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EXTRAÇÃO DE DNA E RNAENZIMAS DE RESTRIÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASLABORATÓRIO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS
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Coleta de material biológico:
Quando?De quem?Como?Tratamentos?Quanto mais fresco melhor!Quantidade aceitávelBoa conservação
EPI!Contenção!
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Extração de DNA
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• Sangue• Tecidos• Células de cultura• Extração plasmídeos de células bacterianas• Purificação de DNA de gel• ...
1. Extração de DNA
De onde podemos extrair DNA?
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Material de pacientes e controles - Lapoge
Sangue total
Buffy coats
Amostras de tecido
1. Extração de DNA
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ObjetivosObjetivos?
Genotipagem?
Sequenciamento?
IntegridadePureza
Quantidade
PCR – tamanho?
Quantificação de RNA - Expressão?
1. Extração de DNA
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1. Extração de DNA
Fundamentos
1. Lisar eritrócitos (choque osmótico)
2. Lisar leucócitos (detergentes)
3. Inativar DNAse (quelante -EDTA)
4. Precipitar/degradar proteínas (sais/proteinase)
5. Precipitar DNA (etanol)
6. Reidratação do DNA em água ou tampão
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Principais Métodos
1.Fenol-Cloróformio
2.Salting-out
3. Kits com colunas
1. Extração de DNA
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1. Lise I: eritrócitos
2. Lise II: leucócitos
3. Fenol-clorofórmio
4. Precipitação etanol
Fenol-Cloróformio
1. Extração de DNA
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• Barato• Simples• Boa quantidade• Boa qualidade• Estabilidade do DNA
• Contaminação da amostra por fenol
• Reagentes tóxicos!
1. Extração de DNA
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http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002
Salting-out 1. Extração de DNA
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BaratoSimplesBoa quantidadeBoa qualidadeNão tóxico
Estabilidade do DNA?Sais contaminantes
1. Extração de DNA
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1. Extração de DNA Kits
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MUITO SimplesBoa quantidadeBoa qualidadeNão tóxico
CaroEstabilidade do DNA
1. Extração de DNA
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• Similar a extração de DNA• Protocolo bem mais cuidadoso• Molécula muito mais instável• Amostra pode ser bem conservado em TRIzol,
RNAlater, etc.) - snapshot• É preciso separá-la do DNA
2. Extração de RNA
Extração de RNA: Análises de expressão
• TRIzol• RNAlater• Kit com colunas
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2. Extração de RNA
1. Lise I: eritrócitos
2. TRIzol (fenol-guanidina)
3. Clorofórmio
4. Precipitação etanol
TRIzol
Pode ser usado para extração de RNA, DNA e Proteínas!
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Kit com colunas
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Transcrição reversa
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(Quebit)
(Nanodrop)
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Espectrofotômetro - Nanodrop
260nm – DNA/RNA280nm – proteína, fenol,..230nm – contaminantes (carboidratos, fenol,..)
260/230 ~1,8260/230 ~2,0
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Armazenar?
DNA: -20◦C
Estoque
Uso (diluído)
RNA: -80◦C
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Enzimas de
restrição
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• Endonucleases produzidas por bactérias para se defender de vírus.
• Quebram o DNA em fragmentos menores, não infecciosos.
• Reconhecem sítios específicos (sítios de restrição) no genoma e a corta.
• São conhecidos mais de 3000 enzimas
Enzima de restrição:
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Enzima de restrição: tipos de clivagem
Fragmentação DNA!Clonagem!Genotipagem!...
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RFPL: Polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição
Detecção dos polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs – single nucleotide polymorphisms).
Os primers utilizados na PCR flanqueiam a região que contém, ou não, o sítio de clivagem reconhecido pela enzima de restrição utilizada.
O produto da PCR é posteriormente submetido à ação da enzima de restrição.
Enzima de restrição: Detecção de SNPs
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Enzima de restrição: como ocorre a clivagem
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3´ CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTACGTA5´5´ GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCATGCAT3´
3´ CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTACGTA5´ 5´ GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCATGCAT3´
2
1
2/21/22/2 1/21/12/2 1/1
2/2 1/2 1/1
Enzima de restrição: resultado da restrição
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