u4 cinetica enzimatica (1)
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ENZIMAS
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Las enzimas son proteínas
� Catalizan reacciones químicas necesariaspara la sobrevivencia celular
� Sin las enzimas los procesos biológicosserían tan lentos que las células no podríanexistir.
� Las enzimas pueden actuar dentro de lacélula , fuera de ésta, y en el tubo de ensayo.
E + SE + S�������� ESES��������EP EP �������� E + PE + P
E E E E
2
La enzima disminuye la energía de activación
Tiempo de la reacción
E + S
E + P
Sin enzimaCon enzima
• La Ea de la hidrólisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la acción de las enzimas, acelerando la reacción 1014 x
• El aumento de temperaturanecesario para producir la reacción no catalizada seria de 529ºC
3
Enzima - Catalizador
� Tanto la enzima como el catalizadoraceleran la velocidad de una reacciónquímica.
� Una enzima puede transformar 1000moléculas de sustrato/ segundo
� Las enzimas tienen 3 propiedades que loscatalizadores NO tienen
• Especificidad por el sustrato
• Se inactivan por desnaturación
• Pueden ser reguladas
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� Las enzimas se unen a los reactivos(sustratos) reduciendo la energía deactivación
� Cada enzima tiene una forma únicacon un sitio o centro activo en el quese une al sustrato
� Después de la reacción, enzimas yproductos se separan.
� Las moléculas enzimáticas no hancambiado después de participar en lareacción
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Las enzimas cumplen su papel catalítico gracias a:
• Fijación estereoquímica complementaria del
sustrato
• Transformación catalítica del mismo
En ambas funciones participan:
• Cadenas laterales de los aminoácidos
• Grupos o moléculas no proteicas:
� Grupos prostéticos
� Iones metálicos
� Cofactores
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Los siguientes hechos:� Especificidad de la reacción enzimática� Carácter heterogéneo de la catálisis enzimática
Nos llevan a postular la existencia de un CentroActivo en la molécula de enzima, capaz de:
� Fijar específicamente al sustrato� Transformarlo catalíticamente.
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Enzima
Sitio activoSitio activo
SustratoSustrato
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� Complementariedad geométrica
� Complementariedad de cargas, unionesiónicas
� Modelos:
� Encaje inducido
� Llave – cerradura.
� Estado de transición
La unión del sustrato es muy específica
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Teorías de la acción enzimática, 1
Modelo de Llave y CerraduraModelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)(Emil Fischer)
Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,
de la misma manera que una llave se ajusta a su
cerradura.
Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se
considera insuficiente al no explicar algunos fenómenos
de la inhibición enzimática
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Teorías de la acción enzimática, 2
Modelo de Ajuste InducidoModelo de Ajuste Inducido (Koshland)(Koshland)
Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración
en su estructura por el hecho físico de la unión.
Está mucho más de acuerdo con todos los datos
experimentales conocidos hasta el momento.
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Teorías de la acción enzimática, 3
La teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidad
definiendo la acción enzimática como
Estabilización del Estado de TransiciónEstabilización del Estado de Transición
Según lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidad
complementario no al substrato o al producto, sino al
estado de transición entre ambos.
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Una enzima puede unir dos sustratos en su sitio activo
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Cinética Enzimática
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Cinética Enzimática
� La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimática, que se evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada.
� Las variables más importantes son:
• Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores)
• pH
• Temperatura
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� Ella está basada en la medición de la velocidad de reacción. Así en la reacción:
� Se tendrá:
� La velocidad de reacción (pendiente) disminuye continuamente a partir de unvalor máximo inicial. Esto se puede deber a:
� Desaturación de la enzima con sustrato, por disminución de laconcentración del sustrato
� Inactivación de la enzima por su inherente inestabilidad
� Inhibición por el producto
� Desplazamiento del equilibrio, si la reacción es reversible
dt
ds
dt
dpv −==
ES P
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Baja concentración de sustrato
ALTA concentración de sustratoSATURACION
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v
[s]
Efecto de la concentración de substrato
.
..
. . . . .
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dt
t
s
p[ ]
Concepto de velocidad inicial
d[P]v = , t 0
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E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:
Hay un número limitado de sitios en la enzima para
fijar el sustrato; una vez que están ocupados todos,
por mucho que aumente la concentración de sustrato,
la velocidad permanecerá constante tendiendo a un
valor asintótico
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El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámica
del sistema
E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
Sistema No admite solución analítica.
