ue 1 cours 1 : signalisation ou métabolisme de

sur 14 Ronéo 1 – UE 1 – Cours 1 (Partie 1) – Ronéo

UE1 Bases Moléculaires et Cellulaires des Pathologies. Dr Katell Peoc’h Le 24/09/2019 de 15h30 à 17h30. Ronéotypeur : Elise Charotte Ronéoficheur : Manon Marchand

UE 1

Cours 1 : Signalisation ou Métabolisme de

l’Information (1ère partie)

L’UE1 Bases Moléculaires et Cellulaires des Pathologies se divise en deux parties :

- Biochimie et Biologie Moléculaire coordonnée par le Dr Katell Peoc’h

- Biologie Cellulaire coordonnée par le Pr Jérôme Larghero

Cette UE comprend 9 CM et 2 EDs.

Les objectifs généraux de l’UE sont de dispenser un socle de connaissance nécessaire à la compréhension des

bases moléculaires des pathologies (manifestations, mécanismes physiopathologiques et traitements) mais aussi

des applications médicales en thérapies moléculaires ciblées, thérapies cellulaires et biothérapies ainsi que de

comprendre le fonctionnement normal de la cellule.

Le but est de nous former aux notions fondamentales de signalisation à la base des communications entre les

cellules, de la régulation de leur prolifération et de leur différenciation.

Les objectifs spécifiques de chaque cours pourront être retrouvés sur Moodle.

L’examen dure 2h00 (notation /20), il est constitué :

- de questions rédactionnelles (75% de l’épreuve, soit /15) :

• en biochimie et bio mol (/10) : des questions à réponse courte (QCROs) ainsi qu’un exercice pratique (sur

données expérimentales)

• en biologie cellulaire (/5) : une question rédactionnelle

- de QCM (25% de l’épreuve, soit /5)

• en biochimie et la bio mol : 4 QCM

• en biologie cellulaire : 6 QCM

C’est la première année où le Dr Peoc’h est en charge de ce cours. Elle accepte de relire la ronéo. Elle a repris la

plupart des diapos du prof précédent mais en a également ajouté. Son mail est : [email protected]

Elle veut surtout que nous connaissions les mécanismes principaux de la transduction.

Vous retrouverez les objectifs de ce cours à la fin de la ronéo.


SOMMAIRE :

I- Communication cellulaire et transduction du signal

A/ Généralités

B/ Différentes voies de communications

C/ Les principaux messagers de la communication cellulaire

D/ Différents types de récepteurs

E/ Principe de la transduction du signal

II- Récepteurs à 7 domaines transmembranaires

A/ Récepteurs 7 TM

1- Les protéines G 2- Les commutateurs moléculaires 3- Les 2nd messagers

B/ Cycle des protéines G

C/ Voie relayant le signal à l’intérieur de la cellule

1- Voie de la protéine kinase A (PKA)

2- Voie de la protéine kinase C (PKC)

3- Signal calcique et voie de la Calmoduline

D/ Terminaison du signal

III- Pathologies liées aux anomalies de la signalisation

Lexique :

AA = acide aminé

DAG = diacylglycérol

IP3 = inositol-triphosphate

Récepteur à 7TM = récepteur à 7 domaines transmembranaires

RCPG = récepteur couplé aux protéines G


I- Communication cellulaire et transduction du signal

A/ Généralités

La transduction du signal est un élément clé de communication intercellulaire et d’adaptation de la cellule à son environnement. Elle s’apparente à une traduction du signal de l’extérieur de la cellule à l’intérieur de la cellule.

Une cellule reçoit en permanence des informations (signaux, stimulus) de son environnement par le biais de molécules chimiques : - Les hormones, les cytokines, les facteurs de croissance, les neuromédiateurs et la matrice extracellulaire

vont induire des changements en réponse à une modification de l’environnement. - Lumière, aromes, odeurs interagissent avec les cellules sensorielles.

La cellule va détecter ces signaux, les intégrer, et les traduire en une réponse intracellulaire appropriée via des modifications biochimiques (changements d’activités enzymatiques, expression de gènes, ouvertures de canaux ioniques…) Les signaux et leurs réponses biologiques, bien que très nombreux, utilisent un nombre réduit de processus fondamentaux.

Souvent, ce processus se termine par la phosphorylation de molécules cibles, qui en changeant d’activité vont changer les activités de la cellule. Contrairement à ce qui était initialement pensé, la signalisation ne se fait pas de façon linéaire un signal/un récepteur/une réponse cellulaire, mais il existe des interactions importantes dans la cellule entre les différentes voies (réseau de molécules de signalisation interagissant entre-elles)

Concernant la communication cellulaire, il existe des interactions entre les cellules, mais également entre les cellules et le milieu extra cellulaire. On distingue 2 grands types d’interactions :

- celle utilisant un messager

- celle se faisant directement par contact (peu abordé dans ce cours car moins complexes & connues)

Les mutations et les effets toxiques, notamment sur des récepteurs, entrainement également très vite des pathologies.

