UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL

1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT

EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELEDRI (Apium graveolens L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Andy Kurniawan

NIM : 078114076

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011

ii  

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL

1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT

EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELEDRI (Apium graveolens L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Andy Kurniawan

NIM : 078114076

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011

iii  

iv  

 

v  

HALAMAN PERSEMBAHAN

I will lift up my eyes to the hills; From whence comes my help?

My help comes from The Lord, Who made heaven and earth.

He will not allow your foot to be moved;

He who keeps you will not slumber.

Prevailing prayer is almost an

impossibility where there is neglect of the study

of the Word of God (Reuben Archer Torrey)

(Psalms 121 : 1-3)

Karya ini Kupersembahkan untuk :

Mama, Papa, dan kakakku tercinta

Para sahabat yang kusayangi

Almamater

 

  

 

vi  

PRAKATA

Puji syukur Penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena atas

segala berkat yang dianugerahkan-Nya, sehingga Penulis dapat menyelesaikan

skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-

2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil

Asetat Ekstrak Etanolik Herba Seledri (Apium graveolens L.)”. Skripsi ini

disusun untuk memenuhi salah satu syarat yang diwajibkan untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

Dalam membuat skripsi ini, Penulis menyadari telah mendapat banyak

bantuan, bimbingan, dukungan, dan semangat dari berbagai pihak, baik secara

langsung maupun tidak langsung. Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan

hati Penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada :

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

2. Bapak Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

banyak memberikan bimbingan dan pengarahan kepada Penulis mulai

saat penyusunan proposal penelitian hingga penyelesaian skripsi ini.

3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi

ini.

4. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

 

vii  

5. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., dan Ibu Phebe Hendra, M.Si.,

Ph.D., Apt., yang telah berkenan meluangkan waktu untuk berdiskusi dan

memberikan masukan kepada Penulis.

6. Segenap staf pengajar, laboran, dan karyawan Fakultas Farmasi, terima

kasih atas bantuan, dukungan, dan motivasi yang diberikan kepada

Penulis serta kerja sama yang terjalin baik selama ini.

7. Rekan seperjuanganku, Damianus Listyanta Edhi Sambada dan Yosafat

Rubbyanto Widodo yang telah berjuang bersama dengan Penulis

melakukan penelitian di laboratorium menyelesaikan skripsi ini, terima

kasih untuk kebersamaan yang indah selama ini.

8. Sahabat-sahabatku, Fandri Astika Maranantan, Ardi Prasetyo, Petrus

Wicaksono, serta Anggun Aji Mukti, terima kasih atas dukungan,

semangat, dan kebersamaan kita selama ini serta suka duka yang kita

lewati bersama.

9. Teman-teman kelompok praktikum B1 FST 2007 yang dikenal dengan

“Team Fun”, terima kasih untuk kebersamaan dan keakraban kita saat

praktikum selama ini.

10. Rekan-rekan mahasiswa Fakultas Farmasi angkatan 2007 terutama kelas

FST, terima kasih untuk kebersamaan dan canda tawa yang telah kita

rasakan bersama selama ini.

11. Teman-teman KKN angkatan XL pedukuhan Destan, terima kasih untuk

kebersamaan kita dan kerjasama yang baik, walaupun hanya dalam

waktu yang singkat.

 

viii  

12. Semua pihak yang tidak dapat Penulis sebutkan satu persatu yang telah

memberikan dukungan dan bantuan sehingga skripsi ini dapat

terselesaikan.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih terdapat

banyak kekurangan. Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati Penulis

memohon maaf apabila terdapat hal-hal yang kurang berkenan serta Penulis

mengharapkan saran dan kritik yang membangun.

Akhir kata, Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi pihak-

pihak yang membutuhkan dan dapat memberikan sumbangan bagi kemajuan ilmu

pengetahuan terutama di bidang kefarmasian.

Penulis

 

ix  

 

x  

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. v

PRAKATA .................................................................................................. vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... ix

DAFTAR ISI ............................................................................................... x

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvi

INTISARI .................................................................................................... xvii

ABSTRACT .................................................................................................. xviii

BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1

A. Latar Belakang ................................................................................ 1

B. Perumusan Masalah ......................................................................... 4

C. Keaslian Penelitian .......................................................................... 4

D. Manfaat ............................................................................................ 5

E. Tujuan .............................................................................................. 6

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 7

A. Seledri .............................................................................................. 7

B. Senyawa Fenolik ............................................................................. 9

 

xi  

C. Antioksidan ..................................................................................... 10

D. Metode DPPH ................................................................................. 15

E. Metode Folin-Ciocalteu ................................................................... 16

F. Ekstraksi .......................................................................................... 17

G. Kesahihan Metode Analisis ............................................................. 19

H. Kesalahan dalam Metode Analisis .................................................. 22

I. Landasan Teori ................................................................................ 23

J. Hipotesis .......................................................................................... 24

BAB III. METODE PENELITIAN ............................................................ 25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 25

B. Variabel ........................................................................................... 25

C. Definisi Operasional ........................................................................ 25

D. Bahan dan Alat Penelitian ............................................................... 26

E. Tatacara Penelitian .......................................................................... 27

1. Determinasi tanaman .................................................................. 27

2. Pengumpulan bahan .................................................................... 27

3. Preparasi sampel ......................................................................... 27

4. Pembuatan larutan DPPH, pembanding, dan uji ........................ 28

5. Uji pendahuluan .......................................................................... 29

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.................................. 30

7. Uji aktivitas antioksidan ............................................................. 31

8. Optimasi penetapan kandungan fenolik total ............................. 32

9. Penetapan kandungan fenolik total ............................................. 32

 

xii  

F. Analisis Hasil ..................................................................................... 33

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................... 36

A. Hasil Determinasi Tanaman .............................................................. 36

B. Hasil Pengumpulan Bahan ................................................................. 36

C. Hasil Pembuatan Ekstrak ................................................................... 37

D. Hasil Uji Pendahuluan ....................................................................... 40

E. Optimasi Metode ............................................................................... 42

1. Penentuan OT ................................................................................ 42

2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ................... 44

F. Validasi Metode Analisis ................................................................... 47

1. Uji aktivitas antioksidan ............................................................... 47

2. Penetapan kandungan fenolik total ............................................... 54

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ................... 57

H. Hasil Uji Penetapan Kandungan Fenolik Total ................................. 63

I. Hasil Analisis Statistik ....................................................................... 67

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 69

A. Kesimpulan ........................................................................................ 69

B. Saran .................................................................................................. 69

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 70

LAMPIRAN ................................................................................................ 75

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 87

 

xiii  

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Rentang akurasi yang masih dapat diterima .................................. 20

Tabel II. Rentang KV yang masih dapat diterima....................................... 21

Tabel III. Data recovery larutan pembanding rutin ..................................... 49

Tabel IV. Data recovery larutan uji............................................................. 50

Tabel V. Data Coefficient of Variation (CV) larutan pembanding rutin..... 51

Tabel VI. Data Coefficient of Variation (CV) larutan uji ........................... 52

Tabel VII. Data recovery asam galat........................................................... 55

Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV) larutan asam galat ............ 56

Tabel IX. Data aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH .............. 59

Tabel X. Data aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik

herba seledri dengan metode DPPH ............................................................ 61

Tabel XI. Tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji dengan metode

penangkapan radikal DPPH ........................................................................ 63

Tabel XII. Konsentrasi asam galat dan absorbansinya setelah

ditambah pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang

diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm.............. 64

Tabel XIII. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik

herba seledri yang dinyatakan sebagai massa ekivalen

asam galat (mg GAE/g) ............................................................................... 67

 

xiv  

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ............... 14

Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen reaktif ...................... 15

Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan ............................... 16

Gambar 4. Skema jalannya penelitian ......................................................... 35

Gambar 5. Uji pendahuluan senyawa fenolik ............................................. 41

Gambar 6. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ...................................... 42

Gambar 7. Kurva penentuan Operating Time (OT) uji aktivitas

antioksidan .................................................................................................. 43

Gambar 8. Kurva penentuan Operating Time (OT)

penetapan kandungan fenolik total ............................................................. 44

Gambar 9. Scanning panjang gelombang maksimum larutan DPPH ......... 45 

Gambar 10. Scanning panjang gelombang maksimum

asam galat + pereaksi Folin-Ciocalteu + natrium karbonat ........................ 46

Gambar 11. Kurva regresi linier antara konsentrasi rutin

dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH .................. 48

Gambar 12. Kurva regresi linier antara konsentrasi fraksi

dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH .................. 48

Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat

dengan absorbansinya setelah ditambahkan pereaksi ................................. 54

Gambar 14. Reaksi terbentuknya warna kuning oleh adanya antioksidan .. 58 

Gambar 15. Struktur rutin .......................................................................... 59

 

xv  

Gambar 16. Struktur asam galat .................................................................. 63

Gambar 17. Oksidasi fenol dalam suasana basa ......................................... 65

Gambar 18. Reaksi fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu ........................ 66

 

xvi  

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman ................................... 75

Lampiran 2. Foto tanaman seledri ............................................................... 76

Lampiran 3. Foto percobaan ....................................................................... 77

Lampiran 4. Perhitungan rendemen ............................................................ 78

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan stok DPPH ........................... 78

Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan stok rutin .............................. 79

Lampiran 7. Spektra pelarut metanol .......................................................... 79

Lampiran 8. Penentuan OT rutin ................................................................. 80

Lampiran 9. Spektra larutan pembanding rutin ........................................... 80

Lampiran 10. Perhitungan pembuatan stok larutan uji ............................... 81

Lampiran 11. Penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanolik

herba seledri ................................................................................................ 81

Lampiran 12. Spektra larutan uji ................................................................. 82

Lampiran 13. Perhitungan pembuatan stok asam galat ............................... 83

Lampiran 14. Spektra asam galat ................................................................ 83

Lampiran 15. Penimbangan larutan uji untuk penetapan kandungan

fenolik total ................................................................................................. 84

Lampiran 16. Penentuan OT untuk penetapan kandungan fenolik total ..... 84

Lampiran 17. Perhitungan kandungan fenolik total .................................... 84

Lampiran 18. Hasil uji statistik menggunakan program

PASW Statistics 18 ...................................................................................... 86

 

xvii  

INTISARI

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan efek buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan sumber antioksidan alami yang biasanya terdapat dalam tumbuhan. Herba seledri merupakan salah satu tumbuhan yang berkhasiat dalam pengobatan dan memiliki kandungan flavonoid serta senyawa golongan fenol. Hal tersebut mendorong untuk melakukan pengujian aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total dalam herba seledri. Pengujian aktivitas antioksidan herba seledri (Apium graveolens L.) dilakukan secara kualitatif (uji pendahuluan) maupun kuantitatif menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Prinsip metode ini adalah penurunan intensitas warna atau absorbansi larutan DPPH yang sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan. Hasilnya dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50) yang menunjukkan konsentrasi suatu senyawa antioksidan yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH. Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu menghasilkan larutan berwarna biru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki aktivitas antioksidan yang lemah dengan nilai IC50 sebesar 316,294 µg/mL. Kandungan fenolik totalnya sebesar 3,27 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Kata kunci : antioksidan, Apium graveolens L., fraksi etil asetat, DPPH, fenolik

total

 

xviii  

ABSTRACT

  Antioxidants are compounds that can counteract the bad effects of free radicals in the body. Phenolic and flavonoid compounds is a source of natural antioxidants that are usually present in plants. Celery herb is one efficacious plant in the treatment and have the content of flavonoids and phenolic group compound. It is encouraging to test the antioxidant activity and total phenolic content in celery herb. Testing the antioxidant activity of celery herb (Apium graveolens L.) was qualitative (preliminary test) and quantitatively using 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical. The principle of this method is the reduction of color intensity or absorbance of DPPH solution that proportional to the increase in the concentration of antioxidant compounds. The result is expressed with a value of Inhibition Concentration 50 (IC50) which indicates the concentration of an antioxidant compound that produces the arrest of 50% DPPH radical. The content of total phenolic determined by the Folin-Ciocalteu method. The principle of this method is the oxidation of phenolic compounds under alkaline conditions by the Folin-Ciocalteu reagent produces a blue solution. The results showed that the ethyl acetate fraction ethanolic extract of celery herb has a weak antioxidant activity with IC50 value of 316,294 µg/mL. Total phenolic content is 3,27 mg gallic acid equivalent per g ethyl acetate fraction.