- Simulaciones numéricas
- Hipótesis que lo simplifiquen
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Hipótesis de Michaelis Hipótesis de Michaelis -- MentenMenten
E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
- La primera parte del mecanismo,
E + S ESk+1
k-1Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:
ES E + Pk+2
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[ ][ ]
[ ]
( )K
E S
ES
es
x
e x s
xm = = =−0
xe s
K sm
=+
0
vk e s
K sm
=+
+2 0
k e V+
=2 0 max
vV s
K sm
=+
max
Hipótesis de
Michaelis-Menten
Equilibrio rápido
v k x= +2
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Hipótesis de estado estacionarioHipótesis de estado estacionario
Según veíamos en la simulación numérica, hay un tiempo
relativamente prolongado en el curso de la reacción en el
que la variación de complejo [ES] es prácticamente igual
a cero:
dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0
A partir de esta expresión podemos llegar a obtener una
expresión que nos da la velocidad para la concentración
de substrato
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( )dx
dtk es k k x= = − +
+ − +0 1 1 2
( ) ( )k es k e x s k k x+ + − +
= − = +1 1 0 1 2
xe s
k k
ks
e s
K sm
=+
+
=+− +
+
0
1 2
1
0
vV s
K sm
=+
max
v k x=+2
k e V+ =2 0 max
Hipótesis de
estado estacionario
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A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten y
Estado estacionario, llegamos a la ecuación
Km + sv =
Vmax * s
La única diferencia radica en el significado de Km:
Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M.
Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.
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Significado de la constante Km
1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES
(en condiciones de equilibrio rápido)
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato
(en condiciones de equilibrio rápido)
3. Mide la función de fijación (en cond. de equilibrio rápido)
4. Concentración de sustrato para la que la velocidad se hace
igual a la mitad de la máxima (s0.5)
Se define para una pareja enzima-sustrato
Se mide en unidades de concentración
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Significado de la constante Vmax = k+2 e0
1. Velocidad asintótica para s
2. Directamente proporcional a la concentración de
enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima
por k+2)
3. Mide la función de transformación catalítica
4. Se expresa en unidades de velocidad
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Modelo Cinético de Michaelis Menten
E + S ES E + Pk+1
k2
k3
29
V1 = k1[E][S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]
En el equilibrio la V de formación de ES es igual a la
velocidad de descomposición
V1 = V2 + V3
k1[S][E] = (k2 + k3) [ES]
[E] = [ET] – [ES][ES] = [ET] [S] / (Km + [S])
Km = (k2 + k3) / k1
Según la hipótesis del estado estacionario, la [ES] es pequeña y constante a lo largo de la reacción
Leonor Michaelis
(1875-1949)
Maud Menten
(1879-1960)
producto
sustrato
enzimaES
Modelo de la reacción)
Modelo cinético de Michaelis-Menten
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Verificación del modelo cinético de Michaelis-Menten
Cuando la [S] es pequeña, la reacción
enzimática es de orden 1
Cuando la [S] es grande, la reacción
enzimática es de orden 0
Relación entre Km y VmaxMichaelis y Menten
Concentración de Sustrato [S]
Ve
loc
ida
d d
e la
re
ac
ció
n (
v)
Km
Vmax
Vmax/2
La Km es la concentración de sustrato donde se obtiene la mitad de la Vmax
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Estimación gráfica de los parámetros cinéticos
Concentración de Sustrato [S]
Ve
loc
ida
d d
e la
re
ac
ció
n (
v)
Km
Vmax
Vmax/2
A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustratoA menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato
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R eprese ntac ión d irec ta
s
0 20 40 60 80 100
v
0
20
40
60
80
100
Km
Vmax
vV s
K s
mx
m
=+
34
Representación de Lineweaver-Burk (doble recíproca)
Representación doble recíproca
(1/v vs. 1/[S])
Representación de Lineweaver-Burk
Cálculo de KM y Vmax (método alternativo)
1/v vs. 1/[S]v vs. [S]
La estimación de los parámetros cinéticos se
hace a partir de una línea recta y permite
calcular KM y Vmax con mayor exactitud
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1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s V
m
mx mx
= ⋅ +-1/Km
1/Vmax
Representación Lineweaver-Burke
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s-20 0 20 40 60 80 100 120
s/v
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
s
v Vs
K
Vmx
m
mx
= ⋅ +1
-Km
Representación Hanes
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v/s0 2 4 6 8 10 12 14 16
v
0
20
40
60
80
100
v Kv
sVm mx= − ⋅ +
Vmax
Representación de Eadie-Hofstee
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Métodos de linealización para determinación parámetros cinéticos
Método Eje Y Eje X Intercepto
Eje Y
Intercepto
Eje x
Pendiente
Lineweaver-Burke
1/v 1/s 1/V -1/K K/V
Hanes s/v s K/V -K 1/V
Eadie-Hofstee
v v/s V V/K -K
40
Definición Actividad Enzimática
� Es el número de moles de sustrato quereaccionan para formar producto, por mol deenzima y por unidad de tiempo. Esto suponeque la enzima está plenamente saturada consustrato y por tanto que la reacción se efectúacon su máxima rapidez
� El índice de recambio muestra la eficienciaimpresionante de la catálisis enzimática
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Efecto del pH en la ENZIMAEfecto del pH en la ENZIMA
Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividadCada enzima tiene un pH óptimo para su actividadEl pH afecta las interacciones iónicasEl pH afecta las interacciones iónicas
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1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:
- Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del substrato
2. Sobre la transformación catalítica del substrato
3. Sobre la estructura de la proteína enzimática
Efecto del pH
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En el efecto de la temperatura hay dos posibles mecanismos:
1. Aceleración de la reacción según la ecuación
de Arrhenius
k = A exp (-Ea/RT)
2. Desnaturalización térmica de la proteína
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Efecto de la temperatura en la ENZIMAEfecto de la temperatura en la ENZIMA
Cada enzima tiene una temperatura óptima.Cada enzima tiene una temperatura óptima.
