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Mécanismes de résistance aux antiparasitaires Mickaël Riou (PhD) Unité de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire (FACM) Nematodes Tenia s.p.p. Trypanosoma s.p.p. Plasmodium falciparum Eimeria s.p.p. Microfilaires

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Mécanismes de résistance aux antiparasitairesMickaël Riou (PhD)

Unité de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire (FACM)

Nematodes

Tenia s.p.p.

Trypanosoma s.p.p.Plasmodium falciparum

Eimeria s.p.p.

Microfilaires

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Objectifs pédagogiquesDifférencier les familles de parasites

Connaître les grandes familles d’antiparasitaires utilisées en médecine humaine et vétérinaire

Définir les principaux mécanismes de résistance aux antiparasitaires

Donner des exemples précis d’antiparasitaires et de leur mode d’action

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SommaireI - Définitions générales

II - Grandes Familles de Parasites

III – Les traitements antiparasitaires

IV - Mécanismes de résistance aux antiparasitaires– Définition et développement de la résistance– Mécanismes spécifiques et non spécifiques

V - Exemples : – un parasite animal : Haemonchus contortus– un parasite humain : Plasmodium falciparum

VI- Conclusions

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I – Définitions généralesParasitologie : L'étude morpho-biologique des parasites et des affections qu'ils

entraînent chez leurs hôtes et parfois chez leurs vecteurs, leurs hôtes. Elle correspond aussi à l’étude du diagnostic, de la prophylaxie et du traitement de ces affections.

Parasite : Etre vivant animal ou végétal qui pendant une partie ou la totalité de son existence vit aux dépens d’un autre organisme appelé hôte.

Parasitisme : Etat de spoliation des matières nutritives d’un parasite envers son hôte.

Hôte : Organisme vivant qui héberge un pathogène. Il peut être définitif (Toxoplasma gondii / félidés) ou intermédiaire (T. gondii / Homme).

Vecteur : Etre vivant qui sert d’hôte à un agent pathogène et qui est susceptible de la transmettre à un autre organisme (Anopheles pour le paludisme).

Réservoir : Organisme vivant ou niche écologique chez qui se perpétue l’agent pathogène et qui assure la survie de l’espèce.

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II – Grandes familles de parasites (1)

A) Protozoaires

B) Plathelminthes

C) Némathelminthes

D) Ectoparasites

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AmibiasesEntamoebahistolytica

TrichomonasesTrichomonas

vaginalis

ToxoplamoseToxoplasma

gondii

TrypanosomosesTrypanosoma

cruzi

GiardiasesGiardia

intestinalis

AProtozoaires

II – Grandes familles de parasites (2)

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BabesiosesBabesia canis

LeishmaniosesLeishmania sp

CryptosporidiosesCryptosporidium

parvum

PneumocystosesPneumocystis

carinii

Paludisme

AProtozoaires

II – Grandes familles de parasites (3)

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II – Grandes familles de parasites (4)

B) Plathelminthes– Cestodes

Teniases (Tenia saginata)

Echinococcoses (E. granulusus)

– TrematodesFascioloses (F. hepatica)

Schistosomiases (S. mansoni)

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II – Grandes familles de parasites (5)

C) Némathelminthes– Ascaridiose (Ascaris lumbricoides)– Oxyurose (Enterobius vermicularis)– Trichocéphalose (Trichuris trichiuria)– Nécatorose (Necator americanus)– Toxocarose (Toxocara canis)– Trichinose (Trichinella spiralis)– Wuchériose (Wuchereria bancrofti)– Loase (Loa loa)– Onchocercose (Onchocerca volvulus)

– Trichonstrongles (Haemonchus contortus)

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II – Grandes familles de parasites (6)

D) Ectoparasites– Poux (Pediculus humanus capitis )– Gales (Sarcoptes scabiei )– Tiques (Ixodes ricinus )– Punaises (Triatoma infestans )– Puces (Pulex irritans )– Myases– Sangsues (Limnatis nilotica )– Dermatoses

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III – Traitements antiparasitaires (1)

