnu
daudzumu saknēs, kas tika audzētas CsA klātbūtnē (par 41%; p<0,05).
Kvalitatīvas summāro šķīstošo proteīnu izmaiņas kviešu dīgstu orgānos CsA (1mg/l)
klātbūtnē pēc karstuma stresa iedarbības
Polipeptīdus, kuri noteikti dīgstu pirmajā lapā var sadalīt trīs grupās: 85 – 40kDa, 36 – 25kDa un
20 – 13kDa. Īslaicīga KS iedarbība nemaina pirmās lapas polipeptīdu elektroforētisko aktivitāti.
Tomēr uzreiz pēc ilglaicīgas KS iedarbības tika novērota 61,7kDa, 79,9kDa un 81,8kDa
polipeptīdu elektroforētiskās intensitātes paaugstināšanās neatkarīgi no CsA klātbūtnes.
Ievērojamas izmaiņas tika novērotas 20 – 13kDa grupā, kur uzreiz pēc ilglaicīgas KS iedarbības
pirmās lapas peptīdiem tika novērota jauna josla (19,2kDa). Etiolēto kviešu dīgstu lapās, kas tika
audzētas CsA klātbūtnē, parādījās jauna josla (12,9kDa). Koleoptilēs tika noteikta viena
polipeptīdu grupa 70 – 25kDa robežās neatkarīgi no CsA klātbūtnes. Etiolēto kviešu dīgstu
saknēs tika novērotas divas polipeptīdu joslas ar paaugstinātu intensitāti (20,9kDa un 10,6kDa).
Turklāt CsA klātbūtne paaugstināja šo joslu intensitāti saknēs, kas tika pakļautas īslaicīgam KS.
KS ilguma pagarināšanās samazināja šo joslu intensitāti.
Antioksidantu fermentu elektroforētiskās aktivitātes izmaiņas kviešu dīgstu orgānos
karstuma stresa iedarbības rezultātā
Pirmajā lapā konstatēta tikai 1 CAT izoforma – CAT1, koleoptilē 2 izoformas – CAT1 un CAT2,
bet CAT elektroforētiskā aktivitāte saknēs netika konstatēta. Uzreiz pēc ilglaicīgas KS iedarbības
pirmajā lapā tika novērota pazemināta CAT1 elektroforētiskā aktivitāte, tomēr pirmajā lapā
paaugstināta CAT1 elektroforētiskā aktivitāte tika novērota uzreiz pēc īslaicīga KS neatkarīgi no
CsA klātbūtnes. Koleoptilē tika novērota paaugstināta CAT elektroforētiskā aktivitāte pēc
ilglaicīga KS, un tika konstatēta jaunas izoformas parādīšanās (CAT2) (14.(a) attēls). Abu
izoformu paaugstinātā aktivitāte pēc ilglaicīga KS tika novērota visu pētāmā perioda laiku.
26
Tomēr dīgstiem, kas tika audzēti CsA klātbūtnē CAT2 izoformas parādīšanās netika novērota,
kaut gan CAT1 izoformas elektroforetiskā aktivitāte arī bija augsta (14.(b) attēls). Pēc īslaicīga
KS nedaudz paaugstināta CAT1 izoformas elektroforētiskā aktivitāte tika novērota koleoptilēs
neatkarīgi no CsA klātbūtnes.
Etiolēto kviešu dīgstu saknēs un koleoptilēs tika reģistrētas 4 SOD izoformas (MnSOD1 –
MnSOD3 un CuZnSOD1), bet pirmajā lapā – 3 izoformas (MnSOD1, MnSOD3 un CuZnSOD1),
kuru elktroforētiskā aktivitāte bija daudz vājāka salīdzinājumā ar saknēm un koleoptilēm. KS
iedarbība un CsA klātbūtne neizraisīja SOD elektroforētiskās aktivitātes izmaiņas pirmajās lapās
un koleoptilēs. Ilglaicīga KS iedarbība izraisīja CuZnSOD izoformas reducēšanos etiolēto kviešu
dīgstu saknēs neatkarīgi no CsA klātbūtnes (15. attēls).
14. attēls
CAT elektroforētiskā aktivitāte pēc dažāda ilguma (15, 30 un 60 min.; 24 st.) KS iedarbības
kviešu dīgstu koleoptilēs dīgstiem, audzētiem bez CsA (A) un CsA klātbūtnē (B)
15. attēls
Kviešu dīgstu sakņu SOD elektroforētiskā aktivitāte pēc dažāda ilguma (15, 30 un 60 min.; 24
st.) KS iedarbības
27
16. attēls
Kviešu dīgstu sakņu POD elektroforētiskā aktivitāte pēc dažāda ilguma (15, 30 un 60 min.; 24
st.) KS iedarbības
Saknēs un koleoptilēs tika reģistrētas 6 POD izoformas, bet pirmajā lapā – 5 izoformas (POD1-
POD3; POD5 un POD6). Koleoptilē netika novērotas POD izoformu elektroforētiskās aktivitātes
izmaiņas KS laikā neatkarīgi no CsA klātbūtnes. Samazināta POD3 aktivitāte tika novērota uzreiz
pēc KS iedarbības pirmajā lapā, tomēr turpmākajās dienās pēc tās pilnīgi atjaunojās. Saknes
POD3 izoformas elektroforētiskā aktivitāte pavājinās ar KS iedarbības ilgumu (16. attēls). Pēc
ilglaicīga KS POD3 un POD5 izoformu aktivitāte netika novērota kviešu dīgstu saknēs visā
pētāmā perioda laikā neatkarīgi no CsA klātbūtnes.
DISKUSIJA
Augsta temperatūra ir viens no svarīgākajiem vides faktoriem, kas ierobežo mērenā klimata zonas
augu augšanu un produktivitāti. Optimālā mērenā klimata zonas augu augšanas temperatūra ir
starp 10˚C un 25˚C (Paulson, 1994). Gaisa temperatūra Latvijā vasaras mēnešos var sasniegt
vairāk nekā 35˚C, bet augsnes virskārtas temperatūras paaugstināšanās 40-50˚C robežās tika
novērota 12% - 33% gadījumos vasaras laikā, kas ir virs augu attīstībai nepieciešamā optimālā
līmeņa (pēc LVĢMC datiem). Augstas temperatūras stress bieži iniciē oksidatīvus procesus, un
stress bieži turpinās novecošanās perioda laikā (Ferguson et al., 1993). Tomēr augstas
temperatūras ietekme uz daudziem procesiem, iekļautiem novecošanās procesā, paliek maz pētīta.
28
Kviešu dīgstu orgānu morfo-fizioloģisko parametru izmaiņas karstuma stresa iedarbības
rezultātā
Kviešu dīgstu orgāni dažādi reaģē uz stresa temperatūras iedarbību, par to liecina morfo-
fizioloģisko parametru izmaiņas. Svarīgi ir novērtēt augu izdzīvošanas spējas pēc karstuma stresa
(KS), jo šis rādītājs iekļauj sevī gan augu primāro siltumizturību, gan atjaunošanās spējas. Mūsu
iegūtie rezultāti liecina, ka pirmā lapa un koleoptile zaudē savas atjaunošanās spējas pēc
ilglaicīgas KS iedarbības neatkarīgi no dīgstu attīstības stadijas. Par to liecina relatīvā ūdens
satura (RŪS) samazināšanās un augšanas apstāšanās. Iespējams, tas ir saistīts ar koleoptiles
aizsargfunkcijas zudumu, jo augsta temperatūra izraisa priekšlaicīgu koleoptiles novecošanos
(Ferguson et al., 1993).
Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā KS nomāc pirmās lapas augšanu. Tomēr vispostošākais efekts
tika novērots pēc visīsākās (15 min.) un visilgākās (24 st.) KS iedarbības. Pēc īslaicīga KS tika
novērotas nenozīmīgas pirmās lapas RŪS izmaiņas visās dīgstu attīstības stadijās, neskatoties uz
to, ka vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērota būtiska pirmās lapas augšanas inhibēšana.
Iespējams, ka augšanas inhibēšana ir saistīta ar pirmās lapas novecošanās procesa sākumu
(Aleksandrushkina et al. 2009). Var pieļaut, ka KS iedarbība paātrina pirmās lapas novecošanās
procesu, un novecojošās lapās, kurās vairs nenotiek šūnu dalīšanās, pēc KS iedarbības samazinās
nobriedušo šūnu izmēri (Alves, Setter, 2004).
Īslaicīga KS iedarbība agrīnajā dīgstu attīstības stadijā nedaudz stimulē koleoptiļu augšanu, un tās
necieš no ūdens deficīta, tomēr vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā novecojošās koleoptilēs tika
konstatēts graujošs ūdens zudums. Iespējams, ka īslaicīgam stresam vēlīnajā dīgstu attīstības
stadijā pakļautas novecojošās koleoptiles nespēj atjaunot savas uzsūkšanas un turgora spējas, un
ūdens zudums palielinās, t.i., īslaicīgs KS paātrina koleoptiles novecošanās procesu.
Sakņu daudzums, garums un masa parasti tiek izmantoti sakņu augšanas novērtēšanai saknes
absorbējošo īpašību dēļ (Huang and Gao, 2000). Pētījuma laikā tika konstatēts, ka KS neatkarīgi
no iedarbības ilguma inhibē sakņu sistēmas augšanu un attīstību, un augšana gandrīz pilnīgi
apstājas uzreiz pēc KS. Pētījumā iegūtie dati parāda, ka ekstrēmas temperatūras ir cieši saistītas
ar ūdens zudumu reducētās sakņu ūdens absorbcijas spējas un izjauktās lapu atvārsnīšu
iztvaikošanas dēļ (Mo et al., 2011), KS pakļautie augi cieš no spēcīga ūdens deficīta un viena no
redzamām sekām ir novīšana.
Auga saknes un vasas sausās masas parasti atrodas noteiktā līdzsvarā un var kalpot par stresa
izmaiņu raksturojumu. Ilglaicīga KS inducētās dīgstu saknes/vasas (S/V) attiecības, relatīvās
sausās masas (RSM) un relatīvā augšanas indeksa (RAI) samazināšanās ir visu kviešu dīgstu
29
orgānu RSM samazināšanās rezultāts. Ilglaicīga KS iedarbība izraisa spēcīgu ūdens zudumu, kas
nomāc šūnu augšanu un attīstību zema turgora spiediena dēļ (Shao et al., 2008). Ilglaicīgs KS
nomāc sakņu augšanu un samazina uzsūkšanas spējas visās dīgstu attīstības stadijās, un saknes
nespēj atjaunot savu turgoru pēc stresa perioda. Tādējādi sakņu sistēmas normālās
funkcionēšanas traucējumi pēc ilglaicīga KS izraisa virszemes auga daļas bojājumus.
Īslaicīga KS iedarbības laikā tika novērota pakāpeniska S/V attiecības samazināšanās pētāmā
perioda laikā visās dīgstu attīstības stadijās. Tomēr, ja salīdzina S/V attiecības ar kviešu dīgstu
orgānu garuma un masas izmaiņām, ir redzams, ka S/V attiecības samazināšanās pēc īslaicīga
stresa iedarbības agrīnajā dīgstu attīstības stadijā ir sakņu garuma un masas samazināšanās
rezultāts un, iespējams, sakņu galiņu atmiršanas sekas. Īslaicīga KS iedarbība stimulē pirmo lapu
un koleoptiļu RAI palielināšanos pirmajās dienās pēc stresa. 30 minūšu KS agrīnajā dīgstu
attīstības stadijā labvēlīgi ietekmē kviešu dīgstu augšanu. Interesanti ir tas, ka visaugstākais RAI
tika novērots novecojošam orgānam – koleoptilei agrīnajā dīgstu attīstības stadijā pēc īslaicīga
KS, kas ļauj koleoptilei pasargāt pirmo lapu no bojājumiem. Iespējams, tas ir saistīts ar to, ka
īslaicīgs KS stimulē šūnas dalīšanos un šūnu elongāciju (Bos et al., 2000).Tikai 8. eksperimentālo
dīgstu attīstības dienā tika novērots koleoptiles un pirmās lapas RAI kritums. Tādējādi koleoptiles
novecošanās procesi tika nobīdīti, pateicoties īslaicīgam KS agrīnajā dīgstu attīstības stadijā.
Vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā KS paātrina koleoptiles novecošanās procesus neatkarīgi no
iedarbības ilguma, kas uzreiz atspoguļojas pirmās lapas stāvoklī.
Tomēr tikai morfo-fizioloģisko pazīmju izmantošana augstas temperatūras izraisīto atšķirību
noteikšanai nav pietiekami informatīva, tāpēc darbā tika izmantotas arī bioķīmiskās pazīmes, t.i.,
lipīdu peroksidācija, membrānu stabilitāte un proteīnu izmaiņas.
Lipīdu peroksidācijas izmaiņas kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības rezultātā
Augstas temperatūras inducētie oksidatīvie bojājumi izraisa membrānu bojājumus un elektrolītu
noplūdi etiolēto kviešu dīgstu orgānos. Lipīdu peroksidācijas produktus izmanto par membrānu
lipīdu oksidatīvo bojājumu pierādījumu (Guo et al., 2006).
Būtiskākais malondialdehīda (MDA) daudzuma palielinājums tika konstatēts koleoptilēs pēc KS
iedarbības visās pētāmajās stadijās. Turklāt MDA līmenis pēc īslaicīga stresa iedarbības bija
daudz augstāks nekā pēc ilglaicīga. Par MDA daudzuma paaugstināšanās iemeslu koleoptilēs pēc
īslaicīga KS var būt ASF produkcija, jo tieši H2O2 piedalās lipīdu peroksidācijā (Goyal, Asthir,
2010), kā arī graujošs ūdens zudums. Īslaicīga KS iedarbība agrīnajā dīgstu attīstības stadijā var
būt siltumizturības veidošanās rādītājs, jo šajā stadijā īslaicīgs KS labvēlīgi ietekmēja koleoptiļu
30
augšanu un attīstību. Siltumizturības veidošanās un H2O2 daudzuma attiecības pēc īslaicīga KS
tika parādīta dažu sugu dīgstiem (Карпець, Колупаєв, 2008). Tomēr īslaicīga KS iedarbība
vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā un ilglaicīga KS iedarbība visās pētāmajās dīgstu attīstības
stadijās paātrina koleoptiles novecošanās procesu turpmākajās dienās pēc KS.
