ue2 biopathologie tissulaire et méthodes d’étude

UE2

Biopathologie tissulaire et Méthodes d’étude

Anatomie Pathologique

Introduction - Techniques

2018-2019

Dr Aurélie Cazes - Département de Pathologie- Bichat

Anatomie pathologique Modalités d’enseignement 2017-2018

En DFGSM2

Moodle Anatomie Pathologique DFGSM2

• 5 cours magistraux : Introduction et techniques, lésions élémentaires, inflammation x2, métabolisme

– Dont 2 cours interactif à préparer sur Moodle Paris Diderot

– Venir avec un smartphone

• 2 ED 2 heures

– Lames virtuelles à consulter avant la séance : Moodle Paris Diderot

– RESPECTER SON GROUPE ++++

• Examen L2 : Question rédactionnelle et QRM portant sur cours et ED

En DFGSM3

• Anatomie pathologique dans d’autres UEs (respiratoire, cardiovasculaire…)

http://portail.univ-paris-diderot.fr/render.userLayoutRootNode.uP?uP_sparam=activeTab&activeTab=3&uP_root=u384l1n203

https://moodlesupd.script.univ-paris-diderot.fr/course/view.php?id=5964

https://moodlesupd.script.univ-paris-diderot.fr/course/view.php?id=5964

• Anatomie pathologique (ou Pathologie) = discipline médicale

• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules

• Utilise des techniques principalement morphologiques

• Lésions = altérations morphologiques des organes, décelables par tout moyen d’observation.

• Ensemble de lésions:

• +/- spécifiques d’une maladie

• Évocatrices d’un diagnostic

• Exemples = nécrose, inflammation, prolifération, fibrose….

Anatomie pathologique Introduction

• Etudie les lésions au cours d’une maladie, survenant sur les organes, tissus ou cellules

• Prélevés puis examinés

- A l’œil nu = « Macroscopie »

- Au microscope optique

Anatomie pathologique Introduction

Démarche diagnostique

Symptômes

Examen clinique

Imagerie

Biologie

Anatomie Pathologique

Diagnostic

TraitementPronostic

Surveillance

Analyse lésions cellulaires et tissulaires Compte-rendu

Anatomo-pathologique

Patient

Synthèse Anatomo-radio-clinique

Patient

A partir de quels prélèvements?

• Cellules isolées = Cytologie • Tissus = Histologie

A partir de quels prélèvements?

• Cellules isolées = Cytologie

• Quel que soit le prélèvement: – Toujours envoyé en anapath

accompagné d’une feuille de demande

– Etat civil du patient

– Coordonnées du préleveur

– Renseignements cliniques +++

– +/- Imagerie, Biologie….

– Nature du prélèvement +++

• Tissus = Histologie

Cytologie - Techniques

• Etude de cellules isolées, déposées sur une lame de verre

• Catégories de prélèvement – Liquides

Physiologiques : liquide céphalo-rachidien Epanchements des séreuses : pleurésie, asciteLavage : broncho-alvéolaire

– Grattage ou brossage : muqueuses (buccale, génitale) « frottis » col utérin

– Appositions de pièces opératoires (ganglion)– Ponction à l’aiguille masse ou organe plein / kyste: gg, nodule

sein, thyroïde

– NB: L’analyse des cellules du sang (numération formule) n’est pas réalisée en anatomie pathologique mais en hématologie biologique


• Techniques « traditionnelles »

– Frottis : étalement sur lame du matériel rapidement après prélèvement

– Cytocentrifugation d’un liquide

– Appositions ou empreintes d’un tissu sur lame de verre

• Séchage à l’air ou fixation par une laque

• Colorations spécifiques de cytologie : Papanicolaou, MGG

• Pas de « réserve » de matériel une fois lame colorée

• Techniques plus récentes

Cytologie en milieu liquide = immersion immédiate des cellules dans le milieu de conservation

• Concentration et transfert en couche mince sur une lame puis coloration

• « réserve » de matériel en cas de besoin .