A) Familles d’antiparasitaires

B) Médicaments en médecine vétérinaire

Les benzimidazoles

Les lactones macrocycliques

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III – Traitements antiparasitaires (2)

A) Différentes familles Benzimidazoles et Pro-benzimidazolesLactones macrocycliques ImidazothiazolesTétrahydropyrimidinesAlcaloïdes naturellesOrganophosphorésSalicylanilidesSulfamides

Les antiparasitaires sont classés selon les auteursen fonction de leur mode d’action ou de leur site d’action (Prichard et al, 1980, Martin, 1997 et Martin et al 1997)

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III – Traitements antiparasitaires (3)Benzimidazoles

– Mintezol ® (Thiabendazole)– Zentel ® (Albendazole)– Panacur ® (Fenbendazole)

Lactones macrocycliques– Mectizan ® (Ivermectine)– Equimectrin ® (Ivermectine)

Imidazothiazoles– Metronidazole ® (Métronidazole)– Levinol ® (Levamisol)

Tétrahydropyrimidines– Catminth ® (Pyrantel)– Combantrin ® (Pyrantel)

Nemathelminthes

CestodesProtozoaires

NemathelminthesEctoparasites (Gales)

NemathelminthesAmibiases

Trichomonose

Nemathelminthes

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III – Traitements antiparasitaires (3)Alcaloïdes

– Nivaquine ® (Chloroquinine)– Surquina ® (Quinine)– Phyto Vermi+ ® (Mélange de plantes)

Organophosphorés– Scabecid ® (Lindane)– Prioderm ® (Malathion)– Diazol 50 ® (Diazinon)

Salicylanilides– Pas utiliser en médecine humaine (toxicité)– Flukiver ® (Closantel)

Sulfamides– Romet-30 ® + Antiparasitaires

(Sulfadiméthoxine/ormétoprime)– Bactrim ® (Cotrimoxazole)

Nemathelminthes

Protozoaires(essentiellement Plasmodium s.p.p)

EctoparasitesNémathelminthes

Némathelminthes

Trématodes

Protozoaires

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III – Traitements antiparasitaires (4)B) Benzimidazoles (BZ)

– Thiabendazole (TBZ, 1963) : premier anthelminthique (AH) utilisé contre les strongles gastro-intestinaux (SGI)

– Effet ovicide sur les œufs non embryonnés (Varady et Cobra, 1999)

–Structure de base : Noyau benzène et noyau imidazoleSubstitutions en position 2 et 5

TBZ

2

5

Noyau benzène

Noyau imidazole

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III – Traitements antiparasitaires (5)B) Benzimidazoles (suite)

– TBZ : n’est plus utilisé actuellement Peu efficace sur les stades larvaires Nombreux cas de résistance

– Nombreux autres dérivés (Albendazole, Fenbendazole…) : action sur les stades larvaires et les vers adultes

– Modes d’action (cibles intracellulaires)Fixation sur des complexes enzymatiques (succinate décarboxylase et fumarate réductase) : Privation des ressources énergétiques

Inhibition de la formation des microtubules du cytosquelette (capping) : Paralysie du vers et arrêt des divisions cellulaires

(Prichard, 1973 ; Lacey, 1988 et Martin et al , 1997)

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III – Traitements antiparasitaires (6)C) Les lactones macrocycliques

– Deux groupes de lactones macrocycliquesAvermectines (ivermectine et doramectine)Milbémycines (moxidectine)

- Effet sur les stades larvaires et les vers adultes

– Modes d’action : Agoniste du récepteur à l’acide gamma amino-butyrique (GABA) ou au glutamateForte libération de ces neuromédiateursHyperpolarisation axonale ( de la perméabilité membranaire aux ions chlorures)Paralysie flasque

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III – Traitements antiparasitaires (6)C) Les lactones macrocycliques suite

– Ivermectine (IVM)

– 1ère lactone macrocyclique utiliséecontre les SGI et les arthropodes(bovins)