KS, neatkarīgi no iedarbības ilguma un kviešu dīgstu attīstības stadijas, samazina MDA līmeni
pirmajā lapā. Tomēr šajā gadījumā nevar apgalvot, ka KS neietekmē pirmo lapu augšanu un
attīstību, jo īslaicīga KS iedarbība vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā un ilglaicīga KS iedarbība
visās pētāmajās dīgstu attīstības stadijās pilnīgi inhibē pirmās lapas augšanu garumā.
Saknēm, līdzīgi kā koleoptilem, pēc īslaicīgas KS iedarbības tika novērota būtiskāka MDA
līmeņa paaugstināšanās nekā pēc ilglaicīgas neatkarīgi no dīgstu attīstības stadijas. Iespējams, tas
var būt saistīts ar sakņu jūtīgumu pret KS un ar H2O2 hiperprodukciju, kuru apstiprina SOD
paaugstināta aktivitāte. MDA līmeņa pazemināšanos etiolēto kviešu dīgstu saknēs pēc ilglaicīga
KS var paskaidrot ar samazinātu SOD aktivitāti un ar CuZnSOD izoformas inaktivēšanos.
Diēnu konjugāti (DK) ir primārais lipīdu peroksidācijas produkts, kas atspoguļo agrīno
oksidēšanas pakāpi (Владимиров, 1989). DK veidošanās kviešu dīgstu orgānos ir cikliska.
Pirmajās lapās un saknēs DK daudzums samazinājās, bet novecojošajos orgānos – koleoptilēs
paaugstinājās agrīnās ontoģenēzes laikā. Īslaicīgs KS izmainīja ciklisko DK veidošanās raksturu,
tomēr ilglaicīgs KS neizmainīja DK veidošanās raksturu kviešu dīgstu orgānos, iespējams, tāpēc,
ka ilglaicīga stresa iedarbība notika DK veidošanās maksimumu laikā.
Uzreiz pēc KS iedarbības agrīnajā dīgstu attīstības stadijā tika novērota nenozīmīga DK līmeņa
paaugstināšanās kviešu dīgstu orgānos, tomēr vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā DK līmenis strauji
paaugstinājās. Turklāt DK līmenis uzreiz pēc īslaicīgas KS iedarbības bija vairākkārt augstāks
nekā pēc ilglaicīgas stresa iedarbības. DK daudzuma izmaiņas bija atkarīgas no orgāna attīstības
stadijas. Novecojošajās koleoptilēs īslaicīga KS iedarbība izraisīja DK līmeņa paaugstināšanos
tikai vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā, bet ilglaicīga iedarbība – visās dīgstu attīstības stadijās.
Pirmajās lapās un saknēs DK līmenis bija tikai nedaudz augstāks pēc īslaicīga KS visās dīgstu
attīstības stadijās. Kaut gan pēc ilglaicīgas KS iedarbības vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā DK
līmenis paaugstinājās stresam pakļautajās pirmajās lapās un saknēs. Iespējams, vēlīnajā dīgstu
attīstības stadijā ilglaicīgai KS nelabvēlīgai iedarbībai pievienojās oksidatīvie procesi. DK var būt
arī par antioksidantu sistēmas efektivitātes indikatoru oksidatīvo bojājumu laikā (Anwar et al.,
2006). Par to liecina antioksidantu fermentu elektroforētiskā analīze.
31
Šūnu membrānu caurlaidības izmaiņas kviešu dīgstu orgānos karstuma stresa iedarbības
rezultātā
Lipīdu peroksidācijas procesi būtiski izmaina šūnu membrānu lipīdu bislāņa struktūru, kas izraisa
jonu un metabolītu pasīvā transporta pastiprināšanu (Барабой, Сутковой, 1997).
Saknē reģistrēta visaugstākā membrānu caurlaidība no visiem kviešu dīgstu orgāniem (p<0,001),
koleoptiles šūnu membrānu caurlaidība pakāpeniski paaugstinājās dīgstu attīstības laikā, bet
pirmajā lapā bija diezgan pastāvīga.
Mūsu pētījumi parādīja, ka ilglaicīga KS iedarbība ievērojami paaugstināja kviešu dīgstu orgānu
membrānu caurlaidību neatkarīgi no dīgstu attīstības stadijas. Būtiskāka elektrolītu noplūde (EN)
tika novērota pirmajās lapās un koleoptilēs. Tabakas lapu pētījumos (Ivanov et al., 2001), tika
parādīts, ka ievērojamu membrānu caurlaidības paaugstināšanos izraisa tikai ilglaicīga karstuma
stresa iedarbība (168st., 45°C). Mūsu pētījumi parādīja, ka uzreiz pēc īslaicīga KS iedarbības
vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā pirmo lapu un koleoptiļu EN līmenis arī paaugstinājās. Tomēr
pirmās lapas spēja atjaunoties pēc īslaicīga KS, par ko liecina EN līmeņa samazināšanās līdz
kontroldīgstu līmenim turpmākajās dienās pēc KS iedarbības. EN līmeņa izmaiņas sakrīt ar
membrānu lipīdu peroksidācijas līmeni, t.i., DK līmenis samazinājās līdz kontrollīmenim.
EN pirmajās lapās pēc ilglaicīgas KS iedarbības visās dīgstu attīstības stadijās un pēc īslaicīgas
KS iedarbības vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā sakrīt ar membrānu caurlaidības paaugstināšanos
koleoptilēs. Iespējams, novecojošā orgānā – koleoptilē īslaicīga un ilglaicīga KS iedarbība izraisa
neatgriezeniskus šūnu membrānu bojājumus. Par to liecina ne tikai augsts membrānu caurlaidības
līmenis visā periodā pēc stresa, bet arī augsts DK līmenis. Mūsu pētījumi parādīja, ka DK ir
būtisks šūnas membrānu bojājumu indikators, jo tieši DK līmeņa paaugstināšanās pavada
membrānu caurlaidības paaugstināšanos pirmajās lapās un koleoptilēs.
Īslaicīga KS iedarbība neizraisa membrānu caurlaidības paaugstināšanos un pat ievērojami
samazina membrānu caurlaidību saknēs vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā. Tas sakrīt ar DK
daudzumu saknēs periodā pēc īslaicīga KS, jo tika parādīts, ka DK daudzums ir kontroldīgstu
līmenī. Pēc ilglaicīgas KS iedarbības saknēs tika novērota būtiska EN. Salīdzinot sakņu
membrānu caurlaidības un lipīdu peroksidacijas līmeni pēc ilglaicīga KS, ir redzams, ka sakņu
DK līmenis palielinājās.
Līdz šim kā oksidatīvā stresa indikatoru izmantoja MDA, bet DK izmaiņas stresa laikā, tajā
skaitā KS laikā, gandrīz netika pētītas. Mūsu pētījumi parādīja, ka tieši DK ir membrānu
caurlaidības paaugstināšanās indikators, membrānu caurlaidības izmaiņu raksturs sakrita ar DK
izmaiņām.
32
Kvalitatīvas un kvantitatīvas summāro šķīstošo proteīnu izmaiņas kviešu dīgstu orgānos
karstuma stresa iedarbības laikā
Proteīnu degradācija paaugstinās KS laikā daudzās augu sugās (He et al., 2005). Kvalitatīvas
proteīnu izmaiņas tika noteiktas etiolēto kviešu dīgstu orgānos uzreiz pēc īslaicīga un ilglaicīga
KS iedarbības agrīnajā dīgstu attīstības stadijā ar SDS-PAGE palīdzību, tāpēc ka SDS-šķīstošie
proteīni ir galvenokārt membrānu proteīni (He et al., 2005).
Kviešu dīgstu orgānu SDS-PAGE profili stipri atšķiras pēc KS iedarbības. Ilglaicīga KS
iedarbība palielina pirmo lapu polipeptīdu joslu intensitāti un jaunu joslu parādīšanos, iespējams,
karstuma šoka proteīnus (Hsp). Uzreiz pēc ilglaicīga KS pirmajā lapā paaugstinājās dažu joslu
intensitāte (85 – 40kDa). Ievērojamas polipeptīdu izmaiņas tika novērotas arī 20 – 13kDa
diapazonā, kur uzreiz pēc 24 stundu KS iedarbības pirmajās lapās tika novērota jauna josla
(19,2kDa). Iespējams, tas ir saistīts ar Hsp sintēzi. Citu augu sugu lapās arī tika konstatēta dažu
proteīnu joslu paaugstināta intensitāte, kā arī jaunu joslu parādīšanās pēc KS iedarbības (Nagesh
Babu, Devaraj, 2008).
Koleoptilēs netika novērotas summāro proteīnu elektroforētiskās aktivitātes izmaiņas pēc KS
iedarbības, tomēr tika konstatēta būtiska proteīnu daudzuma samazināšanās pēc ilglaicīga KS
iedarbības, kas saglabājās visā pētāmajā periodā. Iespējams, ka novecojošās koleoptilēs notiek
proteīnu degradācija, un KS iedarbība vairs nevar ietekmēt proteīnu izmaiņas tajās.
Saknēs tika novērotas divas polipeptīdu joslas ar paaugstinātu intensitāti ( 20,9kDa un 10,6kDa),
kuru intensitāte samazinās ar KS ilguma pagarināšanu. Var pieļaut, ka proteīnu sintēze saknēs ir
atkarīga ne tikai no augstās temperatūras lieluma, bet arī no iedarbības ilguma. Ilglaicīga KS
iedarbība būtiski samazina arī summāro šķīstošo proteīnu daudzumu saknēs. Mēreni augstas
temperatūras neizraisa kviešu dīgstu sakņu summāro šķīstošo proteīnu izmaiņas (Bakalova et al.,
2008). Tomēr tāda proteīnu samazināšanās spilgti izteikta pēc 45°C temperatūras iedarbības
(Карапец и др., 2007). Pēc iegūto rezultātu datiem var secināt, ka saknes ir vairāk jūtīgas pret
KS. Tas var būt saistīts ar proteināžu aktivitātes paaugstināšanos saknēs KS laikā. Jo daudzi
pētījumi parāda, ka proteināžu aktivitāte ir atkarīga ne tikai no KS intensitātes, bet arī no
iedarbības ilguma un ievērojami paaugstinās pēc ilglaicīgas iedarbības (He et al., 2005).
Antioksidantu fermentu elektroforētiskās aktivitātes izmaiņas kviešu dīgstu orgānos
karstuma stresa iedarbības rezultātā
Antioksidantu fermenti uztur augu membrānu viengabalainību (Mittler, 2002). Antioksidantu
līdzsvara izmaiņa ir viena no nespecifiskām stresa reakcijām (Веселова и др., 1993). KS
33
inducēja oksidatīvus bojājumus un izmainīja katalāzes (CAT), superoksīddismutāzes (SOD) un
peroksidāzes (POD) elektroforētisko aktivitāti.
Pirmajā lapā tika konstatētas trīs SOD izoformas, tomēr SOD elektroforētiskās aktivitātes
izmaiņas pēc KS iedarbības netika konstatētas. Iespējams, tāpēc, ka agrīnajā dīgstu attīstības
stadijā KS samazina lipīdu peroksidāciju pirmajās lapās. Tādējādi, varam pieļaut, ka oksidatīvie
procesi pirmajā lapā pēc KS iedarbības ir kontrollīmenī. Koleoptilēs tika reģistrētas četras SOD
izoformas ar augstāku elektroforētisko aktivitāti nekā lapās un saknēs. Iespējams SOD
elektroforētiskās aktivitātes paaugstināšanās ir atbilde uz paaugstinātu O2¯ produkciju
novecojošajās koleoptilēs, jo KS pastiprināja oksidatīvus procesus tajos. Mūsu rezultāti saskan ar
īslaicīga KS pētījumiem izolētajās etiolēto kviešu dīgstu koleoptilēs (Колупаев, Карпец, 2008).
POD aktivitāte šūnā nav viennozīmīgā, no vienas puses POD ģenerē ASF, bet no otras puses
piedalās H2O2 noārdīšanā (Minibayeva et al., 2009). Pirmo lapu pētījumu rezultāti saskan ar KS
un ūdens deficīta pētījumu rezultātiem (Dat et al., 1998), kuros tika parādīta POD aktivitātes
paaugstināšanās un CAT aktivitātes pazemināšanās. Pirmo lapu CAT un POD elektroforētiskā
aktivitāte paaugstinājās laikā pēc KS un spēcīgāka POD elektroforētiskā aktivitāte tika novērota
3. dienā pēc KS. Iespējams, šajā gadījumā var runāt par līdzsvara atjaunošanos starp ASF
daudzumu un antioksidantu sistēmas darbību un siltumizturības veidošanos.
Koleoptilēs POD elektroforētiskā aktivitāte bija kontroldīgstu koleoptiļu līmenī, tomēr tika
novērota CAT elektroforētiskās aktivitātes paaugstināšanās un jaunas izoformas parādīšanās pēc
ilglaicīga KS. Iepriekšējos pētījumos tika secināts, ka CAT un POD samazināšanās un ASF un
MDA paaugstināšanās liecina par oksidatīvo stresu un neatgriezeniskiem membrānu bojājumiem
(Yin et al., 2008; Колупаев, Карпец, 2008). Mūsu pētījumu rezultāti parāda, ka paaugstināta
koleoptiļu CAT un POD elektroforētiskā aktivitāte KS laikā nav oksidatīvo procesu
samazināšanās pierādījums, jo koleoptilēs tika novērota augsta lipīdu peroksidācija. Iespējams,
ilglaicīga KS iedarbība pastiprināja oksidatīvo procesu attīstību novecojošās koleoptilēs, par to
liecina MDA un DK līmeņa paaugstināšanās un EN palielināšanās. Rezultātā, pat paaugstināta
antioksidantu fermentu aktivitāte nespēja cīnīties ar KS bojājošo ietekmi.