Keywords : antioxidant, Apium graveolens L., ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic

 

1  

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

  Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan efek

buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Berdasarkan sumbernya, terdapat dua

macam antioksidan yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik (buatan)

(Dalimartha dan Sudibyo, 1999). Suatu antioksidan umumnya memiliki kelebihan

pasangan elektron bebas sehingga dapat menyumbangkan elektronnya kepada

suatu radikal dan dapat menstabilkan radikal tersebut sehingga tidak lagi reaktif.

Saat ini antioksidan alami lebih diminati dibandingkan antioksidan

sintetik karena dianggap lebih aman. Antioksidan sintetik seperti BHT (butylated

hidroxy toluene) dan BHA (butylated hidroxy anisole) telah diragukan

keamanannya karena memiliki efek samping yang besar dan dapat menyebabkan

kerusakan hati. Hal ini menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang

sangat dibutuhkan oleh masyarakat saat ini (Rohdiana, 2001; Sunarni, 2005).

Antioksidan alami mampu melindungi tubuh dari kerusakan akibat

oksidasi oleh reactive oxygen species (ROS), menghambat terjadinya penyakit

degeneratif serta menghambat terjadinya peroksidasi lipid pada makanan

(Sunarni, 2005).

Radikal bebas adalah suatu spesies yang sangat reaktif karena terdapat

elektron yang tidak berpasangan pada bagian terluarnya. Hal ini mengakibatkan

tidak stabilnya atom atau molekul tersebut. Untuk menjadi stabil, radikal bebas

2  

  

memerlukan elektron yang berasal dari elektron molekul disekitarnya, sehingga

terjadi perpindahan elektron dari molekul donor ke molekul radikal bebas untuk

menjadikan molekul radikal bebas tersebut stabil. Beberapa contoh radikal bebas

antara lain: radikal hidroksil (OH·), nitrit oksida (NO·), hidrogen peroksida

(H2O2), dan sebagainya (Windono, Soediman, Yudawati, Ermawati, Srielita, dan

Erowati, 2001).

Sebenarnya dalam tubuh sendiri secara alami terdapat antioksidan

endogen seperti enzim SOD (superoxyde dismutase), glutation, dan katalase yang

dapat menetralkan radikal bebas yang masuk, akan tetapi jumlahnya terbatas

sehingga membutuhkan suplai antioksidan dari luar tubuh untuk mengatasi

paparan radikal bebas dalam jumlah yang berlebih.

Antioksidan alami dapat diperoleh dari buah-buahan maupun sayuran.

Salah satu sumber antioksidan alami dapat berasal dari herba seledri (Apium

graveolens L.). Pada seledri terdapat kandungan flavonoid seperti graveobiosid A

dan B serta senyawa golongan fenol yang diketahui memiliki aktivitas

antioksidan. Selain itu pada herba seledri terdapat pula glikosida apiin (glikosida

flavon), isokuersetin, dan umbelliferon (Sudarsono dkk., 1996).

Seledri memiliki banyak manfaat untuk kesehatan, di antaranya sebagai

antihipertensi, penambah nafsu makan, peluruh air seni, mengurangi rasa sakit

pada rematik dan gout. Seledri juga sering ditambahkan sebagai sayur dan lalap

untuk penyedap masakan (Sudarsono dkk., 1996).

Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid

dan dianjurkan untuk proses pemurnian (Robinson, 1995). Dalam penelitian

3  

  

tentang antioksidan herba ketul (Bidens pilosa L.), didapatkan fraksi etil asetat

memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi dibandingkan rutin, fraksi

kloroform, dan ekstrak metanoliknya (Nusarini, 2007; Wiyatsih, 2007)

Metode yang digunakan untuk pengujian antioksidan pada penelitian ini

adalah metode DPPH (1,1 difenil-2-pikrilhidrazil). Berdasarkan metode ini,

kemampuan antioksidan suatu senyawa dinyatakan oleh nilai IC50. Metode DPPH

memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.

DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna

violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi

berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding

dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005).

Penentuan kandungan fenolik total dalam herba seledri pada penelitian

ini menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah reaksi

oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu

menghasilkan kompleks berwarna biru yang memberikan serapan kuat pada

panjang gelombang 750 nm. Intensitas warna biru yang terbentuk meningkat

sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada dalam sampel. Kandungan

fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat tiap g sampel.

4  

  

B. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan penelitian dapat

dirumuskan sebagai berikut.

1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan

IC50?

2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?

C. Keaslian Penelitian

Beberapa penelitian mengenai aktivitas antioksidan yang telah dilakukan

dengan menggunakan bahan tanaman seledri antara lain :

1. Penelitian mengenai aktivitas antioksidan ekstrak air beberapa tanaman.

Bahan yang digunakan adalah 25 macam tanaman, termasuk daun seledri

yang dikeringkan kemudian diblender dan diekstraksi menggunakan air

deionisasi. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode DPPH

serta Ferric reducing antioxidant potential assay. Selain itu dilakukan pula

penetapan kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Wong,

Leong, dan Koh, 2005).

2. Penelitian mengenai perbedaan metode untuk mengontrol dan membandingkan

aktivitas antioksidan sayur-sayuran.

Bahan yang digunakan adalah bermacam sayuran, termasuk daun seledri

yang diblender dan diekstraksi menggunakan pelarut aseton 80% dalam asam

5  

  

format 0,2%. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode

TRAP, ORAC, dan HORAC. Dilakukan pula penetapan kandungan polifenol total

menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Ciz et al., 2010).

3. Penelitian mengenai peningkatan aktivitas antioksidan setelah perlukaan,

tergantung jenis jaringan pada buah dan sayuran.

Bahan yang digunakan adalah bermacam buah dan sayur, termasuk

seledri yang dilukai menggunakan pisau dan disimpan pada suhu 15°C untuk

meningkatkan respon jaringan. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan

adalah metode DPPH, sedangkan kandungan fenolik total ditetapkan dengan

metode Folin-Ciocalteu (Reyes, Villarreal, dan Cisneros-Zevallos, 2007).

Uji aktivitas antioksidan yang dilakukan pada penelitian ini berbeda

dengan penelitian sebelumnya. Perbedaannya terletak pada sampel yang

digunakan, yaitu fraksi etil asetat ekstrak etanol herba seledri. Berdasarkan

pengamatan penulis, uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH serta

penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri

belum pernah dilakukan.

D. Manfaat

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan dan bukti

ilmiah mengenai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

6  

  

2. Manfaat metodologis

Penelitian ini dapat dijadikan acuan metode uji aktivitas antioksidan

menggunakan radikal bebas DPPH dan penentuan kandungan fenolik total pada

suatu bahan tumbuhan.

3. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas

antioksidan herba seledri, sehingga bisa dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif

pemeliharaan kesehatan manusia.

E. Tujuan

1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan serta

menetapkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik

herba seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan

dengan IC50.

b. Mengetahui kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.

 

7  

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Seledri

1. Keterangan botani

Seledri (Apium graveolens L.) termasuk dalam familia Apiaceae.

2. Nama tumbuhan

Nama latin: Apium graveolens Linn. (Anonim, 2005).

Nama Indonesia: seledri (Anonim, 2005).

Nama daerah: Jawa: sledri. Sunda: saledri (Dalimartha, 2000).

Common name: Inggris: celery. Perancis: celeri. Italia: seleri. Jerman: selinon;

parsley (Anonim, 2005).

3. Morfologi tanaman

Batang : Tidak berkayu, beralur, beruas, bercabang, tegak, hijau pucat.

Daun : Tipis majemuk, daun muda melebar atau meluas dari dasar,

hijau mengkilat, segmen dengan hijau pucat, tangkai di semua

atau kebayakan daun merupakan sarung.

Daun bunga : Putih kehijauan atau putih kekuningan ½ - ¾ mm panjangnya.

Bunga : Tunggal, dengan tangkai yang jelas, sisi kelopak yang

tersembunyi, daun bunga putih kehijauan atau merah jambu

pucat dengan ujung yang bengkok. Bunga betina majemuk yang

jelas, tidak bertangkai atau bertangkai pendek, sering

8  

  

mempunyai daun berhadapan atau berbatasan dengan tirai

bunga.

Tirai bunga : Tidak bertangkai atau dengan tangkai bunga tidak lebih dari 2

cm panjangnya.

Buah : Panjangnya sekitar 3 mm, batang angular, berlekuk, sangat

aromatik.

Akar : Tebal (Iqbal dan Endang, 2008).

4. Kandungan kimia seledri

Seluruh herba seledri mengandung glikosida apiin (glikosida flavon),

isoquersetin, dan umbeliferon. Juga mengandung manitol, inositol, asparagina,

glutamina, choline, linamarose, pro vitamin A, vitamin C, dan B. Kandungan

asam-asam dalam minyak atsiri pada biji antara lain asam-asam lemak

terutama palmitat, oleat, linoleat, dan petroselinat. Senyawa kumarin lain

ditemukan dalam biji, yaitu bergapten, seselin, isomperatorin, osthenol, dan

isopimpinelin (Sudarsono dkk., 1996).

5. Kegunaan seledri

Secara tradisional tanaman seledri digunakan sebagai pemacu enzim

pencernaan atau sebagai penambah nafsu makan, peluruh air seni, dan penurun

tekanan darah. Di samping itu digunakan pula untuk memperlancar keluarnya

air seni, mengurangi rasa sakit pada rematik dan gout. Selebihnya daun dan

batang seledri digunakan sebagai sayur dan lalap untuk penyedap masakan

(Sudarsono dkk., 1996).

