TUGAS MIKROBIOLOGI INDUSTRI Dosen Pengampu : Dr. Supartono, M.S

Disusun oleh :

SUPRIYANTO

NIM : 0402510082

PROGRAM PASCA SARJANA

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN IPA (KIMIA)

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG (UNNES)

Tahun Akademik 2010/2011

Susu Bubuk Formula Bayi Yang Terkontaminasi

Bakteri Enterobacter sakazakii

Kenji Oonaka, Katsunori Furuhata, Motonobu Hara1, and Masafumi Fukuyama

Laboratory of Microbiology, School of Life and Environmental Science, and 1Laboratory of

Microbiology II,

School of Veterinary Medicine, Azabu University, Kanagawa 229-8501, Japan

(Received August 19, 2009. Accepted February 8, 2010)

RINGKASAN:

Dalam penelitian dasar ini, kami meneliti untuk memperjelas bagaimana jalan dan sumber

infeksi Enterobacter sakazakii dapat menginfeksi kepada anak-anak, kami menganalisis susu

bubuk formula bayi (PIF) yang ada di pasaran. Untuk mempelajari efek kontaminasi dari

bakteri ini dilakukan tes sensitivitas terhadap obat antimikroba yang ada. Dari 149 sampel yang

diteliti (61 sampel dari produksi susu di dalam negeri dan 88 sampel dari produksi susu impor),

ternyata 36 sampel (24,2%) dapat dilakukan isolasi terhadap Enterobacteriaceae, dengan rincian

12 sampel (19,7%) dari produksi dalam negeri Jepang dan 24 sampel (27,3%) dari produksi dari

luar Jepang. Dari 36 sampel yang mengandung Enterobacteriaceae, ternyata E. Sakazakii dapat

diisolasi secara pasti di 9 sampel (6,6%) dengan rincian sebagai berikut 4 sampel (6,6%) dari 61

sampel hasil produksi dalam negeri dan 5 sampel (5,7%) dari 88 sampel hasil produksi dari luar

negeri. Dari 9 sampel yang mengandung E. Sakazakii ternyata 8 sampel memiliki kandungan

bakteri sebesar 0,36 MPN/100 gram, sedangkan 1 sampel susu impor menunjukan tingkat

bakteri 0,91 MPN/100 gram.

Dalam uji tes sensitivitas terhadap E. sakazakii yang diperoleh, kami membandingkan harga

MIC90. Didapatkan hasil sebagai berikut, ternyata E. sakazakii sangat sensitif terhadap 9 zat

antimikroba yaitu: cefotaxime, ceftriaxone, cefoperazone, seftazidim, cefpirome, cefozopran,

gentamisin, meropenem, dan ciprofloxacin, dan agak peka terhadap 5 zat antimikroba seperti:

piperasilin, erythromycin, minocycline, kloramfenikol, dan rifampisin. Namun, tahan terhadap

2 zat anti mikroba ampisilin dan lincomycin.

A. PENDAHULUAN

Enterobacter sakazakii adalah salah satu jenis bakteri anaerob yang

termasuk dalam kelompok Enterobacteriaceae, bakteri ini terdapat secara luas di

saluran usus hewan dan lingkungan alam. Awalnya jenis bakteri ini diidentifikasi

sebagai Enterobacter cloacae berdasarkan karakteristik morfologinya yang

menghasilkan suatu pigmen kuning. Namum pada tahun 1976, Steigerwalt et al

melaporkan bahwa ada perbedaan morfologi antara bakteri yang menghasilkan

pigmen dan non-pigmennya sehingga bakteri ini tidak dapat dimasukan kedalam

jenis bakteri yang sama. Pada tahun 1980, Farmer et al kemudian memberi nama

bakteri jenis ini dengan nama E. Sakazakii.

Mengenai infeksi E. Sakazakii terhadap manusia dilaporkan pertama kali

oleh Urmenyi dan Franklin. Dalam laporan tersebut dijelaskan bahwa ada resiko

yang sangat tinggi dari bakteri ini yang dapat menginfeksi bayi (termasuk bayi

yang lahir prematur atau bayi yang lahir dengan berat badan rendah), karena

bakteri ini dapat menyebabkan membesarnya otak, necrotizing enterocolitis, dan

sepsis. Bahkan pada kasus-kasus yang parah, bakteri ini dapat menyebabkan

hidrosefali dan meningitis, dengan tingkat kematian yang tinggi sekitar 40-50%,

disertai dengan sequelae neurologis berat.