Paaugstināta SOD un POD elektroforētiskā aktivitāte tika konstatēta saknēs uzreiz pēc īslaicīgas
KS iedarbības. Tajā laikā tika novērots arī pazemināts MDA līmenis. Šāds efekts ir saistīts ar
vairāku siltumizturīgu fermentu formu sintēzes pastiprināšanos. 3. dienā pēc KS iedarbības
saknēs tika novērota lipīdu peroksidācijas paaugstināšanās, kas saskan ar SOD un POD
elektroforētiskās aktivitātes samazināšanos. Ilglaicīga karstuma stresa iedarbība pilnīgi izmainīja
sakņu SOD un POD izoformu elektroforētisko aktivitāti salīdzinājumā ar īslaicīgu KS iedarbību.
34
CuZnSOD izoforma ir jūtīga pret H2O2, tāpēc varam pieļaut, ka tieši H2O2 uzkrāšanās sakņu
šūnās oksidatīvo procesu rezultātā varēja izraisīt CuZnSOD izoformas inaktivāciju. Mūsu
pieņēmumu apstiprina POD elektroforētiskās aktivitātes samazināšanās un pat divu izoformu
inaktivācija (POD3 un POD5) pēc ilglaicīga KS iedarbības. Kviešu dīgstu saknēs, netika
konstatēta būtiska lipīdu peroksidācijas paaugstināšanās. Iespējams, tas ir saistīts ar to, ka saknēs
POD darbojas nevis kā antioksidants, bet kā spēcīgs oksidētājs. Tas arī var izskaidrot, kāpēc POD
elektroforētiskās aktivitātes samazināšanās neizraisa lipīdu peroksidācijas paaugstināšanos
saknēs.
Oksidatīvo procesu un antioksidantu sistēmas izmaiņas kviešu dīgstu orgānos CsA (1mg/l)
klātbūtnē
Ciklosporīns A (CsA) ir atgriezenisks mitohondriālo caurlaidību regulējošo poru atvēršanās
inhibitors. Tas bloķē mitohondriālo poru atvēršanos un kavē oksidatīvus procesus (Arpagaus et
al., 2002), tāpēc tika izpētīta CsA ietekme uz etiolēto kviešu dīgstu orgānu oksidatīviem
procesiem pēc KS iedarbības pašā agrīnajā dīgstu attīstības stadijā.
Lipīdu peroksidācijas samazināšanās, kuru inducēja CsA, paaugstināja etiolēto kviešu dīgstu
pirmo lapu un sakņu membrānu stabilitāti, bet koleoptiļu membrānu stabilitāte bija kontroldīgstu
līmenī. Oksidatīvo procesu intensitātes samazināšanās kviešu dīgstu orgānos, kas tika audzēti
mitohondriālo poru atvēršanās inhibitora CsA klātbūtnē, liecina, ka augu šūnu mitohondrijiem ir
liela loma oksidatīvā stresa inducēšanā.
Īslaicīga un ilglaicīga KS iedarbība izmaina CsA ietekmi uz mitohondriālo poru stāvokli un
rezultātā izmaina oksidatīvos procesus kviešu dīgstu orgānos. CsA klātbūtne būtiski samazināja
EN pirmajās lapās un koleoptilēs pēc 15 un 30 minūšu KS, bet 60 minūšu un 24 stundu KS
nivelēja CsA inhibējošo ietekmi uzreiz pēc stresa iedarbības un EN būtiski paaugstinājās. Tomēr
pirmās lapas spēja samazināt membrānu caurlaidību pēc oksidatīvā stresa, kuru inducēja KS,
atšķirībā no koleoptilēm, kurā EN līmenis paaugstinājās līdz stresam pakļauto koleoptiļu EN
līmenim, kas tika audzētas bez CsA. Iegūtie dati liecina par būtisku CsA un īslaicīga KS
kompleksu ietekmi uz pirmo lapu siltumizturības veidošanos, jo mitohondriālo poru atvēršanās
inhibitora CsA klātbūtnē pastiprinājās īslaicīga KS izraisīta lipīdu peroksidācijas inhibēšana,
paaugstinājās CAT un POD elektroforētiskā aktivitāte un tika konstatēta jauna proteīna
(12,9kDa) parādīšanās. Iespējams, ka tas ir saistīts ar mitohondriālo poru atvēršanās inhibēšanu.
CsA klātbūtne būtiski paaugstina membrānu stabilitāti saknēs pēc īslaicīga KS iedarbības un tas
35
saskan ar MDA līmeņa pazemināšanos un ar proteīnu (20,9kDa un 10,6kDa) elektroforētiskās
aktivitātes paaugstināšanos. Taču ilglaicīga KS iedarbība nivelē CsA ietekmi saknēs.
No vienas puses, mitohondriālo poru jūtīgums pret CsA ietekmi var būt orgānu specifisks.
Pētījumos tika parādīts, ka CsA klātbūtne būtiski samazināja sakņu lipīdu peroksidāciju un
paaugstināja sakņu membrānu stabilitāti. CsA oksidatīvus procesus inhibējošā ietekme tika
novērota arī pirmajā lapā oksidatīvā stresa laikā, kuru inducēja īslaicīgs KS. Tomēr koleoptilē
CsA klātbūtne tikai pastiprināja oksidatīvo procesu attīstību.
No otras puses, tas var būt saistīts ne tikai ar orgānu specifiskumu, bet arī ar orgāna attīstības
stadiju. KS izraisa koleoptiles paātrinātu novecošanos, par ko liecina spēcīga oksidatīvo procesu
attīstība. Mitohondriālo caurlaidību regulējošā pora var mainīt savas īpašības atkarībā no stresa
iedarbības (Павловская и др., 2010). Iespējams, oksidatīvā stresa laikā mitohondriālās poras
zaudē jūtīgumu pret CsA. Tādējādi mitohondriālo poru atvēršanās inhibitors CsA var veikt tikai
ievērojamu stabilizējošu ietekmi uz kviešu dīgstu pirmo lapu un sakņu membrānu lipīdiem un
apturēt to degradāciju īslaicīga KS inducētā oksidatīvā stresa laikā.
SECINĀJUMI
1. Morfo-fizioloģisko parametru izmaiņas parāda, ilglaicīga karstuma stresa iedarbībā kviešu
dīgstu orgāni zaudē savas atjaunošanās spējas gan agrīnajā, gan vēlīnajā dīgstu attīstības
stadijā, bet īslaicīga karstuma stresa iedarbībā kviešu dīgstu orgāni zaudē savas atjaunošanās
spējas tikai vēlīnajā dīgstu attīstības stadijā.
2. Karstuma stresa iedarbība samazina membrānu lipīdu peroksidāciju attīstošajos orgānos -
pirmajās lapās.
3. Kviešu dīgstu orgānu šūnu membrānu caurlaidības paaugstināšanās ir cikliska, kas saistīts ar
lipīdu peroksidācijas produkta – diēnu konjugātu daudzuma izmaņām.
4. Karstuma stresa inducētā diēnu konjugātu daudzuma palielināšanās izraisa šūnu membrānu
caurlaidības paaugstināšanos kviešu dīgstu orgānos, bet diēnu konjugātu daudzuma
samazināšanās izraisa šūnu membrānu caurlaidības samazināšanos, tāpēc diēnu konjugātu
daudzuma izmaiņas var izmantot kā šūnu membrānu stabilitātes indikatoru.
5. Kvalitatīvas un kvantitatīvas summāro šķīstošo proteīnu izmaiņas ilglaicīga karstuma stresa
laikā ir atkarīgas no kviešu dīgstu orgānu attīstības stadijas, t.i., attīstošajā orgānā – pirmajā
lapā summāro šķīstošo proteīnu elektroforētiskā aktivitāte paaugstinās, bet novecojošajā
orgānā – koleoptilē nemainās, tomēr būtiski samazinās proteīnu daudzums.
36
6. Kvalitatīvas un kvantitatīvas proteīnu izmaiņas saknēs ir atkarīgas no karstuma stresa
iedarbības ilguma, t.i., pagarinoties iedarbības ilgumam, samazinās proteīnu elektroforētiskā
aktivitāte un daudzums.
7. Antioksidantu fermentu elektroforētiskās aktivitātes izmaiņas kviešu dīgstos parāda, ka
ilglaicīgas karstuma stresa iedarbības rezultātā notiek dažu POD un SOD izoformu zudums
saknēs un jaunas CAT izoformas veidošanās koleoptilēs, kas var būt saistīts ar aktīvā
skābekļa formu uzkrāšanos ilglaicīga karstuma stresa laikā.
8. Mitohondriālo poru atvēršanās inhibitora CsA klātbūtne samazina oksidatīvos procesus, kurus
izraisa īslaicīga karstuma stresa iedarbība, un stabilizē membrānu lipīdus kviešu dīgstu
orgānos.
9. Ilglaicīgs karstuma stress samazina mitohondriālo poru jūtīgumu pret mitohondriālo poru
atvēršanās inhibitora iedarbību saknēs un novecojošajos orgānos – koleoptilēs, bet ilglaicīgs
karstuma stress nemaina mitohondriālo poru jūtīgumu pret mitohondriālo poru atvēršanās
inhibitora iedarbību attīstošajos orgānos – pirmajās lapās.
37
INTRODUCTION
The importance of the research:
Climate changes and extreme weather conditions make the research of ability of plant adaptation
especially important. One of possible climate changes can be an increase in average temperature.
The problem of heat stress is being predicted in the future as well. According to scientists’
predictions the average world temperature is going to increase from 1,5°C to 4,5°C, probably by
~ 2,5°C in the next fifty-years’ time (Bengtsson, 1994). Besides, many regions are supposed to
experience unusual episodes of heat stress, i.e. maximum temperature increase by 35-40°C in
several days in a year (Wrigley, 2006). This heat stress may increase the intensity of injury in
many cool-season plant species (Huang, 2006).
One of the primary reactions of plants on exposure to the stress factor, including heat stress, is
increased production of reactive oxygen species (ROS) and, as a result, activation of the process
of membrane lipid peroxidation (Dat et al., 1998). The increase in the level of lipid peroxidation
causes significant membrane injuries (Барабой и др., 1991). In order to manage oxidative
processes, fast involvement of antioxidant systems is needed. The activity of antioxidant systems
can increase under the influence of stress factors (Goyal, Asthir, 2010). These systems prevent
oxidative damage of membranes and cell death. Relations between the level of lipid peroxidation
and activity of antioxidant systems determine to a certain degree plant resistance against heat
stress. So, to detect the reaction of a whole plant or plant’s different organs onto the exposure of a
certain environmental factor, research of each separate environmental factor is needed. Detection
of the response mechanisms of plants under stress conditions and acquired resistance has a
significant practical value. In order to make plant resistant against each environmental factor not
only specific reactions which depend on properties of environmental factor and plant species, but
also non-specific cell reactions created as a result of any adverse factor are important. Seedling
stage is the most sensitive and crucial period in plant ontogeny especially against environmental
stresses (Çavusoglu, Kabar, 2012).
Plant mitochondria are significant during stress response which is expressed in disturbance of
mitochondria homeostasis and, as a result, production of mitochondrial ROS. Many factors (e.g.,
cell damage, oxidative stress, Ca2+
accumulation, etc.) can initiate the opening of mitochondrial
permeability transition pore (Lord et al., 2011). Cyclosporine A (CsA) is reversible inhibitor of
mitochondrial permeability transition pore (MPTP) opening not only in mammalian cells, but
also in plant and prevents opening of MPTP and delays cell death (Arpagaus et al., 2002).
38
Recent research shows that CsA is a powerful inducer of oxidative stress in mammalian cells,
which participates in production of ROS and, as result, can change the level of lipid peroxidation
in mammalian tissues (Nagaraja et al., 2009). Besides, the data show that CsA retard production
of ROS in plant cells during stress (Lin et al., 2006). However, it is important to mention the fact
that there is almost no information in scientific literature about CsA influence on oxidative
conditions of plant cells and activity of antioxidant system under stress conditions. Therefore, the
study of influence of mammalian cell oxidative process modulator CsA on the lipid peroxidation
and activity of antioxidant system in different plant organs during exposure to heat stress causes
big interest.
The novelty of the research:
The obtained results significantly supplement and expand the existing knowledge about the role
of heat stress in the development of oxidative processes in functionally different plant organs.
For the first time the complex research of changes of morpho-physiological parameters (growth,
relative dry weight, root/shoot ratio, relative water content, relative growth index) under heat
stress have been made. Previously many of these morpho-physiological parameters were used
only as indicators of water deficit and salt stress. However, in the previous study of heat stress
many of these parameters were almost not used, e.g. root/shoot ratio, relative growth index,
relative dry weight etc.
For the first time the changes of electrophoretic activity of antioxidant enzymes induced by heat
stress in the functionally different organs of wheat seedlings at different stages of seedling
development have been made.
For the first time the influence of inhibitor of mitochondrial permeability transition pore opening
– CsA in mammalian mitochondria on the functionally different organs of wheat seedlings at the
different stages of seedling development have been studied.
For the first time the response reaction on heat stress treatment in functionally different organs of
wheat seedlings at different stages of ontogeny has been compared.
The main hypotheses of the research:
1. The influence of heat stress inhibits growth and development, causes oxidative stress and
decreases the activity of antioxidant systems at the stage of seedling development.
2. The presence of cyclosporine A intensifies the influence of heat stress on the development of
oxidative processes at the stage of seedling development.