B/ Différentes voies de communications

On peut retrouver les voies :

- endocrine : passage de certaines molécules dans la circulation sanguine pour pouvoir (potentiellement) agir à distance, comme de nombreuses hormones.

- paracrine : l’élément secrété peut interagir de manière très proche, sur des cellules à proximité.

- autocrine : l’effet se produit sur la cellule sécrétrice elle-même ; la sécrétion est soumise à un système de régulation par la cellule.

- juxtacrine : correspond aux interactions cellule-cellule qui se font par l’intermédiaire d’un médiateur.


C/ Les principaux messagers de la communications cellulaires

- Les hormones sont véhiculées par le sang depuis la glande qui les libère jusqu'à l'organe où elles exercent leurs effets. (ex : insuline)

- Les (neuro)médiateurs sont libérés à l'extrémité d'un nerf et transmettent une information à une structure qui peut être nerveuse ou musculaire. (ex: catécholamine, acétylcholine..)

- Les cytokines, produites par le système immunitaire (mode paracrine, autocrine, endocrine) - Les molécules d'adhésion établissent des liens passifs ou impliquent une signalisation intracellulaire. On peut distinguer deux catégories de messagers : - Les molécules hydrophobes (stéroïdes) et les gaz (comme le NO) qui peuvent franchir la membrane. Dans ce

cas-là, il n’y a pas de 2nd messager. - Les molécules hydrophiles (comme l’insuline) qui ne franchissent pas la membrane. Il y a alors

nécessairement un 2nd messager et le plus souvent une amplification du signal.

Rappel : La cellule est physiquement séparée de son environnement par la membrane plasmique. Cette dernière est perméable uniquement aux petites molécules lipidiques qui peuvent diffuser au travers de la bicouche lipidique. (ex : hormones stéroïdes rentrent dans la cellule et vont agir via un récepteur nucléaire sur l’expression des gènes

en se fixant sur des protéines régulatrices) et imperméable aux molécules hydrophiles (ions, polypeptides, protéines)

D/ Les différents types de récepteurs

On retrouve deux grands types de récepteurs :

- Les récepteurs membranaires : le ligand interagit à l’extérieur de la cellule, ce qui s’explique par une absence de pénétration du médiateur dans la cellule. Ces récepteurs sont des protéines membranaires présentant des domaines de part et d’autre de la membrane (domaine intracellulaire et domaine extracellulaire)

Il en existe différents types : • Récepteurs à activité enzymatique

– Récepteur Tyrosine Kinase – Récepteur Tyrosine Phosphatase – Récepteur Guanylate Cyclase

• Récepteur sans activité enzymatique – Canaux ioniques – Récepteurs couplés aux protéines G/ à 7 domaines transmembranaires

- Les récepteurs intracellulaires ou nucléaires retrouvés dans le cytosol des cellules et où le médiateur est

capable de pénétrer et d’interagir avec des récepteurs qui passent ensuite dans le noyau, comme par exemple, les récepteurs des hormones stéroïdiennes.

On distingue également 6 types de récepteurs de transduction :

- Récepteur d’un canal ionique : s'ouvre ou se ferme en réponse à la concentration du ligand signal ou du potentiel de la membrane.

- Récepteur à activité enzymatique : la liaison du ligand au domaine extracellulaire stimule l'activité enzymatique dans le domaine intracellulaire.

- Récepteur serpentin (car il va « serpenter » dans la membrane plasmique et interagir avec différents

éléments) Il s’agit de l’archétype des récepteurs couplés à aux protéines G (avec 7 TM) La liaison du ligand externe au récepteur active une protéine de liaison au GTP intracellulaire, qui régule une enzyme qui génère un second messager intracellulaire.

- Récepteur stéroïde (ou nucléaire) : la liaison de stéroïdes à un récepteur nucléaire permet au récepteur de réguler l’expression de gènes spécifiques.


- Récepteur sans activité enzymatique intrinsèque : interagit avec la protéine kinase cytosolique, qui active une protéine régulatrice des gènes (directement ou par le biais d'une cascade de protéines kinases), modifiant ainsi l'expression des gènes.

- Récepteur d'adhésion : lie les molécules dans la matrice extracellulaire, modifie la conformation, modifiant ainsi son interaction avec le cytosquelette.

E/ Principe de la transduction du signal

L’information peut être transmise de l’extérieur à l’intérieur de la cellule selon 2 grands principes fondamentaux :

- Le passage du ligand au travers de la bicouche lipidique : correspond à l’entrée d’une nouvelle molécule dans la cellule. Les molécules concernées sont les ions, les petites molécules (sucres), les macromolécules.