9  

  

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik adalah substansi organik dimana terdiri dari senyawa

aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen hidroksil (OH). Senyawa

induk adalah fenol tetapi kebanyakan senyawa fenolik merupakan polifenol.

Sumber senyawa fenolik sangat sedikit pada sumber hewani akan tetapi sangat

melimpah pada sumber tumbuhan. Diantara 8000 senyawa polifenol tumbuhan

yang diketahui, golongan yang terbanyak adalah flavonoid (Mann, Davidson,

Hobbs, Banthorpe, dan Harborne, 1994).

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman

digunakan sehingga menjadi senyawa bioaktif dari suatu tumbuhan. Oleh karena

itu, pada perkembangan penelitian akhir-akhir ini, perhatian peneliti telah tertuju

pada identifikasi tumbuhan yang memiliki aktivitas antioksidan yang dapat

digunakan untuk konsumsi manusia sehari-hari (Ebrahimzadeh, Pourmorad,

Hafezi, 2007).

Aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik didapatkan dengan cara

mereduksi radikal untuk tidak terjadinya reaksi samping yang merugikan. Untuk

transfer atom hidrogen, senyawa fenolik mampu mengikat radikal bebas dengan

mendonasikan atom hidrogen dalam transfer elektron tunggal dari senyawa

fenolik kepada elektron tunggal dari radikal bebas (Marxen et al., 2007).

Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat diukur secara

kolorimetri dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya

reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat-fosfotungstat oleh

adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki

10  

  

serapan kuat pada panjang gelombang 750 nm. Intensitas serapan pada panjang

gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel

(Waterhouse, 2002).

C. Antioksidan

Definisi antioksidan secara umum adalah senyawa yang melawan

oksidasi atau menghambat reaksi yang dipicu oleh oksigen atau peroksida.

Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam

berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk

menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet

untuk menunda oksidasi) (Huang, Ou, dan Prior, 2005).

Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila

dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat

menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994).

Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat

dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim

yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoxyde dismutase (SOD);

glutation peroksidase, katalase, tioredoksin reduktase dan peroksiredoksin

(Masella, Di Benedeto, Vari, Filesi, dan Giovannini, 2005). Secara non-enzimatik,

senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai :

a. Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E.

b. Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA.

11  

  

c. Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen.

d. Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation

peroksidase (Huang et al., 2005).

Aktivitas senyawa polifenol (flavonoid) sebagai antioksidan meliputi tiga

mekanisme sebagai berikut.

a. Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS) ataupun

radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R·, RO·, dan ROO·

dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen.

b. Mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal seperti

reaksi melalui khelasi metal.

c. Interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan penggabungan

dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000).

Antioksidan dan peredam radikal bebas biologis dapat digolongkan

sebagai berikut (Grieb, 1992 dan Himawati, 2001).

a. Berdasarkan sasaran

1) Preventative antioxidant, yaitu antioksidan yang dapat mencegah

terbentuknya oksidan dan mencegah tertimbunnya oksidan. Misalnya :

superoksida dismutase (SOD), katalase, bermacam-macam enzim

peroksidase (misalnya glutation peroksidase), dan senyawa yang

mengandung gugusan sulfidril (glutation, sistein, dan kaptopril).

2) Chain-breaking antioxidant, mekanismenya sebagai berikut.

L· + AH → LH + A·

LO· + AH → LOH + A·

12  

  

LOO· + AH → LOOH + A·

Antioksidan (AH) akan mencegah dua tahapan meliputi tahapan inisiasi

terjadi ketika radikal beraksi dengan Lipid (L) dan proses propagasi

(beraksi dengan alkoksi (LO·) ataupun peroksil (LOO·) (Madhavi et al.,

1996).

b. Berdasarkan mekanisme kerja

1) Antioksidan enzimatik, misalnya : katalase (CAT), superoxyde dismutase

(SOD), dan glutation peroksidase (GSH-Px).

2) Antioksidan non-enzimatik, misalnya: vitamin E (α-tokoferol), vitamin C

(asam askorbat), dan β-karoten.

c. Berdasarkan sifat-sifat fisiko-kimia

1) Antioksidan hidrofilik, yaitu antioksidan yang bekerja dalam sitosol dan

cairan ekstrasel, misalnya: vitamin C, asam urat, glutation, sistein,

kreatinin.

2) Antioksidan lipofilik, yaitu antioksidan yang bekerja pada membran sel

(terlarut dalam lipid membran), misalnya: vitamin E, β-karoten, ubikuinon,

bilirubin, protein pengikat logam (transferin, laktoferin, seruloplasmin, dan

albumin).

Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara

kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah suatu

senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode

kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas. Metode ini

dapat untuk memisahkan campuran antioksidan yang kompleks sekalipun.

13  

  

Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan menjadi empat

kelompok, yaitu :

a. senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika tereduksi (kalium

permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil, dan asam fosfomolibdat);

b. senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti senyawa diazo,

pereaksi diazo, magnesium sulfat, anisaldehid, vanillin dan pereaksi Gibbs

yang membentuk indofenol (akan membentuk garam berwarna dalam kondisi

basa);

c. radikal bebas stabil yang menerima radikal hydrogen dari antioksidan (1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil);

d. senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang berwarna (paladium

klorida) (Davidek, 1997).

Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri.

Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan adalah

sebagai berikut.

1. Pengujian penangkapan radikal (radical scavenging test)

Uji ini dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal sintetik dalam

pelarut organik polar seperti metanol atau etanol dalam suhu kamar. Radikal

sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).

Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap radikal DPPH.

DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517 nm.

Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang

14  

  

kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah

elektron yang diambil.

Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan

2. Pengujian aktivitas antioksidan dengan sistem linoleat tiosianat

Prinsip : pengukuran intensitas warna kompleks feritiosianat yang terbentuk

dari reaksi ion feri dengan amonium tiosianat. Ion feri terbentuk dari oksidasi

ion fero oleh peroksida yang berasal dari oksidasi asam linoleat. Kompleks

feritiosianat yang berwarna merah diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 490 nm. Semakin tinggi absorbansinya (warna merah yang

terbentuk semakin pekat) menunjukkan semakin banyak peroksida yang

terbentuk. Dengan adanya senyawa yang berperan sebagai antioksidan

intensitas warna yang terbentuk semakin rendah.

3. Pengujian dengan asam tiobarbiturat,

Prinsip uji ini adalah reaksi malondialdehid dengan asam tiobarbiturat

menghasilkan kromogen merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 532 nm. Malondialdehid terbentuk dari asam lemak bebas

tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan rangkap. Adanya

senyawa yang bersifat antioksidan akan menghambat terbentuknya

malondialdehid dari asam lemak bebas tidak jenuh.

15  

  

4. Pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat

Pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan pemucatan warna β-

karoten. Karotenoid dapat meredam oksigen yang reaktif menghasilkan

oksigen yang lebih stabil. Energi dari oksigen tersebut dipindahkan ke senyawa

karotenoid. Energi tersebut dilepaskan melalui interaksi rotasional dan

vibrasional antara karotenoid dengan pelarut untuk mengembalikan karotenoid

ke ground state.

Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen reaktif

D. Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian

antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)

(Windono et al., 2001).

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom N di tengah)

serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen,

dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam

suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida, 1994).

Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan

serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh

keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara

stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa

16  

  

antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning

(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk

menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas (Dinis,

et al., 1994). DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk

pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva,

van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002).

Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan (Windono et al., 2001).

E. Metode Folin-Ciocalteu

Metode Folin-Ciocalteu merupakan oksidasi atau reduksi kolorimetrik

untuk mengukur semua senyawa fenolik. Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan

larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam

heteropolifosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat, natrium

molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromin (Folin dan

Ciocalteu, 1944). Pada kenyataannya reagen ini mengandung rangkaian polimerik

17  

  

yang memiliki bentukan umum dengan pusat unit tetrahedral fosfat (PO4)3- yang

dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur

tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Singleton dan

Rossi, 1965).

Menurut Waterman dan Mole (cit. Khadambi, 2007), dasar metode Folin-

Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi ini mengoksidasi

fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks

molibdenum-tungsten (Mo-W). Fenolat hanya terdapat pada larutan basa, tetapi

pereaksi Folin-Ciocalteu dan produknya tidak stabil pada kondisi basa. Selama

reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin-

Ciocalteu, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru

dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi dengan

spektrofotometer (Jansoon, 2005). Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat

setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin besar

konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan

mereduksi asam heteropoli sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat

(Box, 1983; Singleton dan Rossi, 1965).

F. Ekstraksi

Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa

zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari

sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan

18  

  

bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari

semakin luas (Harborne, 1987).

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi

zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

selanjutnya pelarut diuapkan sampai semua atau hampir semua pelarut menguap

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Dalam memilih cairan penyari, seseorang harus mempertimbangkan

banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini.

(1) Murah dan mudah diperoleh,

(2) stabil secara fisika dan kimia,

(3) bereaksi netral,

(4) tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar,

(5) selektif,

(6) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan

(7) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).

Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan

zat dari bahan yang akan disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi :

infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Direktorat

Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan

penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

19  

  

mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan

pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang

sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam

sel. Dapat dilakukan modifikasi terhadap teknik maserasi, misalnya teknik

remaserasi. Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk

simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan dan

diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).

G. Kesahihan Metode Analisis

Kesahihan metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang

digunakan untuk membuktikan bahwa metode analisis tersebut dapat memberikan

hasil seperti yang diharapkan dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai.

Metode analisis instrumen merupakan metode yang terpilih dan memadai untuk

mengantisipasi persoalan analisis yaitu sangat kecilnya kadar senyawa yang

dianalisis dan kompleksnya matriks sampel yang dianalisis (Mulja dan Suharman,

1995). Untuk itu diperlukan suatu pedoman mengenai kesahihan metode analisis

yang didukung oleh parameter-parameter di bawah ini.

1. Akurasi

Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan

dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.

20  

  

Kriteria kecermatan sangat bergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks

sampel dan pada keseksamaan metode (RSD) (Harmita, 2004).

Tabel I. Rentang akurasi yang masih dapat diterima Analit pada Matrik

Sampel (%) Rata-rata yang Diperoleh (%)

100 98-102 >10 98-102 >1 97-103

>0,1 95-105 0,01 90-107 0,001 90-107

0,000.1 (1 ppm) 80-110 0,000.01 (100 ppb) 80-110 0,000.001 (10 ppb) 60-115 0,000.000.1 (1 ppb) 40-120

(Harmita, 2004). 2. Presisi

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen (Harmita, 2004).