Di Jepang, bakteri ini menyebabkan beberapa kasus abses otak pada tahun

2007 dan kasus sepsis pada tahun 2009. Namun, sumber penyebab dan jalanya

menginfeksi kepada anak-anak saat itu tetap tidak dapat dijelaskan. Muytjens et

al. melaporkan bahwa dia dapat mengisolasi bakteri E. Sakazakii sebanyak 14,2%

dari susu bubuk formula bayi (PIF) yang diproduksi di 35 negara. Demikian juga

Leuscher dan Bew, dapat mengisolasi bakteri E. Sakazakii sebanyak 13,8% dari

susu bubuk formula bayi (PIF) di 11 negara.

Sebagai tanggapan terhadap laporan tersebut, kemudian pada tahun 2004

dan 2006 FAO/WHO mengadakan rapat bersama para ahli untuk menetapkan

adanya bahaya dari penyebaran bakteri E. Sakazakii melalui susu bubuk formula

bayi yang dapat membahayakan terhadap kesehatan manusia, khususnya para bayi

yang mengkonsumsinya. Dalam penelitian ini, kami menganalisa susu bubuk

formula bayi (PIF) yang diperkirakan telah terkontaminasi dengan melakukan tes

sensitivitas terhadap zat antimikroba.

B. BAHAN DAN METODE

1. Bahan:

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah 149 sampel susu bubuk

formula bayi (PIF) yang dibeli dari toko-toko eceran antara November

2006 dan Februari 2008 dengan rincian 61 sampel susu produksi dalam

negeri Jepang dan 88 sampel susu impor. Untuk sampel susu produksi

dalam negeri diambil 18 sampel yang paling banyak dibeli oleh

masyarakat untuk diuji 2 sampai 4 kali.

2. Isolasi Dan Identifikasi:

Jenis dan jumlah bakteri yang diisolasi diukur dengan menggunakan

metode MPN (3 metode berturut-turut) sesuai dengan pedoman FDA.

a. Kami menyiapkan 3 botol yang masing-masing berisi 900 mL, 90 mL,

dan 9 mL air suling steril, kemudian botol tersebut masing-masing

diisi dengan 100 gr, 10 gram, dan 1 gram susu bubuk formula bayi

(PIF).

b. Setelah PIF benar-benar larut, kemudian sampel disimpan pada suhu

37°C selama semalam.

c. Selanjutnya, setiap sampel diambil 10 mL dan dicampur dengan 90

mL EE dan disimpan kembali pada suhu 37°C selama semalam.

d. Dengan menggunakan loop, masing-masing media itu dioleskan pada

VRBG dan agar DFI, dan dijaga suhunya pada 37°C selama semalam.

e. Dengan menggunakan 4 cawan, kemudian dilakukan proses

pembuatan koloni kultur murni terhadap sampel yang diduga

mengandung bakteri.

f. Untuk melakukan pengetesan terhadap hasilnya, kemudian dilakukan

pengujian dengan menggunakan berbagai jenis agar-agar, misalnya

agar TSI, agar LIM dan agar kedelai tryptic (untuk uji oksidase).

g. Hasil pada pengetesan diperoleh hasil sebagai berikut: glukosa (+),

laktosa / sakarosa (+), gas (+), hidrogen sulfida (-), lisin (-), motilitas

(+), dan oksidase (-).

h. Setelah pembuatan kultur menggunakan agar-agar kedelai tryptic pada

suhu 25°C selama 3 hari, ternyata menghasilkan tegangan (strain)

berwarna kuning yang menunjukan bakteri E. Sakazakii memang ada

dalam sampel.

i. Untuk identifikasi lebih lanjut terhadap keberadaan bakteri tersebut,

dilakukan 47 kali uji biokimia dengan menggunakan alat VITEK2

untuk memastikan apakah gen rRNA 16 nya betul-betul milik E.

Sakazakii

3. Tes sensitivitas obat :

Tes kepekaan obat dilakukan dengan menggunakan metode plat

pengenceran agar-agar sesuai dengan CLSI. Kita melakukan pengujian

terhadap 16 jenis obat antimikroba: 2 penisilin, 6 cephem, 1 carbapenem, 1

aminoglikosida, 1 lincomycin, 1 macrolide, 1 tetrasiklin, 1 kloramfenikol,

1 kuinolon, dan 1 rifampisin.

