Zeitschrift fiir Krebsforschung 66, 460--465 (1965)

Aus dem Onkologischen Forschungsinstitut Budapest (Direktor: Prof. B. K ~ n L ~ )

Uber die morphologische Wirkung versehiedener r auf Degranol-empfindlichen

und Degranol-resistenten NK/Ly Ascites-Tumor Von

I~vA GATI Mit 3 Textabbildungen

(Eingegangen am 24. September 1964)

Uber einen gegen St icks toff los t unempf ind l ichen Sta ture ber ieh te te zuers t HIRONO im J a h r e 1954. Sei ther wnrden zahlreiche gegen St ickstoff los t und seine Der iva t e res is ten te Bakter iens t •mme und Tumore n hervorgebrach t . Das Wachs- r u m der res i s ten ten Bak t e r i en s tgmme und Gesehwfilste un t e r E inwi rkung von versehiedenen ehemotherapeu t i sehen Mi t t e ln wurde m i t in vitro u n d in vivo- Methoden un te r sueh t . Es s tel l te sich heraus , dab gewisse Mit te l ihre hemmende W i r k u n g in gle iehem Ausmal~ wie gegen den ursprf ingl iehen unbehande l t en Sta ture beibehie l ten , wah rend andere das W a c h s t u m nur weniger oder i i be rhaup t n teht zu beeinflussen vermoehten . So zeigte sich, dab die Resis tenz gegen ein gewisses Mi t te l m i t einer Kreuz- l~es is tenz gegen andere Mit te l e inhergeht (BlcoCKMAN, gcTcm~so~).

An soliden Tumoren wurde in unserem Institut naehgewiesen, da]~ nach ein- maliger gro~er Dosis verseh iedener Chemothe rapeu t i ca charakter i s t i sche , zeit- gebundene morphologische Ver~nderungen auf t re ten . Einige S tunden naeh der A p p l i k a t i o n versehwinden die rege lhaf ten Mitosen, es setzen fehlerhaf te Kern- tef lungen ein, am Gipfe lpunk t der W i r k u n g zeigt sieh eine augenfal l ige p iknot i sehe K a r y o l y s e m i t g roben Chromat inkSrne rn und laehenar t igen Gebilden, und die Zahl der zer fa l lenden Tumorze l len n i m m t zu. Nachher (nach 72- -96 Std) beg inn t die R e s t i t u t i o n m i t dem Auf t r e t en Yon mehrkernigen , ami to t i seh tef lenden Zellen

Naeh eigenen Versuehen (GXTI) spiel t sieh ein ~hnlieher Prozei~ aueh im Ase i t e s -Tumor ab. W i r d dagegen ein gegen Degranol res is ten t gemaeh te r Ascites- T u m o r m i t der ha lb le ta l en Dosis (LDs0) des Mit te ls besehiekt , so b le iben die auf eine Zel lseh~digung h inweisenden morphologisehen Merkma]e aus. D a h e r sehien uns diese Methode aueh zur Un te r suehung der Xreuz- l~esis tenz be im Degranol- sti~ndigen T u m o r geeignet .

I n dieser Versuehsserie h a b e n wir die morphologische W i r k u n g einer einzelnen mass iven Dosis yon 14 verschiedenen ehemotherapeu t i sehen Mi t te ln an Degranol- r e s i s t en tem ( D g ) u n d Degrano l -empf ind l i chem (DE) N K / L y Ase i t e s -Tumor un te r - sucht .

Methode und Material Die Dosis der einze]nen Mit~el wnrde so gew~h]~, dal~ durch Verwendung derse]ben im

NK/Ly Ascites-Tumor auffallende, gut verwertb~re Zellver~nderungen entstanden sind. mg/kg mg/kg mg/kg