Temperatura
15º 40º 75º
Aumento de la velocidad
Desnaturación por calor
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ORGANISMOS TERMÓFILOS
� Son organismos que viven a altas tº y realizansus reacciones enzimáticas a estas altas tº
� Ejemplos son los que viven en las aguastermales
� Es tema de investigación el aislamiento de lasenzimas de estos organismos para desarrollarprocesos industriales en condiciones másextremas
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CoenzimasCoenzimas
�� Las coenzimas son pequeñas moléculas Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas, que se orgánicas, que se unen unen a la enzima.a la enzima.
�� Las coenzimas colaboran en la reacción Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo transitoriamente enzimática recibiendo transitoriamente algún grupo químico: Halgún grupo químico: H+ + , OH, CH, OH, CH33 . .
�� La enzima sin la coenzima recibe el nombre La enzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMAde APOENZIMA
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El NAD es una coenzima aceptora de H
Sustrato oxidado
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Algunas enzimas requieren metales para Algunas enzimas requieren metales para mejorar su actividad mejorar su actividad
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� Así esta actividad corresponde al máximo potencialcatalítico que las enzimas poseen para un determinadoconjunto de condiciones ambientales. Luego, estasdeben ser consideradas en las expresiones matemáticasrepresentativas del proceso enzimático.
� Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde lavelocidad inicial de reacción no es representativa del realpotencial catalítico de la enzima.
� Se asume que la velocidad inicial de reacción esproporcional a la concentración de proteína enzimática.
50
Inhibición enzimática
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Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de
interacciones con el centro activo u otros centros específicos
(alostéricos).
Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la
enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática.
De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:
I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo
II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la
molécula, causando un cambio conformacional con
repercusión negativa en la actividad enzimática.
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Inhibición enzimática isostérica
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Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:
E + I E’
ES + I ESI
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Inhibición reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo
haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción
catalítica: Inhibición No Competitiva
(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato
una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo
se conoce como Inhibición Anticompetitiva
55
Inhibición Competitiva
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Inhibidores Competitivos
� Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima
� Se une solo a la enzima libre� V máx no se altera y K M cambia
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Inhibición competitivaInhibición competitiva
AlAl aumentaraumentar lala cantidadcantidaddede SUSTRATOSUSTRATO elelinhibidorinhibidor competitivocompetitivo esesdesplazadodesplazado yy sese formaformaproductoproducto
58
59
E ES
EI
I
S
E + P
Características:
- Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del
sustrato.
- El inhibidor es tan específico como el sustrato
Se define una constante de
equilibrio de disociación del
inhibidor:Ki =
[E] [I]
[EI]
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En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentración
del complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-
ma de ecuaciones
vV s
Ki
Ks
mx
m
i
=
+
+1
Ke x y s
x
Ke x y i
y
m
i
=− −
=− −
( )
( )
0
0
Que resuelto para x nos da
xe s
Ki
Ksm
i
=
+
+
0
1
De donde
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Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la
Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy
altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia
del inhibidor competitivo.
