trypanossomo vivax

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Trypanosoma evansi e Trypanosoma vivax Biologia, Diagnóstico e Controle

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  • Trypanosoma evansi eTrypanosoma vivax

    Biologia, Diagnstico eControle

  • Repblica Federativa do Brasil

    Fernando Henrique CardosoPresidente

    Ministrio da Agricultura e do Abastecimento

    Marcus Vincius Pratini de MoraesMinistro

    Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

    Conselho de Administrao

    Mrcio Fortes de AlmeidaPresidente

    Alberto Duque PortugalVice-Presidente

    Dietrich Gerhard QuastJos Honrio Accarini

    Srgio FaustoUrbano Campos Ribeiral

    Membros

    Diretoria-Executiva da Embrapa

    Alberto Duque PortugalDiretor-Presidente

    Bonifcio Hideyuki NakasuDante Daniel Giacomelli ScolariJos Roberto Rodrigues Peres

    Diretores-Executivos

    Embrapa Pantanal

    Emiko Kawakami de ResendeChefe-Geral

    Jos Anibal Comastri FilhoChefe-Adjunto de Administrao

    Aiesca Oliveira PellegrinChefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento

    Jos Robson Bezerra SerenoGerente da rea de Comunicao e Negcios

  • Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuriaEmbrapa Pantanal

    Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

    Trypanosoma evansie Trypanosoma vivax

    Biologia, Diagnstico e Controle

    Roberto Aguilar Machado Santos SilvaAndrew SeidlLaura Ramirez

    Alberto Martn Rivera Dvila

    Corumb, MS2002

  • Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:

    Embrapa PantanalRua 21 de Setembro, 1880, CEP 79320-900, Corumb, MSCaixa Postal 109Fone: (67) 233-2430Fax: (67) 233-1011Home page: www.cpap.embrapa.brEmail: [email protected]

    Comit de Publicaes:Presidente: Aiesca Oliveira PellegrinSecretrio Executivo: Marco Aurlio RottaMembros: Balbina Maria Arajo Soriano

    Evaldo Luis CardosoJos Robson Bezerra Sereno

    Secretria: Regina Clia Rachel dos SantosSupervisor editorial: Marco Aurlio RottaRevisora de texto: Mirane dos Santos CostaNormalizao Bibliogrfica: Romero de AmorimTratamento de ilustraes: Regina Clia R. dos SantosFoto da capa: Robeto Aguilar M.S. SilvaEditorao eletrnica: Regina Clia R. dos Santos

    1 edio1 impresso (2002): formato digital

    Todos os direitos reservados.A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou emparte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610).

    Catalogao na Publicao (CIP)Embrapa PantanalTrypanosoma evansi e Trypanosoma vivax: biologia, diagnstico e

    controle / Roberto Aguilar Machado Santos Silva ... [et al.]. Corumb: Embrapa Pantanal, 2002.

    141 p. : il. ; 22 cm. ISBN:? 1.Trypanosoma evansi - Biologia - Diagnstico. 2.

    Trypanosoma vivax Biologia - Diagnstico. I.Silva, RobertoAguilar Machado Santos. II. Seidl, Andrew. III. Ramirez, Laura.IV. Dvila, Alberto Martin Rivera. V.Ttulo.

    636.086962 (21 ed) Embrapa 2002

  • Autores

    Roberto Aguilar Machado Santos SilvaMdico Veterinrio, M.Sc. em Patologia AnimalPesquisador da Embrapa Pantanal,Rua 21 de setembro, 1880, Caixa Postal 109CEP 79320-900, Corumb, MSTelefone (67) [email protected]

    Andrew SeidlDepartment of Agricultural and Resources EconomicsColorado State UniversityFort Collins, Colorado 80523-1172Estados Unidos da Amrica

    Laura RamirezBilogaAlameda Cordolina, 571 -79333-082 Corumb, MS

    Alberto Martn Rivera DvilaDepartamento de Bioqumica e Biologia MolecularInstituto Oswaldo Cruz, FiocruzAv. Brasil 4365Rio de Janeiro, RJCEP 21045-900Internet: http://www.darwin.fiocruz.brEmail: [email protected]

  • Os autores agradecem a Eliney Gaertner pela confeco dos desenhos dos

    tripanosomas. Tambm agradecemos o auxlio de Ernande Ravaglia e Maria

    Davina dos Santos.

  • Apresentao

    A tripanosomose animal constitui um serio problema sanitrio na maioriados paises tropicais onde ela ocorre sendo muitas vezes necessrio autilizao de drogas para o seu controle. Na Amrica do Sul, Central eCaribe ela causa significante prejuzo a industria pecuria. A tripanosomeeqina, causada pelo protozorio Trypanosoma evansi uma doenasecularmente conhecida como Mal de Cadeiras no Pantanal Matogrossensee outras reas inundveis do Brasil e Amrica Latina. Este protozorio tevesua origem no continente africano e foi introduzida nas Amricas pelosprimeiros colonizadores europeus. Desde ento tem causado inmerossurtos com muitas mortes de eqinos, resultando em elevados prejuzos aossistemas pecurios extensivos que dependem do cavalo para o seu manejo.A tripanosomose bovina, causada pelo Trypanosoma vivax, tambm deorigem africana, foi introduzida nas Amricas no sculo 19 porcolonizadores europeus. Sua introduo gerou muita preocupao dosprodutores e defesa sanitria animal em diversos paises do continente SulAmericano e ilhas do Caribe. O impacto econmico de sua ocorrncia aindaesta em estudo, bem como sobre a sua epizootiologia.

    Esta publicao veio suprir uma lacuna representada pela falta deinformaes, principalmente relacionada a epizootiologia dastripanosomoses bovina e eqina, no Pantanal e reas midas da Bolvia.Esta obra resultou do esforo de varias instituies que dedicaram-se aoestudos desses parasitas.

    Esperamos que esse trabalho venha colaborar para que nossas pesquisas emtodos de controle venham contribuir para reduzir as perdas econmicasdecorrentes destas enfermidades.

    Emiko Kawakami de ResendeChefe Geral da Embrapa Pantanal

  • Prefcio

    Esta publicao representa o trabalho de pesquisa de mais dez anos,milhares de contatos com pesquisadores do Brasil e exterior, duasconferncias internacionais virtuais e muitas viagens de investigao pelointerior do Pantanal e da Bolvia. Muitas das informaes contidas no soencontradas em livros convencionais, pois elas resultaram das experinciasvivenciadas pelos autores e de inmeras trocas de correspondncias ediscusses via internet com especialistas no assunto. Esta publicaoprocurou fornecer informaes sobre a biologia, epizootiologia e controledas tripanosomoses bovinas e eqinas no Pantanal brasileiro e reas midasda Bolvia levantadas pelos autores e outros que tambm desenvolverampesquisas na regio.

    Agradecemos a todos aqueles que contriburam na obteno dasinformaes no campo e no laboratrio em especial a Ernandes Ravaglia,Maria Davina dos Santos e Francisco Rodrigues (Chiquinho). Aos colegasveterinrios Dr. Carlos Sahib, Mario S. J. Ferreira e Eduardo (Agropan) pelosinmeros surtos que ajudaram a investigar; aos colegas bolivianos doColgio de Medico Veterinrios de Santa Cruz de la Sierra, a Federacin deGanaderos de Santa Cruz de la Sierra (FEGASACRUZ) e do Laboratorio deInvestigacin y Diagnstico Veterinrio (LIDIVET). Tambm expressamos onosso reconhecimento e gratido as colegas Dra Aiesca Pellegrin peloincentivo nas horas mais difceis, a Regina Clia Raquel pela infindvelpacincia na organizao do manuscrito e da publicao, a Eliney Gaertnerpelas ilustraes e ao Dr. Roy Melendez pelos esfregaos de T. vivax quederam origem ilustrao da capa.

    Por fim somos muito gratos aos Diretores e Colegas da Embrapa Pantanalque pela amizade e carinho com que me receberam e me ensinaram teramor por essa terra.

    Roberto Aguilar Machado Santos SilvaPesquisador

  • xvii

    Sumrio

    Introduo....................................................................................... 19

    Objetivo.......................................................................................... 22

    1. Tripanosomoses ........................................................................... 222. Taxonomia .................................................................................. 233. Morfologia ................................................................................... 244. Ciclo vital .................................................................................... 245. Terminologia utilizada para os tripanosomas baseada no Trypanosoma brucei..................................................................................................... 286. Manuteno dos Tripanosomas ....................................................... 317. Variao molecular em Tripanosomas ............................................... 398. Ecologia e sociologia da variao antignica....................................... 449. Gentica de populaes de Tripanosomas.......................................... 4710. Diagnstico................................................................................ 5011. Caracterizao molecular .............................................................. 7112. Mtodos de controle.................................................................... 8813. Resistncia drogas.................................................................... 9314. Avaliao do uso do tratamento profiltico estratgico ou curativo....... 9615. Quimioterapia da Tripanosomose por Trypanosoma evansi (tratamentocurativo) ......................................................................................... 9716. Quimioterapia da Tripanosomose por Trypanosoma vivax (tratamentocurativo) .........................................................................................9917. Controle estratgico do Trypanosoma evansi atravs do uso de drogastripanocidas.....................................................................................10018. Controle estratgico do Trypanosoma vivax atravs do uso de drogastripanocidas.....................................................................................10019. Comparao do Isometamidium e Brometo de Homidium como drogaprofiltica........................................................................................10120. Mecanismos experimentais de liberao lenta contendo Brometo deHomidium e Isometamidium................................................................10121. Anlise econmica ......................................................................10722. Controle dos vetores....................................................................11423. Controle atravs do uso de inseticidas ............................................11624. Piretroides .................................................................................11825. Utilizao de armadilhas impregnadas com inseticidas........................122

    Referncias bibliogrficas ...................................................................123Anexos...........................................................................................137

  • xvii

    Lista de Figuras

    1. Principais organelas do tripanosoma. C: Cinetoplasto; N:Ncleo;F: Flagelo. (Trypanosoma vivax) ................................................. 25

    2. Multiplicao na corrente circulatria de tripanosomas.................... 25

    3. Medidas dos tripanosomas. L: Comprimento total (incluindo oflagelo livre); PK: Distncia do final da extremidade posterior aocinetoplasto; KN: do cinetoplasto ao meio do ncleo; PN: dofinal da extremidade posterior ao meio do ncleo; NA: do meiodo ncleo ao final da extremidade anterior; F: comprimento doflagelo livre; K: Cinetoplasto. Baseado em Hoare (1972).Trypanosoma vivax : forma tripomastigota em sangue de bovino(surto ocorrido no Pantanal do Pocon, 1995)............................... 50

    4. Trypanosoma vivax encontrado no sangue de bovinosnaturalmente infectados no Pantanal de Pocon, MT, Brasil............. 52

    5. Trypanosoma evansi encontrado no sangue de cavalosnaturalmente infectados no Pantanal da Nhecolndia, MS, Brasil...........52

    6. Distribuio estacional de tabandeos coletados em cavalos noPantanal, Brasil, de junho/92 a maio/93 ...................................... 78

    7. Bovinos do departamento de Santa Cruz de la Sierraencontrados infectados com Trypanosoma vivax em 1996.............. 84