39
The aim of the research:
By analysing the morpho-physiological and biochemical changes of the organs of wheat
seedlings caused by the exposure to short- and long-term heat stress at the different stages of
seedling development to elucidate the response of the functionally different organs of wheat
seedlings onto the changes of oxidative processes.
The tasks of the research:
1. To investigate the influence of heat stress on the growth and development of the functionally
different organs of etiolated wheat seedlings at the early and late stages of seedling
development.
2. To investigate changes of morpho-physiological parameters (growth, relative dry weight,
root/shoot ratio, relative water content, relative growth index) in the organs of etiolated wheat
seedlings under the influence of heat stress.
3. To investigate the process of membrane lipid peroxidation and changes in membrane stability
in the organs of etiolated wheat seedlings under the influence of short- and long-term heat
stress.
4. To analyse the protective reaction of different the organs of wheat seedlings and determine
the electrophoretic activity of antioxidant enzymes.
5. To investigate the qualitative changes of proteins in the organs of wheat seedlings under the
influence of short- and long-term heat stress.
6. To investigate the influence of the inhibitor transition pore Cs A on the lipid peroxidation,
membrane stability and electrophoretic activity of antioxidant enzymes in the organs of
etiolated wheat seedlings under the influence of heat stress.
Approbation:
Main results of the study were presented in 11 international conferences and in 1 local
conference:
5th Baltic Congress of Genetics (Kaunas, Lithuania, 19.-22.2012): ‘The Synthesis of
Different Isoforms of Antioxidant Enzymes as a Reaction on Heat Stress in Different
Wheat Organs (Triticum aestivum L.)’
Development and Application of New Fluorescent Materials and Methods (Daugavpils,
Latvia, 12.09.2012): ‘The Influence of High Temperature on Oxidative Processes and
Accelerated Senescence in Wheat Seedling (Triticum aestivum L.) Coleoptile’
40
V International Conference of Young Scientists ‘Biodiversity. Ecology. Adaptation.
Evolution.’ (Odesa, Ukraine, 13. – 17.06.2011): Impact of Heat Stress on Development of
Senescent Organs of Wheat Seedlings (Triticum aestivum L.): Biochemical and
Morphological Changes.
6th International Conference „Research and Conservation of Biological Diversity in
Baltic Region” (Daugavpils, Latvia 28.-29.04.2011): ‘High-temperature Injury in Relation
to Membrane Lipid Peroxidation in Different Organs of Wheat Seedlings (Triticum
aestivum L.)’
V International Young Scientists’ Conference ‘Biology: from a Molecule up to the
Biosphere’ (Kharkiv, Ukraine, 22.-25.11.2010): ‘Effects of Heat Stress on Oxidative
Damage and Morphological Changes in Wheat Seedlings (Triticum aestivum L.)’
5th International Conference „Research and Conservation of Biological Diversity in
Baltic Region” (Daugavpils, Latvia 22.-24.04.2009): ‘Superoxide Dismutase and Catalase
Electrophoretic Activity and Lipid Peroxidation in Wheat Seedlings (Triticum aestivum
L.) after Heat Stress’
3rd International Young Scientists’ Conference ‘Biology: from a Molecule up to the
Biosphere’ (Kharkiv, Ukraine, 18.-21.11.2008): ‘Lipid Peroxidation and Antioxidant
Activity in Wheat (Triticum aestivum L.) Seedlings in Response to Heat Shock’
International Life-Sciences Conference (Warsaw, Poland 10.-14.09.2008): ‘The Effect of
Heat Stress on the Activity of Antioxidant Enzymes and Lipid Peroxidation in Wheat
(Triticum aestivum L.) Seedlings’
50th International Scientific Conference of Daugavpils University (Daugavpils, Latvia,
05.-17.05.2008): ‘The effect of short-term and long-term influence of heat shock on
production of reactive oxygen species and growth of wheat (Triticum aestivum L.)
seedlings’
IV Baltic Genetical Congress (Daugavpils, Latvia, 09.-12.10.2007): ‘Influence of some
antioxidants on enzyme activity and electrophoretic pattern of isoenzymes of superoxide
dismutase and catalase in wheat seedlings (Triticum aestivum L.)’
World Conference of Stress (Budapest, Hungary, 23.-26.08.2007): ‘Influence of
antioxidants on some stages of oxidative stress in plant cells of wheat and barley
seedlings’
41
4th International Conference „Research and Conservation of Biological Diversity in
Baltic Region” (Daugavpils, Latvia, 25.-27.04.2007): ‘Some molecular mechanisms of
oxidative stress in plant cells of wheat seedlings’
The main results of the study are described in 4 scientific publications:
Savicka M., Škute N. 2012. Some morphological, physiological and biochemical
characteristics of wheat seedling Triticum aestivum L. organs after high-temperature
treatment. Ekologija. 58(1): 9-21.
Savicka M., Škute N. 2010. Effects of high temperature on malondialdehyde content,
superoxide production and growth changes in wheat seedlings (Triticum aestivum L.).
Ekologija. 56(1-2): 26-33.
Shkute N., Savicka M. 2009. Influence of mammalian imunodepresant cyclosporin A on
some molecular processes of plant senescence. Acta Biologica Univiversit. Daugavp. 9
(2): 283-290.
Savicka M., Škute N. 2008. The influence of heat shock on production of reactive oxygen
species and growth of wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Proceedings of the 50th
International Scientific Conference of Daugavpils University. 79-88.
Size and structure of the thesis:
The size of the thesis is 169 pages. It consists of 76 figures and 6 tables. 286 references and 1
Internet source were cited. The structure of the thesis consists of introduction, review of scientific
literature, materials and methods, results, discussion, conclusions, acknowledgements, list of
references and 3 appendixes. Materials and methods, main result, their analysis and conclusions
are summarised in this volume.
MATERIALS AND METHODS
The object of research
Wheat is a convenient object for studying plant morphology, physiology and molecular biology,
because the development of cereals is synchronous throughout ontogeny. The object of the study
was the organs of etiolated seedlings of winter wheat (Triticum aestivum L., cv. Harmonia).
Wheat roots were used because high root temperature accelerates senescence of the entire plant.
42
The first leaf and coleoptile were used because the first leaf is a developing organ of wheat, but
the coleoptile is a senescent organ of wheat.
Heat and Cyclosporine A (1 mg/l) treatment
Heat treatments to wheat seedlings were given in a plant growth chamber by raising its
temperature to desired levels from 26 to 42 °C. The seedlings were exposed by short-term (15, 30
and 60 min) and long-term (24 h) heat stress (HS) at the early and at the late stages of seedling
development (4- and 7-day-old seedlings respectively). Samples (first leaves, coleoptiles and
roots) were taken immediately after high-temperature exposure and at twenty-four hour intervals
for measurement of biometric parameters, lipid peroxidation products (malondialdehyde, MDA,
and conjugated dienes, CD), electrolyte leakage (EL), changes of total soluble protein amount
and electrophoretic activity of antioxidant enzymes (CAT, SOD, POD).
Wheat seedlings were grown in the presence of CsA (1 mg/l), starting from the first day of
seedling development. MDA, EL, changes of total protein amount and electrophoretic activity of
antioxidant enzymes were investigated in the organs of wheat seedlings after compound
treatment of short- and long-term HS and CsA at the early stage of seedling development.
Measurements of the growth parameters
The first leaf, coleoptile and maximum root length was measured in millimeters (mm). Data are
presented taking into consideration the standard error (SE) of three replicates. In general, 5310
wheat seedlings were used for morphometric measurements.
Fresh weight (FW), dry weight (DW) and turgid weight (TW) of the first leaf, coleoptile and
roots were measured immediately after HS and at twenty-four hour intervals after HS (Ali et al.,
2009).
Relative dry weight (RSM) was calculated from the following formula (Ali et al., 2009):
Root/Shoot (R/S) ratio was calculated from the following formula (Worku, Astatkie, 2010):
, where RDW – the root DW; LDW – the first leaf DW; CDW – the coleoptile
DW.
Relative growth index (RGI) was calculated from the following formula (Bhattacharjee,
Mukherjee, 2003):
43
Relative water content (RWC) was calculated from the following formula (Turner, 1981):
Determination of electrolyte leakage
The electrolyte leakage (EL) in the organs of wheat seedlings was determined as described before
by Guo et al. (2006).The EL was calculated from the following formula:
Measurement of lipid peroxidation
The MDA content was determined by the thiobarbituric acid reaction as described by Ali et al.
(2005). MDA concentration was estimated by subtracting the non-specific absorption at 600 nm
from the absorption at 532 nm using a molar extinction coefficient, 155mM−1
cm−1
. Lipid
peroxidation was determined by measuring CD formation (Recknagel, Ghoshal, 1966). The CD
content in the sample was calculated according to 233 nm molar extinction coefficient to
polyunsaturated fatty acids conjugated dienes, 2,2x105 M
-1 cm
–1.
Protein research in the organs of wheat seedlings
The first leaves, coleoptiles and roots of etiolated wheat seedlings were sampled for protein
analysis, starting from 4th
day of seedling development (the 15-, 30- and 60-min HS) and 5th
day
of seedling development (the 24h HS) and three days after stress at twenty-four hour intervals.
All samples were homogenized in 50mM K-phosphate buffer (pH 7.8).
Total amount of proteins was detected by the „Invitrogen” protocol, using Quant-iT™ protein
detection kit and Qubit™ fluorometer (Invitrogen™).
Electrophoretic activity of antioxidant ferments
SOD, CAT and POD isoenzyme patterns were identified by native PAGE on 15%, 7.5% and 12%
acrylamide gels, respectively. Defined amounts of protein, 20 mg, were used.
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
SDS-PAGE was used in order to separate proteins according to their electrophoretic mobility.
SDS-PAGE was carried out according to Laemmli (1970) with slight modification.
Statistical analysis
Statistical data processing and analysis were done with the analysis functions of Microsoft Excel
2010 and Statistica 7.0. All results represent the means of three replicate (except PAGE and SDS-
44
PAGE). Data are presented taking into consideration the standard error (SE) of three replicates.
Results were analysed by one-way ANOVA to identify significant differences between the
groups, and their significance levels (p < 0.05) were determined.
RESULTS
Changes of air and soil surface temperatures from 2004 to 2011
The data of 23 weather stations (the maximum summer air temperature and soil surface
temperature) from 2004 to 2011 were analysed (LVĢMC). Average maximum air temperatures
varied from 24˚C to 32˚C in summer months. Soil surface temperature was varied in the range
between 20˚C to 50˚C, the range between 20 to 40˚C was found in more than 60% cases. Data
analysis of soil surface temperature in Latvia showed the raise of temperature in the range
between 40-50˚C in more than 10% cases during summer months depending on a year, but it
reached 33% in the hottest years (in 2006).
Changes of morpho-physiological parameters of the organs of wheat seedlings under heat
stress
Changes of relative water content (RWC)
The powerful water loss was observed in the coleoptiles after long-term heat stress (HS) exposure
at the early stage of seedling development, i.e. immediately after HS water loss was 6.3%, and
water loss was 49% (p<0.05) five days after HS. The RWC decreased by 5% (p>0.05) in the first
leaves immediately after long-term HS exposure at the late stage of seedling development, and it
reached 45% (p<0.001) at the end of the investigated period compared to control. The water loss
in the coleoptiles depended on the duration of HS exposure, i.e. immediately after the 15-
minutes’ exposure – 21%, after 60 min – 40%, and after 24h – 50%. The gradual decrease in the
RWC (more than 50%, p<0.01) in the coleoptiles five days after HS was observed (Figures 1 and
2).
45
Figure 1
RWC (%) of the coleoptiles at the early (A) and at the late (B) stages of wheat seedling
development in response to short-term HS (42°C). All results represent the means of three
replicate ± SE.
Figure 2
RWC (%) of the coleoptiles at the early (A) and at the late (B) stages of wheat seedling
development in response to long-term HS (42°C; * - experiment starting date). All results
represent the means of three replicate ± SE.
Changes of length of the organs of wheat seedlings under heat stress
The significant inhibition of the first leaf length was observed on the 5th
day after the 15-, 30-,
and 60-minutes’ HS exposure (16% (p<0.05), 35% (p<0.001), and 27% (p<0.01) respectively).
The arrest of the growth of the first leaf was observed after the 15-minutes’ and 24-hours’ HS at
the late stage of seedling development (p<0.001). The growth of the first leaf was inhibited by
19% and 17% immediately after the 30- and 60-minutes’ stress respectively, and it decreased by
28% and 26% respectively five days after HS (p<0.05) (Figure 3). The growth of the first leaf
was inhibited immediately after long-term HS exposure at the early and late stages of seedling
46
development (23% and 29% respectively; p<0.001) and it was inhibited by 55% and 31%
respectively at the end of the investigated period compared to control.
The HS caused inhibition of the maximum root length growth at all stages of seedling
development (p<0.001). The adverse influence of HS increased in the roots throughout the
investigated period at the early and late stages of seedling development, and it reached more than
50% (p<0.001) and more than 40% (p<0.001) respectively at the end of the investigated period
compared to control. Insignificant changes were observed in the coleoptile growth after HS
exposure (p>0.05).
Figure 3
Length of the first leaf at the early (A) and at the late (B) stages of wheat seedling development in
response to short-term HS (42°C) (HS1 (4-day-old seedlings) and HS2 (7-day-old seedlings).