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KmSin
inhibidor
Kmcon
inhibidor
Sin inhibidor
Con inhibidor
El inhibidor competitivo aumenta la Km
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1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/Km
-1/(Km(1 + i/Ki))
1/Vmax
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
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Ejemplo Inhibidor Competitivo
� Ácido succínico + FAD == ácido fumárico + FADH2
� El inhibidor competitivo es el ácido malónico
� Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico
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Ácido Fólico y Sulfanilamida
� La sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p - aminobenzoico (PABA)
� PABA es el punto de partida para la síntesis de ácido fólico en las bacterias
� El ácido fólico es una vitamina esencial para la proliferación (división) bacteriana
� Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones
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Metotrexato y Dihidrofolato
� El ácido fólico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa
� Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA
� Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA
67
Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato
No se forma producto
68
Inhibición No Competitiva
69
Inhibidor No Competitivo
� Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima
� Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato
� Por acción del inhibidor disminuye la Vm
pero el valor de Km no se altera
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Inhibición NO competitivaInhibición NO competitivaInhibición NO competitivaInhibición NO competitiva
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Inhibidor NO competitivoInhibidor NO competitivo
El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo
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E ES
EI
I
S
E + P
I
ESI
SInhibición
No Competitiva
Características:
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E
y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos
74
75
Inhibición Acompetitiva o Incompetitiva
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Inhibidor AcompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centroactivo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho y,por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera,aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda laenzima esté como complejo ES, el inhibidor puedeenlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.
Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, portanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima,disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI noconduce a productos y Vm disminuye.
77
Inhibidor Acompetitivo
� Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima
� Se une sólo al complejo enzima-sustrato� Los efectos que tiene: disminuye el valor
de Km y también el de Vmáx
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E ES
S
E + PI
ESI
Inhibición
Anticompetitiva
El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;
el complejo ESI no es productivo
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Modelo Kap Vap
Inh comp Km(1+i/Ki) Vm
Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)
Inh acomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)
Determinación de parámetros cinéticos de inhibición
80
Inhibición Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
químico de la enzima, modificándola covalentemente
- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,
sino por una constante de velocidad ki:
E + I E’
- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los
inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación
del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
tóxicos.
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Inhibidores Irreversibles
� Producen inactivación permanente de laactividad enzimática
� Se interfiere con el normal desarrollo deuna reacción o vía metabólica
� Ejemplos: p-cloromercuribenzoato,yodoacetato, diisopropilfluorfosfato
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Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
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Inhibición enzimática alosterica
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Enzimas Alostéricas
� Son enzimas cuya estructura proteica está formadade varias subunidades
� No se rigen por la cinética de M - M� Además del sitio o centro activo tienen sitios
alostéricos o de regulación� Sitio activo/sustratos;� Sitio alostérico/moduladores o reguladores� La relación entre la velocidad de reacción y la
concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea
85
Enzimas alostéricas
� Las enzimas alostéricaspresentan estructuracuaternaria.
� Tienen diferentes sitiosactivos, unen mas de unamolécula de sustrato
� La unión del sustrato escooperativa
� la curva de velocidadpresenta una formasigmoidal
86
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Concepto de Cooperatividad
� La unión de los sustratos al sitio activo deuna subunidad produce un cambioconformacional que por contacto físico setransmite a las subunidades vecinas,facilitando las interacciones
� Modelos de unión: secuencial y concertado� Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas
y sus sustratos
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Moduladores Alostéricos
� También reciben el nombre de efectoresy pueden ser positivos o negativos
� Se unen al sitio alostérico que puedeestar en la misma subunidad que tieneal sitio activo o en las subunidadesregulatorias
� Su unión produce un cambioconformacional que afecta al sitio activo
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Aspartato Transcarbamilasa
� Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil-asp + Pi . Primera reacción en la síntesis de pirimidinas
� Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP
� Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores
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RESUMENRESUMEN
�� LasLas enzimasenzimas sonson proteínasproteínas queque catalizancatalizanlaslas reaccionesreacciones biológicasbiológicas
�� PresentanPresentan especificidadespecificidad porpor susu sustratosustrato�� CadaCada enzimaenzima presentapresenta dosdos parámetrosparámetros
importantesimportantes VmaxVmax (saturación(saturación dede lalaenzima)enzima) yy lala KmKm (medida(medida dede lala afinidadafinidadporpor elel sustrato)sustrato)
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RESUMENRESUMEN
�� LaLa actividadactividad enzimáticaenzimática puedepuede serserinhibida,inhibida, porpor inhibidoresinhibidores competitivoscompetitivos(similares(similares alal sustrato)sustrato) oo porpor inhibidoresinhibidoresnono competitivoscompetitivos..
�� LaLa temperaturatemperatura yy elel pHpH afectanafectan aa lalaenzimaenzima enen susu actividadactividad catalíticacatalítica..
�� AlgunasAlgunas enzimasenzimas requierenrequieren dedecoenzimascoenzimas y/oy/o cofactorescofactores parapara susuactividadactividad..
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