– Utiliser dans l’hémisphère sud principalement

– Risque de toxicité élevée pour l’hôte et l’environnement

– Faiblement métabolisée et éliminée par les voies naturelles

(Tyrell et al, 2002 ; Freeman et al, 2003 et Waller, 1997)

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IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (1)

A) Définition de la résistance

B) Développement de la résistance

C) Mécanismes spécifiques

D) Mécanismes non spécifiques

E) Exemple : Les strongyloses animales

– Haemonchose

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IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (2)

A) Définition

L’O.M.S. a définie la résistance comme le développement de la capacité d’individus d’une population (isolat) à tolérer des doses de toxiques qui seraient naturellement mortelles pour la majorité des individus d’une population sensible de la même espèce.

Dose léthale 50 ou DL50

Facteur de résistance FR

FR = (DL50 de l’isolat testé / DL de l’isolat de référence)

FR < 2 : isolat sensible2 < FR < 5 : isolat tolérantFR > 5 : isolat résistant (Kelly et Hall, 1979)

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IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (3)

Différents types de résistance aux antiparasitaires

– Résistance simple : vis-à-vis d’un seul antiparasitaire

– Résistance de famille : + antiparasitaires d’une même famille ayant le même mode d’action

– Résistance croisée : + antiparasitaire de familles différentes ayant la même cible

– Résistance multiple : + antiparasitaires ayant des cibles différentes et appartenant à différentes familles

Réversion : retour de la valeur de la DL50 à celle d’un isolat sensible de la même espèce

– Difficile à obtenir : utilisation d’inhibiteurs des mécanismes cellulaires (vérapamil et lectines)

(Kelly et Hall, 1979 ; Kerboeuf et al, 1988 et 1999)

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IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (4)

B) Développement de la résistance

Le sous dosage volontaire ou involontaire (élevages)– Estimation du poids de l’animal incorrect– Coût des produits

Pression de sélection : répétition des traitements (++++ multirésistances)

« Dose and move » (en médecine vétérinaire) Cette pratique consiste à traiter des animaux avec des antiparasitaires et à

ensuite les placer sur un pâturage sain pour empêcher les réinfestations. Pb : si parasites résistants = infestation du pâturage sain et contamination des

animaux

Individus porteurs de parasites résistants dans une population sensible

(Kelly et Hall, 1979 ; Prichard et al, 1980 ; Jackson, 1993)

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IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (5)

C) Mécanismes spécifiques

– Mutations spontanées sur des allèles rares = modification de la cible de l’antiparasitaire

– Mutation ponctuelle suffit pour induire une résistance

Exemples :

– BZ : β-tubuline

– Imidazothiazoles : récepteur nicotinique à l’acétylcholine

– Avermectines : récepteur au glutamate

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IV – Mécanismes de résistance aux anx antiparasitaires (6)

D) Mécanismes non spécifiques

– Ce n’est pas une mutation de cible

– Elimination des xénobiotiques (antiparasitaires, antitumoraux, antibiotiques…)

– Absorption, rejet ou séquestration de ces substances

– Détoxication cellulaire :

Phase I : biotransformation (cytochrome P450)

Phase II : conjugaison (gluthation)

Phase III excrétion : efflux (MDR = Multidrug résistance)

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V – Exemples :

A) Les strongyloses animales

Strongles gastro-intestinaux appartenant à la famille des Trichostrongylidae et à la sous-famille des Haemonchinae

Parasite : Haemonchus contortus

Parasite de la caillette des petits ruminants (ovins et caprins)

Cosmopolites et grandes capacités d’adaptation

Très pathogènes, hématophages et très prolifiques

Nombreux cas de résistance multiple

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H. contortus :

Décrit en 1803 par Rudolphi, puis Cobb 189810 espècesClassification (Durette-Desset et Chabaud, 1993) :

– Phylum Némathelminthes– Classe Nématodes– Sous-classe Sercernentae– Ordre Strongylida– Sous-ordre Trichostrongilina– Super-Famille Trichostrongyloidea– Famille Trichostrongylidae– Sous-Famille Haemonchinae– Genre Haemonchus– Espèce H. contortus