Il y a une mise en place de différents types de moyen de transport :

- Canaux ioniques : ouverture d’un pore. (Les récepteurs ionotropes sont des protéines transmembranaires qui, après avoir fixé un messager chimique, ouvrent un canal ionique.)

- Transporteurs : transport associé à un changement de conformation (sucres) - Internalisation par endocytose du complexe ligand/récepteur

- La transduction (transmission) du signal

La plupart des molécules sont trop grosses et trop polaires pour entrer dans la cellule. L’information doit donc être transmise à la cellule sans que la molécule apportant cette information ne pénètre directement dans la cellule.

La réponse à une molécule hydrophile extracellulaire (= ligand) va dépendre de l’interaction spécifique au niveau de la face externe de la membrane avec une protéine localisée dans la membrane cellulaire, c’est à dire le

récepteur membranaire. En effet, le récepteur membranaire est une protéine transmembranaire qui, après avoir fixée un ligand, change de conformation et permet l’activation d’une cascade d'événements intracellulaires. Cela correspond à l’apparition d’une nouvelle fonction dans la cellule.

Un site de liaison du domaine extracellulaire reconnaît spécifiquement un ligand venant du milieu extérieur. Il existe une haute affinité ligand/récepteur (Kd de l’ordre de 10-10).

L’interaction ligand-récepteur va modifier la structure tertiaire ou quaternaire du récepteur, y-compris dans son domaine intra-cellulaire.

Le signal peut être transduit selon 2 grands mécanismes :

• Par activation d’une fonction enzymatique (kinase) au niveau du domaine intracellulaire du récepteur lorsque le ligand se fixe au récepteur.

• Par interaction avec une protéine G associée au récepteur au niveau de la face interne de la membrane cytoplasmique.

II- Récepteurs à 7 domaines transmembranaires

A/ Récepteurs 7 TM

Les récepteurs couplés aux protéines G présentent une structure commune. Ils présentent 7 domaines transmembranaires et fonctionnent en monomères.

• Sept domaines hydrophobes permettent à la chaîne d'acides aminés de traverser successivement la membrane d'une face à l'autre.

• L'extrémité N-terminale et les boucles extracellulaires forment le site de liaison du ligand (hormone, molécule-signal).

• L'extrémité C-terminale est située dans le cytoplasme, en relation avec le cytosquelette.


Malgré cette structure commune, les récepteurs aux protéines G répondent à une grande variété de ligands :

- les photons (la lumière) qui agissent sur la rhodopsine des batônnets de la rétine,

- les ions comme le Ca2+,

- des stimuli sensoriels avec des molécules olfactives, gustatives et phéromones,

- des petites molécules endogènes (des AA comme l’acide glutamique et γ-amino-butyrique, des lipides, des nucléosides, des amines comme l’acétylcholine, l’adrénaline, la noradrénaline, dopamine…)

- des protéines (des hormones comme le glucagon ou des protéases comme la thrombine)

On dénombre plus de 1000 RCPG ce qui correspond à 1% du génome. Ils sont les lointains descendants d’un récepteur ancestral aux photons, à l’œuvre dans la rétine : la rhodopsine.

Le signal apporté par le stimulus extracellulaire est transduit à l'intérieur de la cellule, par l'intermédiaire du récepteur. Le récepteur transmet l'information aux protéines-G intracellulaires, qui à leur tour activent ou inhibent des effecteurs intracellulaires.

Composition d’un récepteur à 7 domaines transmembranaires :

• L’extrémité N-terminale extracellulaire peut subir des modifications post-traductionnelles de type N-glycosylation.

• 7 hélices α transmembranaires (TM1 à TM7) reliés par 3 boucles intracellulaires (I1, I2, I3) et 3 boucles extracellulaires (El, E2, E3).

• Un pont disulfure entre les boucles El et E2.

• L'extrémité C-terminale intracellulaire qui possède parfois des sites d'ancrage lipidique dans la membrane plasmique et qui peut être phosphorylée (PP) sur différents résidus.

1- Les protéines G

Leur nom leur vient de leur capacité GTPasique. En effet, elle possède une activité hydrolase leur permettant d’hydrolyser le GTP. Certaines protéines G sont trimériques, c’est-à-dire qu’elles comportent 3 chaines d’AA : les chaînes α, ß et γ. Ces dernières sont liées ensemble par des liaisons électrostatiques et hydrophobes. (liaisons

faibles)

Les protéines G, bien qu’hydrophiles, sont ancrées à la face interne de la membrane cytoplasmique via des groupements lipidiques hydrophobes (acides gras fixés par covalence par modification post traductionnelles) des sous-unités α et γ.

La sous-unité α porte :

- le site de liaison avec le récepteur, - le site de liaison avec un nucléotide guanosine phosphate, - le site catalytique d'hydrolyse du GTP (activité GTPase), - le site de liaison avec l’effecteur

Les sous-unités ß et γ portent aussi des sites de liaisons avec d'autres effecteurs.