Changes of relative dry weight (RDW)
The increase in the RDW of the first leaves and coleoptiles caused the increase in the RDW of
wheat seedlings (from 8% (p<0.01) to 15% (p<0.05)) after the 15-minutes’ HS at the early stage
of seedling development. The gradual decrease in the RDW (from 1% to 21%) of wheat
seedlings was observed after the 15-minutes’ HS at the late stage of seedling development. The
RDW of wheat seedlings increased immediately after the 30-minutes’ HS at the early and late
stages of seedling development (4% and 6% respectively; p<0.05), and it reached 10% and 12%
respectively at the end of the investigated period compared to control (p>0.05). Though the RDW
increase at the early stage of seedling development occurred due to the increase of the RDW of
all organs of wheat seedlings, but the RDW increase at the late stage occurred due to the increase
of the RDW of underground parts of seedlings. Changes of the RDW after the 60-minutes’ HS
exposure were observed only at the late stage of seedling development – at the end of the
47
investigated period it was found to be decreased by 13%, it occurred due to the reduction of the
RDW of the coleoptile (19%) and roots (13%). The decrease in the RDW of wheat seedlings
(7%; p<0.001) immediately after long-term HS at the early stage of seedling development
occurred due to the decrease in the RDW of the root (43%; p<0.05). The RDW decreased (20%;
p<0.001) due to the decrease in the RDW of the first leaf and coleoptile (26% and 38%
respectively; p<0.01) at the end of the investigated period. However, the RDW increased till the
control level at the late stage of seedling development due to the increase in the RDW of the first
leaf (27%; p<0.05).
Changes of root/shoot ratio (R/S)
The most drastic decrease in the R/S ratio was observed after the 15-minutes’ and 24-hours’ HS
exposure (p<0.05) – it decreased by 28% and 73% respectively immediately after HS exposure at
the early stage of seedling development, and by 44% and 40% respectively at the late stage
(Figure 4). However, the R/S ratio increased after long-term HS at the late stage of seedling
development and reached the control level. The decrease in the R/S ratio was observed after
short-term HS at the early stage of seedling development – on the 5th
day after the 15-, 30- and
60-minutes’ HS exposure it was found to be decreased by 56% (p<0.001), 19% (p<0.05), and
47%; (p<0.001) respectively compared to control. The decrease in the R/S ratio was observed
also after short-term HS at the late stage of seedling development – on the 5th
day after the 15-,
30- and 60-minutes’ HS exposure it was found to decrease by 64% (p<0.001), 51% (p<0.01), and
28%; (p<0.001) respectively compared to control.
Figure 4
R/S ratio of wheat seedlings at the early (A) and at the late (B) stages of wheat seedling
development in response to HS (42°C). All results represent the means of three replicate ± SE.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Control 15 min 30 min 60 min 24 h
Ro
ot/
Sh
oo
t ra
tio
Duration of heat stress
HS1 HS2
48
Changes of relative growth index (RGI)
The RGI depended on HS duration and the treated organ (Table 6). The most critical duration of
HS was 24 hours, and the most favourable duration of HS was 30 minutes. The roots were the
most sensitive against HS exposure (Table 6).
The decrease of the RGI of the first leaf was observed on the 5th
day after short-term HS at the
early stage of seedling development (approx. by 35%, p<0.05), and it decreased by more than
20% at the late stage of seedling development (p<0.05). The increase of the RGI of the coleoptile
was observed during three days after short-term HS exposure at the early stage of seedling
development (p<0.05), however, the RGI decreased by 23% and 33% (p<0.05) after the 30- and
60-minutes’ HS respectively on the 5th
day after HS exposure, but it was similar to control after
the 15-minutes’ HS. The gradual decrease of the RGI of the coleoptile was observed after short-
term HS at the late stage of seedling development. The gradual decrease of the RGI of the roots
was observed after short-term HS at the early stage of seedling development, and on the 5th
day
after the beginning of the 15-, 30- and 60-minutes’ HS it was found to decrease by 62%, 42% and
65% (p<0.001) respectively. The decrease of the RGI of the roots at the late stage of seedling
development was similar to the RGI increase at the early stage of seedling development
(p<0.001).
A sharp decrease of the RGI (p<0.001) of the organs of wheat seedlings was observed after long-
term HS at the early stage of seedling development, and it was steadily low at the late stage of
seedling development compared to the RGI of the control seedlings (>50%; p<0.05).
Table 6
RGI of the organs of wheat seedlings at the early (HS1 – 4-day-old seedlings) and at the late
(HS2 – 7-day-old seedlings) stages of wheat seedling development in response to HS (42°C).
Duration
of HS
RGI (%)
The first leaf The coleoptile The roots
HS1 HS2 HS1 HS2 HS1 HS2
0 min 100 100 100 100 100 100
15 min 125±0.05*** 89±0.56** 119±1.78** 100±0.05 100±0.05 42±2.22**
30 min 100±0.05* 112±0.69** 120±13.19 125±0.05*** 100±0.08 84±6.11
60 min 100±0.02* 135±2.08** 102±2.96 85±5.45 80±0.10*** 79±1.11**
24 h 71±0.01*** 54±4.17** 104±4.35 50±10.00* 27±1.79*** 33±7.50**
*- p<0.05; **- p<0.01; ***- p<0.001. All results represent the means of three replicate ± SE.
49
Changes of lipid peroxidation in the organs of wheat seedlings under heat stress
Changes in malondialdehyde level
The decrease in the MDA level was observed in the first leaf after short-term HS exposure at the
early stage of seedling development (p<0.001; Figure 5), and on the 5th
day after the beginning of
the 15-, 30- and 60-minutes’ HS it was found to be decreased by 48%, 59% and 59% (p<0.001)
respectively. The MDA level decreased by 48%, 54% and 57% immediately after the 15-, 30-
and 60-minutes’ HS respectively in the first leaf at the late stage of seedling development
compared to control seedlings. However, the MDA level was similar to control level on the 4th
day after short-term HS exposure due to the decrease in the MDA level in the control leaves
(p<0.05).
Figure 5
MDA level in the first leaf at the early (HS1) and at the late (HS2) stages of development in
response to short-term HS (42˚C)
The MDA level increased gradually in the coleoptiles, starting from the 2nd
day after short-term
HS at the early stage of seedling development. The MDA level increased in the coleoptiles 2.5
times (p<0.001) on the 5th
day after the 15-minutes’ HS, but it increased 4-fold on the 5th
day
after the 30- and 60-minutes’ HS (p<0.05) compared to control seedlings. The significant
increase in the MDA level was observed in the coleoptiles after short-term HS at the late stage of
seedling development. The MDA level increased 2.5 times (p<0.05) after the 15-minutes’ HS,
4.5 times after the 30-minutes’ HS, and 3.3 times after the 60-minutes’ HS (p<0.001) compared
to the control coleoptiles. On the 2nd
and 3rd
days after short-term HS the 7-fold increase of MDA
level was observed in the coleoptiles after the 15-minutes’ HS (p<0.05), and the 4 and 3.5-fold
increase was observed in the coleoptiles after the 30- and 60-minutes’ HS respectively (p<0.001).
50
On the 4th
day after HS at the late stage of seedling development the 3-fold increase in the MDA
level was observed in the coleoptiles compared to the control coleoptiles (p<0.001).
The MDA level was found to be lower in the heat-treated roots immediately after the 30- and 60-
minutes’ HS at the early stage of seedling development than in the control roots (16% and 46%
respectively; p<0.05). However, the MDA level increased in the following days after exposure,
and 3-fold increase in the MDA level was observed in the heat-treated roots on the 5th
after HS
exposure compared to control (p<0.05). The 15-, 30- and 60-minutes’ HS exposure at the late
stage of seedling development caused the significant increase of the MDA level in the roots (by
88%, 48% and 3-fold respectively; p<0.05). The MDA level remained more than three times
higher in heat-treated roots till the end of the investigated period compared to control (p<0.01).
A significant decrease (p<0.001) in the MDA level was observed in the first leaf immediately
after long-term HS exposure at the early (48%) and at the late (32%) stages of seedling
development compared to control (Figure 6).
Figure 6
MDA level in the first leaf at the early (HS1) and at the late (HS2) stages of development in
response to long-term HS (42˚C). All results represent the means of three replicate ± SE.
The MDA level was found to be significantly lower in the heat-treated first leaves after the long-
term HS than in the control first leaves during the investigated period, and at the end of the
investigated period it decreased by 56% (p<0.001) at the early stage of seedling development and
by 17% (p<0.01) at the late stage of seedling development. The MDA level was similar to the
control MDA level in the coleoptiles after the 24-h HS at the early stage of seedling development.
However, the MDA level increased in the coleoptiles during four days after long-term HS
exposure, and it was 2-fold higher (p<0.001) at the end of the investigated period compared to the
control coleoptiles. The increase in the MDA level was observed in the coleoptiles immediately
51
after long-term HS exposure at the late stage of seedling development (51%; p<0.05), and it
reached 65% (p<0,001) on the 4th
day after HS exposure. The decrease in the MDA level was
observed in the roots throughout seedling development. The decrease in the MDA level was
observed in the roots immediately after long-term HS exposure at the early stage of seedling
development compared to control (34%; p<0.01), but it reached a similar value to the control
value on the 4th
day after the 24-h HS. The increase in the MDA level was observed in the roots
immediately after the 24-h HS at the late stage of development (54%; p<0.01), and it reached a
similar value to the control value at the end of the investigated period.
Changes in content of conjugated dienes (CD)
Three peaks of the CD formation were observed in the organs of wheat seedlings throughout the
early ontogeny. However, the CD content decreased in the first leaf and roots throughout the
early ontogeny, and the sharp increase of the CD content was observed in the coleoptile
throughout seedling development (p<0.05).
Figure 7
CD level in the first leaf at the early (HS1) and at the late (HS2) stages of development in
response to short-term HS (42˚C). All results represent the means of three replicate ± SE.
The first peak of the CD formation in the first leaf after the 15-, 30- and 60-minutes’ HS
concurred with the control at the early stage of seedling development, however, the CD content
was lower in the heat-treated first leaves compared to the control leaves (20%, 23% and 12%
respectively; p<0.05) (Figure 7). The second peak of the CD formation in the first leaf after the
15-, 30- and 60-minutes’ HS was observed one day earlier than in the control leaves, and it was
found to be respectively 34%, 2-fold and 62% higher than in the control leaves (p<0.05). The
52
peaks of the CD formation in the first leaves, which was treated by short-term HS, at the late
stage of seedling development were observed immediately after the 15-, 30- and 60-minutes’ HS
(the CD level was higher by 74%, 28% and 88% respectively; p<0.05) and on the 3rd
day after
exposure (the CD level was similar to control).
The peaks of the CD formation were observed one day earlier in the coleoptiles after short-term
HS at all stages of seedling development compared to the control coleoptiles, i.e., immediately
after HS exposure and on the 3rd
day after HS exposure. The peaks of the CD formation in the
coleoptiles were 3-fold higher at the late stage of seedling development compared to the control
coleoptiles (p<0.01). Two peaks of the CD formation were observed in the roots after short-term
HS at all stages of seedling development – immediately after HS exposure and on the 3rd
day
after HS exposure. The significant increase in the CD level was observed in the roots after the 15-
, 30- and 60-minutes’ HS at the late stage of seedling development (99%, 2.5-fold and 48%
respectively; p<0.05).
There were no significant changes in the content of the CD after long-term HS in the first leaf at
the early stage of development. However, the significant increase in the CD level was observed in
the first leaf after long term HS at the late stage of seedling development (approx. 50%; p<0.01),
and the increased CD level in the first leaf after the 24-h HS remained all investigated period
(Figure 8).
Figure 8
CD level in the first leaf at the early (HS1) and at the late (HS2) stages of development in
response to long-term HS (42˚C). All results represent the means of three replicate ± SE.
The significant increase in the CD level was observed in the coleoptiles at all stages of seedling
development. The increase in the CD level was observed in the coleoptiles immediately after
53
long-term HS exposure at the early and late stages of seedling development compared to the
control coleoptiles (30% and 43% respectively; p<0.05). The second peak of the CD formation
was observed on the 3rd
day after long-term HS exposure at all stages of seedling development,
and it was 3-fold higher than the CD level in the control coleoptiles (p<0,01).
The increase in the CD level was observed in the roots immediately after long-term HS at the
early and late stages of seedling development (17% and 39% respectively; p<0.05), and it
reached 103% and 89% respectively (p<0.05) at the end of the investigated period.
Changes of cellular membrane permeability in the organs of wheat seedlings under heat
stress
Short-term HS decreased membrane permeability in the first leaves. The electrolyte leakage (EL)
in the first leaf increased by 7% (p>0.05) immediately after the 15-minutes’ HS, by 1% (p>0.05)
– after the 30-minutes’ HS, and by 33% (p<0.05) – after the 60-minutes’ HS compared to control
seedlings. A statistically significant decrease in the EL was observed in the first leaf on the 5th
day after the 15-, 30- and 60-minutes’ HS at the early stage of seedling development (49%, 39%,
and 47%; p<0.05) (Figure 9).
Figure 9
EL in the first leaf at the early (HS1) and at the late (HS2) stages of development in response to
short-term HS (42°C)
The 15-, 30- and 60-minutes’ HS adversely affected the membrane of the first leaves at the late
stage of seedling development, thereby the EL increased by 35%, 33%, and 66% respectively
(p<0.05; Figure 9). There was observed the decrease in the EL in the heat-treated first leaf at the
late stages during some days after the 15- and 30-minutes’ HS and it reached control level of the
54
EL at the end of the investigated period. However, a sharp increase in the EL was observed in
the first leaf on the 5th
day after the 60-minutes’ HS at the late stage of development (95%;
p<0.05).
There was observed a steadily high level of the EL in the first leaf after long-term HS throughout
the investigated period compared to control seedlings (Figure 10). Although a high level of the
EL was observed throughout the investigated period (p<0.05), at the late stages membrane
permeability in the first leaf was higher after long-term HS exposure (approx. 4-fold) than at the
early stages (approx. 3-fold) compared to control.
Figure 10
EL in the first leaf at the early (HS1) and at the late (HS2) stages of development in response to
long-term HS (42°C). All results represent the means of three replicate ± SE.