Presisi dari suatu metode analisa meliputi repeatabilitas, presisi antara,

dan reproduksibilitas. Repeatabilitas menyatakan presisi metode analisis yang

dilakukan dalam kondisi yang sama dalam interval waktu yang singkat. Dengan

kata lain uji repeatabilitas dilakukan untuk mengetahui variabilitas data yang

dihasilkan pada dua pengujian berurutan pada kondisi yang sama. Perbedaan

absolut kedua data hasil uji diharapkan berada pada kisaran tingkat kepercayaan

(konfidensi) 95%. Presisi antara menyatakan variasi dalam yang sama baik hari,

analit, ataupun alat yang berbeda (Anonim, 2008).

21  

  

Reproduksibilitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui

variabilitas yang dihasilkan pada dua pengujian contoh identik pada kondisi

berbeda. Perbedaan absolut dari masing-masing data hasil uji diharapkan berada

dalam kisaran tingkat kepercayaan (konfidensi) 95% (Anonim, 2008).

Tabel II. Rentang KV yang masih dapat diterima Analit pada Matrik Sampel (%) KV (%)

>1 2,5 0,001 5

0,000.1 (1 ppm) 16 0,000.000.1 (1 ppb) 32

(Harmita, 2004).

3. Linearitas

Linearitas dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya (pada

rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional

dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).

Persyaratan data linearitas yang dapat diterima jika memenuhi nilai koefisien

korelasi (r) yang diperoleh dari hasil analisis > 0,999 (Anonim, 2004).

4. Range (Kisaran)

Range adalah interval antara kadar terendah sampai kadar tertinggi dari

suatu analit yang masih dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode

tertentu yang masih dapat menghasilkan akurasi, presisi, dan linearitas yang

mencukupi. Biasanya range memiliki satuan yang sama dengan satuan yang

digunakan pada metode analisis, misalnya persen atau ppm (United States

Pharmacopeial Convention, 2007).

22  

  

H. Kesalahan dalam Metode Analisis

Kesalahan dalam metode analisis sangat sukar untuk dihilangkan namun

sumber kesalahan tetap harus ditekan seminimal mungkin. Kesalahan dalam

analisis kimia dapat dikategorikan menjadi dua kelas utama, yaitu:

1. Kesalahan sistemik.

Kesalahan sistemik adalah hasil analisis yang menyimpang secara tetap

dari harga kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis,

sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur (Mulja dan Suharman,

1995). Kesalahan sistematik dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain:

a. Kesalahan personil dan operasi. Kesalahan ini disebabkan oleh cara

pelaksanaan analisis, bukan karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat

fisis (bukan khemis), misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir

titrasi, kekeliruan cara pencucian endapan, dan sebagainya. Jadi kesalahan ini

bersifat individual dan sangat dipengaruhi oleh ketrampilan analis dalam

melakukan pekerjaan analisis.

b. Kesalahan alat dan pereaksi. Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang

kurang murni, alat yang kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat

walaupun alatnya sendiri baik, contohnya pengambilan volume tepat dengan pipet

ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk analisis

mikro, dan sebagainya.

c. Kesalahan metode analisis. Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kesalahan

pengambilan sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau

ikut mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan.

23  

  

Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan cara sebagai

berikut.

(a) Mengkalibrasi instrumen dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya

tiap bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat).

(b) Memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi.

(c) Mamakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis.

(d) Meningkatkan pengetahuan dan ketrampilan para analis.

(e) Melakukan penetapan blangko atau kontrol dengan zat baku.

(f) Melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo) (Mulja dan Suharman,

1995).

2. Kesalahan tidak sistemik

Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap dari

hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari

instrument yang dipakai. Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan dan tidak

dapat dikontrol maka kesalahan ini disebut juga kesalahan acak (Mulja dan

Suharman, 1995).

I. Landasan Teori

Herba Seledri (Apium graveolens L.) memiliki kandungan flavonoid

seperti graveobiosid A dan B serta senyawa golongan fenol yang diketahui

memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Antioksidan adalah senyawa yang dapat

menangkal efek buruk dari radikal bebas, hal ini dikarenakan pada senyawa

antioksidan terdapat kelebihan pasangan elektron bebas yang dapat disumbangkan

24  

  

untuk menetralkan radikal bebas sehingga menjadi tidak reaktif. Hal tersebut

mendorong untuk dilakukan penelitian terhadap herba seledri terutama untuk

mengetahui aktivitas antioksidan yang dimilikinya.

Metode pengujian antioksidan yang umum digunakan terutama untuk

senyawa dari bahan alam adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan sumber

radikal bebas berupa senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Metode ini

memiliki kelebihan yaitu mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas

antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman.

Kandungan fenolik total dapat ditentukan dengan metode Folin-

Ciocalteu. Adanya senyawa fenolik dalam sampel uji akan mereduksi reagen asam

fosfomolibdat-fosfotungstat menjadi produk berwarna biru. Intensitas warna biru

yang dihasilkan sebanding dengan kandungan fenolik yang terdapat dalam sampel

uji.

J. Hipotesis

Fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri mempunyai aktivitas

antioksidan melalui pengujian dengan metode DPPH dan dapat digunakan sebagai

sumber baru senyawa antioksidan alami. Kandungan fenolik dalam fraksi etil

asetat ekstrak etanolik herba seledri berperan dalam aktivitas antioksidannya.

  

25  

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji

diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total

fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan, umur tanaman, dan cara panen.

4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari dan cuaca.

C. Definisi Operasional

1. Ekstrak etanolik herba seledri adalah sari hasil proses maserasi herba seledri

dengan penyari etanol.

2. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik herba seledri dengan

menggunakan etil asetat.

3. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri untuk menangkap

radikal DPPH.

26  

 

4. Inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat

ekstrak etanolik herba seledri yang menghasilkan penangkapan 50% radikal

DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: herba seledri

(Apium graveolens L.) yang diambil dari daerah Banyuroto di Muntilan;

akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck yaitu: methanol,

asam galat; bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH (1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil), reagen Folin-Ciocalteu dan rutin; bahan kualitas teknis

Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV.

General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.

2. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: blender, neraca

analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Janke &

Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel),

spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), corong Buchner, oven,

mikropipet 10-1000µL; 1-10mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup,

dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-

Germany dan Iwaki).

27  

 

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman seledri dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi,

Fakultas Farmasi USD menurut Backer dan Bakhuizen van den Brink (1963) serta

Backer dan Bakhuizen van den Brink (1965).

2. Pengumpulan bahan

Tanaman seledri diperoleh dari daerah Banyuroto di Muntilan.

Pengumpulan pada musim kemarau bulan September. Pemanenan dilakukan pada

tanaman yang menjelang berbunga saat pagi hari, dipilih herba seledri yang masih

segar, berwarna hijau, serta tidak layu.

3. Preparasi sampel

Sebanyak 1 kg herba seledri segar, dibersihkan, kemudian dihaluskan

dengan blender. Ketika dihaluskan, herba tersebut ditambahkan sedikit cairan

penyari (etanol). Simplisia yang telah dihaluskan dituang ke dalam bejana

maserasi, ditambah etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen.

Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh

melalui penyaringan menggunakan kertas saring kasar dengan bantuan corong

Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol

secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya dicampurkan dengan filtrat

terdahulu. Keseluruhan filtrat yang diperoleh diuapkan pelarutnya hingga

diperoleh ekstrak etanol herba seledri.

Ekstrak etanol herba seledri ditambah 300 mL air hangat dan dilakukan

ekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak :

28  

 

wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air

akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian

atas.

Dari hasil ekstraksi cair-cair tersebut diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi

wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi lagi menggunakan etil

asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga

didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan

dengan vacuum rotary evaporator. Lalu fraksi yang telah kering digunakan untuk

dianalisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan DPPH, pembanding, dan uji

a. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh

larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan

alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok rutin

Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL.

c. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0, dan 2,5 mL larutan stok rutin,

kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh

konsentrasi larutan pembanding rutin sebesar 12,5; 25; 37,5; 50; dan 62,5 µg/mL.

29  

 

d. Pembuatan larutan uji

1) Larutan uji untuk uji aktivitas antioksidan

Sebanyak 100 mg ekstrak ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a

sampai 25,0 mL. Dari larutan tersebut kemudian diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0

mL untuk kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga

diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 400; 800; 1200; 1600; dan 2000 µg/mL.

2) Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total

Sebanyak 20 mg hasil fraksi etil asetat pada preparasi sampel ditimbang,

lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi

larutan uji sebesar 2000,0 µg/mL.

e. Pembuatan larutan asam galat

Dibuat larutan asam galat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam akuades

: metanol p.a. (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan

tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a. (1:1) sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125;

dan 150 µg/mL.

5. Uji pendahuluan

a. Uji fenolik

Sebanyak 0,5 mL metanol p.a, larutan pembanding asam galat 150,0

µg/mL, dan larutan uji 2000,0 µg/mL dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi.

Lalu ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan akuades (1:10; v/v). Larutan tersebut selanjutnya ditambahkan dengan 4,0

mL Na2CO3 1M. Setelah 10 menit, amati warna pada larutan tersebut.

30  

 

b. Uji aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga

labu takar 5 mL. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan

pembanding rutin 37,5 µg/mL, dan larutan uji 1200,0 µg/mL. Selanjutnya larutan

tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut

kemudian divortek selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan

tersebut.

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-

masing tiga labu takar 5,0 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1,0 mL

larutan pembanding rutin 12,5; 37,5; dan 62,5 µg/mL kemudian tambahkan

metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30

detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada

panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan

uji 400; 1200; dan 2000 µg/mL.

b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada tiga labu takar 5,0 mL, dimasukkan masing-masing 0,2; 0,6; dan 1,0

mL larutan DPPH 0,4 mM. Masing-masing larutan tersebut ditambahkan metanol

p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi larutan DPPH menjadi 0,016; 0,048;

dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30 detik. Diamkan

selama OT. Lalu dilakukan scanning absorbansinya dengan spektrofotometer

visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

31  

 

7. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri sesuai dengan penelitian Armala (2009).

a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol

Pada labu takar 5,0 mL, dimasukkan sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4

mM kemudian ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut

dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum.

Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan

kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-

masing labu takar 5,0 mL kemudian ditambah dengan 1,0 mL larutan pembanding

dan uji pada berbagai seri konsentrasi larutan yang telah dibuat. Selanjutnya

tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek

selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan

dilakukan sebanyak tiga kali.

c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter akurasi

(%recovery), presisi (%CV), linearitas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).

% Recovery =

% CV =

32  

 

d. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk rutin dan

fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.

8. Optimasi penetapan kandungan fenolik total

a. Penentuan operating time (OT)

Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150

µg/mL dalam metanol p.a. Masing-masing diambil sebanyak 0,5 mL dan

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10; v/v) serta 4,0 mL larutan natrium karbonat (Na2CO3) 1M. Ukur

absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teroritis 750 nm selama 30

menit. Operating Time diperoleh saat nilai absorbansi larutan tersebut telah stabil.

b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150

µg/mL dalam metanol p.a. Masing-masing diambil sebanyak 0,5 mL dan

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10; v/v) serta 4,0 mL larutan natrium karbonat (Na2CO3) 1M. Diamkan

selama OT, lalu dilakukan scanning absorbansinya dengan spektrofotometer

visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.