La fonction des protéines G repose sur leur capacité à se dissocier en monomères α et βγ induite par l’activation d’un récepteur associé.


2- Les commutateurs moléculaires

Dans la cellule, les réactions ne se déroulent pas toutes de façon continue. Les protéines G appartiennent à un grand groupe de molécules : les commutateurs moléculaires, qui oscillent entre un état activé « on » et un état inactivé « off » sans étape intermédiaire pour passer d’un état à un autre. Le point commun entre ces protéines est de subir un changement conformationnel selon qu’elles sont liées à un nucléotide triphosphate ou diphosphate. (GTP ou GDP)

Le plus souvent, le nucléotide est une guanosine triphosphate (GTP) et le commutateur moléculaire une GTPase ou protéine G. L’activité du commutateur est donc gouvernée par le nucléotide qui lui est associé. Les protéines sont activées par fixation du GTP par l’enzyme GEF (protéines facteurs d’échange) et sont inactivées par hydrolyse du GTP par l’enzyme GAP. (GTPase Activated Protein), permettant un retour à l’état inactif.

3- Les 2nd

messagers

La liaison à l'extérieur de la cellule du ligand à un récepteur membranaire active la production d'une autre molécule dans le cytoplasme, le second messager, qui transmettra à son tour le signal aux cibles intracellulaires.

Les seconds messagers appartiennent à diverses catégories de corps chimiques. Leur structure chimique est

extrêmement variable.

- Ions : Ca2+

, H+, Fe

2+

- Alcools (carbohydrate) dérivés des phospholipides : inositol-phosphates - Nucléotides particuliers : AMPc, GMPc, cADP-ribose - Lipides membranaires : diglycérides, cholestérol, céramides

Mais tous agissent via des changements de concentration induits par la fixation ligand/récepteur.

Les 2nd

messagers vont souvent activer des protéines kinases ou phosphorylases (n=520). Une protéine kinase est une protéine qui a la capacité d’ajouter un groupement phosphorylé sur la fonction alcool d’un AA. (sérine, thréonine, tyrosine possèdent un -OH) Le phosphate est fourni par l’hydrolyse d’un ATP en ADP.

L'addition d'un petit résidu phosphate modifie très fortement la fonction des protéines car étant chargé négativement :

- il change la structure tridimensionnelle de la protéine et - il permet des interactions avec d'autres protéines.

Par conséquent, on observe selon les cas une activation ou une désactivation.

De plus, la phosphorylation est souvent la première réponse dans le temps en réponse aux stimuli

cellulaires (1ère

vague de modifications post-traductionnelles).

On retrouve comme sites de phosphorylation : - Les sérines à 86% - Les thréonines à 12% - Les tyrosines à 2% (cela est lié à l’encombrement stérique de cette AA aromatique)

Les protéines sérine/thréonine kinase sont le type le plus fréquent des kinases cytoplasmiques et sont

responsables de la majorité des phosphorylations dans la cellule.


Les protéines tyrosine kinase (n=90) constituent le type prédominant de récepteur à activité kinase. (une cinquantaine sont connues) Il existe cependant de nombreuses Tyr kinases cytoplasmiques.

Un troisième type de kinase est représenté par les kinases à double spécificité qui peuvent phosphoryler tant des tyrosines que des sérine/thréonines.

On retrouve aussi des phosphatases (n = 250), le plus souvent cytosoliques, mais il existe quelques récepteurs.

NB : 30% des protéines sont régulées par phosphorylation/ déphosphorylation. Environ 1 à 2 % du génome humain va coder pour ces protéines kinases et phosphatases. On remarque qu’il existe

environ deux fois plus de protéines kinase que de phosphatases. (520 vs 250)

Quelles sont les conséquences et l’intérêt de l’utilisation des seconds messagers ?

Cela offre une possibilité de diffusion vers d’autres compartiments cellulaires.

Cela permet aussi l’amplification du signal : en effet, l’activation d’une macromolécule conduit à la formation de nombreuses molécules de 2nd messager. Une faible concentration de molécules signal dans l’environnement sera alors souvent suffisante pour induire les modifications cellulaires.

Enfin, on retrouve des 2nd messagers communs à plusieurs voies de signalisation : ainsi, on a une intégration de signaux venant de stimuli différents. (Ce qui permet une régulation plus fine que si les voies séparées étaient indépendantes mais peut aussi entraîner des interférences.)

L’activation des effecteurs et le niveau de 2nd messager est donc la résultante d’un équilibre.

Par exemple dans la cellule, le niveau d’AMP cyclique (qui est le produit de l’adénylate cyclase, enzyme localisée dans la membrane plasmique des cellules) est le résultat d’un équilibre entre :

- l’activité de synthèse des protéines Gαs (activatrice) et Gαi (inhibitrice) et donc de leurs ligands activateurs respectifs.