    8. Localizao dos surtos de Trypanosoma vivax na Bolvia (Mapa1 e 2) no departamento de Santa Cruz de la Sierra (Mapa 3). 1:Provncias de Nuflo de Chavez e Guarayos; 2: Provncia deVelasco; 3. Provncia de Chiquitos; 4. Provncia de HermanBush ..................................................................................... 86

    9. Localizao dos surtos de Trypanosoma vivax no Pantanal.Mapa 1: Localizao do Estado do Mato Grosso do Sul; Mapa 2:Sub-regies do Pantanal e localizao dos surtos........................... 87

  • xvii

    Lista de Tabelas

    1. Medidas biomtricas (m) do Trypanosoma vivax encontrado naAmrica Latina........................................................................ 53

    2. Medidas biomtricas (m) do Trypanosoma evansi encontradona Amrica do Sul e ndia ......................................................... 55

    3. Iniciadores especficos para a deteco de tripanosomasSalivaria................................................................................. 66

    4. Compostos quimioteraputicos e quimioprofilticos existentesno mercado internacional, usados para a tripanosomose animal(Peregrine, 1994) .................................................................... 90

    5. Produtos usados no tratamento das tripanosomoses porTrypanosoma evansi e Trypanosoma vivax disponveis nomercado brasileiro ................................................................... 91

    6. Dosagem recomendada pelo fabricante para a aplicao doTrypamidium..................................................................................103

    7. Dosagem recomendada pelo fabricante para a aplicao doCymelarsan. ........................................................................ 105

    8. Dosagem recomendada pelo fabricante para a aplicao doNovidium ............................................................................ 106

    9. Dosagem recomendada pelo fabricante para a aplicao doEthidium .............................................................................. 107

    10. Caractersticas da fazenda usada no exemplo .............................. 109

    11. Taxa anual esperada de infeco e perdas de animais ................... 109

    12. Custo anual esperado do tratamento (em R$). ............................. 111

    13. Custo anual esperado das alternativas estratgicas sob riscovarivel ................................................................................ 112

    14. Investimento anual esperado para a razo do retorno daalternativa estratgica ............................................................. 113

  • xvii

    Lista de Anexos

    I. Solues................................................................................ 137

    II. Lista dos fornecedores de drogas contra a Tripanosomose .............. 139

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

    19

    Introduo

    As doenas parasitrias tm atormentado o homem e seus animaisdomsticos desde os tempos mais remotos. Hoje no mundo muitasnaes tm controlado essas doenas dentro de suas fronteiras, pormos mesmos parasitas continuam causando mortes entre os pases menosdesenvolvidos. Freqentemente um ciclo vicioso estabelecido: umaeconomia deficiente impede que se produza educao e medidassanitrias eficientes e isto torna um povo continuamente susceptvel ainfeces parasitrias. A morbidade e a mortalidade resultante dasdoenas causadas por protozorios representam ainda hoje umformidvel desafio pesquisa cientfica e aos programas de sadepblica e animal.

    A imensa biodiversidade do planeta no igualmente distribuda em suasuperfcie. Sabe-se que cerca de 60% de toda a biodiversidade biolgicase encontra em apenas 1,44% da superfcie da terra, e nessa pequenarea se encontram 44% das espcies de plantas vasculares e 35% dosvertebrados no peixes. Os trpicos representam hoje as maioresreservas mundiais de biodiversidade. A biodiversidade alm derepresentar um recurso gentico de valor inestimvel, tambm contribuipara a ocorrncia de grande nmero de doenas. Os ambientes tropicais,onde geralmente o calor e a umidade so elevados, propiciam meiosideais ao desenvolvimento de microorganismos patognicos e seusvetores.

    Segundo Perry et al (2002), as doenas de animais continuam afetando aproduo pecuria, desenvolvimento agropecurio, o bem estar humano e aluta contra a pobreza de diferentes maneiras em muitas regies dos paisesem desenvolvimento. Algumas dessas doenas afetam as regies maispobres, afetando a populao humana, ocasionando mortes e inclusiveincapacidade e sofrimento, criando assim uma barreira para o escape dapobreza. Segundo os mesmos autores, as tripanosomoses se encontramlocalizadas na lista das 20 doenas mais importantes de acordo com seuimpacto na pobreza. Febre aftosa, antrax, ectoparasitas, fasciolasis entreoutras doenas se encontram includas na mesma lista. Adicionalmente astripanosomoses se encontram entre as 10 zoonoses mais importantes junto

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

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    com o antrax, tuberculose bovina, bruceloses, cistocercose, leptospirose,entre outros.

    As tripanosomoses so causadas por espcies do gnero Trypanosomaque pertencem ao filo Euglenozoa, ordem Kinetoplastida. Por sua vez,esta ordem se encontra dividida em 2 sub-ordens: Bodonina eTrypanosomatina. A caracterstica principal destes protozorios apresena da organela chamada cinetoplasto localizada na base doflagelo, que contm o DNA mitocndrial (Vickerman 1976). Existemainda outras duas caractersticas nicas encontradas nos Kinetoplastidaexaminados at agora: a compartimentalizao da gliclise dentro de ummicrocorpo chamado glicosoma (Michels & Hannaert 1994), e otrans-splicing de uma seqncia curta e conservada de RNA chamadaspliced leader ou mini-exon.

    A subordem Trypanosomatina contm uma nica famlia,Trypanosomatidae, que por sua vez contm oito gneros (Trypanosoma,Leishmania, Endotrypanum, Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas,Herpetomonas e Phytomonas).

    Os tripanosomas patognicos de importncia pecuria se encontram todoslocalizados na seo Salivaria, dos quais apenas Trypanosoma vivax, T.equiperdum e T. evansi podem ser encontrados na Amrica do Sul.

    Enquanto a taxonomia destes protozorios flagelados tem sido cada vezmais acurada nos ltimos tempos, a origem e evoluo dos mesmos soainda pouco conhecidas. Na falta de registros fsseis, a evoluo dosKinetoplastida tem sido bastante especulativa. Entretanto, com o usodas ferramentas modernas e informaes genticas, atualmente est secomeando a inferir quais poderiam ter sido seus ancestrais.

    Um dos primeiros a especular sobre as relaes filogenticas dostripanosomas foi Leger (1904), sugerindo que seus ancestrais teriamsido parasitas monogenticos de insetos no hematfagos. Quasesessenta anos mais tarde, Baker (1963) sugeriu uma filogenia na qualum tripanosomatdeo ancestral deu origem a dois grupos: o primeirocontendo linhagens transmitidas por insetos (tripanosomas de crocodilos,aves e mamferos, excluindo o grupo dos Salivaria), e o segundocontendo espcies transmitidas por sanguessugas (tripanosomas depeixes, anfbios e rpteis aquticos). Os tripanosomas africanos teriamento divergido da linhagem dos vertebrados aquticos transmitidos pela

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

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    sanguessuga. Esta hiptese foi compartilhada por Woo (1970).Adicionalmente, Hoare (1972) props que a seo Salivaria teriaoriginado recentemente a partir dos tripanosomas Stercoraria.

    Uma segunda hiptese para a origem dos Kinetoplastida foi propostaoriginalmente por Minchin (1908), que sugeriu que os ancestrais dostripanosomatdeos teriam parasitado inicialmente o intestino de antigosvertebrados aquticos. O sangue teria sido invadido logo aps esubseqentemente, estes tripanosomatdeos teriam passado para assanguessugas e insetos hematfagos. Estes, por sua vez, teriamespalhado os parasitas nos diferentes grupos de vertebrados, terrestres eaquticos. Esta hiptese recebeu mais tarde apoio de diferentes grupos(Lavier 1943, Wallace 1966, Lainson & Shaw 1987)

    Anlises preliminares da filogenia molecular dos Kinetoplastida, usandogenes ribossomais (rDNA) sugeriram que a origem dos tripanosomas eraparafiltica (Marche et al. 1995, Berchthold et al. 1994). Por outro lado, ascomparaes dos aminocidos dos genes de gliceraldedo-3-fosfatodesidrogenase (Wiemer et al., 1995) ou seqncias que codificam paraoutras protenas (Hashimoto et al. 1995, Alvarez et al. 1996, Haag et al.1998) sugeriram monofilia das sees Salivaria e Stercoraria.Recentemente, um estudo completo envolvendo um maior nmero degneros dos Kinetoplastida concordou com a monofilia dos tripanosomas(Stevens & Gibson 1999, Wright et al. 1999). As estimativas dadivergncia dos Salivaria so de 335 (Haag et al. 1998) e 100 milhes deanos (Stevens & Gibson 1999), o que colocaria a origem destestripanosomas na poca em que os continentes estavam juntos (Pangea) ouna poca em que a frica se separou dos outros continentes,respectivamente. Finalmente, Overath et al. (2001) sugeriram que osSalivaria apareceram originalmente em rpteis, os vertebrados dominantesna poca em que estes tripanosomas divergiram. A transferncia de rpteispara mamferos teria acontecido quando as moscas ts-ts ou seusancestrais surgiram.

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

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    Objetivo

    A escassez de informaes sobre as tripanosomoses de importnciaeconmica nas Amricas preocupante pois com a globalizao daeconomia e a formao de blocos econmicos como o Mercosul atendncia ocorrer uma maior comercializao de animais entre os pasessul-americanos e com isso uma maior expanso dessas enfermidades. Estapublicao tem por objetivo suprir a ausncia de livros tcnicos-cientficossobre tripanosomose animal no mercado editorial de lngua portuguesa.

    1. Tripanosomoses

    Segundo Finelle (1974) a tripanosomose conduz a uma considervel sub-explorao dos recursos naturais e um baixo nvel de produo animal. Omesmo autor apontou conseqncias diretas e indiretas datripanosomose animal. As diretas so representadas por : 1- Perdaseconmicas, que compreendem a mortalidade e a doena a qual semanifesta por emaciao, retardo do crescimento, aborto, esterilidadetemporria e leses orgnicas; 2- Gastos com o seu controle devido acustos de diagnsticos, tratamento de animais infectados, profilaxia epesquisa sobre o controle da doena. As conseqncias indiretasafetam: 1- A sade humana pela diminuio na produo de carne e leiteque causam deficincias proticas, as quais so particularmente danosass crianas; 2- A agricultura devido a perda de animais de trao; 3- Aproduo pecuria pois a tripanosomose limita a possibilidade daintroduo de reprodutores de raas exticas nas reas de produopecuria e tambm impedem que algumas reas sejam utilizadas o anotodo devido s variaes sazonais na incidncia da doena; e 4- Aeconomia, por causa do dficit na produo de carne e leite que fazemcom que as regies ou os pases sejam obrigados a importar essesprodutos.