9. Penetapan kandungan fenolik total

Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri sesuai dengan penelitian Veeru, Kishor, dan Meenakshi (2009).

33  

 

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10; v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL Na2CO3 1M. Setelah

10 menit, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 750 nm terhadap blanko

yang terdiri atas akuades : metanol p.a. (1:1), reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan

Na2CO3 1M.

b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total

Hasil dari prosedur 9 a divalidasi berdasarkan parameter akurasi

(%recovery), presisi (%CV), linearitas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).

c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 2000 µg/mL, lalu dimasukkan ke dalam

tabung reaksi, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva

baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen

asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat).

F. Analisis Hasil

Uji aktivitas antioksidan menghasilkan aktivitas penangkapan radikal

DPPH yang dilaporkan sebagai %IC dihitung dengan rumus:

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan

persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun

pembanding dan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalis secara statistik menggunakan

34  

 

program PASW Statistics 18 untuk menentukan apakah rutin memiliki aktivitas

antioksidan yang lebih besar dibanding fraksi uji.

Kandungan fenolik total dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri dihitung sebagai massa ekivalen asam galat. Caranya dengan memasukkan

nilai absorbansi larutan uji ke dalam persamaan kurva baku asam galat sehingga

diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat. Nilai tersebut kemudian

dikalikan volume larutan uji yang diambil kemudian dibagi dengan massa fraksi

uji yang ditimbang.

Kandungan fenolik total =

Nilai ekivalen asam galat (GAE)

35  

 

 

Determinasi tanaman

Pengumpulan bahan

Pembuatan ekstrak etanolik herba seledri

Fraksi air

Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air

Fraksi wasbensin Fraksi air

Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Fraksi etil asetat

Uji pendahuluan

Gambar 4. Skema jalannya penelitian

Optimasi metode penetapan kandungan

fenolik total

Optimasi uji aktivitas antioksidan

Validasi metode penetapan kandungan

fenolik total

Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Estimasi kandungan fenolik total

Estimasi aktivitas antioksidan

Analisis statistik dengan PASW Statistics 18

  

36  

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman merupakan langkah awal yang harus dilakukan

apabila ingin menggunakan tanaman sebagai sampel penelitian. Determinasi

bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang

akan digunakan dalam penelitian untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam

pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Determinasi tanaman seledri (Apium

graveolens L.) dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi

Sanata Dharma menurut Backer dan Bakhuizen van den Brink (1963) serta Backer

dan Bakhuizen van den Brink (1965). Hasil determinasi didapatkan bahwa sampel

tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah benar herba seledri (Apium

graveolens L.).

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Herba seledri yang akan digunakan dalam penelitian diperoleh dari

daerah Banyuroto, Dusun Banyuroto, Kecamatan Sawangan, Kabupaten

Magelang, Jawa Tengah. Waktu panen suatu tanaman bergantung pada bagian

tanaman yang hendak digunakan, tujuannya agar didapat kandungan aktif yang

optimal.

Herba seledri yang digunakan pada penelitian ini dipilih berdasarkan tiga

kriteria, yaitu dipanen pada musim kemarau, pagi hari, dan sebelum tanaman

37  

  

berbunga. Alasan herba seledri dipanen pada musim kemarau adalah supaya

kandungan lembab tidak terlalu tinggi sehingga meminimalkan pertumbuhan

mikroorganisme seperti jamur dan bakteri yang dapat menurunkan kualitas

tanaman. Dipanen pada pagi hari tujuannya agar didapatkan bahan yang masih

segar serta kandungan aktifnya masih banyak tersimpan dalam tanaman karena

belum mengalami metabolisme. Selain itu, dipilih herba seledri yang menjelang

berbunga karena konsentrasi kandungan aktifnya akan lebih besar terdapat pada

daun dan batangnya apabila tanaman tersebut belum berbunga, karena pada

penelitian ini digunakan daun dan batang tanaman seledri.

Herba seledri dipilih yang masih segar, berwarna hijau serta tidak layu.

Sebelum digunakan untuk penelitian, herba seledri dicuci dan dibersihkan dahulu

menggunakan air mengalir untuk menghilangkan pengotor atau kontaminan

berupa partikel debu maupun tanah yang masih menempel pada tanaman. Herba

seledri dikumpulkan sebanyak 1 kg basah. Herba seledri segar harus segera diolah

untuk menghindari terjadinya fenomena phenolic browning, yaitu warna tanaman

berubah menjadi kecoklatan bahkan menghitam, hal ini terjadi karena oksidasi

senyawa fenolik yang terdapat dalam tanaman (Galati, Angie., McKay, Allan.,

dan Tan, Soon Chye., 2005).

C. Hasil Pembuatan Ekstrak

Ekstrak dibuat dari herba seledri segar tanpa melalui proses pengeringan

terlebih dahulu. Alasan digunakan bahan segar dalam penelitian ini karena banyak

kandungan aktif dalam herba seledri yang belum diketahui secara pasti sifat fisika

38  

  

kimianya sehingga dikhawatirkan akan mengalami perubahan apabila dikeringkan

dahulu (Markham, 1988). Selain itu, selama proses pengeringan dapat terjadi

reaksi oksidasi enzimatis karena kandungan air yang masih cukup tinggi sehingga

senyawa fenolik dan flavonoid dalam herba seledri menjadi terurai dan aktivitas

antioksidannya menurun (Harborne, 1987). Seledri biasa dikonsumsi dalam

keadaan segar sehingga akan lebih sesuai bila menggunakan bahan herba seledri

yang masih segar untuk penelitian ini.

Herba seledri yang telah dicuci dan dibersihkan kemudian dihaluskan

menggunakan blender sambil ditambahkan sedikit cairan penyari, yaitu etanol

96%. Simplisia tersebut diblender agar ukuran partikel tanaman menjadi lebih

kecil sehingga kontak dengan cairan penyari lebih efektif dan semakin banyak

kandungan aktif dalam tanaman yang dapat tersari. Pemilihan etanol sebagai

cairan penyari dikarenakan etanol dapat bercampur dengan air sehingga

diharapkan dapat menyari sebagian besar kandungan kimia dalam bahan segar

yang memiliki kandungan air cukup tinggi.

Penyarian kandungan aktif dilakukan dengan maserasi karena umumnya

kandungan aktif dalam tanaman tidak tahan terhadap pemanasan sehingga lebih

dipilih ekstraksi cara dingin serta proses maserasi dianggap lebih sederhana dan

mudah dilakukan dibanding cara ekstraksi yang lain seperti perkolasi. Perkolasi

memerlukan banyak pelarut serta proses ekstraksinya cukup lama sehingga kurang

efisien untuk penelitian ini. Selain itu, penelitian ini menggunakan bahan segar

sehingga tidak memungkinkan untuk dilakukan ekstraksi dengan cara lain seperti

perkolasi yang mempersyaratkan bahan berupa serbuk atau yang mudah dialiri

39  

  

oleh pelarut (susunannya harus kompak). Maserasi dilakukan terhadap campuran

bahan dan cairan penyari selama dua hari dan dilanjutkan tahap remaserasi ampas

selama dua hari. Selama proses maserasi dilakukan penggojogan dengan bantuan

shaker sehingga meningkatkan kontak simplisia dengan cairan penyari. Hal ini

dilakukan untuk memaksimalkan jumlah kandungan aktif yang dapat tersari dari

simplisia tersebut. Filtrat dari kedua tahapan tesebut dikumpulkan lalu disaring

menggunakan bantuan corong Buchner yang dilapisi kertas saring serta pompa

vakum sehingga prosesnya lebih cepat. Hasil penyaringan filtrat tersebut

kemudian diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak etanol herba seledri.

Ekstrak etanol yang diperoleh sebanyak 27,3421 g.

Ekstrak kental yang telah diperoleh kemudian difraksinasi. Sebelum

difraksinasi maka ekstrak kental tersebut ditambahkan 300 mL air hangat terlebih

dahulu karena dengan air dingin ekstrak etanolik sukar larut. Fraksinasi dilakukan

dengan pelarut wasbensin yang bersifat non polar dengan perbandingan 1:1 v/v.

Bagian yang polar seperti polifenol dan flavonoid akan tersari ke air sedangkan

bagian non polar seperti lipid dan klorofil akan tersari ke wasbensin. Fraksi air

akan berada pada bagian bawah sedangkan fraksi wasbensin akan berada di

bagian atas. Hal tersebut dikarenakan bobot jenis (bj) air (1 g/mL) lebih besar

daripada bj wasbensin (0,730 g/mL). Selanjutnya, fraksi air yang telah dipisahkan

dari fraksi wasbensin difraksinasi menggunakan etil asetat yang kepolarannya

berada diantara air dan wasbensin dengan perbandingan 1:1 v/v. Tahapan

fraksinasi menggunakan etil asetat-air sama seperti tahapan fraksinasi wasbensin-

air. Pada fraksinasi air dengan etil asetat, fraksi air juga akan berada pada bagian

40  

  

bawah karena bj air (1 g/mL) lebih besar dibandingkan etil asetat (0,903 g/mL).

Setelah proses fraksinasi selesai, didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi

etil asetat selanjutnya diuapkan menggunakan bantuan vacuum rotary evaporator

untuk menghilangkan pelarutnya. Pada saat hampir semua pelarut telah menguap,

fraksi tersebut diletakkan dalam cawan porselen yang telah ditara sebelumnya

kemudian dipanaskan di atas waterbath sambil diaduk agar terbentuk ekstrak yang

benar-benar kental. Setelah kental, fraksi etil asetat yang berwarna kehijauan

ditimbang dan diperoleh 0,5446 g.

D. Hasil Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui apakah dalam fraksi etil

asetat ekstrak etanolik herba seledri terdapat kandungan senyawa fenolik serta

apakah fraksi tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Pada uji pendahuluan

keberadaan senyawa fenolik, senyawa uji ditambahkan pereaksi fenol Folin-

Ciocalteu, didiamkan selama dua menit kemudian ditambahkan larutan natrium

karbonat 1M. Pembanding yang digunakan untuk uji ini adalah asam galat yang

merupakan senyawa fenolik.

41  

  

Gambar 5. Uji pendahuluan senyawa fenolik

Keterangan : 1 : Pereaksi Folin-Ciocalteu + Na2CO3 sebagai kontrol; 2 : Asam galat; 3 : Fraksi uji

Adanya senyawa fenolik dalam fraksi uji akan mengubah warna larutan

menjadi biru. Perubahan warna tersebut terjadi karena oksidasi senyawa fenol

dalam fraksi uji oleh pereaksi Folin-Ciocalteu. Hasil pengujian pada fraksi etil

asetat ekstrak etanolik herba seledri menunjukkan positif terdapat kandungan

fenolik karena terbentuk warna biru, hal tersebut terjadi pula pada senyawa

pembanding asam galat.