- l’activité de dégradation : activité de la phosphodiestérase (activée par l’insuline)

B/ Cycle des protéines G

La fonction des protéines G repose sur leur capacité à se dissocier en monomères α et βγ induite par l’activation d’un récepteur associé.

• Sous sa forme trimérique, la protéine G est inactive et la sous-unité α est liée à un GDP et aux deux autres sous-unités. Elle se place dans la membrane et se lie latéralement au récepteur, attendant de recevoir de celui-ci le signal activateur.

• La liaison du ligand active le récepteur. Sa conformation change et induit à son tour une modification conformationnelle de la sous-unité α. Le GDP est alors relargué et un GTP (dont la concentration est 10 fois supérieure dans le cytoplasme) vient le remplacer. Cette réaction est catalysé par l’enzyme GEF.

• La liaison au GTP induit la dissociation de la sous-unité α du récepteur et du complexe βγ.

• Les sous-unités dissociées vont agir sur des protéines cibles (= effecteurs) au niveau de la membrane.

• La durée de l’activation de la protéine G est contrôlée par la sous-unité α qui, par sa fonction GTPase est capable d’hydrolyser le GTP en GDP. Lorsque le GTP est hydrolysé, la sous-unité α se réassocie au dimère βγ.


L’interaction entre récepteur et protéine G est de type catalytique. Après que la protéine G se soit dissociée du récepteur activé, un autre trimère peut venir se fixer et le cycle recommence. Ainsi, un complexe ligand/récepteur peut activer plusieurs protéines G dans une courte période, amplifiant le signal original.

La caractéristique commune de ces réactions est que les protéines G vont agir sur un effecteur, souvent de type enzymatique qui va modifier la concentration d’une petite molécule dans la cellule : le second messager.

C/ Voie relayant le signal à l’intérieur de la cellule

1- Voie de la protéine kinase A (PKA)

La concentration en AMPc peut affecter toute une série de processus cellulaires via l’activation d’un seul type de protéine kinase : la PKA (Sérine/thréonine kinase)

Les Protéines Kinase A sont constituées de 2 sous-unités catalytiques et de 2 sous-unités régulatrices.

Les sous-unités catalytiques phosphorylent les résidus Ser ou Thr présents dans la séquence : Arg-Arg-X-Ser/Thr.

A l’état basal, l'inhibition des sous-unités catalytiques par les sous-unités régulatrices résulte de

l'occupation du site catalytique par un peptide pseudo-substrat Arg-Arg-X-Ala, qui ne peut pas être phosphorylé (il n'y a pas de groupement hydroxyle sur la chaine latérale de l'Ala). La fixation d'AMPc sur les 2 sites de chaque sous-unité régulatrice de la PKA induit un changement de conformation de ces sous-unités. Les deux sous-unités catalytiques sont alors relarguées, de même que le pseudo-peptide : les sous-unités catalytiques deviennent actives.

Concernant la terminaison du signal, l'AMPc (second messager) est hydrolysé en 5'AMP par une phosphodiestérase ce qui entraîne l'extinction du signal.

Si le taux d'AMP cyclique diminue, les sous-unités régulatrices perdent leur ligand et, reprenant leur liaison avec les sous-unités catalytiques, les inhibent à nouveau.

Il y a environ 100 protéines substrats de la PKA. La PKA joue un rôle dans la modulation du profil d’expression des gènes et dans la modulation de l’activité des protéines (ex : activités enzymatique)

Certaines de ces protéines substrats de la PKA sont activées par phosphorylation : elles appartiennent aux voies

métaboliques du jeune ou de l'effort : glycogénolyse, gluconéogenèse, lipolyse, synthèse d'hormones :

catécholamines, hormones thyroïdiennes.

D'autres sont au contraire inhibées par phosphorylation : ce sont des enzymes de la glycogénogénèse ou de la

lipogenèse, actives pendant les périodes post-prandiales.


2- Voie de la protéine kinase C (PKC)

Il existe 7 différents types de phosphoinositides selon le profil de phosphorylation en position 3, 4, 5 du cycle. Ces seconds messagers sont la cible de la PLC. (les phospholipases sont des enzymes qui hydrolysent les liaisons esters des phospholipides) On retrouve les phosphoinositides ancrés par une queue lipidique dans les membranes cellulaires de tous les eucaryotes supérieurs. Ils représentent 10% des phospholipides membranaires, notamment grâce à leur localisation qui leur permet d’être adaptés à des signaux restreints dans l’espace.

Les 2nd messagers intracellulaires formés par l’activation de cette voie viennent du phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2), un phospholipide présent dans les membranes cellulaires. L’hydrolyse du PIP2 par la PLC fait apparaître les 2nd messagers suivant :

• Le diacylglycérol (DAG), qui reste dans la membrane, • L’inositol 1,4,5,-triphosphate (IP3), molécule soluble qui va diffuser.