C. HASIL

1. Isolasi terhadap Enterobacteriaceae dari sampel PIF:

Dari 149 sampel susu bubuk formula bayi (PIF) yang ada ternyata

didapatkan 36 sampel (24,2%) mengandung Enterobacteriaceae. Untuk

sampel susu bubuk formula bayi yang berasal dari dalam negeri Jepang

yang diteliti, ternyata 6 sampel (27,3%) dari 22 sampel produksi

perusahaan A, 4 sampel (40%) dari 10 sampel produksi perusahaan C, dan

2 sampel (20%) dari 10 sampel produksi perusahaan E mengandung

Enterobacteriaceae. Sedangkan 12 sampel produksi perusahaan B dan 7

sampel produksi perusahaan D tidak mengandung Enterobacteriaceae.

Untuk sampel susu bubuk formula bayi (PIF) yang berasal dari import

yang diteliti: ternyata Enterobacteriaceae dapat diisolasi pada 7 sampel

(26,9%) dari 26 sampel yang berasal dari Filipina, 6 sampel (26,1%) dari

23 sampel dari negara Thailand, 6 sampel (40,0%) dari 15 sampel dari

negara Korea, 2 sampel (20,0%) dari 10 sampel dari negara Amerika

Serikat, 1 sampel (25,0%) dari 4 sampel dari negara Brasil, dan 2 sampel

(66,7%) dari 3 sampel dari negara Arab Saudi. Sedangkan 3 sampel susu

bubuk formula bayi (PIF) dari negara Kanada dan 1 sampel dari negara

Australia, Kamboja, Hongkong, dan Vietnam tidak ditemukan adanya

bakteri Enterobacteriaceae.

2. Identifikasi Enterobacteriaceae terisolasi dari PIF:

Kami mengidentifikasi 52 strain Enterobacteriaceae terisolasi dari PIF.

Dalam 36 sampel (24.2%) dari 149 sampel yang ada, kami menemukan 11

jenis bakteri yang dapat diisolasi: 13 spp Pantoea, 9 E. sakazakii, 7

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, 6 E. cloacae, 4 Leclercia

adecarboxylata, 3 Escherichia coli, 2 Escherichia vulneris, 2 Klebsiella

pneumoniae subsp. ozaenae, 1 Buttiauxella agrestis, 1 Escherichia

hermannii, dan 1 Ewingella americana. 3 lainnya strain tidak dapat

diidentifikasi.

3. Isolasi E. sakazakii dari PIF dan Perkiraan kadar bakteri:

Keadaan E. Sakazakii yang terisolasi dari susu bubuk formula bayi (PIF)

dan perkiraan tingkat bakteri ditunjukkan pada Tabel 4. E. sakazakii yang

diisolasi untuk 9 sampel (6,0%) dari 149 sampel susu bubuk formula bayi

(PIF).

Untuk sampel susu bubuk formula bayi (PIF) produk dalam negeri Jepang

, ternyata sampel yang positif mengandung E. Sakazakii sebagai berikut : 1

sampel (4,5%) dari 22 sampel perusahaan A, 2 sampel (20%) dari 10

sampel perusahaan C, dan 1 sampel (10%) dari 10 sampel perusahaan E.

Sedangkan 12 sampel perusahaan B dan 7 sampel perusahaan D

produknya tidak mengandung E. Sakazakii.

Untuk sampel susu bubuk formula bayi (PIF) produk import (luar negeri),

ternyata sampel yang positif mengandung E. Sakazakii sebagai berikut : 1

sampel (3.8%) dari 26 sampel dari negara Filipina, 1 sampel (4,3%) dari

23 sampel dari negara Thailand, dan 3 sampel (20%) dari 15 sampel dari

negara Korea. Sampel PIF import yang diteliti dan tidak mengandung

bakteri E. Sakazakii antara lain dari negara-negara : Amerika Serikat,

Brasil, Kanada, Arab Saudi, Australia, Kamboja, Hongkong, dan Vietnam.

Kami mengukur Semi kuantitatif terhadap kadar E. sakazakii untuk 9

sampel yang terdeteksi. Seperti terlihat pada Tabel 4, diperkirakan

kadarnya mencapai 0,36 MPN/100 gr untuk 4 sampel PIF produksi dalam

negeri, dan kadarnya mencapai 0,36 MPN/100 gr untuk 4 sampel PIF

produk import serta 0,91 MPN/100 gr untuk 1 sampel PIF produk import

Dengan menggunakan sampel susu bubuk formula bayi (PIF) yang

diproduksi oleh 5 perusahaan di Jepang, survei dilakukan terhadap merk

susu yang diproduksi oleh masing-masing perusahaan dan survei

dilaksanakan secara berurutan antara 2 sampai 4 kali. Hasil yang

didapatkan, perusahaan A selama 3 kali produksi PIF ternyata produknya

masih mengandung E. Sakazakii, sedangkan untuk perusahaan C dan E

hanya sekali saja produknya yang mengandung E. Sakazakii. (Lihat Tabel

5)

4. Tes kepekaan Obat terhadap E. Sakazakii yang sudah terisolasi:

Penyebaran harga minimum inhibitory concentrations (MICs) dari

berbagai obat terhadap 9 strain terisolasi ditunjukkan pada Tabel 6.