Anatomie : pièce buccale et une bourse caudale caractéristique en Y chez le mâleHématophage

Présentation d’Haemonchus contortus

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Larves L4

Larves L1Larves L2

Environnement : Phase externe(facteurs : température et humidité)

Hôte : Phase interne

Prolificité

Ponte

Larves infestantes L3

Mâles et Femelles

Oeufs

Cycle biologique d ’H.contortus

Ingestion Elimination dans les fécès

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Animaux infestés : individus jeunes, individus âgés et immunodéprimés

Effet variable selon le taux d’infestation

Dégradation de l’état général : – Perte de poids– Laine de mauvaise qualité– Diarrhées – Anémie

Trois syndromes d’Haemonchose (Chermette, 1982) : – Haemonchose suraiguë (infestation massive)– Haemonchose aiguë (jeunes animaux ou mères au moment de la parturition)– Haemonchose chronique ( plus courante)

Pouvoir pathogène d’Haemonchus contortus

Mort de l’animal

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Répartition mondiale d’Haemonchus contortus

Peu Haemonchoses

Très important dans l’hémisphère sud(50 %)

Episodique et ponctuelle15 %

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La résistance chez H. contortus

Phénomènes de résistance impliquent :

(1) Mécanismes spécifiques : inhibition de la polymérisation de la β-tubuline par les benzimidazoles

(2) Mécanismes non spécifiques : en autres la "Multi-Drug Resistance" (MDR)

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Mécanismes spécifiques chez H. contortus

Exemple : Mutation de la β-tubuline dans la résistance aux BZ

– La mutation la plus connue et étudié en médecine vétérinaire

– 2 isotypes de β-tubuline chez H. contortus : Isotype 1 : gènes répartis sur 6 allèlesIsotype 2 : gènes répartis sur 12 allèles

– Une seule mutation du gène β-tubuline 1WT (phénylalanine / phénylalanine)Mutation 200 (tyrosine en phénylalanine) ++++++++Mutation 167 (tyrosine en phénylalanine)

– Pas de mutation du gène β-tubuline 2 mais une délétion totale du gène

(Jackson, 1993 ; Beeck et al, 1994 ; Kwa et al, 1994 ; Sylvestre et Cabaret, 2002)

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Mécanismes non spécifiques chez H. contortus

Exemple : Multidrug résistance aux BZ

– P-glycoprotéines ou P-gp

ABC transporteursUbiquistesDeux parties symétriques (duplication d’un gène ancestral en deux séquences homologues dont 43 % d’homologiePM de 170 kDa soit 1300 aa et une partie glucidique de 30 KDa12 domaines transmembranaires (TM)2 domaines ATPasiques (NBD)Deux sites hydrophiles en Cter et NterDeux sites de fixation R (Rhodamine 123) et H (Hoetsch 33342)Glycosylation sur la 1ère boucle extracallulaire

(Borst et al., 1993 ; Feller et al., 1995 ; Sharom, 1997 ; Shapiro et Ling, 1998 ; Di Pietro et al., 2002 et Gottesman et al., 2002)

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12 domaines transmembranaires 2 domaines de fixation à l’ATP ("nucleotide binding domains" ou NBD). Glycosylation

La P-glycoprotéine : P-gp

Domainestransmembranaires

1 32 54 7 86 12

NBD1

11109

NH2

COOH

NBD2

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Mécanismes non spécifiques chez H. contortus

Classification des MDR correspondant aux P-gp

– Chez l’hommeGènes homologues : MDR1 et MDR3MDR1 : MDR1a et MDR1b76 % d’homologie entre MDR1 et MDR3

– Chez la sourisGènes homologues : mdr1, mdr2 et mdr3

– Chez les nématodes14 isoformes de P-gp connues, mais la classification n’est pas claire

(Sangster, 1994 ; Sharom, 1997 ; Garrigues, 2002 ; Di Pietro et al., 2002 et Gottesman et al., 2002)

MDR1 = Résistance

MDR3 = Transport de lipides

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Identification des P-gp pour le stade œuf

broyattotal

d’oeufs

170 kDa

114 kDa

85 kDa

Westernblot

(C219)