Cytologie - Exemples

Liquide pleural contenant des lymphocytes tumoraux (=lymphome)Coloration MGG

Frottis cervico-vaginal (Papanicolaou)

Normal Tumoral

Cytologie - Exemples

Cytologie

• Indications -Accès non chirurgical à une lésion profonde, nature? -Dépistage, surveillance (peut être répété)-Complément d’examen histologique

• Avantages: peu invasif, rapide, performant

• Limites -Qualité technique pas tjrs optimale -Morphologie des cellules en suspension différente des cellules ds le tissu (compétence du cytologiste)-Matériel peu abondant pour techniques complémentaires-Si suspicion de malignité un prélèvement tissulaire de “contrôle” est souvent indiqué

Prélèvements tissulaires

• Biopsie : prélèvement d’un fragment de tissu pour analyse anatomo-pathologique

– par ponction (aiguille coupante ou trocart) (foie, rein, os, etc.) : « à l’aveugle » ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur une lésion focale

– au cours d’une endoscopie (pince montée sur l’endoscope)

– Au bistouri, au punch….

Biopsie pulmonaire à l’aiguille Biopsie bronchique à la pince Biopsie exérèse d’un polype colique

• Pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d’un ou de plusieurs organes


Valve aortique

Tumorectomie du sein

Pneumonectomie avec pariétectomie

1 cm

• Autopsie (ou nécropsie) = examen anatomopathologique pratiqué sur un cadavre.

- Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice dans tous les cas de mort suspecte

- Les autopsies à but scientifique sont pratiquées dans les hôpitaux, généralement à la demande des médecins.



• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….

?

• Etape cruciale et irréversible: Fixation du tissu

Fixation= méthode permettant de conserver les cellules et le tissu dans un état fixe le plus proche possible de l'état physiologique, pour éviter qu'ils ne se dégradent.

rapide après le prélèvementla plus utilisée = fixation au Formol, par immersionDurée variable selon taille (de quelques heures à quelques jours)



?

Film réalisé à St Antoine, illustrant la prise en charge macroscopique d’une pièce opératoirehttps://youtu.be/6-HdKZFb9xo

https://youtu.be/6-HdKZFb9xo

Biopsie

Examen microscopique


Pièce opératoire

Mise en cassettesInclusion en paraffine

Coupe du tissu Coloration HES (Hématoxyline Eosine Safran)

Examen macroscopiquesur tissu fixé

Fixation au Formol

Tem

ps

tech

niq

ue

24

à 7

2h

+/- techniques complémentaires

Compte -rendu

Examen macroscopiquesur tissu frais

Enregistrement des prélèvements au

laboratoire


Pièce opératoire fixée au formol

Inclusion en paraffine du tissu:Déshydrater dans bains d’alcool Remplacer alcool par solvant (toluène /xylène)Imprégner de paraffine liquide chaudeCréer un « bloc de paraffine » refroidie contenant le tissu à analyser

Examen macroscopique:Description - Mesure de la pièce

Choix des lésions à analyser (ex: tumeur, marges de résection,

ganglion)

Zones d’intérêt mises en cassettes

Coloration standard = HES (Hématoxyline Eosine Safran)

Automate à colorations

Le tissu coupé et étalé sur lame est « déparaffiné » puis réhydraté et trempé dans différents bains de colorants


Coloration standard = HES Hématéine (hématoxyline): bleu, noyaux Eosine: rose, cytoplasme Safran: jaune, tissu conjonctif , collagène




?

Film réalisé à St Antoine illustrant la prise en charge complète d’une biopsie, avec inclusion et coloration https://youtu.be/pPe1CAVRibg

https://youtu.be/pPe1CAVRibg

0,2 cm

Biopsie sous fibroscopie Lobectomie pulmonaire

Biopsie: Tumeur: 5 cm


Blocs de paraffine se conservent et sont exploitables pendant des dizaines d’années si fixation de bonne qualité….