Konsentrasi antimikroba golongan obat penisilin, MICs untuk ampisilin

(ABPC) berkisar antara 16-128 µg/ml, dan untuk piperasilin (PIPC)

berkisar antara 2-32 µg/ml. Untuk antimikroba kelompok obat cephem,

MICs untuk cefotaxime (CTX) berkisar antara 0,03-1 µg/ml, dan

ceftriaxone (CTRX) berkisar antara 0,03-2 µg/ml. Selain itu, MICs untuk

cefoperazone (CPZ) konsentrasinya berkisar antara 0,5 hingga 2 µg/ml,

untuk seftazidim (CAZ) konsentrasinya berkisar antara 0,06-0,25 µg/ml,

untuk cefpirome (CPR) konsentrasinya berkisar antara 0,03-0,12 µg/ml,

dan untuk cefozopran (CZOP) konsentrasinya berkisar antara 0,06-0,12

µg/ml.

Harga MICs untuk kelompok obat antimikroba penem, meropenem

(MEPM) berkisar dari ≤ 0,008-0,03 µg/ml. Untuk kelompok gentamicin

(GM), obat antimikroba aminoglikosida berkisar 0,25-0,5 µg/ml. Untuk

kelompok lincomycin (LCM), obat antimikroba lincomycin berkisar 128-

128 <µg/ml. Untuk kelompok eritromisin (EM), obat antimikroba

macrolide berkisar antara 16-64 µg/ml. Untuk kelompok minocycline

(Mino), obat antimikroba tetrasiklin berkisar 0,5-4 µg/ml. Untuk

kelompok kloramfenikol (CP), obat antimikroba kloramfenikol berkisar 4-

16 µg/ml. Untuk kelompok siprofloksasin (CPFX), obat kuinolon berkisar

dari ≤0,008-0,015 µg/ml. Sedangkan untuk kelompok rifampicin (RFP)

berkisar antara 2-8 µg/ml.

Nilai MIC90 dari beberapa CTX, CTRX, CPZ, CAZ, CPR, CZOP, GM,

MEPM, dan CPFX adalah 1 – 2 – 2 – 0,25 – 0,12 – 0,12 – 0,5 – 0,03 dan

0,015 µg/ml yang menunjukkan bahwa E. sakazakii sangat sensitif

terhadap obat ini. Nilai MIC90 dari beberapa PIPC, EM, Mino, CP, dan

RFP adalah 32, 64, 4, 16, dan 8 µg/ml yang menunjukkan bahwa E.

sakazakii ini cukup sensitif terhadap obat ini. Namun, nilai MIC90 dari

ABPC dan LCM adalah 128 dan 128 <µg/ml yang menunjukkan bahwa E.

sakazakii tahan terhadap 2 jenis obat ini.

D. PEMBAHASAN

Di Eropa dan Amerika Serikat, beberapa penelitian telah mengangkat isu

penting tentang laporan kasus infeksi E. sakazakii pada bayi yang menggunakan

produk PIF. Menanggapi laporan infeksi pada bayi yang lahir dengan berat badan

rendah. Departemen Kesehatan, Perburuhan dan Kesejahteraan di Jepang secara

hati hati mempublikasikan hal ini pada bulan Mei 2007 dengan judul "Penanganan

secara higienis terhadap susu formula untuk bayi". Namun, infeksi baru terjadi

pada tahun 2009.

Dalam studi pendahuluan mengenai infeksi yang disebabkan oleh E.

sakazakii, kita isolasi Enterobacteriaceae sebesar 24,2% dari sampel PIF yang

ada. Iversen dan Stephan berhasil mengisolasi 7 jenis Enterobacteriaceae dalam

kultur medium EE yaitu : E. sakazakii dalam 2 sampel, Pantoea spp. dalam 2

sampel, E. cloacae dalam 1 sampel, K. pneumoniae subsp. ozaenae dalam 1

sampel, ficaria Serratia dalam 1 sampel, aquatilis Rahnella dalam 1 sampel, dan

Citrobacter freundii dalam 1 sampel.