170 kDa

114 kDa

la bande à 170 kDa est une P-gpla bande à 114 kDa :

soit une P-gp dégradée soit un autre transporteur ABC

Kerboeuf et al, 2003

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Œuf d’H. contortus

Blastomères

Bi-couche phospholipidiqueCouche chitineuse

Couche vitelline

Espace embryonnaire

1

1 Coque = 300-400 nm

Structure d’une membrane

Membranes plasmiques

Phospholipides

Protéines transmembranaires

Cholestérol

7-10 nm

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Présence de P-gp actives dans différentes zones de la coque des œufs

Localisation des P-gp dans les œufs

Contrôle isotypique

Int

Ext

UIC2

Coque (x21000)

Int

Ext Bi-couche phospholipidique

Couche chitineuseCouche vitelline

Microscopie électroniqueMarquage immunogold

Riou et al, 2005

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Activité des P-gp dans les œufs

Mesure du nombre de P-gp actives grâce à un anticorps monoclonal anti-Pgp humaine (UIC2 anti-MDR1)

Substrat de pompe : R123

IS IRKerboeuf et al, 2003

DL50 faible DL50 forte

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Modulation de l’activité des P-gp dans les œufs (1)

vsddfndModulation chimique de l’activité

des P-gp par le vérapamil sur l’efflux de TBZ

- Inhibition chimique

- Fixation de l’inhibiteur sur la P-gp

- Blocage de l’efflux au TBZ

Augmentation de la sensibilité au TBZ

Kerboeuf et al, 1999

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Modulation de l’activité des P-gpdans les œufs (2)

Modulation chimique de l’activité des P-gp par les lectines (Lens culinaris

lectin)

- Fixation de l’inhibiteur sur la partie glycosylée de la protéine

- Blocage de l’efflux au TBZ

Augmentation de la sensibilité au TBZ

La partie glycosylée de la P-gp est indispensable à la fonctionnalité de la

protéine

IR

Kerboeuf et al, 2002

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Modulation de l’activité des P-gpdans les œufs (3)

Modulation biologique de l’activité des P-gp

par le cholestérol

- changement de l’environnement membranaire (fluidité)

- Activation ou blocage des pompes

- Augmentation ou Diminution de l’efflux TBZ

La teneur en cholestérol de la membrane est primordiale pour le bon fonctionnement des pompes de type P-gp

Riou et al, 2003 IS

IR

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2

AP

?Membrane

plasmique*

Milieu

intracellulaire

Milieu

extracellulaire

ATP ADP + Pi

3

5

Entrée des anthelminthiques

Etat de repos des P-gp

Elimination des anthelminthiques

Schéma hypothétique du fonctionnementdes P-gp chez les nématodes

1 Diffusion passive 3 Activation des P-gp 5 Retour à un état initial

2 Influx actif lié aux P-gp 4 Efflux actif lié aux P-gp

NBDs

?

NBDs NBDs

?AP

AP ?

1AP

?

?

AP AP

AP

AP

4

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V – Exemples suite:B) Le paludisme : parasitose humaine

Le paludisme ( du latin paludis ou marais), appelé aussi malaria

Découverte en 1880 en Algérie par Charles Louis Alphonse Laveran, prix Nobel de médecine 1907

Homme et Chimpanzés

Parasitose due à un protozoaire (Plasmodium) transmis par la piqûre de la femelle l’anophèle

Infection des hématies et des cellules hépatiques

Fièvres intermittentes

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Cycle biologique de Plasmodium s.p.p.

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Homme

Erythrocytopathie parasitaire :

• accès fébriles violents et rythmés • destruction massive d'hématies (directe et indirecte) = anémie hémolytique et réaction du SRH (splénomégalie progressive)•biligénie pigmentaire, d'où subictère (et hépatomégalie de reprise•détérioration de l'état général

Paludismes récurrents

Pouvoir pathogène des Plasmodium

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Répartition mondiale

♦ Prévalence élevée de la chloriquino-résistance ou multi-résistance♦ Chloriquino-résistance présente♦ Pas de Plasmodium falciparum ou de chloriquino-résistance♦ Pas de paludisme

2007

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Chloroquine (Nivaquine*) 600 mg (2 comprimés à 0,30 g) par jour les 2 premiers jours, puis 300 mg (1 comprimé à 0,30 g) par jour les 3 jours suivants.