Pada uji pendahuluan aktivitas antioksidan, baik senyawa uji maupun

senyawa pembanding, yaitu rutin ditambahkan pada larutan DPPH dalam metanol.

Adanya aktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH yang semula

berwarna ungu menjadi kekuningan. Hasil pengujian baik untuk senyawa uji

maupun senyawa pembanding kesemuanya positif karena terjadi perubahan warna

pada larutan DPPH dalam metanol menjadi kekuningan, dibandingkan dengan

kontrol berupa larutan DPPH dalam metanol yang berwarna ungu.

1 12

3

42  

  

Gambar 6. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Keterangan : 1 : Larutan DPPH sebagai kontrol; 2 : Rutin; 3 : Fraksi uji

E. Optimasi Metode

1. Penentuan Operating Time (OT)

Penetuan operating time dimaksudkan untuk memperoleh waktu

pengukuran absorbansi dengan nilai yang stabil. Waktu pengukuran absorbansi

ditentukan saat warna yang terbentuk stabil, ditandai dengan nilai absorbansi yang

stabil dari senyawa yang diukur.

a. Uji aktivitas antioksidan

Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan larutan

DPPH yang telah ditambahkan senyawa uji maupun senyawa pembanding rutin

pada tiga konsentrasi berbeda (low, med, dan high). Larutan divorteks dahulu

selama 30 detik sebelum diukur untuk menghomogenkan campuran tersebut agar

bereaksi optimal. Pembacaan absorbansi dilakukan menggunakan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis dari DPPH yaitu 517

nm selama 1 jam. Pengukuran absorbansi dilakukan tiap 5 menit dikarenakan

instrumen yang digunakan tidak dapat digunakan untuk mengukur OT secara

1 12 3

43  

  

otomatis. Waktu operasi (OT) yang diperoleh untuk larutan pembanding rutin

maupun larutan uji adalah 30 menit, ditandai dengan nilai absorbansi yang tetap.

Gambar 7. Kurva penentuan Operating Time (OT) uji aktivitas antioksidan

b. Penetapan kandungan fenolik total

Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan kompleks

molybdenum blue yang terbentuk oleh reaksi antara senyawa fenolik yaitu asam

galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dalam suasana basa. Pembacaan absorbansi

dilakukan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis

kompleks molybdenum blue yaitu 750 nm selama 30 menit. Pengukuran

absorbansi dilakukan tiap 5 menit dikarenakan instrumen yang digunakan tidak

dapat digunakan untuk mengukur OT secara otomatis. Waktu operasi (OT) yang

diperoleh untuk larutan asam galat adalah 10 menit, ditandai dengan nilai

absorbansi yang tetap.

44  

  

Gambar 8. Kurva penentuan Operating Time (OT) penetapan kandungan fenolik total

2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

a. Uji aktivitas antioksidan

Meskipun telah diketahui dari sejumlah literatur (Blois, 1958; Lu dan

Foo, 2000; Zhu et al., 2002) bahwa panjang gelombang serapan maksimum DPPH

yaitu pada λ 517 nm, tetapi tetap perlu untuk dilakukan penentuan dikarenakan

panjang gelombang serapan maksimum dapat mengalami perubahan (pergeseran)

dikarenakan perbedaan kondisi percobaan yang dilakukan. Perubahan tersebut

dapat berupa perbedaan instrumen, waktu pengukuran, pelarut, iklim, maupun

individu yang melakukan.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan terhadap

larutan DPPH dalam pelarut metanol pada tiga konsentrasi, setelah sebelumnya

divorteks dan didiamkan selama OT. Scanning dilakukan pada panjang

45  

  

gelombang 400-600 nm. Hasilnya diperoleh panjang gelombang serapan

maksimum untuk penelitian ini adalah 515,8 nm. Selisih panjang gelombang ini

dengan panjang gelombang maksimum teoritis sebesar 1,2 nm, selisih nilai ini

masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi

IV, yaitu kurang dari 2 nm. Karena hal diatas, panjang gelombang maksimum

yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian.

Gambar 9. Scanning panjang gelombang maksimum larutan DPPH

Keterangan : A : larutan DPPH 0,016 mM; B : larutan DPPH 0,048 mM; C : larutan DPPH 0,08 mM

b. Penetapan kandungan fenolik total

Dilakukan pula penentuan panjang gelombang serapan maksimum untuk

pengujian kandungan fenolik total. Scanning dilakukan pada tiga seri konsentrasi

asam galat (low, med, dan high) pada panjang gelombang 600-800 nm. Dari hasil

46  

  

scanning diperoleh panjang gelombang maksimum untuk penentuan kandungan

fenolik total adalah 750 nm. Hasil tersebut sesuai dengan panjang gelombang

maksimum teoritis dari kompleks molybdenum blue yaitu 750 nm.

Gambar 10. Scanning panjang gelombang maksimum asam galat + pereaksi

Folin-Ciocalteu + natrium karbonat

Keterangan : A : konsentrasi rendah; B : konsentrasi sedang; C : konsentrasi tinggi

Panjang gelombang maksimum merupakan faktor penting dalam analisis

menggunakan spektrofotometer UV-Vis karena pada panjang gelombang tersebut

diperoleh serapan optimum dari suatu senyawa yang diukur. Selain itu, panjang

gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang

bersifat karakteristik. Panjang gelombang serapan maksimum tidak bergantung

pada struktur senyawa melainkan pada gugus yang mengabsorbsi radiasi sinar

UV-Vis, sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama,

belum tentu keduanya adalah senyawa yang sama. Hal inilah yang menyebabkan

47  

  

panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis

kualitatif.

Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi selalu dilakukan pada

panjang gelombang serapan maksimum dikarenakan perubahan absorbansi untuk

tiap perubahan konsentrasi adalah paling besar sehingga memberikan kepekaan

analisis yang tinggi. Selain itu, bila dilakukan pengukuran pada panjang

gelombang serapan maksimum maka untuk pengukuran berulang hasilnya lebih

reprodusibel sehingga kesalahan yang terjadi makin kecil (Mulja dan Suharman,

1995).

F. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter

tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan yang digunakan (Harmita, 2004).

Validasi metode analisis perlu dilakukan baik untuk uji aktivitas antioksidan

dengan metode DPPH maupun penetapan kandungan fenolik total dengan metode

Folin-Ciocalteu. Parameter validasi yang dinilai meliputi akurasi, presisi,

linearitas serta spesifisitas pengukuran.

1. Uji aktivitas antioksidan

Berikut ini adalah kurva regresi linier antara konsentrasi rutin atau

fraksi uji dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH.

48  

  

Gambar 11. Kurva regresi linier antara konsentrasi rutin dengan aktivitas

antioksidannya menggunakan metode DPPH

Gambar 12. Kurva regresi linier antara konsentrasi fraksi dengan aktivitas

antioksidannya menggunakan metode DPPH

a. Akurasi

Penilaian akurasi suatu metode didasarkan pada nilai perolehan kembali

(recovery) dari data hubungan antara konsentrasi larutan pembanding ataupun

larutan uji dengan absorbansi yang dihasilkan.

49  

  

Tabel III. Data recovery larutan pembanding rutin

Rutin Konsentrasi

Teoritis (µg/mL)

% IC Konsentrasi

Terukur (µg/mL)

Recovery

Seri I 2,4 7,738 2,26 94,14 2,5 8,452 2,36 94,33 2,5 8,333 2,34 93,67

Seri II 4,8 27,619 5,01 104,44 5 28,452 5,13 102,57 5 28,214 5,10 101,91

Seri III 7,2 43,81 7,26 100,78 7,5 45,476 7,49 99,83 7,5 45,357 7,47 99,61

Seri IV 9,6 63,571 9,99 104,10 10 65,119 10,21 102,08 10 65 10,19 101,91

Seri V 12 78,69 12,09 100,73

12,5 80,357 12,32 98,55 12,5 80,119 12,29 98,29

Berdasarkan data pada tabel diatas, persentase perolehan kembali larutan

pembanding rutin berada dalam rentang 93,67-104,44%. Hasil tersebut masih

berada dalam rentang recovery yang baik untuk analit dengan kadar 2,4-12,5

µg/mL. Nilai recovery yang masih bisa diterima berkisar antara 90-107%

(Harmita, 2004).

50  

  

Tabel IV. Data recovery larutan uji Fraksi

Etil Asetat

Konsentrasi Teoritis (µg/mL)

% IC Konsentrasi

Terukur (µg/mL)

Recovery

Seri I 80,08 18,69 81,99 102,39

80 19,405 87,33 109,16 80 19,167 85,55 106,94

Seri II 160,16 28,333 153,96 96,13

160 28,81 157,51 98,45 160 29,048 159,29 99,56

Seri III 240,24 38,333 228,58 95,15

240 39,286 235,69 98,21 240 39,048 233,92 97,47

Seri IV 320,32 49,405 311,21 97,16

320 50,357 318,31 99,47 320 50,119 316,54 98,92

Seri V 400,4 61,905 404,49 101,02 400 62,5 408,93 102,23 400 62,381 408,04 102,01

Berdasarkan data pada tabel diatas, persentase perolehan kembali larutan

uji berada dalam rentang 95,15-109,16%. Nilai recovery yang masih bisa diterima

berkisar antara 90-107% untuk kadar analit 10-100 µg/mL serta 95-105% untuk

kadar analit >100-1000 µg/mL (Harmita, 2004). Hasil tersebut masih berada

dalam rentang recovery yang baik untuk analit dengan kadar 80-400,4 µg/mL.

Hanya terdapat satu data yang tidak memenuhi persyaratan, yaitu untuk kadar 80

µg/mL yang nilai recoverynya 109,16 %. Dapat dikatakan bahwa metode DPPH

yang digunakan memiliki akurasi yang baik.

b. Presisi

Presisi suatu metode analisis dinyatakan dalam persentase Coefficient of

Variation (CV). Tabel berikut menunjukkan persentase CV untuk tiap konsentrasi

larutan pembanding rutin.

51  

  

Tabel V. Data Coefficient of Variation (CV) larutan pembanding rutin

Rutin Konsentrasi

Teoritis (µg/mL)

% IC Konsentrasi

Terukur (µg/mL)

Recovery SD CV (%)

Seri I 2,4 7,738 2,26 94,14

0,3398 0,36132,5 8,452 2,36 94,33 2,5 8,333 2,34 93,67

Seri II 4,8 27,619 5,01 104,44

1,3123 1,27445 28,452 5,13 102,57 5 28,214 5,10 101,91

Seri III 7,2 43,81 7,26 100,78

0,6218 0,62147,5 45,476 7,49 99,83 7,5 45,357 7,47 99,61

Seri IV 9,6 63,571 9,99 104,10

1,2183 1,186310 65,119 10,21 102,08 10 65 10,19 101,91

Seri V 12 78,69 12,09 100,73

1,34 1,351012,5 80,357 12,32 98,55 12,5 80,119 12,29 98,29

Nilai % CV untuk larutan pembanding rutin pada tabel diatas berada

pada rentang 0,3613-1,3510%. Untuk kadar analit antara 2,4-12,5 µg/mL, nilai

presisi yang masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri

konsentrasi larutan pembanding rutin telah memenuhi nilai presisi yang baik.