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

    23

    2. Taxonomia

    Todos os hemoflagelados pertencem a famlia Trypanosomatidae.Baseado no modo de transmisso, Hoare (1972) e Losos (1986)concordaram na diviso do gnero Trypanosoma em duas sees:Salivaria e Stercoraria. Os tripanosomas da seo Salivaria soaqueles transmitidos atravs das glndulas salivares (inoculativa), e osStercoraria aqueles que so transmitidos por meio das fezes dos insetosvetores (contaminativa). Nessas revises, esses autores concordaramtambm na diviso da seo Salivaria em quatro subgneros (Dutonella,Pycnomonas, Nannomonas e Trypanozoon) e a seo Stercoraria em trssubgneros (Herpetosoma, Megatrypanum e Schizotrypanum) . Losos(1986) sugere uma classificao prtica dos tripanosomas deimportncia mdica e veterinria, como se segue:

    Salivaria

    Subgnero DuttonellaEspcie: Trypanosoma vivaxSubgnero NannomonasEspcies: Trypanosoma congolense, T. simiaeSubgnero TrypanozoonEspcies: Trypanosoma brucei, T. rhodesiense, T. gambiense, T. evansie T. equiperdumSubgnero: PycnomonasEspcie: Trypanosoma suis

    Stercoraria

    Subgnero SchizotrypanumEspcie: Trypanosoma cruzi

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

    24

    3. Morfologia

    3.1. Aparncia Externa

    As formas tripomastigotas encontradas na corrente sangnea sobasicamente lancetadas, o corpo alongado e achatado. Ao cortetransversal apresenta-se elptico ou oval e suas extremidades soafiladas. A extremidade pela qual avana durante a locomoo costumeiramente descrita como anterior final. Ela tipicamente terminaem um fino ponto, enquanto que o final da extremidade posterior variana forma, mas geralmente mais larga, afilando mais abruptamente outerminando em uma forma rombuda ou ainda apresentando a pontaarredondada.

    3.2. Citologia

    As principais organelas de um tripanosoma so o ncleo, o cinetoplasto,o sistema mastigonte representado pelo corpo basal e o flagelo.

    3. 2.1. Multiplicao

    Em todos os casos a diviso dos tripanosomas se processa em umaseqncia definitiva envolvendo sucessivamente o corpo basal, flagelo,cinetoplasto e ncleo, culminando na clivagem do citoplasma.

    4. Ciclo vital

    Membros do gnero Trypanosoma so parasitas digenticos, aquelescujo ciclo vital envolve dois hospedeiros. Um destes, um animalvertebrado o hospedeiro final, enquanto diversos invertebradoshematfagos representam os hospedeiros intermedirios ou vetores, osquais transmitem a infeco para novos hospedeiros vertebrados. Naliteratura, alguns autores preferem usar o termo inoculadoresmecnicos em vez de vetores para se referir a transmisso mecnicade tripanosomas.

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

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    Fig. 1. Principais organelas do tripanosoma. C: Cinetoplasto; N:Ncleo;F: Flagelo. (Trypanosoma vivax).

    Fig. 2. Multiplicao na corrente circulatria de tripanosomas.

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

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    No caso de tripanosomas de mamferos os vetores mais conhecidos soinsetos hematfagos, embora outros invertebrados hematfagos podemtambm atuar como vetores. As formas sangneas dos tripanosomasso tomadas pelo inseto durante repasto sangneo. Aps, ento, ostripanosomas empreendem um ciclo de desenvolvimento no hospedeirointermedirio, culminando na produo de formas infectivas especiais,conhecidas como tripanosomas metacclicos ou metatripanosomas. Ostripanosomas metacclicos so transmitidos para um novo hospedeiropor vrios mtodos, de acordo com a sua localizao no vetor.

    O sucesso na transmisso pode normalmente ser efetuada somente apso parasita ter completado seu ciclo de desenvolvimento no hospedeirointermedirio e produzido os metatripanosomas. Os estgiosintermedirios no vetor no so infectivos para o hospedeiro vertebrado.No caso da transmisso mecnica, as formas sangneas dostripanosomas so transferidas diretamente de um mamfero, para outro,por insetos hematfagos (p.ex. espcies de Tabanidae e Somoxydae)(Fig. 2) ou artificialmente por agulhas contaminadas com sangueinfectado. No caso da transmisso mecnica com agulhas, pode-se dizertambm que uma infeco com ao de veculo. Em contraste com atransmisso cclica, que pode ser to longa quanto for a vida do vetor, ahabilidade para transmitir os tripanosomas mecanicamente de curtadurao (geralmente mensuradas em minutos), dependendo dasobrevivncia dos parasitas nas peas bucais do inseto.

    4.1. Estgios de Desenvolvimento

    No curso de seu ciclo vital digentico os tripanosomas passam por vriosestgios de desenvolvimento, os quais tm sido definidos por termosderivados do gnero dos Trypanosomatidae dos quais eles representamas formas mais tpicas.

    A principal caracterstica distinguindo os estgios morfolgicos dosTrypanosomatidae a disposio do flagelo no corpo, como determinadopelo seu ponto de partida (indicado pela posio do Cinetoplasto), seucurso e ponto de emergncia de sua poro distal livre. Desde ento estacaracterstica "flagelar" serviu como base para a classificao do estgioem questo. A raiz - mastigota um termo grego que significa chicote.

  • Tripanosoma evansi e Trypanosoma vivax: Biologia, Diagnstico eControle

    27

    A terminologia abaixo citada utilizada por Hoare (1972) emundialmente aceita :

    (a) AMASTIGOTA. Estgio "Leishmanial", representado por formasarredondadas ou alongada, sem flagelo livre.

    (b) ESFEROMASTIGOTA. Arredondada ("Leishmanial") possuindo umflagelo livre; representando um estgio transitrio entre as formasamastigota e mastigotas.

    (c) PROMASTIGOTA. Estgio "Leptomonada", representado por formasalongadas com um cinetoplasto antenuclear. Flagelo aparecendo prximoao cinetoplasto e emergindo no final da extremidade anterior do corpo.

    (d) OPISTOMASTIGOTA. Estgio "Tripanomrfico", representado(somente no gnero Herpetomonas) por formas alongadas comcinetoplasto ps-nuclear. Flagelo aparecendo prximo ao cinetoplasto,ento passando atravs do corpo e emergindo no final da extremidadeanterior.

    (e) EPIMASTIGOTA. Estgio "Critidial", representado por formasalongadas com cinetoplasto justanuclear. O flagelo aparece prximo aocinetoplasto e emerge ao longo do corpo para correr ao longo da suasuperfcie ou ao longo da membrana ondulante.

    (f) TRIPOMASTIGOTA. Verdadeiro estgio "Tripanosoma", representadopor formas alongadas com cinetoplasto ps-nuclear. O flagelo surgeprximo ao cinetoplasto e emerge ao lado do corpo para correr ao longoda sua superfcie ou membrana ondulante.

    (g) COANOMASTIGOTA. Estgio peculiar, geralmente com cinetoplastoantenuclear. O flagelo surgindo de um reservatrio com formato de funile emergindo no final da extremidade anterior do corpo (restrito ao gneroCrithidia).

    4.2. Ciclo no Mamfero

    O desenvolvimento dos tripanosomas nos hospedeiros mamferos relativamente simples. iniciado pela introduo de metatripanosomaspelo inseto hospedeiro, ou passivamente pela contaminao demembranas mucosas do hospedeiro mamfero ou pele (no caso deespcies Stercoraria como o T. cruzi) ou ativamente pela inoculao

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    atravs de uma picada (no caso de espcies Salivaria, como por exemploT. evansi e T. vivax ).

    4.3. Seo Salivaria

    A reproduo desta seo normalmente toma lugar na correntecirculatria por fisso binria no estgio tripomastigota.

    Os tripanosomas da seo Salivaria tambm so capazes de invadirtecidos dos seus hospedeiros, sendo regular a ocorrncia de amastigotase outros estgios.

    4.4. Ciclo No Inseto

    Os tripanosomas Salivaria T. evansi e T. vivax encontrados na Amricado Sul so apenas transmitidos mecanicamente. Devido a perda dahabilidade de se desenvolver ciclicamente, T. evansi tambmtransmitido mecanicamente na frica. O T. vivax africano transmitidociclicamente pelas moscas tse-tse. As formas sanguneas detripanosomas do hospedeiro infectado so ingeridas pela tse-tse elocalizadas no esfago e faringe (Moloo & Gray, 1989) onde setransformam em formas epimastigotas. Depois de 24 horas as formasepimastigotas migram em direo ao canal alimentar onde se multiplicamintensivamente e se localizam nas paredes do labro. As formasepimastigotas migram depois em direo hipofaringe onde setransformam em formas tripomastigotas, e depois em formasinfectantes, tambm chamadas metatripanosomas.

    5. Terminologia utilizada para os tripanosomas baseada noTrypanosoma brucei (Who, 1986)

    5.1 Termos associados Taxa

    Espcies - Um conjunto de organismos que podem ser distinguidos deoutras espcies por um ou mais caracteres morfolgicos estveis e/oudescontnuos.

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    Sub-espcies - Conjuntos de organismos dentro de uma espcie que nopodem ser separados um do outro por caracteres morfolgicos, mas simpor outros caracteres estveis. Nota: Quando o material definido aonvel de sub-espcie, um tipo de material vivo poderia ser depositadonuma chamada coleo estabilizada para futura referncia.

    5.2 Termos sem implicaes na caracterizao

    Os seguintes termos no esto implicados na caracterizao, pormalguns deles podem tambm ser usados para denotar alguns materiaiscaracterizados.

    Clone - Os tripanosomas derivados de um nico indivduo. Nota: Nopode se esperar conservao da uniformidade gentica de um clone porcontnuas passagens in vitro ou in vivo.

    Linha - Um derivado de laboratrio de um estoque mantido em diferentescondies fsicas ou em diferentes localidades geogrficas. Nota: Aexpresso condies fsicas diferentes abrange diferentes espciesanimais bem como diferentes meios de cultura.

    Populao - Grupo de tripanosomas presentes em um dado momentoem uma cultura ou hospedeiro determinado. Nota: (1) Pode consistir deuma mistura de vrias espcies e sub-espcies. (2) O termo pode serqualificado por um adjetivo se requerida uma descrio adicional.

    Isolado Primrio - Organismos viveis presentes (a) em uma cultura ouem um animal experimental aps inoculao de uma amostra ou partedela obtida de um hospedeiro naturalmente infectado ou (b) em umestabilizado obtido tambm a partir de um hospedeiro naturalmenteinfectado. Nota: Pode consistir de uma mistura de vrias espcies e sub-espcies.

    Amostra - A parte de uma populao de tripanosomas coletada em umanica ocasio.

    Estabilizado - Uma amostra criopreservada de tripanosomas viveis.

    Stock (estoque) - Populao derivada por passagens seriadas in vivoe/ou in vitro a partir de um isolado primrio, sem qualquer implicao dehomogeneidade ou caracterizao. Nota: Estoques derivados emdiferentes momentos a partir de um nico isolado primrio podem serdiferentes.

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    5.3. Termos que implicam caracterizao

    Dema - Populao de tripanosomas que diferem de outras da mesmaespcie ou sub-espcies em relao a uma propriedade especfica ou umgrupo de propriedades. Notas: Os prefixos podem ser acrescentados aesse termo para designar qualidades similares, exemplo: serodema,zimodema, esquizodema, nosodema.

    Esquizodema - Todas as populaes de tripanosomas tendo padres derestrio de DNA similares.

    Serodema - Todas as populaes de tripanosomas expressandorepertrios de VATs similares.

    Nosodema - Todas as populaes de tripanosomas causando padresclnicos de doena similares.

    Zimodema - Todas as populaes de tripanosomas mostrando padresde isoenzimas similares.