Cas particulier de l’examen extemporané

• Examen histologique rapide • Réalisé en cours d’intervention chirurgicale • Résultats orientent les suites de l’intervention

Technique • Prélèvement frais (=non fixé +++) : 1 à 2 cm max.

Sur pièce opératoire ou biopsie • Congélation dans un cryostat (-20°C): durcit le prélèvement permet la coupe 4 microns • Coloration rapide à la main • Résultat rendu immédiatement (téléphoné)• Durée environ 20 mn


Cas particulier de l’examen extemporané

• Examen histologique rapide • Réalisé en cours d’intervention chirurgicale • Résultats orientent les suites de l’intervention

• Film réalisé à St Antoine illustrant la prise en charge d’un examen extemporané

https://youtu.be/kH1Z0A_TxTE

https://youtu.be/kH1Z0A_TxTE


Limites de l’examen extemporané

• Réalisé dans des conditions d’analyse non optimale:• Congélation altère la morphologie• Analyse partielle (1 à 2 cm)• Coloration rapide manuelle

• Sera toujours confirmé par un examen après fixation/inclusion en paraffine du reste du prélèvement

• Moins fiable que l’examen définitif


Cas particulier de la congélation des tissus pour conservation

• Possibilité de conserver les tissus/cellules à -80° après congélation en azote liquide

• Banque de tissu « Tissuthèque », « Tumorothèque »

• En vue d’études de biologie moléculaire (ARN++)• En vue d’études protéiques• En vue d’immunofluorescence….

• Dans le cadre du soin (=utile au diagnostic)• Dans le cadre de la recherche biomédicale = tissuthèque gérée

en conformité avec la loi (information et non opposition des patients)


Cas particulier de la congélation des tissus pour conservation

• Différent d’un examen extemporané• Se fait à partir d’un prélèvement frais (=non fixé)• Le plus rapidement possible à réception• Souvent réalisé à l’étape de « macroscopie fraîche »

• Stockage à -80° jusqu’à utilisation



?



Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration

Analyse au microscope optique

?

Principes d’analyse d’une coupe histologique

• Examen à faible grossissement :

architecture du tissu

Organe normal résiduel ou pas ?

repérage des zones lésionnelles

• Examen à plus fort grossissement :

détails cellulaires

• Diagnostic (s)

X 25

X 400

Faible grossissement


B

B

Grossissement intermédiaire


B

Fort grossissement


Pathologie 2.0…du microscope à la lame virtuelle

Principe:Numériser une lame à l’aide d’un scanner de lames

Stockage du fichier sur un serveur

Consultationavec logiciel approprié

Pathologie 2.0…du microscope à la lame virtuelle

Exemple : lame virtuelle ED1

Principales applications actuelles: EnseignementPrésentation de cas aux réunions de concertation multidisciplinairesDemande d’avisGroupes d’experts……

Nécessite adaptation +++ des moyens matériels/des compétences

http://virtual-slides.univ-paris7.fr/mscope-education/coursematerials/openAjaxViewer.action?mediaId=25315



Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration HES

Analyse au microscope optique




Analyse au microscope optiqueTechniques complémentaires (spéciales)

ColorationsImmunohistochimieBiologie moléculaire « in situ »

Mise en évidence de constituants particuliers « in situ »

• Des cellules : mucus, glycogène, pigments…• De la matrice extracellulaire : fibres élastiques, amylose• Agents infectieux : bactéries, parasites, champignons…

Colorations histochimiques « spéciales »

Techniques histochimiques basées sur des réactions biochimiques

Exemple: identification du glycogène, des mucopolysaccharidesneutres dans la réaction de Schiff (coloration de PAS)Oxydation de certains polysaccharides par l’acide Révélée par une coloration rouge

Coloration PAS

Mucines

Glycogène



Coloration de Perls : colore le Fer en bleu

Colorations de la fibrose : Rouge Sirius se fixe sur le collagène



Grocott: colore les champignons (mycoses), filaments, levures, kystes

Filaments d’AspergillusKystes de Pneumocystis jirovecii


Coloration de Ziehl-Neelsen : coloration permettant l'identification des

mycobactéries (Bacille Acido-Alcoolo Resistants, BAAR).