52  

  

Tabel VI. Data Coefficient of Variation (CV) larutan uji Fraksi

Etil Asetat

Konsentrasi Teoritis (µg/mL)

% IC Konsentrasi

Terukur (µg/mL)

Recovery SD CV (%)

Seri I 80,08 18,69 81,99 102,39

3,4512 3,250880 19,405 87,33 109,16 80 19,167 85,55 106,94

Seri II 160,16 28,333 153,96 96,13

1,7502 1,7851160 28,81 157,51 98,45 160 29,048 159,29 99,56

Seri III 240,24 38,333 228,58 95,15

1,5965 1,6469240 39,286 235,69 98,21 240 39,048 233,92 97,47

Seri IV 320,32 49,405 311,21 97,16

1,2067 1,2249320 50,357 318,31 99,47 320 50,119 316,54 98,92

Seri V 400,4 61,905 404,49 101,02

0,6445 0,6334400 62,5 408,93 102,23 400 62,381 408,04 102,01

Nilai % CV untuk larutan uji pada tabel diatas berada pada rentang

0,6334-3,2508%. Untuk kadar analit antara 80-400,4 µg/mL, nilai presisi yang

masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri konsentrasi

larutan uji diketahui telah memenuhi nilai presisi yang baik. Dari hasil tersebut,

dapat dikatakan bahwa metode DPPH yang digunakan memiliki presisi yang baik.

c. Linearitas

Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r) yang

dihasilkan dari suatu persamaan regresi linier. Semakin nilai r mendekati ± 1

maka linearitasnya semakin baik. Nilai koefisien korelasi (r) untuk larutan

pembanding rutin adalah sebagai berikut

replikasi I = 0,9990; replikasi II = 0,9991; dan replikasi III = 0,9991. Menurut

Mulja dan Suharman (1995) dan Anonim (2004), data linearitas dapat diterima

53  

  

jika memenuhi nilai r > 0,999. Dari hasil tersebut, persamaan kurva baku untuk

ketiga replikasi larutan pembanding rutin telah memenuhi persyaratan lineraitas

yang baik.

Untuk larutan uji, nilai koefisien korelasinya adalah sebagai berikut

replikasi I = 0,9985; replikasi II = 0,9989; dan replikasi III = 0,9989. Persyaratan

linearitas untuk larutan uji mengacu kepada nilai r tabel untuk taraf kepercayaan

95% dan degree of freedom (df) 3, yakni 0,878 (Muth, 1999). Dari hasil tersebut,

persamaan kurva baku untuk ketiga replikasi larutan uji telah memenuhi

persyaratan lineraitas yang baik. Dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan

bahwa metode DPPH yang digunakan memiliki linearitas yang baik.

d. Spesifisitas

Parameter spesifisitas dinilai dari ketepatan suatu metode untuk

mengukur analit tertentu dalam sampel yang kompleks. Pada pengujian ini

spesifisitas dapat dilihat dari spektra yang dihasilkan baik oleh pelarut, senyawa

uji, senyawa pembanding rutin, asam galat, maupun larutan DPPH.

Spesifisitas uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dapat dilihat

dari spektra pelarut metanol, senyawa uji, maupun senyawa pembanding rutin

yang tidak memberikan serapan pada panjang gelombang maksimum larutan

DPPH yang akan diukur absorbansinya sehingga nilai absorbansi yang terukur

merupakan absorbansi larutan DPPH tanpa ada intervensi absorbansi pelarut

maupun senyawa lain yang ditambahkan (lampiran 7, 9, dan 12).

54  

  

2. Penetapan kandungan fenolik total

Berikut ini adalah kurva baku larutan asam galat setelah ditambahkan

pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat.

Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat dengan

absorbansinya setelah ditambahkan pereaksi

a. Akurasi

Penilaian akurasi suatu metode didasarkan pada nilai perolehan kembali

(recovery) dari data hubungan antara konsentrasi larutan pembanding ataupun

larutan uji dengan absorbansi yang dihasilkan.

55  

  

Tabel VII. Data recovery asam galat

Asam galat

Konsentrasi Teoritis (µg/mL)

AbsorbansiKonsentrasi

Terukur (µg/mL)

Recovery

Seri I 50 0,317 51,26 102,52 50 0,319 52,00 104,00

50,4 0,322 53,11 105,38

Seri II 75 0,383 75,70 100,94 75 0,386 76,81 102,42

75,6 0,391 78,67 104,06

Seri III

100 0,452 101,26 101,26 100 0,454 102,00 102,00

100,8 0,458 103,48 102,66

Seri IV

125 0,52 126,44 101,16 125 0,523 127,56 102,04 126 0,529 129,78 103,00

Seri V 150 0,591 152,74 101,83 150 0,595 154,22 102,81

151,2 0,602 156,81 103,71

Berdasarkan data pada tabel diatas, persentase perolehan kembali larutan

asam galat berada dalam rentang 100,94-105,38%. Hasil tersebut masih berada

dalam rentang recovery yang baik untuk analit dengan kadar 50-151,2 µg/mL.

Nilai recovery yang masih bisa diterima berkisar antara 90-107% untuk kadar

analit 10-100 µg/mL serta 95-105% untuk kadar analit >100-1000 µg/mL

(Harmita, 2004). Dari data diatas, diketahui semua recovery memenuhi nilai yang

dipersyaratkan. Dapat dikatakan bahwa metode Folin-Ciocalteu yang digunakan

memiliki akurasi yang baik.

b. Presisi

Presisi suatu metode analisis dinyatakan dalam persentase Coefficient of

Variation (CV). Tabel berikut menunjukkan persentase CV untuk tiap konsentrasi

larutan pembanding rutin.

56  

  

Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV) larutan asam galat

Asam galat

Konsentrasi Teoritis (µg/mL)

AbsorbansiKonsentrasi

Terukur (µg/mL)

Recovery SD CV (%)

Seri I 50 0,317 51,26 102,52

1,4303 1,375750 0,319 52,00 104,00 50,4 0,322 53,11 105,38

Seri II 75 0,383 75,70 100,94

1,5607 1,523175 0,386 76,81 102,42 75,6 0,391 78,67 104,06

Seri III

100 0,452 101,26 101,26 0,7004 0,6868100 0,454 102,00 102,00

100,8 0,458 103,48 102,66

Seri IV

125 0,52 126,44 101,16 0,9203 0,9017125 0,523 127,56 102,04

126 0,529 129,78 103,00

Seri V 150 0,591 152,74 101,83

0,9403 0,9148150 0,595 154,22 102,81 151,2 0,602 156,81 103,71

Nilai % CV untuk larutan asam galat pada tabel diatas berada pada

rentang 0,6868-1,5231%. Untuk kadar analit antara 50-151,2 µg/mL, nilai presisi

yang masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri

konsentrasi larutan asam galat telah memenuhi nilai presisi yang baik. Dari hasil

tersebut, dapat dikatakan bahwa metode Folin-Ciocalteu yang digunakan memiliki

presisi yang baik.

c. Linearitas

Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r) yang

dihasilkan dari suatu persamaan regresi linier. Semakin nilai r mendekati ± 1

maka linearitasnya semakin baik. Nilai koefisien korelasi (r) untuk larutan asam

galat adalah sebagai berikut

57  

  

replikasi I = 0,9999; replikasi II = 0,9999; dan replikasi III = 0,9999. Menurut

Mulja dan Suharman (1995) dan Anonim (2004), data linearitas dapat diterima

jika memenuhi nilai r > 0,999. Dari hasil tersebut, persamaan kurva baku untuk

ketiga replikasi larutan asam galat telah memenuhi persyaratan linearitas yang

baik. Dapat disimpulkan bahwa metode Folin-Ciocalteu yang digunakan memiliki

linearitas yang baik.

d. Spesifisitas

Spesifisitas penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-

Ciocalteu juga dapat dilihat dari spektra pelarut metanol, senyawa uji, maupun

asam galat yang tidak memberikan serapan pada panjang gelombang maksimum

kompleks molybdenum-blue yang akan diukur absorbansinya sehingga nilai

absorbansi yang terukur merupakan kompleks molybdenum-blue tanpa ada

intervensi absorbansi pelarut maupun senyawa lain yang ditambahkan (lampiran

7, 12, dan 14).

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Pada penelitian ini, pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan

metode DPPH. Metode ini menggunakan senyawa radikal bebas, yaitu (DPPH)

karena terdapat elektron yang tidak berpasangan pada strukturnya sehingga dapat

digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan suatu senyawa yang dapat

mendonorkan elektronnya sehingga terjadi penurunan intensitas warna atau

absorbansi larutan DPPH.

58  

  

Gambar 14. Reaksi terbentuknya warna kuning oleh adanya antioksidan

Pengurangan intensitas warna larutan DPPH tersebut dihasilkan oleh

bereaksinya molekul radikal DPPH dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan

komponen bahan uji sehingga terbentuk senyawa 1,1 difenil-2-pikrilhidrazin yang

berwarna kuning. Pengurangan intensitas warna ungu larutan DPPH karena

adanya penambahan senyawa penangkap radikal bebas dapat dihitung secara

kuantitatif dari berkurangnya absorbansi larutan tersebut.

Pada prinsipnya absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH

yang tidak bereaksi dengan bahan uji atau DPPH yang masih tersisa dalam

larutan, sehingga dengan bertambahnya konsentrasi senyawa penangkap radikal

bebas dalam larutan, maka absorbansi larutan akan berkurang. Hal ini berarti

bahwa aktivitas penangkapan radikal bebasnya semakin meningkat.

Menurut metode ini, aktivitas antioksidan dari senyawa uji dinyatakan

dengan IC50. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan

hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan radikal

yang dimilikinya. Semakin kecil nilai IC50, maka semakin aktif suatu

fraksi/ekstrak tanaman sebagai antioksidan.

Antioksidan 

1,1 difenil-2-pikrilhidrazil (ungu)  1,1 difenil-2-pikrilhidrazin (kuning)

59  

  

Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding dalam uji aktivitas

antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri ini karena rutin

merupakan senyawa antioksidan alami golongan flavonoid yang telah diketahui

memiliki potensi penangkapan radikal yang poten. Dalam uji ini, rutin akan

mereduksi radikal DPPH menjadi senyawa 1,1 difenil-2-pikrilhidrazin sehingga

terjadi penurunan intensitas warna pada larutan dari yang semula ungu menjadi

kekuningan.

Gambar 15. Struktur rutin (Mabry et al., 1970).