    Tipo Antignico Varivel (VAT) - A identidade de um nico tripanosomametacclico ou sangneo como determinado pela sua glicoprotenavarivel de superfcie (VSG).

    VAT de formas sangneas (bVAT) - VAT expressado por umtripanosoma no hospedeiro mamfero.

    VAT predominante - bVAT que tende a surgir em um estgio precoce dainfeco. Nota: VATs inoculados por seringa ou por mosca tse-tse sedesenvolveram primeiro, independente de se eles sero predominantesou no.

    VAT de referncia - Um VAT caracterizado e criopreservado usado comoponto de referncia.

    VAT repertrio - Todos os VATs que podem ser expressados por umclone. Notas: (1) mVATs e bVATs predominantes so as principaispartes caractersticas do repertrio. (2) VATs repertrios similares soditos pertencerem ao mesmo serodema.

    VAT metacclico (mVAT) - VAT expressado por um tripanosomametacclico.

    Hetero-VAT - VAT heterlogo que surge dentro de um clone expandido.

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    Homo-VAT - VAT especfico da maioria dos tripanosomas em um clone,sendo idntico aquele do organismo nico original.

    6. Manuteno dos Tripanosomas 6.1 Cultura

    6.1.1. Cultura do T. evansi

    O T. evansi pode ser mantido em cultura contendo feeder cells ouculturas axnicas.

    Mtodo usado por C.A . Ross e A .M. Taylor para adaptao do T.evansi cultura celular (CTVM, 1991):

    Introduz-se pequenas quantidades (

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    - A adio destes trs compostos suporta o crescimento da maioria dosestoques a uma densidade superior a 1 x 10 6 tripanosomas/ml.

    - A adio de glicose a concentrao de 0,1% ao meio importanteporque as formas sangneas usam a glicose quase que exclusivamentecomo fonte de energia.

    Os tripanosomas crescem em meios de cultura padro como o MEMEagle suplementado com 10 a 15% de soro de eqino, aminocidos noessenciais 100M de tioglicerol, 100M de L-cistena, 100M de BCS e0,1% de glicose. O meio deve ser trocado 3 vezes por semana.

    6.1.1.2. Mtodo de cultura simples

    De acordo com Zywergarth et al (1989) um mtodo simples e rpidopara iniciar culturas com formas sangneas de T. evansi como segue:

    I. Meio de cultura

    a) RPMI suplementado com bicarbonato de sdio com a concentraofinal de 8,9 mM.b) soro inativado de eqino....................................................... 20%c) meio Leibovitz L-15...............................................................10%d) Mercaptoetanol..................................................................0,2mMe) Penicilina......................................................................100 UI/mlEstreptomicina..................................................................100g/mlHhipoxantina........................... ......................................... 0,1 mMII. As placas de cultura so colocadas em estufas de CO2Deve ser trocado 1/3 do meio por dia. As culturas podem ser mantidaspor 30 dias.III. Os tripanosomasPodem ser somente detectados atravs do teste do microhematcrito eno por exame direto entre lmina e lamnula.IV. As culturasSomente tm sucesso quando se utilizam menos de 1000 tripanosomaspor poo nas microplacas.

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    6.1.2. Cultura do T. vivax

    O Trypanosoma vivax mais difcil de cultivar que o T. evansi, sabendoque alguns estoques no infectam realmente animais de laboratrio.

    Tcnica de cultura usada pelo Dr. Erich Zweygarth do OnderstepoortVeterinary Institute (OVI) - frica do Sul:

    I. Mdio de cultura

    A. Meio mnimo essencial de Eagle (MEM).............................1% (v/v)MEM aminocidos no essenciais;B. Soro bovino aquecido-inativado.. .................................. 20% (v/v)C. L-glutamina........................................................................ 2 mM Piruvato de sdio....................................................... .......... 1mM Penicilina...................................................................... 100 IU/ml Streptomicina......................... ................................. ....... 100 g Hipoxantina............................. ......................................... 0.2 g Sulfanato de batocuproina........................................... 20 microM L-cisteina............................................................................ 1 mM 2-mercaptoetanol............................................................. 0.1 mM *Em A: pode ser substitudo pelo meio de Iscove, ou por uma mistura de 1 + 1de meio Iscove e RPMI 1640; em B: Tem-se sucesso no uso do soro bovino,porm, aps o sangramento, os soros de cada um dos bovinos devem sertestados, at se identificar um bom soro (contudo, quando se acredita que issoest timo, depois de poucas semanas, o mesmo animal sangrado podeapresentar um soro no muito bom para tal efeito).

    II. Clulas Feeder layer

    Usam-se clulas endoteliais da aorta de bovinos (clulas fibroblastidestambm podem ser usadas; assim como fibroblastos embrionrios deMicrotus montanus).

    III. Cultura de tripanosomas

    A. Formas sangneas de T. vivax so obtidas da veia jugular de umbovino infectado e com parasitemia razoavelmente alta, em tuboscontendo heparina como anticoagulante;

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    B. Os tripanosomas so ento separados das clulas sangneas porcentrifugao diferencial, onde o pellet ressuspendido com meio decultura;

    C. Adicionar diferentes nmeros de tripanosomas nos poos das placasde cultura (24 wells), por exemplo: 10 000, 50 000 ou 100 000 oumais;

    D. Outra abordagem pode ser utilizada para isto, usando uma gota desangue parasitado;

    E. A gota transferida dentro de um poo da placa de cultura contendofeeder cells;

    F. O volume de sangue depositado at a superfcie do poo;

    G. O meio trocado diariamente substituindo 350-500 l dosobrenadante da cultura por meio fresco;

    H. As placas tm que ser incubadas a 35 C degree e a 4% deatmosfera de CO2.

    6.2. Passagens em animais de laboratrio

    Geralmente as passagens so realizadas por via intraperitoneal. Osroedores de laboratrio (coelhos, cobaios, ratos e camundongos) tm semostrado sensveis nas infeces experimentais com T. evansi. No casodo T. vivax tem sido mais difcil a manuteno deste parasita em animaisde laboratrio desde que geralmente no so infectivos para estesanimais. Alguns autores tm mencionado que as formas de T. vivaxencontradas durante a fase inicial da infeco em bovinos poderiaminfectar roedores de laboratrio. Tambm tem se obtido algum sucessona adaptao deste parasita, imunosuprimindo ou irradiandocamundongos e ratos e inclusive atravs de passagens rpidas, logoaps o aparecimento de alguns parasitas na corrente sangnea.

    6.2.1. Recomendaes na manuteno de tripanosomas em animais delaboratrio

    Tem-se discutido muito sobre a representatividade das cepas mantidasem laboratrio quando comparadas com os isolados de campo (Deane et

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    al., 1984). Aparentemente existe uma adaptao do parasita na troca dehospedeiro. Sabe-se que um isolado de campo pode estar constitudo poruma populao heterognea de tripanosomas. Assim, um nmerodeterminado de clones expressando diferentes VATs podem ser obtidosmediante clonagem de uma cepa ou isolado.

    Temos encontrado variaes na infectividade das cepas de T. evansi.Estas se mostram pouco infectivas em animais de laboratrio quandorecm isoladas do hospedeiro natural, apresentando um perodoprepatente de 12 a 43 dias e baixa parasitemia. Aps algumaspassagens, elas se mostram mais infectivas com um perodo prepatentede 2 a 4 dias e uma parasitemia mais alta. Inclusive tem-se observadosignificantes variaes biomtricas deste parasita nas passagens.Verificou-se que este parasita sofre alteraes morfomtricas durante aspassagens como conseqncia da adaptao ao novo hospedeiro ouseleo de algumas sub-populaes. O mais importante que ascaractersticas biomtricas das passagens foram sempre maiores que asdo isolado primrio (Dvila et al., 1997a).

    Baseados nestas observaes recomendvel criopreservar as amostrasisoladas diretamente do campo: isolado, isolado primrio ou isoladode campo, fazendo o menor nmero de passagens em animais delaboratrio como uma tentativa de estudar as propriedades destesparasitas como expressadas na natureza.

    6.3 Criopreservao

    Existem vrios mtodos para criopreservao, entre eles poderamoscitar os usados por :

    Dr. Anthony G. Luckins (Centre for Tropical Veterinary MedicineUniversity of Edinburgh, Esccia):

    Os camundongos so os melhores hospedeiros para o isolamento do T.evansi. Para obter uma alta parasitemia so necessrias vriaspassagens em camundongos. Quando uma alta parasitemia alcanada,ento possvel congelar a cepa.

    I. Coletar sangue de camundongo, geralmente um camundongo sersuficiente, e adicionar glicerol resfriado no gelo at uma concentraofinal de 7,5%;

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    Misturar cuidadosamente e guardar a mistura a +4C (geladeira) epreencher aproximadamente 1/3 de tubos capilares;

    III. Selar ambas as extremidades dos tubos com uma chama. Colocar oscapilares em tubos plsticos e lentamente resfriar a -196 C;

    IV. Guardar os capilares em tubos no nitrognio lquido.Alternativamente, guardar a -76C em refrigerador de CO2 slido.

    Para o controle das parasitemias nos camundongos deve-se fazeresfregao do sangue da cauda. Para a passagem, somente dois animaisso necessrios. A freqncia das passagens depender da virulncia dacepa, uma vez adaptada para os camundongos, estes desenvolverorapidamente a doena e morrero. Deve-se fazer esforos para guardartodos os isolados como material crioperservado.

    Dr. Carlos M. Monzn (CEDIVEF, Formosa-Argentina):

    I. Infecta-se ratos por via intraperitoneal (o tempo das passagensdepender da quantidade do inoculo e da virulncia da cepa);

    II. Como anticoagulante, utilizar citrato de sdio ao 3.8% em guadestilada ou EDTA;

    III. Depois de 2 ou 3 passagens, coletar o sangue de vrios ratos;

    IV. Para coletar o sangue destes animais, devero ser anestesiados comter sulfrico num frasco com tampa, logo aps realiza-se um corte noplexo axilar e coleta-se o sangue com o anticoagulante;

    V. Misturar o sangue com 7% de dimetilsulfoxido (DMSO). Colocar 1mlde sangue na geladeira de 4-8 C durante uma hora, depois mais umahora no freezer a -20 C, uma hora no vapor de nitrognio lquido efinalmente colocar no nitrognio lquido.

    Para descongelar, colocar os frascos de criopreservao a 35 C durante2-3 min. Misturar o sangue com buffer 7,0 , glicose a 1% , e 20% desoro bovino. Depois deste procedimento se poder inocular novamenteem ratos. No usar tubos de vidro na criopreservao, pois podemquebrar-se no descongelamento.

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    Dr. Roberto Aguilar M. S. Silva (EMBRAPA/CPA-Pantanal, Corumb-MS)

    I. Coleta de sangue infectado em tubos com heparina ou EDTA (depreferncia os tubos com anticoagulante devero estar a baixatemperatura, rodeado com gelo ou gua gelada);

    II. Misturar o sangue dos tubos com 7-10% de glicerol;

    III. Homogeneizar;

    IV. Colocar o sangue homogeneizado com glicerol em frascos decriopreservao preenchendo no mximo 75% do volume do recipiente;

    V. Colocar os frascos de crioperservao contendo o sangue no vaporde nitrognio lquido (num isopor contendo um pouco de nitrogniolquido) durante 20 min.;

    VI. Depois deste procedimento se poder armazenar no botijo denitrognio lquido a -196 C.

    Para o descongelamento, retirar os frascos a serem descongelados donitrognio lquido e coloc-los em banho Maria a 37 C durante 5-7 min.Depois deste procedimento poder se conferir no microscpio aviabilidade e motilidade destes parasitas.