Les 2 produits de cette réaction de clivage, le DAG et l’IP3 vont chacun déclencher des étapes supplémentaires dans les cascades de transduction du signal.

En effet, le DAG active ensuite la protéine kinase C, qui phosphoryle les résidus sérine ou thréonine de nombreuses protéines cible. La PKC possède :

- un domaine catalytique homologue à celui de la PKA - 2 domaines C1 fixant le DAG, - un domaine C2 d’interaction avec les phospholipides membranaires (proche de celui de la PLC), - Une séquence pseudo-substrat où « Ser/Thr » est remplacé par un AA non phosphorylable : Ala. Cette

séquence se lie au site actif de l’enzyme et empêche la fixation du substrat.

La connaissance de cette structure permet de comprendre comment la PKC est activée par l’hydrolyse du PIP2 : avant l’activation, la PKC est libre en solution. Après l’hydrolyse du PIP2 membranaire par la PLC, le second domaine C1 de la PKC se lie au DAG. Cette liaison et la fixation du domaine C2/phospholipides membranaires fixent la PKC à la membrane. L’interaction C2/phospholipides nécessite des ions Ca2+. La fixation du DAG au premier domaine C1 (C1A) repousse le site pseudo-substrat hors du site actif. La PKC est alors sous sa configuration active, avec exposition de sa partie à activité kinase.

La terminaison du signal se fait rapidement lorsque le DAG est métabolisé (ex : glycérol + AG)


3- Signal calcium et voie de la Calmoduline

L’ion Ca2+ est un messager cytosolique ubiquitaire important dans de nombreuses voies de transduction du signal. Il joue un rôle clé dans la régulation du métabolisme en contrôlant, directement ou indirectement, l'activité biologique de nombreuses protéines. Il est fondamental pour la coagulation du sang, la contraction musculaire, le relargage de neurotransmetteurs, la mobilité du cytosquelette… Il est aussi essentiel pour la formation des os, des dents etc.

Cependant, les complexes calciques, bien qu’indispensables, présentent comme inconvénient d’être insolubles. Leurs taux intra-cellulaires doivent donc être maintenus bas pour éviter la précipitation. Ces taux faibles sont maintenus par des systèmes de pompe. Cela explique que la concentration extracellulaire soit supérieure à la concentration intracellulaire. La concentration est aussi élevée dans les citernes du réticulum endoplasmique et les autres organites, où le calcium est lié à diverses protéines : calséquestrine, calréticuline, endoplasmine.

Ce gradient important donne aux cellules une opportunité incomparable : la concentration cytosolique du Ca2+ peut être augmentée brusquement (10 µmol.L-1) en ouvrant transitoirement les canaux calciques de la membrane plasmique ou d’une membrane intra-cellulaire. Ceci constitue le signal calcium.

L’enveloppe électronique du Ca lui permet d'établir 6 à 8 liaisons de coordination avec les protéines avec un bon degré de flexibilité. Il se fixe donc fréquemment dans des "poches" constituées d'AA acides ou polaires (Asp et Glu, Asn).

Par exemple, la calmoduline est une protéine intervenant comme médiateur de la régulation par le calcium dans de très nombreux systèmes animaux et végétaux. Comme sa fixation au calcium module l'activité de nombreuses protéines, cette protéine régulatrice a été baptisée calmoduline ou CaM.

Elle possède quatre sites de fixation du calcium. Lorsque la calmoduline a fixé 4 ions calcium, elle adopte une nouvelle conformation qui lui permet d'interagir avec ses protéines cibles afin de les activer.

La CaM possède des propriétés de régulation de la fonction des protéines très particulières puisqu'elle interagit avec environ 100 cibles protéiques (enzymes et protéines) distinctes.

L’IP3 provoque la libération rapide du Ca2+ de ses réservoirs intra-cellulaires (citernes du réticulum endoplasmique, et, dans le muscle lisse, le réticulum sarcoplasmique). L’association de l’IP3 à une protéine de la membrane du réticulum fait ensuite fonction de canal Ca2+ à travers cette membrane.

L’ouverture hautement coopérative des canaux calcium par des concentrations nanomolaires d’IP3 permet aux cellules de détecter et d’amplifier de très petits changements en concentration de ce messager. Par conséquent, le taux de Ca2+ est fortement augmenté dans le cytosol.

Comment le signal par l’IP3 est-il stoppé ?

L’inositol triphosphate est un messager à courte durée de vie car il est rapidement converti en dérivés n’ouvrant pas le canal Ca2+. (par une inositol 5-phosphatase)

L'extinction du signal calcium est très rapide du fait de l'activité permanente de pompes à Ca2+ qui grâce à l'énergie de l'ATP enferment à nouveau les ions Ca2+ dans le réticulum, ou l'échangent avec des ions Na+ pour le faire sortir de la cellule.