Primaquine* 15 mg (3 comprimés à 0,5 mg) par jour pendant 15 jours, soit du 6e au 20e jour inclus.

Les ACT (Artemisinin-based combination therapy : combinaisons à base d'artémisinine).

Traitements : (chimioresistance) :– La méfloquine comme le LARIAM® (Roche, 250 mg)– L’atovaquone-proguanil comme le MALARONE® (250 mg. atovaquone + 100 mg. proguanil chlorhydrate)

Traitements des Plasmodium

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Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium

Exemple : Pfmdr1 (Plasmodium falciparum multi-drugresistance)

– Pfmdr 1 (ou PfCRT)

ABC TransporteursParasiteChromosome 5PM de 162 kDa soit 1426 aa12 domaines transmembranaires (TM)2 domaines ATPasiques (NBD)Efflux des quinines et d’autres antimalariensAssociation avec les MDR cellulairesEfflux de la vacuole digestiveRésistance du à une mutation ponctuelle en positon Tyr 184 to Phe 184; Ser 1034 to Cys 1034; Asn 1042 to Asp 1042; and Asp 1246 to Tyr 1246

(codon 86)

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Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium

Modification du gène Pfmdr1 chez deux clones de P. falciparum

(Reed M.B. et al, 2000 dans letter to Nature)

2 allèles (7G8) de Pfmdr1 connus pour induire la résistance aux chloroquines

-Utilisation de vecteurs plasmidiques

- Deux isolats : 2 sauvages résistants et 4 mutants de Pfmdr1

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Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium

Effet des mutations du gène Pfmdr1 sur la croissance de P. falciparum

(Reed M.B. et al, 2000 dans letter to Nature)

- 5 antimalariens testés

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Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium

Effet des mutations du gène Pfmdr1 sur l’acculmulation des antimalariens chez P. falciparum

(Reed M.B. et al, 2000 dans letter to Nature)

Accumulation doublée chez 7G8-mdrD10/c1 et 7G8-mdrD10/c2 et corrélée à une double diminution de la IC50 de la chloroquine.

Pas de changement dans l'accumulation de la chloroquine chez les 2 D10-mdr7G8 / 1 ou D10-mdr7G8 / 3.

Changement de phénotype de résistance est traduite par une augmentation de l'accumulation de la méfloquine à la fois pour les D10-mdr7G8 / 1 et D10-mdr 7G8/3relative àD10-mdrD10

Conclusion :

Les mutations de certains aa de Pfmdr1 jouent un rôle important dans la résistance aux antimalariens

Pfmdr1 est un cible pour les traitements antimalariens

Il n’agit pas seul pour conférer la résistance

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V – ConclusionsLa résistance aux antiparasitaires

Problème de santé humaine et animale

Toutes des espèces de parasites

Dans les élevages : pertes économiques importantes

Deux types de mécanismes : spécifiques et non spécifiques(combinaison des deux)

Peu ou pas de production de nouveaux antiparasitaires

Recherche de molécules naturelles pour lutter contre ces parasites

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Rappels des objectifs pédagogiques

Connaître les familles de parasites

Connaître les grandes familles d’antiparasitaires utilisées en médecine humaine et vétérinaire

Définir les principaux mécanismes de résistance aux antiparasitaires

Donner des exemples précis d’antiparasitaires et leur mode d’action

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Liens utileshttp://coursdeparasitologie.ifrance.com

w3.rennes.inra.fr/.../nematodes/nematodes.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed (rechercher les articles scientifiques)

www.pasteur.mg/cyclepaludisme.html

kentsimmons.uwinnipeg.ca/16cm05/1116/16comeco.html

http://www.google.fr (images)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Accueil