    Dr. Peter Stevenson (ODA/KETRI Trypanosomiasis Research Project,Nairobi, Qunia):

    A criopreservao um processo onde uma populao de tripanosomas preservada viva como um estabilizado em nitrognio lquido. Isso temuma vantagem comparado com a passagem in vivo, pois a manutenopelo ltimo mtodo mencionado tem problemas logsticos e tambm acriopreservao elimina mudanas no carter biolgico da populaoatravs de seleo artificial sob condies especiais de passagens. Asdesvantagens so a vulnerabilidade de interrupo de suplementosrefrigerantes (no caso de armazenamento em nitrognio lquido) oufalhas na energia (freezer de muito baixa temperatura), em cada caso omaterial poderia ser perdido.

    I. Obtm-se uma quantidade de sangue heparinizado de um animaldoador infectado (concentrao final de heparina 5-10 unidades/ml desangue);

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    II. Adicionar gotas de glicerol, agitando continuamente at atingir aconcentrao de 10% de glicerol;

    III. Deixar durante 15 min. para equilibrar;

    IV. Com uma pipeta pasteur passar o sangue com glicerol aos capilares,preenchendo s a metade de cada um deles (aproximadamente 70 l /tubo);

    V. Deixar um espao no final de cada tubo, usar plastilina ou outrocomposto similar para selar os lados finais de cada tubo;

    VI. Transferir ao tubo plstico de 75 x 12 mm., junto uma etiquetaapropriada a resistir baixas temperaturas. Usando um comprimentonecessrio, furar cada final dos tubos para o ingresso do nitrogniolquido; - Inserir o tubo de capilares;

    VII. Suspender em vapor de nitrognio lquido e deixar para esfriardurante 2 horas;

    VIII. Depois do esfriamento, transferir imediatamente os tubos comcapilares da fase de esfriamento no nitrognio lquido para a fase dearmazenamento no mesmo botijo. A verificao do estabilizado podeser feita quebrando um capilar e examinando o contedo conferindo amotilidade e viabilidade.

    6.4. Clonagem

    Segundo Tudor W. Jones da Universidade de Edimburgo (comunicaopessoal) seriam feitos os seguintes procedimentos:

    I. Pequenas gotas de suspenso de tripanosomas so examinadas aomicroscpio para determinar a presena de um nico tripanosoma, o qual injetado em um camundongo. Isto usualmente repetido trs vezespara garantir que eles so propriamente clones.

    II. Para esta rotina usam-se normalmente camundongosimunossuprimidos com ciclofosfamida (300 mg/Kg) aproximadamente 2horas antes da injeo. Assim so feitas passagens de rotina no mximocada 3 dias em outro camundongo imunossuprimido.

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    III. Se o segundo camundongo no apresenta parasitemia pelo mtododo microhematcrito, essa linha descartada.

    IV. Quaisquer tripanosoma que se desenvolva nos camundongosimunossuprimidos so inoculados em outros at atingir uma parasitemiasuficiente para criopreservao.

    V. A pureza dos clones pode ser verificada por ensaios de isoenzimase/ou DNA - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) , RAPD(Ramdom Amplified Polymorphic DNA), etc.

    Deve-se notar que a imunossupresso usada unicamente se a inteno prevenir a variao antignica a qual pode tomar lugar na produo depopulaes de VATs. Se a inteno apenas obter massa de parasitasento os estoques de T. evansi podero ser clonados facilmente sem anecessidade da ciclofosfamida, a qual muito txica.

    7. Variao molecular em Tripanosomas

    Os tripanosomas esto entre os mais primitivos dos eucaritos e, devidoa sua linhagem ancestral no surpreendente que apresentempropriedades biolgicas no usuais. Eles esto entre os primeiroeucariontes por terem mitocndria e uma de suas mais marcveiscaractersticas seu DNA mitocndrial, conhecido como DNAcinetoplstico (kDNA). Contrrio a qualquer outro DNA na natureza, okDNA est organizado dentro de uma rede contendo vrios milhares decrculos de DNA interligados topologicamente. Os crculos so de doistipos. H vrios milhares de pequenos minicrculos e de uma a poucasdzias de maxicrculos. Cada clula contm uma nica rede dentro damatriz de sua nica mitocndria (Englund et al., 1996).

    Vrias espcies do gnero Trypanosoma causam doenas parasitrias deconsidervel importncia mdica e veterinria em todas as partes dafrica, sia e as Amricas. Estes parasitas exibem considerveldiversidade gentica intraespecfica, variao que tem complicado suaclassificao taxonmica. Esta diversidade e variao podem serdefinidas em ambos nveis : do genoma e genes individuais. O genomanuclear monstra uma considervel plasticidade inter e intra-espcies emtermos de nmero de cromossomas e tamanho (caritipo molecular). Ogenoma mitocndrial (kDNA) tambm varia consideravelmente entre

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    espcies, especialmente em termos de tamanho de minicrculos eorganizao. H tambm uma considervel diversidade de seqnciaintra-especfica nos minicrculos e dentro da regio varivel dosmaxicrculos. Anlises de enzimas de restrio desta diversidade tmliderana no conceito de esquizodemas. No nvel gentico, anlises deisoenzimas tm demonstrado muita utilidade na identificao de cepas eisolados, com a classificao dentro de vrios zimodemas. Umaconsidervel diversidade antignica tem sido tambm identificada em T.cruzi e T. brucei, com o desenvolvimento de serodemas, ultimamente.Em adio a esta diversidade inter-cpa, os tripanosomas africanos (T.brucei, T. congolense e T. vivax) exibem o fenmeno da variaoantignica, onde parasitas individuais so capazes de expressar qualqueruma das centenas de diferentes cpias da Glicoprotena Varivel deSuperfcie (VSG) em qualquer momento em particular. Os mecanismosmoleculares que definem a variao antignica so agora conhecidos emconsidervel detalhe (Myler, 1993).

    7.1. Estrutura, organizao, replicao e funo do kDNA

    Estrutura

    Todos os membros da ordem Kinetoplastida so caracterizados pelapresena do kDNA, o qual organizado em uma complexa rede de doistipos de molculas circulares concatenadas. Esta rede compreende 50cpias de maxicrculos, os quais variam de aproximadamente 20 kb(Trypanosoma brucei) 40 kb (Crithidia fasciculata) e 5000 a 10000minicrculos, que variam de 0,5 kb (T. vivax) 2,5 kb (C. fasciculata)dependendo da espcie (Lun & Desser,1995; Chen et al., 1995).

    Organizao

    O kDNA mais intensivamente estudado o pertencente C. fasciculata.Embora este parasita infecte somente insetos, as informaes obtidaspodem perfeitamente ser estendidas a outros membros da famliaTrypanosomatidae. Segundo Englund et al. (1996) a rede do kDNA da C.fasciculata tem aproximadamente 10 m x 15 m, sendo portanto maiorque a prpria clula do qual ele derivado e este fato apresenta uma

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    importante questo de como ele condensado dentro da matrizmitocndrial. Atravs da microscopia eletrnica ou microscopia confocalutilizando-se como corante a acridina laranja observa-se que esta rede compactada em um disco de 1 m de dimetro por 0,4 m deespessura. A espessura do disco compactado de aproximadamentemetade da circunferncia de um minicrculo. Cada minicrculo tem umsegmento curvo da hlice, o qual facilita a compactao. Na clulas,com as redes empreendendo replicao, o disco do cinetoplasto guarnecido por dois complexos de protenas que esto envolvidos nareplicao do DNA. Estes complexos medem aproximadamente 0,4 mm eesto situados nos lados opostos do disco. Os complexos soconstitudos por uma topoisomerase II, uma DNA polimerase eprovavelmente por outras enzimas envolvidas na replicao do DNA.

    Replicao

    Em contraste com a replicao do DNA mitocndrial das clulas demamferos, o qual ocorre durante todo o ciclo celular, o kDNA ocorredurante a fase S coincidente com a do ncleo. Durante a fase S hreplicao de cada minicrculo e maxicrculo individualmente. A progniedos crculos distribuem-se em duas redes filhas as quais segregam-se emclulas filhas no momento da diviso celular (Englund et al.,1996).

    Funo

    Os maxicrculos de todos os tripanosomatdeos tm uma funo genticasimilar ao DNA mitocndrial de outros organismos, bem como acaracterstica no usual de edio do RNA. Os minicrculos codificam amaioria dos guias do RNA para a edio do RNA. Para o sucesso natransformao morfolgica dos tripanosomatdeos no vetor ou emcultura os tripanosomas precisam ter um cinetoplasto funcional, o qualcontm enzimas e citocromos para a execuo da fosforilao oxidativamitocndrial. Evidncias de que o cinetoplasto fundamental para odesenvolvimento cclico no vetor foram obtidos em experimentos ondemosca tse-tse foram infectadas com T. b. gambiense contendo formasacinetoplsticas e formas com cinetoplasto. Porm somente as formascontendo cinetoplasto sobreviveram. Em outro experimento uma cepaacinetoplstica de T. brucei, induzida por acriflavina, desenvolveu-se no

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    hospedeiro mamfero, porm no se desenvolveu no vetor (Lun &Desser, 1995).

    7.2. Importncia do kDNA e sua influncia na distribuio dostripanosomas

    As formas alongadas (slender) de tripanosomas africanos noapresentam enzimas do citocromo e tm um ciclo de Krebs funcional,quando elas esto no hospedeiro mamfero. Embora o T. evansi noapresente os maxicrculos, ele ainda assim consegue desenvolver-se nohospedeiro mamfero porque as formas sangneas no requerem umsistema respiratrio gerando ATP. Contudo os tripanosomas que tm umcinetoplasto funcional precisam empreender uma srie detransformaes morfolgicas e bioqumicas aps a sua ingesto pelovetor. Assim a distribuio geogrfica destes tripanosomas depende dadistribuio de seus vetores. Como resultado da perda dos maxicrculose ausncia de transformaes morfolgicas no vetor, a transmisso doT. evansi no depende da distribuio de um vetor e por esta razovrios insetos hematfagos tm potencial de transmit-lo de umhospedeiro mamfero para outro. Embora o T. brucei possaocasionalmente ser transmitido mecanicamente ele usualmente requer aingesto do sangue infectado por uma mosca ts-ts. Aps a ingestopela mosca o T. brucei rapidamente perde a capacidade de infectar ohospedeiro mamfero e dentro do tubo digestivo da mosca eleempreende uma srie de complexas alteraes morfolgicas ebioqumicas. A forma metacclica tripomastigota o nico estgio noinseto que infeccioso para os mamferos. Embora o nmero dehospedeiros mamferos do T. brucei seja to amplo quando o do T.evansi ele somente ocorre na frica tropical entre as latitudes 15 N e25S que coincidem com a distribuio da mosca tse-tse (Lun & Desser,1995).