1. Degranot . . . . . 100 6. TEiV[ . . . . . . 3 11. ~yleran . . . . . 10 2. S~ickstofflost . . . 5 7. Trenimon . . . . 3 12. Colcemid . . . . . 8 3. Sarcolysin . . . . 25 8. Brom-Degranol . . 3 13. Vinca-Leukoblastine 5 4. Endoxan . . . . . 120 9. Dibrommani~ . . 120 14. Mitomycin-C . . . 10 5. Thio-TEPA . . . . 5 10. )/[annit~Myleran. . 300 15. Purinethol . . . . 5

t~ber die morphologische Wirkung verschiedener Chemotherupeutiea 461

C 3-M~use desselben Geschlechts und Gewichts (20 g) wurden mit 2 x 106 Tumorzellen i.p. geimpft. Es wurden yon je 5 Tieren mit unbehandeltem Tumor (Kontrollgruppe) bzw. mit vorher gegen Degranol resistent gemachten Tumor gebildet und jedes Mittel an beiden Gruppen erprobt. Der zum Versuch herangezogene Tumor stammte aus der 65. Impfserie nnd erhielt seit der 35. i3berimpfung keine Behandlung mehr. Am 8. Tag nach der Uber- impfung wurden die Mittel i. p. eingespritzt und vor sowie nach der Impfung zu verschiedenen Zeitpunkten (3--3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 Std) Ausstrichmaterial entnommen, das n~ch GI~SA und mit Or~nge-Acridin gef~rbt wurde. In den Acridin-Orange-gef~rbten Ausstrichen sind im Fluorescenzmikroskop die ihre Fluorescenz verlorenen, untergehenden Zellen (Typ B) von den lebensf~higen, rot fluorescierendea Tumorzellen (Typ A) leicht zu unterseheiden. Die Fehlmitosen und die mehrkernigen Zellen sind ira Lichtmikroskop in den nach GIS~SA gef/s Strichen leicht erkennb~r. Die prozentuelle Verteilung der einzelnen Typen wurde in jedem Ausstrich von 2000 gez~hlten Zellen bestimmt.

cnl r'r'Mtl~ ~d_ PURINETHOL s~d.

- - - t

~ 72j

HtYLERAN TRENIMON

2zt ]::~1

Abb. 1. Dt~ Degranolresisfient; DE deg'~'anolempfindlich; ~ geseh~digte Mitosen; degenerierte Zellen; ~ mehrkernige Zellen

72

Ergebnisse

Abb. 1: Vinca-Leukoblas t ine , Colcemid, Pur ine thol , Myleran, T E M und Trenimon, in einer einzelnen LDs0 angewendet , e rhShten im DE- wie auch in D R - T u m o r die Zahl der Feh lmi tosen und der un te rgehenden B-Zellen. I n sp/~teren S tad ien der W i r k u n g ve rmehr t sich die Zahl der mehrkern igen Zellen.

Abb. 2: ~qach tier Anwendung der Los tde r iva t e Stickstofflost , Sarcolysin, E n d o x a n und T h i o - T E P A stieg die Zahl der Feh]mi tosen im D E - T u m o r - - in Verh/flLnis zum D R - T u m o r - - zur Zei t der m a x i m a l e n W i r k u n g (48--72 Std) auf das 2 - -4 fache , aueh die Zellen vom T y p B waren v e r m e h r t anwesend. Mito- m y c i n C bewirk te ebenfal ls eine Ste igerung der anomalen Mitosen, welehe ira D E - T u m o r das Zweif~che yon denen im D R - T u m o r be t rug . Un te r dem EinflnB

462 ~. Gi~:

NITRO&EN'LO$~DR ~ ~ ~ _1- .........

~ 4 8 ........ ~

SAIKOLYSIN ~ 3__! TI.IIO-Tr

DI~ ~ ~

-

~ 7z

Abb. 9. DR Degr~nolresistent; DE degr~nolempfindlich; ~ gesch~tdigte Mitosen; degenerierte Zelle~; ~ mehrkernige Zellen

DEGQANOL BROM- DE6RANOL

DE DR._; DE

481!

i1201

DR mm 2~ ~ DE

50 ~0 30 20 10 0

MANNIT- ~6 ~ ~YL ERAN -- ~

1 2 ~ bE DR ~ - - 24

0 10 20 30 40 50 50 ~0 50 20 10

t4ANNIT

Abb. 3. DR Degranolresistent; DE degranolempfindlioh; ~ degenerierte Zellen; mehrkernige Zellen; [ ~ geschadigte Mitosen

~ber die morphologische Wirkung versckiedener Chemotherupeutic~ 463

dieser Stoffe gehen die DR-Tumorzellen frfiher, schon naeh 24--48 Std und in gr6Berer Zahl als die DE-Zellen, in mehrkernige fiber.