Mycobacterium tuberculosis (Bacille de Koch, BK), agent de la tuberculose

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Immunohistochimie

• Mettre en évidence certaines protéines cellulaires (antigènes)

– Cytoplasmiques, membranaires, nucléaires

• A l'aide d'une réaction antigène (Ag) – anticorps (Ac)

• Complexe formé rendu visible par un marqueur

– Localisation

– Quantification

• Système révélateur : chromogène, fluorochrome (immunofluorescence)

Immunohistochimie

Antigène cible

Anticorps primaire

Ac secondaire couplé

Substrat

• Méthode indirecte :

Sur une coupe tissulaire ou lame de cytologie

Appliquer un anticorps primaire spécifique de la ciblePuis un anticorps secondaire couplé à une enzyme, à laquelle on fournit un substrat Le produit coloré de la réaction enzymatique apparait au niveau du complexe Ag-Ac si la liaison a eu lieu

Immunohistochimie

Antigène cible

Anticorps primaire

Ac secondaire couplé

Substrat

Antigène: cytokératine 7 Antigène: TTF-1

Marqueur épithélial Marqueur pulmonaire

• Intérêt diagnostique : classification d’une tumeur (épithéliale, lymphoïde, conjonctive….)

• Mise en évidence d’un agent infectieux : CMV, herpès.. • Mettre en évidence une sécrétion• Détection de molécules ayant une importance pronostique (Ki-67)• Intérêt thérapeutique : recherche d’une cible : recherche de

récepteurs aux oestrogènes, protéine HER2 dans les cancers du sein….

Immunohistochimie : applications

Cancer du sein:IHC HER2Surexpression du récepteur membranaire

Indication d’un traitement par trastuzumab


Lésion inflammatoire colique chez un greffé


IHC anti-CMV (cytomégalovirus)Positive

Diagnostic: Colite à CMV

• Hybridation in situ (HIS) ou In situ Hybridization (ISH)

• But: mise en évidence et localisation sur coupes tissulaires ou étalements cellulaires, de séquences connues d’ARN ou ADN

• Par des sondes d’acides nucléiques complémentaires le plus souvent couplées à une enzyme ou un fluorochrome (Fluorescent ISH, nécessite un microscope à fluorescence +++)

• Fait appel aux propriétés de la molécule d'ADNpossibilité de la dénaturer (séparation des 2 brins)tendance a se réassocier avec complémentarité des bases

Techniques de biologie moléculaire in situ

Techniques de biologie moléculaire in situ

• Localisation de l’expression d’un gène dans un tissu (quelles cellules ?)

• Mise en évidence de l’amplification d’un gène

• Mise de la perte d’un gène

• Mise en évidence de la cassure d’un gène (translocation protéine chimérique)

Cancer du sein:FISH gène HER2Amplification du gène (marqué en rouge) par rapport au centromère du chr17 en vert

Indication d’un traitement par trastuzumab

• Anatomie pathologique = discipline médicale

• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules

• Lésions analysées en intégrant la connaissance de la clinique +++ et de l’imagerie

• Interprétation et non mesure exacte

• Utilise des techniques principalement morphologiques en constante évolution (veille technologique ++)

• Aboutit à la rédaction d’un compte-rendu comportant:

– diagnostic / hypothèses diagnostiques,

– indications sur potentialité évolutive des lésions

– éléments permettant d'orienter le pronostic/le traitement

Anatomie pathologique

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Ouvrage de référence

http://campus.cerimes.fr/anatomie-pathologique/liste-1.html

ue2 biopathologie tissulaire et méthodes d’étude

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