    7.3. Perda dos maxicrculos do kDNA pelo Trypanosoma evansi

    Segundo Lun & Desser (1995) a hiptese mais provvel para a ausnciados maxicrculos em T. evansi a seguinte. O T. evansi originou-se deum mutante do T. brucei o qual primeiro perdeu os seus maxicrculosdurante o processo de replicao. Isto deve ter ocorrido quando um

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    minicrculo que se liberou da rede de DNA (vide processo de replicaodos minicrculos). Porm, diferentemente de outros minicrculos, ele nose religou rede e durante o processo subseqente da diviso celular,uma parte da rede em diviso continha ambos maxi e minicrculos e aoutra continha apenas os minicrculos. Esta cepa mutante contendosomente minicrculos espalhou-se pela frica e outras partes do mundoem funo da migrao animal. Todos os isolados de T. evansi teriamportanto uma nica origem. Este fato pode ser suportado por dados deisoenzimas de T. evansi de vrias partes do mundo (vide isoenzimas). Oupelas anlises dos minicrculos feitas por Borst et al. (1987).Recentemente, Brun et al. (1998) revisaram as evidencias biolgicas,clnicas, morfolgicas e moleculares sugerindo que o T. evansiprovavelmente evoluiu a partir de um clone de formas sanguneas do T.equiperdum, que perdeu seus maxicrculos num mecanismo parecido aodescrito por Lun e Desser (1995).

    7.4. Homogeneidade do cinetoplasto e DNA nuclear em isolados deTrypanosoma evansi

    Segundo Bajyana Songa et al. (1990) o kDNA dos maxicrculos parecemser homogneos dentro de um organismo e contm genes mitocndriaisestruturais homlogos aqueles encontrados em outros microorganismos,bem como vrios ainda no identificados ORF (open reading frames). Osminicrculos, so homogneos em algumas seqncias em algumasespcies tais como T. equiperdum ou T. evansi, embora em outras elesdemonstrem considervel heterogeneidade. A organizao deles mostrauma pequena regio conservada e uma grande regio varivel. A regioconservada de 130 bp dos minicrculos do T. brucei demonstrou sermuito similar do T. equiperdum. Borst et al. (1987) encontraram que 5de 6 cepas de T. evansi da frica do leste e oeste e Amrica do Sulcontinham minicrculos que diferiam em menos de 4% em suasseqncias. Estudos moleculares realizados por Bajyana Songa et al.(1990) avaliando os minicrculos de 13 estoques de T. evansi, bemcomo o polimorfismo nuclear de 9 desses estoques. Fragmentos restritosde kDNA de alguns desses estoques foram clonados nos vetores M13 ouPUC 18 e seqenciados. Os resultados obtidos demonstraram que todosos estoques analisados eram membros de um grupo muito homogneo.A anlise do sequenciamento demonstrou que os minicrculos do T.

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    evansi contm a mesma regio conservada que est presente nosminicrculos do T. brucei e T. equiperdum.

    O T. evansi no pode ser confiavelmente diferenciado do T. brucei. Nopresente, o nico mtodo para distinguir T. evansi de T. brucei a servisto : (1) alguns testes de genes de antgenos (Massamba & Williams,1984) e (2) a perda dos maxicrculos no kDNA do T. evansi (Borst et al.,1987). De acordo com Mathieu-Daud & Tibayrenc (1994) o T. evansiparece ser um limitado arranjo de clones de T. brucei bem sucedidos,tendo sofrido adaptao especfica transmisso cclica em reasausentes da mosca ts-ts. Seu estado, como uma espcie distinta do T.brucei, no corroborada por qualquer base filogentica clara, mas seriacontudo mantida com considerao para caractersticas especficasepidemiolgicas.

    8. Ecologia e sociologia da variao antignica

    O entendimento da variao antignica requer informaes sobre adinmica e a ecologia dos tipos antignicos variveis ( VAT, do inglsVariable Antigenic Type).

    O aparecimento de VATs causado pela expresso de diferentescamadas de superfcie. A camada de superfcie composta por umaglicoprotena principal, a glicoprotena varivel de superfcie (VSG).Como conseqncia, a sucesso de diferentes VATs est associada expresso consecutiva de VSGs antigenicamente diferentes (Vickerman,1978; Cross, 1975; Barbet & McGuire, 1982). Quando expressados namembrana de parasitas vivos, as diferentes molculas de VSG no tmreao-cruzada. Porm, quando purificada uma determinante de reao-cruzada detectada (Barbet & McGuire 1978; Barbet et al., 1981) aqual localizada dentro do carboidratocarboxlico terminal, estrutura dasmolculas solveis de VSG (Cardoso de Almeida & Turner 1983).

    O sinal que induz a ativao de VSG no totalmente conhecido.Variantes antignicas aparecem em populaes de tripanosomascultivadas in vitro, indicando que a presena de anticorpos no requerida para induzir a variao (Doyle et al., 1980). Porm o sistemaimune do hospedeiro tem um papel crucial no estabelecimento nomodelo de onda da parasitemia e em definir a ordem de expresso davariante. A variao antignica no um processo aleatrio, e novas

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    variantes aparecem em uma ordem imprecisa (Miller & Turner 1980).Modelos matemticos tm mostrado que essa ordem no pode sersimulada nas bases da gerao aleatria e seleo por razo decrescimento (Kosinsky, 1980).

    Os tripanosomas expressam normalmente um nico gene VSG, mas asimultnea expresso de dois genes resultando no aparecimento de umacamada superficial mista tem sido reportado (Baltz et al, 1986). Estasformas podem representar formas intermedirias no processo daativao da camada de superfcie. Os parasitas metacclicos nasglndulas salivarias so antigenicamente heterogneos, mas expressamum nmero limitado de VATs (Le Ray et al., 1978; Hajduk andVickerman, 1981; Turner et al., 1988). Porm, o repertrio metacclico instvel: um estudo de isolados de um foco de enfermidade do sono noLeste da frica tem mostrado mudanas graduais nos VATs expressadospelas formas metacclicas por mais de um perodo de 20 anos (Barry etal., 1983).

    De acordo com Gray (1966) diferentes isolados da mesma espcieobtidos em diferentes localizaes geogrficas freqentementeexpressam diferentes repertrios de variantes. Van Meirvenne et al.(1977) observaram que tripanosomas derivados de diferentes isolados decampo da mesma espcie animal ou de espcies diferentesapresentavam reaes cruzadas ao testes de imunlise eimunofluorescncia. Tem-se observado que VATs pertencentes atripanosomas que circulam na mesma regio tendem a serem similares.Gill (1965) relatou a presena de antgenos solveis no plasma de ratosinfectados com T. evansi e observou que a imunizao de camundongoscom o plasma de ratos infectados produziu alguma proteo contra areinfeco com tripanosomas da mesma cepa. Um isolado de campopode consistir de um nmero de diferentes VATs quando h um nicogentipo circulando em uma rea.

    Bovinos que tenham sido infectados com estoques de T. vivax eapresentaram cura espontnea resistem ao desafio com estoquehomlogo ou podem resistir com estoque de uma regio geogrficadiferente demonstrando que identidade entre o serodema dos doisestoques (Vos e Gardiner,1989). Dar et al. (1973) demonstraram reaocruzada entre populaes de T. vivax do Qunia e Uganda. Soros debovinos da Zmbia demonstraram possuir baixos ttulos de anticorposlticos para 4 estoques da Nigria e um estoque do leste da frica

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    naturalmente infectados (Murray e Clarkson, 1982). Soros de bovinos doQunia naturalmente infectados lisaram parasitas de um estoque daNigria (Barry, 1986). Estes resultados levaram Dar et al. (1973) a crerque o nmero de tipos antignicos de T. vivax na frica seja reduzido.De acordo com Barriga (1994) somente 12 VATs so conhecidos existirem tripanosomas injetados por ts-ts

    Existem indcios de que animais que vivem em uma determinada regiogeogrfica desenvolvem imunidade para os VATs circulantes na regio.A entrada de animais reservatrios vindos de outras regies podemintroduzir tripanosomas portadores de VATs diferentes dos existentes nolocal e com isto provocarem novos surtos de tripanosomose. Nopresente, a epizootiologia da infeco com T. vivax pouco conhecida.Assim, a habilidade para diferenciar entre estoques morfologicamentesimilares o qual exibe qualidades de interesse epidemiolgico, comoabrangncia de hospedeiros, abrangncia geogrfica e patogenicidade,sobre as bases dos repertrios de VATs, poderiam ser de considervelimportncia em estudos epidemiolgicos. Adicionalmente, como aresposta imune protetora do hospedeiro VAT especfica, um estudo donmero e distribuio de VAT-serodemas na natureza poderia fornecerinformao sobre o papel da imunidade contra os VATs no controle dadoena (Jones & McKinnell, 1984).

    Segundo Seed et al. (1984) em adio aos estudos de biologia molecularser necessrio definir claramente as diferenas nas curvas decrescimento de populaes variantes e o papel da competio entreessas variantes em um nico lugar anatmico. Se os linfcitos produzemlinfocinas com diferentes propriedades biolgicas e estas podem recrutaroutras clulas para funes especficas, os tripanosomas produziriamfatores anlogos os quais poderiam ser chamados de tripanosinas.Atualmente sabe-se que as comunidades das clulas se comportamcomo as comunidades de outras classes de indivduos. As clulasnecessitam se comunicar umas com as outras, por exemplo parasatisfazer funes biolgicas se no forem sociais. Estudos recentes noILRI (International Livestock Research Institute) tm confirmado que ostripanosomas usam molculas bioqumicas mensageiras para secomunicar uns com os outros e tambm com as clulas do seu animalhospedeiro. Uma dessas molculas encontradas a Ciclofilina(Cyclophilin), uma enzima que foi identificada como um alvo potencial nainterveno teraputica (ILRI, 1996).

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    9. Gentica de populaes de Tripanosomas

    Vrias espcies do gnero Trypanosoma causam doenas parasitrias deconsidervel importncia mdica e veterinria em todas partes da frica,sia e as Amricas. Estes parasitas exibem considervel diversidadegentica de intraespcies e variao a qual tem complicado suaclassificao taxonmica. Esta diversidade e variao pode ser definidaem ambos nveis : do genoma e genes individuais. O genoma nuclearmonstra uma considervel plasticidade de inter e intra-espcies emtermos de nmero de cromossomas e tamanho (caritipo molecular). Ogenoma mitocndrial (kDNA) tambm varia consideravelmente entreespcies, especialmente em termos de tamanho de minicrculos eorganizao. H tambm uma considervel diversidade de seqnciaintra-especfica nos minicrculos e dentro da regio varivel dosmaxicrculos. Anlises de enzimas de restrio de esta diversidade tmliderana no conceito de esquizodemas. No nvel gentico, anlises deisoenzimas tm demonstrado muita utilidade na identificao de cepas eisolados, com a classificao dentro de vrios zimodemas. Umaconsidervel diversidade antignica tem sido tambm identificada em T.cruzi e T. brucei, com o desenvolvimento de serodemas, ultimamente.Em adio a esta diversidade inter-cpa, os tripanosomas africanos (T.brucei, T. congolense e T. vivax) exibem o fenmeno da variaoantignica, onde parasitas individuais so capazes de expressar qualqueruma das centenas de diferentes cpias da Glicoprotena Varivel deSuperfcie (VSG) em qualquer momento em particular. Os mecanismosmoleculares que definem a variao antignica so agora conhecidos emconsidervel detalhe (Myler, 1993).