Schéma récapitulatif

D/ Terminaison du signal

Les réponses cellulaires à de nombreuses hormones ou neurotransmetteurs sont en général de courte durée (secondes à quelques minutes). La terminaison du signal se fait à 3 niveaux : ligand, récepteur et post-récepteur. (=transduction du signal)

Au niveau du ligand, il peut y avoir une dissociation ligand/récepteur, mais aussi un recaptage des neurotransmetteurs localisés dans la terminaison pré-synaptique par des transporteurs ainsi qu’une dégradation extracellulaire. (ex : l’acétylcholinestérase dégrade l'acétylcholine) Le recaptage de dopamine et de noradrénaline peut être bloqué par la cocaïne. Celui de sérotonine peut l’être par les antidépresseurs.

Au niveau du récepteur, il peut y avoir une désensibilisation ou encore une diminution de la synthèse du récepteur (par diminution de la transcription des gènes le codant, uniquement pour des signaux prolongés de plus d’1h)

En effet, il existe des mécanismes moléculaires qui permettent d'atténuer la sensibilité d'un tissu en dépit d'une exposition chronique à un signal extracellulaire (ligand). Ces mécanismes concourent à la désactivation de la voie de signalisation, c'est le phénomène de désensibilisation. La désensibilisation est une des propriétés les plus importantes du fonctionnement des récepteurs couplés aux protéines G. Elle survient quelques secondes ou quelques minutes après l'activation de ce dernier et implique : une inactivation du récepteur par phosphorylation et une diminution temporaire du nombre de récepteurs au niveau de la membrane plasmique. La désensibilisation se fait en 2 étapes :

- Dans un premier temps, le changement conformationnel du récepteur après liaison du ligand augmente son affinité pour une enzyme cytoplasmique : la GRK (protéines kinases des récepteurs couplés aux protéines G). La GRK, activée, phosphoryle le récepteur. Par conséquent, le récepteur est fonctionnellement découplé des protéines G et son affinité augmente pour les protéines β-arrestines.

- Dans un second temps, la fixation de la β-arrestine sur le récepteur empêche toute nouvelle activation de protéine G. La β-arrestine est capable de se lier avec des molécules de la machinerie d’endocytose comme la clathrine pour permettre l'endocytose du récepteur. Dans les endosomes, les phosphatases garantissent le recyclage du récepteur pour autoriser son retour à la membrane, mais il peut aussi être dirigé vers les lysosomes.

Cette fonction est essentielle car, pour être opérationnelle, toute régulation cellulaire par des récepteurs nécessite d’être limitée dans le temps. La désensibilisation est aussi impliquée dans la baisse d'efficacité des traitements de certaines maladies.

Au niveau du post-récepteur (=intracellulaire), les phosphodiestérases ont pour rôle d'hydrolyser l'AMPc et ainsi d'inactiver la voie de signalisation initiée lors de l'élévation intracellulaire de l'AMPc. La concentration intracellulaire d'AMPc est donc le résultat d'un équilibre entre l'activité de l'adénylcyclase et de la phosphodiestérase.

De plus, la sous-unité Gα des protéines RGS (Regulator of G protein signaling) possède une activité GTPase intrinsèque ce qui lui permet d'hydrolyser le GTP en GDP et également d’inactiver la voie de signalisation. Les protéines RGS participent à cette hydrolyse en l'accélérant. La sous-unité α-GDP peut alors se réassocier à βγ, ce qui désactive plus rapidement la voie de signalisation.


III) Pathologies liées aux anomalies de la signalisation

Les anomalies liées aux protéines G peuvent être causées par des mutations (constitutionnelles ou somatiques) ou bien par des toxines. (agents extérieurs sécrétés par des microorganismes entrant dans la cellule pour en modifier le fonctionnement)

Les mutations constitutionnelles vont avoir lieu au niveau des gamètes et vont être héritées par toutes les cellules d’un organisme tandis que les mutations somatiques sont acquises dans un second temps, et sont à l’origine des cancers. On considère qu’il y a une mutation somatique d’un récepteur à 7 TM ou d’une protéine Gα dans plus de 20% des cancers.

Des mutations pathogènes fréquentes dans les protéines G peuvent provoquer l’activation du signal en convertissant GDP en un activateur, plutôt que de verrouiller les protéines à un point GTP lié.

Par exemple, le gène GNAS codant pour la Gαs est muté dans 4% des cas de cancers (de la thyroïde, de l’hypophyse, etc). Une des formes mutantes de GNAS est particulièrement récurrente : p.R201C (la mutation se trouve sur l’arginine au codon 201 et consiste en une substitution.)

Afin de déterminer les conséquences de cette mutation, des chercheurs ont incubé une protéine Gαs sauvage (saine) et une Gαs mutée avec du γ-32P GTP (phosphate radioactif) et ont mesuré la radioactivité au cours du temps.