The increase in the EL depended on the duration of HS exposure in the coleoptile at the early
stage of seedling development (p<0.05), thereby the EL increased by 35% immediately after the
15-minutes’ HS, by 88% after the 30-minutes’ HS, 2-fold after the 60-minutes’ HS and 4-fold
after the 24-h HS. However, membrane permeability decreased in the coleoptiles on the next day
after short-term HS at the early stage of development, and it remained lower than in the control
coleoptiles throughout the investigated period. But, it remained steadily high after long-term HS
exposure at the early stage of seedling development (p<0.01). The EL level significantly
increased in the coleoptiles immediately after HS exposure at the late stage of seedling
development (p<0.01). The EL increased by 96% immediately after the 15-minutes’ HS
exposure, by 103% after the 30-minutes’ HS, by 87% after the 60-minutes’ HS and 4-fold after
the 24-h HS. The increased EL level remained also at the end of the investigated period. The 2-
fold increase of the EL was observed after the 15-minutes’ HS, 33% – after the 30-minutes’ HS,
55
74% – after the 60-minutes’ HS, and 32% – after the 24-hours’ HS compared to control
coleoptiles (p<0.05).
The EL level decreased in the roots immediately after the 60-minutes’ HS (22%; p<0.05), but
increased immediately after the 24-h HS (10%; p<0.05) at the early stage of seedling
development. However, the EL level in the roots was found to be similar to the control level
throughout the recovery period. The EL level in the roots was lower than the EL in the control
roots after short-term HS exposure at the late stage of seedling development and remained
steadily low throughout the studied period compared to control. However, the EL level remained
steadily high in the roots after long-term HS exposure at the late stage of seedling development.
Immediately after exposure EL was found to increase by 34% and the 1.5-fold increase in the EL
was observed at the end of the investigated period (p<0.05).
Changes of oxidative processes in the organs of wheat seedlings in the presence of CsA (1
mg/l)
The MDA level decreased in the coleoptiles at the early stage of seedling development in the
presence of CsA (p<0.05). However, the presence of CsA caused an insignificant increase in the
MDA level in the senescent coleoptiles. The presence of CsA significantly decreased the MDA
level in the roots at the early stage of seedling development. However, on the 6th
day of
development the MDA level started to increase in the roots of wheat seedlings, and it increased
above control value (p<0.05).
The 17% and 35% decrease in the MDA level was found in the first leaf grown in the presence of
CsA after the 15- and 30-minutes’ HS exposure compared to control and the 50% increase in the
MDA level (p<0,05) was found in the first leaf compared to seedlings grown in the absence of
CsA. The MDA level was similar to control in the first leaf on the 3rd
day after short-term HS
exposure in the presence of CsA. However, the MDA level in the presence of CsA was found
higher than in the absence of CsA (p<0.001). The 15-minutes’ HS exposure caused the increase
in the MDA level in the coleoptiles regardless of the presence of CsA (42%; p<0.001). The
gradual increase in the MDA level (p<0.01) was found in the coleoptiles grown in the presence of
CsA after the 30-minutes’ HS and it increased by 74% (p<0.01) at the end of the investigated
period compared to the control coleoptiles grown in the presence of CsA. The MDA level
increased by 85% in the coleoptiles grown in the presence of CsA immediately after the 60-
minutes’ HS compared to control and by 67% compared to heat-treated coleoptiles grown in the
56
absence of CsA (p<0.01). However, the MDA level decreased in the coleoptile one day after the
60-minutes’ HS and was similar to control throughout the investigated period.
The presence of CsA decreased the MDA level (p<0.05) in the roots after short-term HS
exposure.
The MDA level in the first leaf grown in the presence of CsA after long-term HS exposure was
found to be similar to the MDA level in the control first leaf grown in the presence of CsA, but, it
increased compared to the MDA level in the first leaf grown in the absence of CsA (p<0,05). The
MDA level decreased only on the 3rd
day after long-term HS compared to the control first leaf
grown in the absence of CsA (43%). Powerful increase in the MDA level after long-term HS was
observed in the coleoptiles grown in the presence of CsA (more than 4-fold, p<0.001), and it
remained steadily high throughout the investigated period (p<0.001). There were no changes in
the MDA level in the roots grown in the presence of CsA after the 24-h HS, however, the MDA
level was found to be higher than in the roots grown in the absence of CsA.
Change of membrane permeability in the organs of wheat seedlings in the presence of CsA
(1 mg/l)
There were no changes in the curve of the electrolyte leakage (EL) in the organs of wheat
seedlings grown in the presence of CsA throughout the investigated period (Figure 11). There
were no changes in the EL in the coleoptile in the presence of CsA. However, the EL
significantly decreased in the roots in the presence of CsA –the EL decreased by 29% (p<0.01)
on the 4th
day of seedling development, and the decrease reached 72% (p<0.001) on the 8th
day of
seedling development compared to the control roots.
The 2-fold increase (p<0,05) in the EL was found immediately after the 24-h HS in the first leaf
grown in the presence of CsA compared to the EL in the control leaf, however, it was lower
(32%; p<0.05) than in heat-treated first leaf grown in the absence of CsA. The membrane
permeability decreased in the heat-treated leaf throughout the investigated period and it was
found to be similar to the control EL level at the end of the investigated period (Figure 12(a)).
The 4-fold increase was observed in the coleoptile after long-term HS exposure regardless of the
presence of CsA (Figure 12(b)). The EL decreased in the roots grown in the presence of CsA
compared to the roots grown in the absence of CsA immediately after long-term HS (18%), but it
was 2-fold higher (p<0.01) compared to the control EL (Figure 12(c)).
57
Figure 11
EL (%) in the organs of wheat seedlings grown in the presence of CsA (1 mg/l) throughout the
early ontogeny. All results represent the means of three replicate ± SE.
Figure 12
EL in the first leaf (A), coleoptile (B) and roots (C) of wheat seedlings grown in the presence of
CsA in response to the 24-hours’ HS. All results represent the means of three replicate ± SE.
Membrane permeability decreased in the first leaf grown in the presence of CsA immediately
after the 15- and 30-minutes’ HS (p<0.05) compared to the control EL level (47% and 54%
respectively), and compared to the first leaf grown in the absence of CsA (52% and 60%
respectively) (Figure 13). However, the EL increased by 54% in the first leaf grown in the
presence of CsA immediately after the 60-minutes’ HS compared to the EL in the control first
leaf and by 97% (p<0.05) compared to the first leaf grown in the absence of CsA. The EL level
was found to be similar to the control level on the 3rd
day after HS.
The EL decreased in the coleoptile grown in the presence of CsA immediately after the 15- and
30-minutes’ (39% and 36% respectively; p<0.05) compared to control, and the decreased EL
level remained throughout the investigated period (till 20%). However, the EL level increased 3-
fold (p<0.001) in the coleoptile in the presence of CsA immediately after the 60-minutes’ HS
compared to control and by 25% (p<0.05) compared to the heat-treated coleoptile grown in the
58
absence of CsA. The EL level in the coleoptile grown in the presence of CsA reached the control
EL level on the 5th
day after HS exposure.
The presence of CsA decreased the EL level in the experimental roots and despite the increase in
the EL level in the roots grown in the presence of CsA on the 3rd
day after the 15-, 30- and 60-
minutes’ HS compared to the control roots grown in the presence of CsA (4-, 3- and 2-fold
respectively; p<0.05), the EL level was lower than in the control roots grown in the absence of
CsA (p<0.05).
Figure 13
EL in the first leaf of wheat seedlings grown in the presence of CsA in response to short-term HS.
All results represent the means of three replicate ± SE.
Quantitative changes of total soluble proteins in the organs of wheat seedlings under heat
stress in the presence of CsA (1 mg/l)
The presence of CsA changed the amount of total soluble proteins in the organs of wheat
seedlings. The increased protein amount was found in the first leaf grown in the presence of CsA
(11% – on the 4th
day of seedling development; 28% – on the 6th
day of development; p<0.05).
The presence of CsA caused the decrease in protein amount in the coleoptile, but the inhibiting
influence of CsA in the roots was not observed.
There were no changes in the total amount of proteins in the organs of wheat seedlings after
short-term HS. However, the reduced second peak of total soluble protein formation was found in
the first leaf grown in the presence of CsA after the 15- and 30-minutes’ HS. There were no
changes in the total amount of soluble proteins in the first leaf and coleoptile after short-term HS
regardless of the presence of CsA.
Total amount of proteins decreased in the first leaf on the 1st day after long-term HS in the
presence of CsA (16%). However, it was found to be similar to control in the first leaf in the
absence of CsA. Long-term HS provoked the increase in amount of proteins in the coleoptile
59
regardless of the presence of CsA (13%; p<0.05). The decrease in amount of proteins was found
in the roots after long-term HS in the presence of CsA (41%; p<0.05).
Qualitative changes of total soluble proteins in the organs of wheat seedlings under heat
stress in the presence of CsA (1 mg/l)
Polypeptides detected in the first leaf of wheat seedlings segregated into four groups. The groups,
based on molecular weight were: 85 – 40kDa, 36 – 25kDa, and 20 – 13kDa. There were no
changes in electrophoretic activity of polypeptides in the first leaf after short-term HS exposure.
However, the three most intensive polypeptide bands (61,7kDa, 79,9kDa, and 81,8kDa) were
found in the first leaf immediately after long-term HS exposure regardless of the presence of
CsA. Significant changes of polypeptides were determined in the range of 20 – 13kDa, in which a
new band (19,2kDa) immediately after long-term HS in the first leaf was observed. A new band
(12,9kDa) in the first leaf grown in the presence of CsA was observed. One polypeptide group
(70 – 25kDa) was observed in the coleoptiles regardless of the presence of CsA. Two polypeptide
bands with increased intensity (20,9kDa and 10,6kDa) were observed in the roots of etiolated
wheat seedlings. Besides, the intensity of these bands increased in the presence of CsA after
short-term HS exposure. However, the increased duration of HS decreased intensity of bands.
Changes of electrophoretic activity of antioxidant enzymes in the organs of wheat seedlings
under heat stress
One CAT isoform was detected in the first leaf (CAT1), two CAT isoforms were detected in the
coleoptile (CAT1 and CAT2), but, electrophoretic activity of CAT was not observed in the roots
of wheat seedlings. The reduced electrophoretic activity of CAT was observed in the first leaf
immediately after long-term HS exposure. However, the increased electrophoretic activity of
CAT1 was observed in the first leaf immediately after short-term HS despite the presence of
CsA. The increased electrophoretic activity of CAT was observed in the coleoptiles after long-
term HS exposure, and appearance of the new isoform (CAT2) was detected (figure 14.(a)). The
increased electrophoretic activity of both isoforms was observed during the investigated period.
However, appearance of CAT2 isoform was not detected in the coleoptile in the presence of CsA.
Though the electrophoretic activity of CAT1 isoform in the presence of CsA also was high
(figure 14.(b)). Insignificantly increased electrophoretic activity of CAT1 was observed in the
coleoptile after short-term HS despite the presence of CsA.
60
Four SOD isoforms (MnSOD1 – MnSOD3 and CuZnSOD1) were detected in the coleoptile and
roots of etiolated wheat seedlings. Three SOD isoforms (MnSOD1, MnSOD3 and CuZnSOD1)
were detected in the first leaf, however, their electrophoretic activity was lower than in the
coleoptile and roots. HS exposure and the presence of CsA did not provoke changes of SOD
electrophoretic activity in the first leaf and coleoptile. Long-term HS exposure provoked
disappearance of CuZnSOD isoform in the roots of etiolated wheat seedlings despite the presence
of CsA (figure 15).
Figure 14
CAT electrophoretic activity in the coleoptiles of wheat seedlings grown in the absence (A) and
presence (B) of CsA in response to HS exposure (15, 30 and 60 min; 24 h)
Figure 15
SOD electrophoretic activity in the roots of wheat seedlings in response to HS exposure (15, 30
and 60 min; 24 h)
61
Figure 16
POD electrophoretic activity in the roots of wheat seedlings in response to HS exposure (15, 30
and 60 min; 24 h)
Six POD isoforms were detected in the roots and coleoptiles, and five POD isoforms were
detected in the first leaves (POD1-POD3; POD5 and POD6). Changes of electrophoretic activity
of POD isoforms were not observed in the coleoptile after HS despite the presence of CsA.
Decreased POD3 electrophoretic activity was observed immediately after HS exposure in the first
leaves, but it reached control level at the next days after HS exposure. Increasing the duration of
HS decreased the electrophoretic activity of POD3 isoform in the roots (Figure 16). There were
no changes in the electrophoretic activity of POD3 and POD5 isoforms in the roots grown in the
presence of CsA after long-term HS compared to control seedlings.
DISCUSSION
High temperature is one of the most important environmental factors which limit the growth and
yield of cool-season plant species. The optimum temperature of the growth of cool-season plants
varies between 10˚C and 25˚C (Paulson, 1994). The air temperature in Latvia in summer can rise
above 35˚C, but the soil surface temperature in the range 40-50˚C was observed in 12% - 33%
cases during summer months depending on a year (LVĢMC data), which is higher than the
optimal temperature level necessary for plant development. Heat stress often causes accelerated
senescence and stress influence continues during the period of senescence (Ferguson et al., 1993).
However, the influence of high temperature on various processes involved in senescence process
has not been studied enough.
62
Changes of morpho-physiological parameters of the organs of wheat seedlings under heat
stress
The response of the organs of wheat seedlings on exposure of stress temperature is different. It is
shown in changes of morpho-physiological parameters. It is important to estimate the ability of
plants to survive under heat stress (HS) because this parameter included both primary heat
resistance of plants, and the ability of plants to recover. Our results showed that the first leaf and
coleoptile lost their recovery skills after long-term HS exposure at all stages of development. The
decrease in the relative water content (RWC) and growth arrest indicates this. Probably, it is
connected with loss of protective functions of coleoptile because high temperature provokes
accelerated senescence of coleoptile (Ferguson et al., 1993).