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    9.1. Teoria da clonalidade

    Termos genticos:

    . Reproduo clonal - Reproduo sexual envolvendo mitose, com aconseqncia que as clulas filhas so geneticamente idnticas umas asoutras. Formas de reproduo que produzem indivduos geneticamenteidnticos um o outro tm as mesmas conseqncias de gentica depopulaes como reproduo clonal (ainda que a meiose, semrecombinao gentica, pode tomar lugar). Uma espcie clonal quandoa prognie geneticamente idntica ao indivduo em reproduo.

    . Clonet - Um termo criado pelos autores para designar, em uma espcieclonal, todos os isolados que parecem ser geneticamente idnticos aoutro, sobre as bases de um particular arranjo de marcadores.

    . Heterozigosidade fixada - Quando todos os indivduos amostrados soheterozigotos (em um ou mais loci); isto inconsistente com asegregao meitica e, portanto, uma indicao de propagao clonal.

    . Equilbrio Hardy-Weinberg - As freqncias do gentipo (dadas pelaexpanso quadrada) esperada quando a recombinao aleatria. Se asfreqncias de dois alelos, a e b, so p e q (p + q = 1), as freqnciasde equilbrio so p2 (homozigotos aa), q2 (homozigotos bb) e 2pq(heterozigotos ab).

    . Linkage desequilibrium - Associao no aleatria entre alelos ougentipos em diferentes loci. Com o linkage equilibrium, a freqnciaesperada de um gentipo multilocus o produto das freqncias de umgentipo com um nico locus. Quando h desequilbrio, a presena deum gentipo particular em um locus polimrfico faz isso mais provvelque certos gentipos particulares ocorreriam em outro loci polimrfico.Assim, em T. cruzi, sabendo que o gentipo no locus Gpi faz possvel apredio com uma alta probabilidade o gentipo que um dado estoqueter em qualquer um dos outros 14 loci. O linkage desequilibrium podeaparecer em organismos outbreeding reproduzindo-se sexualmente comouma conseqncia da seleo natural e aleatoriedade deriva, masocorre dentro de organismos cruzando-se unicamente em nveis baixosse no for em tudo.

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    Contrariamente, em populaes de T. cruzi, o nvel observado de linkagedesequilibrium aborda o mximo terico, o qual uma forte evidnciacontra o interbreeding.

    . Panmixia - Cruzamento entre indivduos (e, portanto, a associaoentre os alelos em um locus) ocorre em forma aleatria.

    As duas conseqncias importantes da reproduo sexual so asegregao dos alelos em um locus e sua recombinao entre os loci. Asevidncias destes dois processos so raras ou ausentes enquanto aevidncia da reproduo sexual rara ou ausente na natureza. O critrioamplia os dois clssicos estatsticos usados em gentica de populaespara averiguar o cruzamento aleatrio e a livre recombinao gentica:freqncias de equilbrio de Hardy-Weinberg e linkage disequilibrium.Quando alelos particulares no podem ser percebidos, ou o organismo haplide, ou a ploidia desconhecida, s os testes recombinantes soaplicveis.

    Outro ponto a ser considerado que o modelo clonal no implica que arecombinao gentica totalmente ausente, mas embora que arecombinao rara numa escala evolucionria, persistem asconseqncias da gentica de populaes de um modo clonal dereproduo. Por exemplo, resultados preliminares (Tibayrenc & Ayala,1991) sugerem que a diversidade do gentipo do T. brucei elevada emmamferos silvestres ou moscas ts-ts quando comparado comhumanos ou o gado.

    O modelo clonal proposto por Tibayrenc & Ayala (1991) tem aplicaono desenvolvimento de drogas curativas, vacinas, estudosepidemiolgicos, diagnstico e tratamento de pacientes.

    Segundo Mathieu-Daud & Tibayrenc (1994) se os clones so tomadoscomo unidades taxonmicas em lugar de subespcies e grupos, doisproblemas aparecem: primeiro, o nmero de clones que compem umaespcie dada potencialmente ilimitado; segundo, a variabilidade clonalregistrada num determinado estudo depende do nvel de resoluo dosmarcadores genticos utilizados.

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    10. Diagnstico

    10.1 caracteres Diagnsticos

    A caracterstica mais importante a estrutura geral das formassangneas reveladas em preparaes coradas e examinadas atravs damicroscopia tica. Vrias espcies de tripanosoma podem diferir notamanho e forma do corpo, na posio do ncleo e cinetoplasto, bemcomo no grau do desenvolvimento da membrana ondulante e do flagelo.

    Alguns ndices so teis para definir a posio do ncleo e docinetoplasto. Um desses ndices o ndice nuclear (N.I.). O NI representaa razo da distncia do final da extremidade posterior para o ncleo e doncleo para o final da extremidade anterior (PN/NA). Quando o NI=1 oncleo est no meio do corpo. Quando 1 est na metade anterior. O ndice cinetoplstico (K.I.) seobtm dividindo a distancia desde o final da extremidade posterior aoncleo (PN) por a distancia desde o cinetoplasto ao ncleo (KN). Se o KI menor que 2, o cinetoplasto est no meio dos dois, e se maior que 2o cinetoplasto est prximo ao ncleo (Hoare, 1972) (Fig. 3).

    Fig. 3. Medidas dos tripanosomas. L: Comprimento total (incluindo oflagelo livre); PK: Distncia do final da extremidade posterior aocinetoplasto; KN: do cinetoplasto ao meio do ncleo; PN: do final daextremidade posterior ao meio do ncleo; NA: do meio do ncleo ao finalda extremidade anterior; F: comprimento do flagelo livre; K:Cinetoplasto. Baseado em Hoare (1972). Trypanosoma vivax : formatripomastigota em sangue de bovino (surto ocorrido no Pantanal doPocon, 1995).

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    No Pantanal, MS um isolado de T. evansi de co (Ramirez et al., 1997) ena Bolvia um isolado de T. vivax (Dvila et al., 1997a; 1997b) tm sidodescritos com um comprimento total inferior aos descritos por Hoare(1972). As medidas biomtricas do T. evansi e do T. vivax somostradas na Tabela 1 e 2, respectivamente.

    10.2 Mtodos de diagnsticos parasitolgicos

    Mtodo do aspirado do linfonodo

    O linfonodo mais fcil de manipular em bovinos o pr-escapular.Utiliza-se uma seringa de 2ml com uma agulha N 21 G X de 1 polegadas, contendo 1 ml. de soro fisiolgico estril. Localiza-se olinfonodo pr-escapular e se desinfecta a zona com lcool ou com iodo,deixa-se secar. Fixar o linfonodo entre os dedos ndice e polegar e com amo livre pegar o sistema seringa-agulha e introduzir a agulha nolinfonodo at a metade do seu comprimento. Injetar o soro contido naseringa. Logo aps, segurando ainda o linfonodo retira-se o soroinjetado, obtm-se um lquido misturado com sangue, mas nunca seobtm 100 % do volume injetado. Com o lquido obtido preparam-seesfregaos grossos, os quais sero corados pelo mtodo de Giemsa apsfixao com lcool metlico.

    Tcnica do esfregao

    Coloca-se uma gota do sangue numa lmina a uma distncia deaproximadamente 2-3 cm. de um lado final. O gota espalhada at olado final oposto, isto feito empurrando a gota com outra lmina numngulo de 45 . So recomendveis esfregaos de camada fina, poisfacilitam a leitura ao apresentarem as clulas mais dispersas.

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    Fig. 4. Trypanosoma vivax encontrado no sangue de bovinosnaturalmente infectados no Pantanal de Pocon, MT, Brasil.

    Fig. 5. Trypanosoma evansi encontrado no sangue de cavalosnaturalmente infectados no Pantanal da Nhecolndia, MS, Brasil.

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    Tabela 1. Medidas biomtricas (m) do Trypanosoma vivax encontrado na Amrica Latina.

    L PK KN PN NA F PN/KN(KI)

    PN/NA(NI)

    Hoare, 1972 18-31 3-6Bolvia, Santa Cruz(Silva et al., 1997a)

    15.86(2.23)

    0.54(0.51)

    5.05(1.07)

    5.59(1.15)

    5.90(0.76)

    4.35(1.26)

    1.10 0.96(0.24)

    Brasil, Par(Shaw & Lainson, 1972)

    22.77(1.38)

    0.65(0.25)

    6.16(0.57)

    7.60(0.57)

    8.22(1.08)

    6.92(1.03)

    1.23 0.94(0.24)

    Brasil, Mato Grosso(Silva et al., 1996a)

    18.73(3.8)

    1.02(1.16)

    6.10(1.29)

    7.18(1.18)

    5.40(1.63)

    6.15(2.38)

    1.17 1.50(0.72)

    Brasil, Mato Grosso doSul(Silva et al., 1997dados no publicados)

    18.1(2.04)

    0.30(0.53)

    7.46(1.56)

    7.76(1.59)

    6.03(1.18)

    4.3(0.87)

    1.04 1.34(0.37)

    Colmbia(Plata, 1931) 21.00Guiana Francesa(Leger & Vienne, 1919) 22-23 0.80 5.50 6.3 7.20 6.00 1.14 0.87Guiana Francesa(Desquesnes, 1996) **

    20.3(0.55)

    1.10(0.17)

    6.00(0.22)

    7.1(0.16)

    5.70(0.37)

    7.50(0.40)

    1.18(0.04)

    1.24(0.08)

    Panam(Johnson, 1941) 21.38Venezuela(Desquesnes, 1996) ** 21.52 0.82 6.02 6.83 7.83 6.86 1.13 0.87

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    (Kubes, 1994)(1.17)22.00

    (0.19) (0.47) (0.54) (1.03) (1.32) (0.06) (0.14)

    Suriname(Nieschulz & Frickers,1938)(Nieschulz, 1939)

    21.0021.50

    PK=distncia do final da extremidade posterior ao cinetoplasto; KN=do cinetoplasto ao meio do ncleo; PN=do final daextremidade posterior ao meio do ncleo; NA=do meio do ncleo ao final da extremidade anterior; F= comprimento doflagelo livre; L= comprimento total incluindo o flagelo livre; KI=ndice cinetoplstico; NI=ndice nuclear. Os valores entreparntesis representam o desvio padro. ** Comunicao pessoal.

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    Tabela 2. Medidas biomtricas (m) do Trypanosoma evansi encontrado na Amrica do Sul e ndia.