Abb. 3: DE-Tumorzellen zeigten nach Degranol, Brom-Degranol und Mannit- Myleran zu 19, 20 bzw. 22 % fehlerhafte Mitosen am Gipfelpunkt der Wirkung, d,h. nach 48--72 Std. Zur selben Zeit erh6hte sich die Zahl der B-Zellen auf 60--65 %. Bei der einsetzenden Restitution vermehren sich die Riesenzellen bis zu 35, 39 bzw. 37 %. Besonders nach Dibromannit waren verfallende Zellen in hoher ZaM vorhanden, wi~hrend fehlerhafte Mitosen und Mehrkernige ziemlich selten vorlagen. Demgegenfiber betrugen im Dl~-Tumor die Fehlmitosen nicht mehr Ms 6--7% und die untergehenden B-Zellen 33, 24, 20 bzw. 18%, also Ver- h~ltnisse wie im unbehandelten Kontrolltumor. Auch die Restitution ankfindi- gende riesenzellige Transformation blieb aus.

Besprechung S C ~ D T konnte an seinem Sarcolysin-resistenten Tumor eine Kreuz-Resistenz

gegen Degranol, Stickstofflost, Endoxan, Thio-TEPA und Mannit-Myleran naeh- weisen. In unseren Versuchen erwies sieh der Oegranol-resistente Tumor gegen die gleichen Stoffe ebenfalls Ms unempfindlich. Einige Autoren, wie Hmo~o, SCHMIDT, SKI~I"]~R, SCHABEL, SHA~LIKOVA, LA~]~-u165 behaupten, dal~ die Lost- (blitromin, Sarcolysin, Endoxan) resistenten Tumoren au2er den erwahnten Stoffen auch gegen TEM und Myleran Resistenz aufweisen. Die Kreuz-Resistenz mit Myleran wird yon den Verfassern als fiberraschend bezeichnet, nachdem sieh die Methansulfonate in ihrer Wirkungsart yon den Lostderivaten und den ~thyl- iminen unterscheiden sollten. In unseren Versuchen sch~digten TEM und Myleran den Degranol- empfindiichen wie auch den Degranol-resistenten Tumoren in gleicher Weise. Eine Erklarung ffir dieses abweichende Verhalten mag in der Dosierung zu liegen: wahrend namlich yon den Verfassern Bruehteile der LD~0 chroniseh angewendet wurden, haben wir die vollen LDs0 auf einmal gegeben. Laut An- gaben wird die Kreuz-Resistenz dutch verstarkte Dosierung abgeschwiiclht, so stellten z.B. SK~PE~ und SCHABEL lest, dab ein Endoxan-resistenter Tumor bei der Anwendung yon 0,2 mg/kg TEM um 108% hSher als ein Endoxan-empfind- lieher Anwuchs, wenn aber die Dosis serienweise au/ 0,4, 0,6 bzw. 0,8 mg/kg erh6ht wurde, reduzierte sich die Wachstumdifferenz zwischen den beiden auf, 64, 43 bzw. 34%.

Ubereinstimmend mit den Literaturangaben (OBosHo ; SKIPPE~ und SC~BEL) fanden wit, dab dutch Mitomycin C ein Degranol-resistenter Tumor weniger ge- hemmt wird Ms ein Degranol-empfindlicher. In diesem Fall kann die Kreuz- Resistenz der Abnlichen Wirkungsart zugeschrieben werden, zumM sowohl Mitomycin C als auch die Mkylierenden Mittel die DNA-Synthese hemmen.