HS inhibited the first leaf growth at the late stage of seedling development. However, the most
unfavourable influence of HS exposure was observed after the shortest (15 min) and the longest
(24 st.) HS treatment. In spite of the significant inhibition of the first leaf growth, slight changes
of the RWC in the first leaf were observed after short-term HS at all stages of seedling
development. Probably, the growth inhibition is connected with beginning of the first leaf
senescence (Aleksandrushkina et al. 2009). It can be assumed that HS exposure accelerates the
first leaf senescence, and the size of mature cells decreased in the senescent leaves where cell
division does not occur (Alves, Setter, 2004).
Short-term HS exposure slightly stimulated the coleoptile growth at the early stages of seedling
development, and it did not suffer from water deficit. However, injurious loss of water was
observed in the senescent coleoptile at the late stages of seedling development. Probably, the
senescent coleoptile could not repair its imbibition and turgid skills after short-term HS exposure
at the late stages of seedling development, and water loss increased. Thereby, short-term HS
accelerated senescence of coleoptile.
The amount of roots, the length and weight of roots usually is used to estimate root growth
because of the water absorption ability (Huang and Gao, 2000). The results of our research
showed that the growth and development of root system was inhibited by HS despite the duration
of HS exposure, and root growth was almost completely arrested immediately after HS exposure.
The data of our research showed that extreme temperatures were associated with water loss
because of disturbance of the water absorption ability of roots and stomata evaporation of leaves
(Mo et al., 2011). Plants under HS suffered from strong water deficit, and one of the
consequences is wilting.
63
Root and shoot dry weight usually is in the certain balance and can be an indicator of stress
changes. The decrease of root/shot ratio (R/S), relative dry weight (RDW) and relative growth
index (RGI) of wheat seedlings induced by long-term HS was a result of the decrease of the
RDW of all wheat seedling organs. Long-term HS exposure provokes the strong water loss, and it
inhibits cell growth and development because of low turgor pressure (Shao et al., 2008). Long-
term HS inhibits root growth and decreases root imbibition at all stages of seedling development,
and the roots cannot restore their turgor during recovery period. Thus, disturbance of root
functions after long-term HS provokes injuries of above ground plant parts.
The gradual decrease of R/S ratio was observed after long-term HS at all stages of seedling
development. However, a comparison of R/S ratio and changes of length and weight of wheat
seedlings showed that the decrease of R/S ratio after short-term HS at the early stage of seedling
development occurred because of the decrease of the length and weight of roots and dieback of
root tips as well. Short-term HS exposure stimulated the increase of the RGI of the first leaf and
coleoptile in the initial days after stress. It was found that exposure of 30 minutes to HS at the
early stage of seedling development favorably impacted the growth of wheat seedlings.
Interestingly, the highest RGI was observed in the senescent organ, i.e. coleoptile, at the early
stage of seedling development after short-term exposure. Probably, it allowed the coleoptile to
protect the first leaf from injuries. Probably, short-term HS caused stimulation of cell division
and elongation (Bos et al., 2000). The decrease of the first leaf and coleoptile RGI was observed
only at the eighth day of development of the experimental seedlings. Thus, the process of the
coleoptile senescence was delayed due to short-term HS at the early stage of seedling
development. HS accelerated the coleoptile senescence at the late stage of seedling development
despite the duration of HS exposure, and it immediately affected the first leaf condition.
However, in order get the statistically significant results about the influence of HS on plants not
only measurements of morpho-physiological parameters, but also biochemical methods
(measurements of lipid peroxidation, membrane permeability and protein amount) are important.
Changes of lipid peroxidation level in the organs of wheat seedlings under heat stress
The high temperature induced oxidative injuries, which provoked membrane injury and
electrolyte leakage in the etiolated organs of wheat seedlings. Products of lipid peroxidation have
been commonly used to assess oxidative injury of membrane lipids (Guo et al., 2006).
Significant increase of malondialdehyde (MDA) level was observed in the coleoptile after HS
exposure at all stages of seedling development. Though the MDA level was much higher after
64
short-term HS than after long-term HS. Possible reasons for the increase of the MDA level under
HS could be ROS production, because exactly H2O2 participates in lipid peroxidation (Goyal,
Asthir, 2010), and drastic water loss as well. Short-term HS at the early stage of seedling
development might be an indicator of formation of heat resistance because short-term HS
favourably affected the growth and development of coleoptile at this stage. Relationship between
formation of heat resistance and H2O2 level was observed in seedlings of various species
(Карпець, Колупаєв, 2008). However, short-term HS at the late stage of seedling development
and long-term HS at all stages of seedling development accelerated senescence of the coleoptile.
HS increased the MDA level in the first leaf regardless of the duration of HS. In this case,
however, assumption that HS did not affect growth and development of the first leaf was
incorrect, because short-term HS exposure at the late stage of seedling development and long-
term HS at all studied stages of development completely inhibited the leaf length growth.
The increase of the MDA level in the root like the MDA level in the coleoptile was higher after
short-term HS than after long-term HS in the roots despite the duration of HS. Probably, it can be
connected with root sensitivity against HS, and with overproduction of H2O2, it was confirmed by
high electrophoretic activity of SOD. The decrease of the MDA level in roots after long-term HS
can be explained by decreased electrophoretic activity of SOD and CuZnSOD isoform
inactivation.
Conjugated dienes (CD) are the primary product of lipid peroxidation . The CD level reflects the
early stage of lipid oxidation (Владимиров, 1989). The results of our research showed that the
production of the CD has a cyclic character in the organs of wheat seedlings. The CD level in the
first leaf and roots decreased, but it increased in the senescent organ (coleoptile) during the early
ontogeny. Short-term HS changed the cyclic curve of the CD production; however, long-term HS
did not change curve of the CD production in the organs of wheat seedlings. Probably, long-term
HS exposure occurred at the same time with the maximum of the CD formation.
Insignificant increase of the CD level was observed in the organs of wheat seedlings at the early
stage of seedling development, though, the CD level increased dramatically at the late stage of
development. Besides, the CD level increased several times more immediately after short-term
HS than after long-term HS exposure. Changes of the CD level depended on the stage of seedling
development. Short-term HS exposure provoked the increase of the CD level in the senescent
coleoptiles only at the late stage of seedling development, but long-term HS provoked the
increase of the CD level at all stages of seedling development. Insignificant increase of the CD
level was observed in the first leaves and roots after short-term HS exposure at all stages of
65
seedling development. Though the CD level increased in the first leaves and roots after long-term
HS exposure at the late stage of seedling development. Probably, oxidative processes added to
adverse long-term HS exposure at the late stage of seedling development. Besides, the CD can be
an indicator of efficiency of antioxidant system under oxidative injuries (Anwar et al., 2006). The
electrophoretic analysis of antioxidant ferments proves participation of antioxidant in protection
against oxidative injuries.
Changes of cellular membrane permeability in the organs of wheat seedlings under heat
stress
Lipid peroxidation significantly changes the structure of membrane lipid bilayer and enhances
passive transport of ions and metabolites (Барабой, Сутковой, 1997).
The highest membrane permeability was observed in the roots of wheat seedlings (p<0,001).
Membrane permeability gradually increased in the coleoptile throughout seedling development,
but it was quite stable in the first leaf.
The data of our results showed that long-term HS exposure significantly increased the membrane
permeability of the organs of etiolated wheat seedlings regardless of the stage of seedling
development. Significant electrolyte leakage (EL) was observed in the first leaf and coleoptile.
Ivanov et al. (2001) showed that only long-term high temperature (168h, 45°C) exposure
provoked the significant increase of the EL in tobacco leaves. However, the results of our
research showed that short-term HS exposure also increased the EL in the first leaf and coleoptile
at the late stage of seedling development. The first leaves could recover their state after short-
term HS; the decrease of the EL till the EL level of control seedlings during period of recovery
proved it. Changes of the EL agreed with changes of the level of membrane lipid peroxidation,
i.e. the CD level like the EL level decreased till the control level.
The EL level in the first leaves agreed with the increase of the EL in the coleoptiles after long-
term HS at all stages of seedling development and after short-term HS at the late stage of seedling
development. Probably, short-term and long-term HS exposure provoked irreversible injuries of
cellular membranes in the senescent coleoptiles. The high level of membrane permeability during
recovery period and high CD level proved the adverse influence of HS. The results of our
research showed that the CD is an important indicator of cellular membrane injury because the
increase of the CD was connected with the increase of membrane permeability in the first leaves
and coleoptiles.
66
Short-term HS exposure did not provoke the increase of membrane permeability in the roots and
even significantly decreased membrane permeability in the roots at the late stage of seedling
development. The EL coincided with the CD level in the roots after short-term stress period. The
data of research showed that the CD level was similar to the level of control CD. The significant
increase in the EL was observed in the roots after long-term HS exposure. Besides, the increase
of the CD was observed in the roots after long-term HS as well.
In the previous research MDA was used as oxidative stress indicator, but changes of CD under
stress treatment, including HS, almost have not been studied. However, the results of our research
showed that CD level was an indicator of membrane permeability. Changes of membrane
permeability corresponded to the change of the CD level.
Qualitative and quantitative changes of total soluble proteins in the organs of wheat
seedlings under heat stress
Increased protein degradation is observed under HS in several plant species (He et al., 2005).
Qualitative changes of proteins were determined in the organs of etiolated wheat seedlings after
short- and long-term HS exposure at the early stage of seedling development while using SDS-
PAGE because SDS-soluble proteins are mainly membrane proteins (He et al., 2005).
SDS-PAGE profiles of the organs of wheat seedlings differed a lot after HS exposure. The
intensity of polypeptide bands of the first leaf increased after long-term HS exposure. Besides,
the appearance of new bands occurred, probably heat shock proteins (Hsp). The intensity of some
bands (85 – 40kDa) in the first leaf increased immediately after long-term HS. Significant
changes of polypeptides were determined in the range of 20 – 13kDa, in which a new band
(19,2kDa) immediately after long-term HS in the first leaf was observed. Probably, it is
connected with Hsp synthesis. The increased intensity of some protein bands and the appearance
of new bands were found in the leaves of other plant species under heat stress exposure (Nagesh
Babu, Devaraj, 2008).
The changes of electrophoretic activity of total soluble proteins were not detected in the
coleoptiles of etiolated wheat seedlings after HS. However, significant decrease in protein
amount, which was observed throughout the whole period of research, was found after long-term
HS exposure. Probably, protein degradation took place in the senescent coleoptiles and heat stress
exposure could not influence protein changes in the coleoptiles of wheat seedlings any more.
Two polypeptide bands (20,9kDa and 10,6kDa) with increased staining intensity were observed
in the roots of wheat seedlings. The band intensity decreased together with the increase of HS
67
duration. Probably, the protein synthesis in the plant roots depends not only from high
temperature level but also from stress duration. Besides, long-term HS exposure significantly
reduced the total amount of soluble proteins in the roots of wheat seedlings. Moderate high
temperature did not provoke changes of the total soluble proteins in the roots of wheat seedlings
(Bakalova et al., 2008). However, such a decrease in the amount of proteins was detected after
the lethal temperature (45°C) exposure (Карапец и др., 2007). According to our results the roots
were more sensitive to HS. This may be connected with the increase of protease activity in the
roots of wheat seedlings under heat stress. The protease activity was dependent not only on the
intensity of HS but also on HS duration and significantly increased after long-term exposure (He
et al., 2005).
Changes of electrophoretic activity of antioxidant enzymes in the organs of wheat seedlings
under heat stress
Antioxidant enzymes maintain membrane integrity of higher plants (Mittler, 2002). The change
of antioxidant balance is one of the unspecific reactions of stress (Веселова и др., 1993). HS
induced the oxidative damages and changed the electrophoretic activity of antioxidant enzymes
(CAT, SOD and POD).
There were three SOD isoforms in the first leaf. However, unchanged activities of SOD isoforms
were found after HS exposure. Probably, HS exposure decreased level of lipid peroxidation in the
first leaf at the early stage of seedling development. Thus, we can assume that the oxidative
processes in the first leaf after HS were similar to the control first leaf. There were four SOD
isoforms in the coleoptile with increased electrophoretic activity compared to the first leaf and
roots. Probably, the increase of SOD electrophoretic activity is the response to the increased
production of O2¯ in the senescent coleoptiles because HS intensified the oxidative processes in
them. Our results agree with short-term HS research in the isolated coleoptiles of wheat seedlings
(Колупаев, Карпец, 2008).
POD can act in the cells in different ways: on the one hand, POD can produce ROS but, on the
other hand, it catalyzes the oxidation of H2O2 (Minibayeva et al., 2009). The results of our
research agree with the research of heat stress and water deficit stress (Dat et al., 1998), in which
significant increase of POD activity and decrease of CAT activity were found. Our results
showed that POD and CAT electrophoretic activity in the first leaf increased after HS and higher
POD electrophoretic activity was found on the third day after treatment. This may be connected
68
with the recovery of balance between ROS and antioxidant system activity which results in the
formation of heat resistance.
Unchanged POD electrophoretic activity was found in the coleoptiles of wheat seedlings. The
increase of CAT electrophoretic activity and the appearance of a new CAT isoform were
observed after long-term HS. Previous research showed that the oxidative damages and
irreversible damages of membrane appeared as a result of the decrease of CAT and SOD activity
and significant increase of ROS and MDA level (Yin et al., 2008; Колупаев, Карпец, 2008). The
results of our research showed that increased CAT and POD electrophoretic activity in the
coleoptiles under HS was not evidence of decrease of oxidative processes because of the presence
of high level of the lipid peroxidation products in the coleoptile. Probably, long-term HS
exposure increased level of oxidative processes (increased MDA and CD level and increased
membrane permeability) in the senescent coleoptiles. As a result, even increased activity of
antioxidant enzymes could not overcome the injurious effect of HS.