Question type Partiel :

Que cherchent à évaluer les chercheurs ?

Quelle est la conclusion de cette expérience ?

Réponse à la question type Partiel :

La première question doit être interprétée sous la forme : « Quel est le rôle de la mutation ? Agit-elle sur une

fonction catalytique de la protéine Gαs ? »

On observe que les deux courbes sont toutes deux des représentations graphiques de la quantité de GTP

libéré/hydrolysé en fonction du temps, ce sont donc des courbes cinétiques.

On peut donc déterminer la Kcat (Constante Catalytique) donnée sur les graphiques.

On remarque que la Kcat du Gαs sauvage est supérieure à celle de Gαs mutée. Or la Kcat est représentative de la

fonction GTPasique (activité catalytique de Gαs).

On observe que dans le cas de la Gαs mutée, l’anomalie provoque une diminution de la Kcat, donc de la fonction

GTPase. Cette même diminution induit une augmentation de l’activité de Gαs (le GTP y restant fixé). Cette

mutation est donc une mutation gain de fonction avec hyperactivation de Gαs.

Pour conclure, une même protéine peut être mutée de façon constitutionnelle comme dans la pseudo-para-

hypothyroïdie qui est une maladie génétique rare du métabolisme phosphocalcique.


De plus, des produits de sécrétion bactérienne (les toxines) peuvent agir directement sur les mécanismes de transduction.

Par exemple, le choléra correspond à une diarrhée aiguë pouvant être mortelle, avec d’importantes sécrétions (pertes) d’eau et d’électrolytes. Cette pathologie est due à la toxine cholérique, sécrétée par le vibrion cholérique (Vibrio cholerae). Cette bactérie est composée de deux sous-unités :

- Sous unité β : se fixe aux gangliosides GM1 de l’épithélium intestinal. (Infection par voie orale) - Sous unité α : catalyse la modification covalente de la protéine Gαs (fixation d’un ADP-ribose à une arginine). Cette modification stabilise la forme GTP, bloquant la molécule dans sa forme activée.

La toxine cholérique stimule la production d’AMP cyclique même en l’absence de toute interaction signal-récepteur. Cela active anormalement la PKA, entrainant l’ouverture d’un canal chlore et l’inhibition de l’échangeur Na+/H+ par phosphorylation. On a alors une perte excessive de NaCl et une fuite de grandes quantités d’eau dans l’intestin. (Les patients atteints peuvent éliminer jusqu’à 2 fois leur poids de liquide pendant 4 à 6 jours)

Cette pathologie se retrouve facilement lors d’une catastrophe, d’une crise ou encore d’une guerre car les sources

d’eau ne sont pas suffisamment viabilisées.

Le traitement se fait par réhydratation. (Solution de glucose et électrolytes)

QCM d’autoévaluation :

Concernant les récepteurs à 7 domaines transmembranaires, cochez-la ou les réponses exactes : A- Leur activation dépend de la phosphorylation de leur partie C-terminale intracytoplasmique. B- La sous-unité alpha des protéines G liées aux récepteurs à 7 domaines transmembranaire possède une

activité GTPase. C- La sous-unité alpha des protéines G liées aux récepteurs à 7 domaines transmembranaire possède une

activité tyrosine kinase. D- Ils assurent la transduction du signal induit par de multiples types de stimuli en facilitant le passage

cytosolique de leur ligand. E- Ils peuvent induire l’activation de la protéine kinase A (PKA).

Réponse QCM : F-F-V-F-F

Les objectifs de ce cours sont de savoir :

- citer les différents modes de transmission de l’information, les différents types de messagers, les principales

étapes de l’activation d’une protéine G - citer les différents types de récepteurs, et connaître leur structure et leur mode de fonctionnement, - comprendre le rôle d’un commutateur moléculaire et les voies de transduction associées aux protéines, - connaitre des pathologies de ces voies de transduction.

Quelques points auxquels vous devez pouvoir répondre :

- Qu’est-ce qu’un second messager (exemples) ? Qu’est-ce qu’un commutateur moléculaire ? - L’action des protéine kinases et phosphatase & leurs conséquences sur la fonction des protéines ? - Comment fonctionne un récepteur à 7 TM (cycle des protéines G, principales voies d’aval, extinction du signal) ____________________________________________________________________________________________ Dédicaces : à LG, Marie D. et Léa S. pour tous leurs précieux conseils sans lesquels je ne serai sûrement pas là pour ronéotyper – encore mille merciii <3 À tous les Antémediens et aux P2/D1 avec qui j’ai déjà pu parler (apérooo) Aux raviolets de la JDR, la victoire sera pour une prochaine fois À cette « hyper » promo, j’ai hâte de vous connaître À cette année qui, je l’espère, va merveilleusement bien se passer <3

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