Kami membandingkan temuan ini dengan 11 jenis bakteri yang berhasil kita

isolasi. Sebanyak 4 jenis bakteri, E. sakazakii, E. cloacae, K. pneumoniae subsp.

ozaenae, dan Pantoea spp. ditemukan di kedua penelitian sementara 3 lainnya

jenis bakteri yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa bahan baku dapat

terkontaminasi dengan berbagai bakteri di lingkungan pabrik selama produksi.

Selain itu, tingkat deteksi E. sakazakii dalam penelitian ini adalah 6,0%,

sedangkan laporan oleh Kongo dan Kandhai et al menyebutkan bahwa tingkat

keberadaan bakteri ini masing-masing 28,6 dan 20,6%, yang 3 sampai 4 kali lebih

tinggi. Namun, 20% bakteri E. sakazakii terdapat dalam jumlah sedikit untuk

sampel yang diproduksi oleh Perusahaan C di Jepang dan pada 20% sampel dari

Korea. Persentase ini adalah serupa dengan yang dilaporkan oleh Kongo dan

Kandhai et al. Oleh karena itu, tingkat deteksi mungkin tergantung pada keadaan

kontaminasi pabrik.

Selanjutnya Iversen dan Stephan menyelidiki 82 sampel PIF menggunakan

2 jenis media VRBG dan DFI untuk proses isolasinya dan melaporkan 2,4%

isolasi mengandung E. sakazakii. Dengan menggunakan metode yang dilakukan

oleh Iversen dan Stephan, kami dapat mengisolasi E. sakazakii sebanyak 4,7 dan

5,4%, ternyata persentase ini 2 kali lebih tinggi daripada yang dilaporkan oleh

Iversen dan Stephan.

Mengenai perkiraan tingkat kontaminasi E. sakazakii, Muytjens et al.

melakukan survei terhadap produk PIF di berbagai negara dan berhasil

mengisolasi E. sakazakii sekitar 14,2% sampel yang berisi bakteri dengan kadar

36-66 CFU/100 g. Kami menemukan tingkat kontaminasinya sekitar 0,36-0,91

MPN/100 gr, sebanding dengan yang dilaporkan oleh Muytjens et al. Namun,

dalam beberapa kasus jumlah bakteri yang mengkontaminasi produk PIF ada yang

berkisar antara 1 – 7 dari apa yang ditemukan oleh Muytjens et al. Hal ini

kemungkinan terkait dengan waktu survei, perbedaan jenis medium uji, ada atau

tidak adanya budaya, bahan, dan keadaan kontaminasi pabrik.

Kita di sini menunjukkan kontaminasi bakteri terhadap produk PIF di

Jepang, meskipun pada tingkat yang rendah. Dengan demikian PIF tidak steril.

Perhatian harus dilakukan mengenai pertumbuhan bakteri dalam botol bayi selama

pembuatan susu pada suhu rendah dan penyimpanan pada suhu kamar untuk

jangka waktu lama. Banyak laporan telah dibuat pada infeksi bayi karena bakteri

jenis Pantoea. Dengan demikian kehati-hatian sangat diperlukan mengenai

kontaminasi produk PIF oleh bakteri jenis Pantoea dan E. sakazakii.

Kami melakukan tes sensitivitas strain E. sakazakii yang kami isolasi, dan

membandingkan nilai-nilai MIC90. Ternyata E. sakazakii sangat sensitif terhadap

CTX, CTRX, CPZ, CAZ, CPR, CZOP, GM, MEPM, dan CPFX. E. Sakazakii

cukup sensitif terhadap PIPC, EM, Mino, CP, dan RFP. Namun, E. Sakazakii

tahan terhadap ABPC dan LCM. Demikian juga, Muytjens dan van der Ros-van

de repe melaporkan bahwa E. sakazakii sensitif terhadap PIPC, CTX, CTRX,

CPZ, CAZ, GM, dan CPFX, sedangkan dia tahan terhadap ABPC dan CP. Saham

dan Wiedemann menunjukkan bahwa jenis bakteri sensitif terhadap PIPC, CTX,

CTRX, CPZ, CAZ, GM, MEPM, Mino, dan CPFX, sedangkan bakteri tahan

terhadap LCM dan EM. Dengan demikian, dalam studi ini, E. sakazakii

ditemukan sebanyak 6,0% dari sampel PIF yang diteliti, hal ini menunjukkan

bahwa produk PIF yang dijual dipasaran dapat terkontaminasi dengan jenis

bakteri ini, walaupun probabilitas rendah. Selain itu, tes terhadap obat antimikroba

menunjukan bahwa bakteri ini tahan (resistensi) terhadap obat jenis ABPC dan

LCM.