Eine gemeinsame morphologische Charakteristik der Wirkung yon Stickstoff- lost, Endoxan, Thio-TEPA und Mitomycin C ist das baldige Auftreten yon zahl- reichen amitotischen mehrkernigen Zellen. Auf Grund unserer frfiheren Fest- stellungen hMten wir diese riesenzellige Phase bezeichnend ffir das Friihstadinm einer au/tauchenden Degranol-Resistenz. Naeh den in unserem Institut ausge- ffihrten Untersuchungen yon K]~LL~ER haben die mehrkernigen Zellen eine bedeutende Rolle in der der Zellsch~digung folgenden Reparation. Demnach

464 ]~. GiTI:

w/irde die auf den Degranol-resistenten Tumor ausgeiibte Wirkung dieser Mittel in einer friih einsetzenden Restitutionsbesch]eunigung bestehen.

Auch nach der Anwendung won Brom-Degrano], Dibrommannit und Mannit- Myleran waren wesentliche morphologisehe Differenzen im Bild des Degranol- em]?findlichen bzw. -resistenten Tumors zn beobachten. W/ihrend beim resisten- ten Tumor die LDa0 keine wesentliche J~nderung im Verh/~ltnis zur unbehandelten Geschwulst hervorrief, waren solche im Degranol-em]?findliehen Tumor vorhanden und auswertbar. Von den genannten Mitteln hat das Dibrommannit als Wirkungs- gru]?]?e nur ein Halogen (Brom), trotzdem/~hnelt es in seinem Effekt den alkylie- renden Mitteln (CsA~YI u. Mitarb.).

Dureh die Untersuehung der mor]?hologisehen Wirkung unterschiedlicher Chemotherapeutica auf eine Degranol-resistente und em]?findliche Tumorart wet- den die Angaben, naeh denen zwisehen einem Tell der Mkylierenden Mittel Kreuz- t~esistenz vorkommt, bestgtigt. ,,Alldies bestirkt die Annahme, dab ein Tell der alkylierenden Mittel (wenn aueh nieht alle) ira Grunde genommen denselben Wirkungsmeehanismus besitzt" (Sc~mDT).

Zusammenfassung Im Degranolresistenten NK/Ly Ascites-Tumor kommen Zeichen einer Zell-

schi~digung (untergehende Zellen, pathologische Mitosen) unter der Einwirkung vom Brom-Degranol, Dibrommannit und Mannit-Myleran kaum und unter Ein- wirkung yon Stickstofflost, Sareolysin, Endoxan, Thio-TEPA und Mitomycin C in viel geringerem Ausmag vor als im DegranoLem]?findlichen Tumor.

Nach der Gabe yon Stickstofflost, Sarcolysin, Endoxan, Thio-TEPA und Mitomycin C erscheinen bald und in groBer Zahl amitotische mehrkernige Zellen, welche ffir die der Zellschs naehfolgenden Restitution charakteristisch sin&

Die cyclischen Lostderivate TEN und Trenimon, der Purinantagonist t)n - rinethol und die Alkaloide Colcemid und Vinca-Leukoblastin, wie auch Myleran- sch/idigen die Degranol-em]?findliehen und Degranol-resistenten Tumorzellen in gleiehem AusmalL

The Morphological Effect of Various Chemotherapeutic Agents on Degranol-Sensitive and Degranol-Resistant 5~K/Ly Aseites Tumor

Summary In the Degranol-resistant NK/Ly ascites tumor, signs of cellular injury (de-

generating cells, pathological mitoses) are hardly evident after treating with brom-Degranol, Dibrommannite, and mannite-Myleran. Under the effects of nitrogen mustard, Sarcolysin, Endoxan, Thio-TEPA, and Mitomycin-C, cellular damage is much less ap]?arent than in the Degranol-sensitive tumor.

After administering nitrogen mustard, Sarcolysin, Endoxan, Thio-TEPA, and Mitomycin-C, amitotic multinueleated cells soon a]?]?ear and in large numbers. These cells are characteristic of restoration following the cellular injury. The cyclic mustard derivatives, TEM and Trenimon; the ]?urine antagonist, Burine- thol; and the alkaloids, colcemid and vinealeukoblastin; and also Myleran, damage the Degranol-sensitive and Degranol-resistent tumor cells to the same extent.

~ber die morphologische Wirkung verschiedener Chemotherupeutlea 465

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Dr. ~vA GATI Onkologisehes Forsehungsinstitut

~udapest XII, R~th Gy. 5