    PK KN PN NA F L PN/NA

    Hoare (1972) 15 - 34Brasil(Ramirez et al.,1997)cavalo*

    - - 6.46 0.56 5.07 1.2 5.63 1.32 17.16 1.61 1.35 0.37

    coati* - - 9.19 2.21 7.48 1.82 8.01 2.3 24.69 3.64 1.29 0.45co 1* - - 11.33 2.74 9.33 3.22 5.33 1.30 25.75 3.35 1.33 0.41co 2* - - 5.32 1.77 5.45 1.02 3.98 1.35 13.35 4.90 1.05 0.30Suriname(Desquesnes,1996)co*

    2.17 0.22 7.67 0.48 9.83 0.50 10 0.22 7.67 0.46 27.5 0.58

    ** Venezuela(Desquesnes,1996)

    2.72 0.31 6.87 0.52 9.58 0.72 8.41 1.09 8.5 1.17 26.5 1.52

    ndia(John et al.,1992)BfaloBovinoCo

    2.16 0.051.95 0.041.91 0.04

    6.00 0.185.87 0.165.37 0.11

    5.66 0.145.40 0.134.64 0.10

    21.61 0.3720.60 0.3217.65 0.22

    PK=distncia do final da extremidade posterior ao cinetoplasto; KN=do cinetoplasto ao meio do ncleo; PN=do final da extremidade posterior aomeio do ncleo; NA=do meio do ncleo ao final da extremidade anterior; F= comprimento do flagelo livre; L= comprimento total incluindoo flagelo livre; = desvio padro; * Isolados primrios; ** Medidas biomtricas cedidas gentilmente pelo Dr. Marc Desquesnes, comunicao pessoal.

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    Tcnica Woo (1970) do Microhematcrito e Buffy Coat

    Preenche-se aproximadamente 2/3 do volume de cada capilar com osangue a ser testado. recomendvel montar dois capilares por cadaamostra de sangue. Sela-se com chama ou com plastilina numa dasextremidades. Centrifuga-se e logo se realiza a leitura. Para o Buffy Coatpode se montar uma lmina, quebrando cada capilar na parte onde sedivide a parte lquida com a parte celular, colocando assim uma ou duasgotas deste material numa lmina e fazendo logo o esfregao.

    Inoculao em camundongo

    A inoculao em camundongo se faz geralmente por via intraperitonealmas tambm pode ser feita por via intramuscular. O inculo de sangueinfectado de aproximadamente 0,20 ml. Os camundongos mais usadosso os de linhagem Swiss (suios) e Balb/C.

    NOTA: Os mtodos diagnsticos parasitolgicos mais freqentementeutilizados so os esfregaos corados pelo Giemsa (GSS), esfregaossangneos midos (WBF), mtodo de concentrao de Strout (SCM),mtodo do microhematcrito ou mtodo de Woo (HCT), mtodo "BuffyCoat" (BCM) e inoculao em camundongos (Monzn et al., 1990). Omtodo da inoculao em camundongo d uma sensibilidade de 88,2%,HCT 71.1%, BCM 63,4%, WBF 53.8%, SCM 46,1% e GSS 45.6%.

    Segundo os mesmos autores os mtodos HCT, inoculao emcamundongo e esfregao corados com o Giemsa foram propostos como acombinao mais efetiva.

    10.3 Mtodos de diagnsticos sorolgicos

    Os mtodos sorolgicos tm limitaes na sua utilizao comodiagnstico da tripanosomose causada pelo T. evansi pelos seguintesmotivos:

    Aps o tratamento os anticorpos permanecem por mais de um ano, o quedificulta saber se trata-se de uma nova infeco ou so anticorposresiduais de uma infeco passada e j curada.

    Conforme recomendaes do Dr. A.G. Luckins da Universidade deEdimburgo, Esccia (comunicao pessoal) na infeco com T. evansideve-se diagnosticar os animais com infeces produtivas e trat-losindividualmente.

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    Os mtodos diagnsticos sorolgicos mais comumente utilizados so:

    10.3.1. Imunofluorescncia indireta

    Materiais:

    LminasLamnulas 24x50Glicerina TamponadaImunoglobulina conjugadaMicroplacas (96 poos)Pipeta multicanalPipeta automtica (0,5 l - 100 l)Azul de evans (10mg%)Soluo tampo fosfato 0,15M.

    Preparao do antgeno:

    1. Origem dos parasitas

    a) Parasitas em cultura.

    b) Parasitas no sangue. Isto acontece quando os parasitas so mantidosem animais de laboratrio. Deve infectar-se 1 ou mais ratos (os maisusados so os de linhagem Wistar) e esper-los apresentar altaparasitemia. Deve coletar-se o sangue com anticoagulantepreferencialmente com heparina, tomando cuidado de colocar os tuboscom o sangue coletado num recipiente com gelo, diminuindo assim ometabolismo dos parasitas e prolongando o seu tempo de vida fora dohospedeiro.

    Aps passar o sangue contendo parasitas pela coluna de DEAE celulose :Segura-se uma seringa de 20 ou 50 ml (dependendo do volume de sanguea ser passado) num pequeno suporte. Coloca-se no fundo desta, l devidro ou papel filtro. Segura-se a extremidade inferior da seringa com umamangueira pequena e fecha-se a extremidade desta. Montar a colunacolocando aproximadamente 20 g. de DEAE celulose quando tiver umvolume de sangue coletado de dois ratos. Compactar a resina colocada naseringa passando 3 vezes o seu volume de PSG pH 8.0 (por exemplo se aresina estiver preenchendo 10 ml. da seringa sero passados 30 ml. dePSG). Deve se tomar cuidado de no deixar passar o nvel do PSG abaixo

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    da resina durante a compactao, pois causaria pequenas rachadurasnela. Depois de compactada passar pela coluna a mistura de PSG com osangue infectado na concentrao de 1:1, monitorando sempre o nveldesta mistura com o nvel da resina evitando possveis rachaduras nacoluna. Deve se monitorar a passagem dos parasitas pela coluna, a qualocorrer logo aps da passagem de um pouco de PSG.

    2. Lavar 3 vezes com soluo tampo fosfato 0,15M (pH 7,2),centrifugando a 3000 RPM durante 15m a 4 C.

    3. Resuspende-se os parasitas em soluo tampo fosfato 0,15M (pH7,2) ajustando at atingir a quantidade aproximada de 40 parasitas porcampo num aumento de 400x.

    4. Coloca-se apenas uma camada fina do antgeno preparado em cadapoo das lminas para imunofluorescncia a serem usadas.

    Diluio dos soros:

    A princpio para uma triagem preliminar os soros a serem testados nodevero ser diludos. Conforme encontrados positivos recomendvel quesejam testados novamente em diluies seriadas de 1:10, 1:20, 1:40,1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280.

    Montagem da Imunofluorescncia:

    a) Diluir o conjugado na diluio indicada pelo fabricante (ou numadiluio especfica determinada prvio teste pelo usurio) em azul deEvans 10 mg%.

    b) Colocar 10 l do soro a ser testado em cada poo das lminas comantgeno. Incubar em cmara mida a 37 C durante 30 min. Logo apslavar 2 vezes com soluo tampo fosfato 0,15 M (pH 7,2) deixando aslminas no porta lminas com soluo tampo fosfato 0,15M durante 2min. de cada vez.

    c) Colocar 10 l da conjugado diludo como descrito em (a) em cada pooda lmina incubada com o soro. Incubar em cmara mida a 37 Cdurante 30 min. Logo aps lavar 2 vezes com soluo tampo fosfato0,15 M como descrito em (b).

    d) Fazer a leitura num microscpio para Imunofluorescncia no aumentode 400x.

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    e ) Como sugesto o teste pode ser considerado positivo quando mais dametade do campo em observao apresente tripanosomas fluorescendo.Mas para isto tem que ser considerada a padronizao prvia doconjugado na procura da melhor fluorescncia para leitura.

    10.3.2. Teste de aglutinao direta (Monzn, 1993)

    Preparao do antgeno:

    Camundongos de linhagem CF so inoculados intraperitonealmente comT. evansi. No pico da parasitemia o sangue e coletado do plexo braquial.Trs partes do sangue so misturados com uma parte de citrato de sdioa 3,8%. A amostra centrifugado por 7 min. a 754 G. Os parasitassedimentados acima da camada de clulas sangneas so coletados esuspendidos em 250 volumes de soluo tampo fosfato pH 7,3.contendo glicose a 1% (soluo tampo fosfato com glicose).

    Ocasionalmente os parasitas podem ser separados das clulas sangneaspor meio de tcnicas cromatogrficas.

    O material coletado lavado em soluo tampo fosfato com glicose ecentrifugado em centrfuga refrigerada a 10 C por 20 min. a 340 G.Subseqentemente os parasitas so pesados e suspensos na soluo detripsina a 0,2% em soluo tampo fosfato pH 7,6.

    Para cada grama dos parasitas coletados usado 30ml de tripsina a 0,2%tamponada. O material incubado por 30 min. a 37 C e misturadonovamente em 250 volumes de soluo tampo fosfato com glicose elavado vrias vezes, na ltima lavagem deve se usar soluo tampofosfato sem glicose.

    Para cada grama do plete resultante adicionado 50 ml de soluotampo fosfato contendo 1% de formalina. A preparao misturadacuidadosamente vrias vezes em uma seringa e deixada por 24 hs. atemperatura ambiente, agitada novamente e deixada sedimentar por 30min. O sobrenadante ento removido filtrado duas vezes atravs defiltro de vidro (glass filter) com poros de aproximadamente 40 m.

    A concentrao do antgeno ajustada a uma densidade ptica de 0,40usando um fotocolormetro com um comprimento de onda de 50 nm,representando cerca de 50 x 106 parasitas/ml.

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    10.3.3. Aglutinao direta

    So realizadas diluies seriadas a partir de 1:2 utilizando-se um volumede 25 l por poo em microplacas com fundo em V, usando a soluotampo fosfato pH 7,3 contendo 0,8% de albumina bovina polimerizada(v/v).

    Aps a adio de 25 l de antgeno para cada diluio do soro as placasso agitas manualmente por 30 seg. Devem-se cobrir as placas para evitarevaporao. Deixar 18 hs. a 37 C.

    Tratamento das amostras com 2-Mercaptoetanol:

    Para ativar a IgM iniciadas pelas infeces pelo T. evansi as amostrasdevem ser tratadas com 2-Mercaptoetanol (2-ME). 25 l de 0,8% de 2-ME (v/v) em 0,15 M de NaCl so misturados com 25l do soro teste eincubados durante 30 min. a 37 C.

    Leitura do teste:

    A leitura feita em caixas de teste similares s utilizadas nos testes deaglutinao para brucelose.

    Resultado:

    Negativo: quando formar um boto no fundo da placa.

    Positivo: quando formar uma rede ocupando pelo menos 50% do fundo.

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    10.3.4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

    Deteco de antgenos circulantes em animais infectados com T. evansi(Ag-ELISA)

    Segundo Nantulya et al. (1989) um teste imunoenzimtico para detecode antgeno utilizando monoclonal especfico para o grupo T. brucei foiutilizado para deteco de antgenos circulantes em vrias espcies deanimais infectados experimentalmente com estoques de T. evansi doSudo, Indonsia, Tailndia e Amrica do Sul. Os antgenos circulantesforam detectados 6 dias aps infeco e permaneceram por todo operodo de observao do experimento (mais de 60 dias aps infeco).Em uma analise dos soros de bfalos da Tailndia naturalmenteinfectados, o teste identificou todos os animais com examesparasitolgicos positivos e mais 3 casos adicionais que no haviam sidodetectados pelas tcnicas parasitolgicas. Em uma anlise de soros desunos na Tailndia suspeitos de um surto de T. evansi, o teste detectouantigenemia em 66,7% dos animais com ttu