The increased SOD and POD electrophoretic activity and decreased MDA level were found in
the roots immediately after short-term HS exposure. Probably, the increased SOD and POD
activity was connected with increased synthesis of heat resistant forms of enzymes. At the third
day after HS the increase of lipid peroxidation resulted in the decrease of SOD and POD
electrophoretic activity. Long-term HS exposure completely changed the electrophoretic activity
of SOD and POD isoform in the roots compared to short-term heat stress. CuZnSOD isoform is
H2O2-sensitive, therefore we can assume that excessive H2O2 level was able to cause the
inactivation of CuZnSOD isoform after long-term HS exposure. Our assumption confirmed the
decrease of POD electrophoretic activity and even the inactivation of two POD isoforms (POD3
and POD5) after long-term HS exposure. Significant increase of lipid peroxidation level in the
roots was not observed. Probably, POD in the roots fulfilled the oxidative, but not antioxidative,
function. In this case it can be explained why the decrease of POD electrophoretic activity did not
cause the increase of lipid peroxidation.
Changes of oxidative processes and antioxidant system in the organs of wheat seedlings in
the presence of CsA (1mg/l)
Cyclosporine A (CsA) is reversible inhibitor of mitochondrial permeability transition pore
(MPTP) opening. CsA prevents opening of MPTP and delays oxidative processes (Arpagaus et
al., 2002), therefore the influence of CsA on oxidative processes in etiolated wheat seedlings
under HS treatment at the early stage of seedling development was studied.
69
The CsA induced decrease of lipid peroxidation increased membrane stability of the first leaves
and roots, but membrane stability of the coleoptiles was similar to control. The decrease of
oxidative process intensity in the organs of wheat seedlings, which was grown in the presence of
CsA, showed that mitochondria of plant cells plays an important role in the induction of oxidative
stress.
Short-term and long-term HS exposure changed the influence of CsA on mitochondrial pores,
and, as a result, it changed oxidative processes in the organs of wheat seedlings. The presence of
CsA significantly decreased the EL in the first leaves and coleoptiles after the 15- and 30-
minutes’ HS exposure. But, 60-minutes’ and 24-h HS destroyed the inhibiting influence of CsA
immediately after stress exposure and the EL increased significantly. However, the first leaves
were able to decrease membrane permeability after high temperature induced oxidative stress,
unlike the coleoptiles. The EL increased in the coleoptiles till the heat-treated coleoptile level,
which were grown without presence of CsA. The data of our research showed that the complex of
CsA and short-term HS favourably affected the formation of heat resistance in the first leaf
because short-term HS and CsA complex provoked the inhibition of lipid peroxidation, increased
the electrophoretic activity of SOD and CAT and the appearance of the new protein band (12,9
kDa) was observed. Probably, it was associated with the inhibition of mitochondrial pore
opening. CsA presence significantly increased membrane stability and electrophoretic activity of
some protein bands (20,9kDa and 10,6kDa), and it decreased the MDA level in the roots after
short-term HS exposure. However, long-term HS exposure reduced the influence of CsA in the
roots.
On the one hand, the sensitivity of mitochondrial pore against influence of CsA could be organ-
specific. The results of our research showed that the presence of CsA significantly decreased lipid
peroxidation in roots and increased root membrane stability. The inhibition of oxidative processes
was observed in the first leaves in CsA presence during high temperature induced oxidative
stress. However, the presence of CsA intensified oxidative processes in the coleoptiles.
On the other hand, it could be connected not only with organ specificity but also with the stage of
seedling development. The powerful increase of oxidative processes showed that HS provoked
accelerated senescence of coleoptiles. Mitochondrial permeability transition pore can change its
properties according to stress exposure (Павловская и др., 2010). Probably, mitochondrial pores
lost their sensitivity against CsA during oxidative stress. Thus MPTP inhibitor CsA can exert a
stabilizing influence on membrane lipids of the first leaves and roots and inhibit degradation of
membrane lipids during short-term HS induced oxidative stress.
70
CONCLUSIONS
1. Changes of morpho-physiological parameters show that the organs of wheat seedlings lose
their recovery abilities after long-term heat stress exposure (42°C; 24 h) at both the early, and
the late stages of wheat seedling development which have been investigated, however, the
organs of wheat seedlings lose their recovery abilities after short-term heat stress only at the
late stage of seedling development.
2. Heat stress exposure decreases membrane lipid peroxidation in developing organs – the first
leaves.
3. The increase in cell membrane permeability of the organs of wheat seedlings has cyclic
character which corresponds to the increase of the level of lipid peroxidation product
(conjugated dienes) during the early ontogeny.
4. Heat stress induced increase in the conjugated dienes causes the increase in membrane
permeability in the organs of wheat seedlings, but the decrease in the conjugated diene level
causes the decrease in cellular membrane permeability, therefore the changes of the level of
conjugated dienes can be used as the indicator of stability of cell membranes.
5. Qualitative and quantitative changes of total soluble proteins under long-term heat stress
depend on stage of development of wheat seedling organs, i.e., the electrophoretic activity of
total soluble proteins increase in developing organs (the first leaves) and it do not change in
senescent organs (coleoptiles), however, total protein amount significantly decreases in the
coleoptiles.
6. Qualitative and quantitative changes of total soluble proteins in the roots depend on the
duration of heat stress exposure, i.e., the increase of the duration of heat stress exposure
decreases the electrophoretic activity and the amount of proteins.
7. Changes in electrophoretic activity of antioxidant ferments show that loss of some POD and
SOD isoforms in the roots and an appearance of new CAT isoform in the coleoptiles under
long-term heat stress can be connected with accumulation of reactive oxygen species under
long-term heat stress.
8. The presence of inhibitor of mitochondrial pore opening (CsA) stabilizes the membrane lipids
of the organs of wheat seedlings and decreases oxidative processes, which is induced by
short-term heat stress.
9. Long-term heat stress decreases the sensitivity of the inhibitor of mitochondrial pore opening
in the roots and senescent organs – coleoptiles, but it do not change the sensitivity of
mitochondrial pore against CsA in the developing organs – the first leaves.
71
REFERENCES/ LITERATŪRAS SARAKSTS
1. Aleksandrushkina N.I., Seredina A.V., Vanyushin B.F. 2009. Endonuclease activities in the
coleoptile and the first leaf of developing etiolated wheat seedlings. Russian J. Plant Phys.
56(2): 154-163.
2. Ali M.A., Abbas A., Niaz S., Zulkiffal M., Ali S. 2009. Morpho-physiological criteria for
drought tolerance in sorghum (Sorghum Bicolor) at seedling and post-anthesis stages. Int. J.
Agric. Biol., 11: 674–680.
3. Ali M.B., Hahn E. J., Paek K.Y. 2005. Effects of light intensities on antioxidant enzymes and
malondialdehyde content during short-term acclimatization on micro-propagated
Phalaenopsis plantlet. Environ. Exp. Botany. 54(2): 109–120.
4. Alves, A.A.C., Setter T.L. 2004. Response of cassava leaf area expansion to water deficit:
Cell proliferation, cell expansion and delayed development. Ann. Bot. (London) 94:605–613.
5. Anwar F., Jamil A., Iqbal S., Sheikh M.A. 2006. Antioxidant activity of various plant extracts
under ambient and accelerated storage of sunflower oil. Grasas y Aceites. 57 (2): 189-197.
6. Arpagaus S., Rawyler A., Braendle R. 2002. Occurrence and characteristics of the
mitochondrial permeability transition in plants. J. Biol. Chem. 277:1780–7.
7. Bakalova, S.N., Nedeva, D.Y., McKee J. 2008. Protein profiles in wheat seedlings subjected
to dehydration stress. Appl. Ecology Environ. Research. 6(2): 37-48.
8. Bengtsson, L., Climate change. Climate of the 21th century. Agric. For. Meteor., 72:3, 1994.
9. Bhattacharjee S., Mukherjee A.K. 2003. Implications of reactive oxygen species in heat shock
induced germination and early growth impairment in Amaranthus lividus L. Biol. Plantarum.
47 (4): 517-522
10. Bos, H.J., T. Tijani-Eniola, and P.C. Struik. 2000. Morphological analysis of leaf growth of
maize: Responses to temperature and light intensity. Neth. J. Agric. Sci. 48:181–198.
11. Çavusoglu K., Kabar K. 2010. Effects of hydrogen peroxide on the germination and early
seedling growth of barley under NaCl and high temperature stresses. EurAsian J. BioSci. 4:
70–79.
12. Dat J. F., Foyer C. H., Scott I. M. 1998. Changes in salicylic acid and antioxidants during
induced thermotolerance in mustard seedlings. Plant Physiol. 118: 1455–1461.
13. Ferguson D. L., Al-Khatib K., Guikema J. A., Paulsen G. M. 1993. Degradation of proteins
from thylakoid membranes in senescing leaves at high temperature. Plant Cell Envoron. 16:
421-428.
72
14. Goyal M., Asthir B. 2010. Polyamine catabolism influences antioxidative defense mechanism
in shoots and roots of five wheat genotypes under high temperature stress. Plant Growth
Regul. 60(1): 13-25.
15. Guo Z., Ou W., Lu S., Zhong Q. 2006. Differential responses of anti-oxidative system to
chilling and drought in four rice cultivars differing in sensitivity. Plant Physiol. Biochem.
44:828–36.
16. He Y., Liu X., Huang B. 2005. Changes in Protein Content, Protease Activity, and Amino
Acid Content Associated with Heat Injury in Creeping Bentgrass. J. Am. Soc. Hortic. Sci.
130(6): 842-847.
17. Huang B. 2006. Cellular Membranes in Stress Sensing and Regulation of Plant Adaptation to
Abiotic Stresses. In: (ed. Huang B.) Plant–Environment Interactions, Third Edition. NY:
Taylor & Francis Group, pp. 1-25.
18. Huang B. and Gao H. 2000. Growth and carbohydrate metabolism of creeping bentgrass
cultivars in response to increasing temperatures. Crop Sci. 40:1115–1120.
19. Ivanov S., Konstantinova T., Parvanova D., Todorova D., Djilianov D., Alexieva V. 2001.
Effect of high temperatures on the growth, free proline content and some antioxidants in
tobacco plants. Proc. Bulg. Acad. Sci. 54(7): 71–74.
20. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227 (5259): 680–685.
21. Lin J., Wang Y., Wang G. 2006. Salt stress-induced programmed cell death in tobacco
protoplasts is mediated by reactive oxygen species and mitochondrial permeability transition
pore status. J. Plant Physiol. 163: 731—739.
22. Lord C.E.N., Wertman J.N., Lane S., Gunawardena A. 2011. Do mitochondria play a role in
remodelling lace plant leaves during programmed cell death? BMC Plant Biol. 11:102,
doi:10.1186/1471-2229-11-102
23. Minibayeva F., Kolesnikov O., Chasov A., Beckett R.P., Lüthje S., Vylegzhanina N., Buck
F., Böttger M. 2009. Wound-induced apoplastic peroxidase activities: their roles in the
production and detoxification of reactive oxygen species. Plant Cell Environ. 32: 497-508.
24. Mittler R. 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci 7: 405–
410
25. Mo Y., Liang G., Shi W., Xie J. 2011. Metabolic responses of alfalfa (Medicago Sativa L.)
leaves to low and high temperature induced stresses. Af. J. Biotech. 10(7): 1117-1124.
73
26. Nagaraja H.S., Jassal R.S., Chakravarthi S., Thanikachalam P., Lee N., Anupama B.K. 2009.
Apigenin reduces cyclosporine A induced changes in lipid hydroperoxides and total
antioxidants in Sprague-Dawley rats. J. Chin. Med. 4(1): 26-31.
27. Paulsen G.M. 1994. High temperature responses of crop plants. In: Boote K.J., Bennett J.M.,
Sinclair T.R., Paulsen G.M. (eds.) Physiology and determination of crop yield. Madison, WI:
ASA, CSSA, SSA, 365–389.
28. Recknagel R. O., Ghoshal A. K. 1966. Lipoperoxidation of rat liver microsomal lipids by
carbon tetrachloride. Nature. Vol. 210: 1162–1163.
29. Shao H.B., L.Y. Chu, M.A. Shao, Jaleel C.A., Hong-Mei M. 2008. Higher plant antioxidants
and redox signaling under environmental stresses. Comp. Rend. Biol. 331: 433–441.
30. Turner N.C. 1981. Techniques and experimental approaches for the measurement of plant
water status. Plant Soil. 58: 339–366.
31. Worku M., Astatkie T. 2010. Dry matter partitioning and physiological responses of Coffea
arabica varieties to soil moisture deficit stress at the seedling stage in Southwest Ethiopia. Af.
J. Agricul. Res. 5(15): 2066-2072.
32. Wrigley C. 2006. Global Warming and Wheat Quality. Cereal Foods World. 51(1): 34-36.
33. Yin H., Chen Q., Yi M. 2008. Effects of short-term heat stress on oxidative damage and
responses of antioxidant system in Lilium longiflorum. Plant Growth Reg. 54(1): 45-54.
34. Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и при
патологии. – Киев: Наук. думка, 1997. – 420 с.
35. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. 1993. Стресс у растений.
Биофизический подход. М.: Изд-во Моск. ун-та, 144 с.
36. Владимиров Ю.А. 1989. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии
патологических процессов. Патол. физиол. и экспер. тер. 4: 7-19.
37. Карпец Ю.В. 2007. О возможных механизмах индуцирования теплоустойчивости
проростков пшеницы мягкой и сосны обыкновенной кратковременным действием
высокой температуры // Вісн. Харків. на-ціон. аграрн. ун-ту. Сер. Біологія. 3 (12): 63-70.
38. Колупаев Ю. Е., Карпец Ю. В. 2008. Окислительный стресс и состояние
антиоксидантной системы в колеоптилях пшеницы при действии пероксида водорода и
нагрева. Вісн. Харків. націон. аграрн. ун-ту. Сер. Біологія. 2 (17): 42-52
39. Павловская Н.С., Грабельных О.И., Побежимова Т.П., Королёва Н.А., Войников В.К.
2010. Чувствительность дыхания и набухания митохондрий злаков к соединениям,
изменяющим проницаемость мембран. Физиол. и биох.растений. 3(11): 119-132.