Tabel IX. Data aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH

Replikasi I

Konsentrasi rutin (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%) 2,4 0,775 7,738 4,8 0,608 27,619 7,2 0,472 43,810 9,6 0,306 63,571 12 0,179 78,690

Persamaan garis regresi linier : y = 7,411 x – 9,071 r = 0,9990 IC50 = 7,971 (µg/mL) x = konsentrasi rutin y = aktivitas antioksidan rutin Absorbansi kontrol 0,840

60  

  

Replikasi II

Konsentrasi rutin (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%) 2,5 0,769 8,452 5 0,601 28,452

7,5 0,458 45,476 10 0,293 65,119

12,5 0,165 80,357 Persamaan garis regresi linier : y = 7,219 x – 8,572 r = 0,9991 IC50 = 8,114 (µg/mL) x = konsentrasi rutin y = aktivitas antioksidan rutin Absorbansi kontrol 0,840 Replikasi III

Konsentrasi rutin (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%) 2,5 0,770 8,333 5 0,603 28,214

7,5 0,459 45,357 10 0,294 65

12,5 0,167 80,119 Persamaan garis regresi linier : y = 7,214 x – 8,703 r = 0,9991 IC50 = 8,137 (µg/mL) x = konsentrasi rutin y = aktivitas antioksidan rutin Absorbansi kontrol 0,840 Rata-rata IC50 = 8,074 µg/mL

SD = 0,090

CV = 1,115 %

Dari analisis regresi linier diperoleh nilai IC50 rata-rata rutin sebesar

8,074 µg/mL. Hal ini berarti untuk menangkap radikal bebas sebesar 50%

diperlukan konsentrasi rutin sebesar 8,074 µg/mL.

Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri

dengan metode DPPH disajikan pada tabel berikut.

61  

  

Tabel X. Data aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri dengan metode DPPH

Replikasi I

Konsentrasi fraksi (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%)

80,08 0,683 18,690 160,16 0,602 28,333 240,24 0,518 38,333 320,32 0,425 49,405 400,4 0,320 61,905

Persamaan garis regresi linier : y = 0,134 x + 7,083 r = 0,9985 IC50 = 320,276 (µg/mL) x = konsentrasi fraksi y = aktivitas antioksidan fraksi Absorbansi kontrol 0,840 Replikasi II

Konsentrasi fraksi (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%)

80 0,677 19,405 160 0,598 28,810 240 0,510 39,286 320 0,417 50,357 400 0,315 62,5

Persamaan garis regresi linier : y = 0,135 x + 7,751 r = 0,9989 IC50 = 312,956 (µg/mL) x = konsentrasi fraksi y = aktivitas antioksidan fraksi Absorbansi kontrol 0,840

62  

  

Replikasi III

Konsentrasi fraksi (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%)

80 0,679 19,167 160 0,596 29,048 240 0,512 39,048 320 0,419 50,119 400 0,316 62,381

Persamaan garis regresi linier : y = 0,134 x + 7,703 r = 0,9989 IC50 = 315,649 (µg/mL) x = konsentrasi fraksi y = aktivitas antioksidan fraksi Absorbansi kontrol 0,840 Rata-rata IC50 = 316,294 µg/mL

SD = 3,702

CV = 1,170 %

Dari analisis regresi linier diperoleh nilai IC50 rata-rata fraksi sebesar

316,294 µg/mL. Hal ini berarti untuk menangkap radikal bebas sebesar 50%

diperlukan konsentrasi fraksi sebesar 316,294 µg/mL.

IC50 merupakan konsentrasi antioksidan yang diperlukan untuk

menangkap 50% radikal DPPH. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier

yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji (x) dengan aktivitas

antioksidan yang dihasilkan (y). Semakin kecil nilai IC50, maka sampel uji

mempunyai keefektifan sebagai antioksidan yang lebih baik. Dari hasil regersi

linier diperoleh IC50 rutin adalah 8,074 µg/mL, sedangkan untuk fraksi etil asetat

ekstrak etanolik herba seledri memiliki IC50 sebesar 316,294 µg/mL. Dari nilai

tersebut dapat diketahui bahwa rutin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih

baik bila dibandingkan dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.

63  

  

Rutin memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat karena nilai IC50 < 50

µg/mL, sedangkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki

aktivitas antioksidan yang lemah karena nilai IC50 > 150 µg/mL.

Tabel XI. Tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji dengan metode penangkapan radikal DPPH (Ariyanto cit., Kurniasih, 2008).

Sampel IC50 (µg/mL)

Tingkatan aktivitas antioksidan (IC50) dengan metode penangkapan radikal DPPH

Sangat kuat (< 50 µg/mL)

Kuat (<50-100 µg/mL)

Sedang (101-150 µg/mL)

Lemah (>150

µg/mL) Rutin 8,074 √

Fraksi etil asetat 316,294 √

H. Hasil Uji Penetapan Kandungan Fenolik Total

Penetapan kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah

kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri

karena senyawa fenolik memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Penetapan

kandungan fenolik dilakukan secara spektrofotometri dan hasilnya dinyatakan

sebagai massa ekivalen asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar karena

merupakan senyawa fenolik yang telah dikenal memiliki aktivitas antioksidan.

Gambar 16. Struktur asam galat (Lopez, et al., 2003).

64  

  

Tabel XII. Konsentrasi asam galat dan absorbansinya setelah ditambah pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang diukur secara

spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm

Replikasi I

Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi

50 0,317

75 0,383

100 0,452

125 0,520

150 0,591

Persamaan garis regresi linier : y = 0,0027 x + 0,1786 r = 0,9999 x = konsentrasi asam galat y = absorbansi

Replikasi II

Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi

50 0,319

75 0,386

100 0,454

125 0,523

150 0,595

Persamaan garis regresi linier : y = 0,0028 x + 0,1798 r = 0,9999 x = konsentrasi asam galat y = absorbansi

65  

  

Replikasi III

Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi

50,4 0,322

75,6 0,391

100,8 0,458

126,0 0,529

151,2 0,602

Persamaan garis regresi linier : y = 0,0028 x + 0,1812 r = 0,9999 x = konsentrasi asam galat y = absorbansi

Dasar penetapan kandungan fenolik total secara spektrofotometri ini

adalah adanya oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-

Ciocalteu menghasilkan senyawa yang berwarna. Fenol dalam suasana basa akan

berubah menjadi ion fenolat yang bersifat lebih reaktif sehingga lebih mudah

bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu (gambar 17). Suasana basa diakibatkan

oleh adanya penambahan natrium karbonat.

OH

fenol

OH

O

ion fenolat  

Gambar 17. Oksidasi fenol dalam suasana basa

66  

  

Ion fenolat dioksidasi oleh asam dalam pereaksi Folin-Ciocalteu dan

kompleks molybdenum-tungstat akan direduksi sebagian oleh sampel sehingga

menghasilkan warna biru (molybdenum-blue) (gambar 18).

H3PO4(MoO3)12

pereaksi Folin-Ciocalteu

+

OH

gugus fenol sampel

+ H2O

O

O

kuinon

+

H5(PMo12O40)

atau

H7(PMo12O40)

kompleks oktahedralmolybdenum-blue

 

Gambar 18. Reaksi fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu

Saat reaksi terjadi, pereaksi Folin-Ciocalteu mendapatkan proton (H+)

dari gugus fenol sampel dan air (tereduksi), sedangkan gugus fenol akan

mendapatkan tambahan oksigen dari air dan pereaksi (teroksidasi), sehingga

membentuk kompleks oktahedral molybdenum-blue dan kuinon. Kompleks

octahedral yang terbentuk merupakan kompleks MoO3-fosfat dengan fosfor (P)

sebagai pusatnya. Molibdat pada kompleks dapat disubstitusi oleh tungsten (W).

Kompleks molybdenum-blue yang terbentuk berupa koloid dan akan

menjadi encer dengan adanya asam fosfat pada pereaksi Folin-Ciocalteu, sehingga

dapat dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel.

Hasil penetapan kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak

etanolik herba seledri dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat dan

dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Hasilnya disajikan pada tabel berikut.

67  

  

Tabel XIII. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri yang dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg GAE/g)

Replikasi Absorbansi Kadar (mg/mL) Kandungan fenolik total (mg GAE/g)

I 0,613 0,161 3,284 II 0,609 0,159 3,275 III 0,607 0,159 3,25

Rata-rata kandungan fenolik total = 3,27 mg GAE/g

SD = 0,018

CV = 0,550 %

I. Hasil Analisis Statistik

Dari hasil uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba

seledri, dapat dilakukan analisis statistik untuk mengetahui apakah ada perbedaan

signifikan antara aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh fraksi uji dengan

aktivitas antioksidan yang dimiliki senyawa pembanding rutin. Analisis statistik

dilakukan menggunakan program PASW Statistics 18. Untuk mengetahui

kenormalan distribusi data dilakukan analisis statistik deskriptif menggunakan

perhitungan Kolmogorov-Smirnov, hasilnya diperoleh nilai signifikansi sebesar

0,200. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa Hnull diterima karena nilai p

lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Jadi, data uji aktivitas antioksidan

mengikuti distribusi normal.

Karena distribusi datanya normal maka dapat dilanjutkan pengujian

statistik induktif menggunakan uji parametrik yaitu Independent Sample t Test.

Alasan pemilihan uji ini karena tujuannya untuk mengetahui perbedaan antara dua

sampel yang tidak saling berhubungan, yaitu rutin dan fraksi etil asetat. Uji ini

digunakan untuk mengetahui apakah aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh rutin

68  

  

lebih besar dibandingkan dengan fraksi uji. Hipotesis yang diujikan sebagai

berikut.

Hi : Aktivitas antioksidan rutin lebih besar dibandingkan fraksi uji.

Hnull : Aktivitas antioksidan rutin tidak lebih besar dibandingkan fraksi uji.

Hasil pengujian memperoleh nilai signifikansi 0,000 antara rutin dengan fraksi etil

asetat. Bila dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05

maka Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada

nilai signifikansi yang ditentukan. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa rutin

memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dibandingkan fraksi uji. Data

analisis statistik tercantum pada lampiran 18.

 

69  

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki aktivitas antioksidan

melalui pengujian dengan metode DPPH, dengan IC50 sebesar 316,29 ± 3,70

µg/mL.

2. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri sebesar

3,27 ± 0,018 mg GAE/g.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian aktivitas antioksidan untuk serbuk herba seledri.

2. Perlu dipertimbangkan adanya pengaruh absorbansi larutan uji pada hasil

pengukuran aktivitas antioksidan.

3. Perlu dilakukan orientasi konsentrasi larutan uji yang dibuat agar nilai

absorbansinya masuk dalam range absorbansi kurva baku dan didapatkan hasil

pengukuran yang memenuhi parameter validasi.

 

70  

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2004, Guidelines for the Validation of Analitical Methods for Active

Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products, 4-5, www.apvma.gov.au/guidelines/downloads /g169_analytical_methods.pdf, diakses tanggal 2 September 2010.

Anonim, 2005, Tanaman Obat Indonesia, Seledri,

http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=127, diakses tanggal 30 April 2010.

Anonim, 2008, Proposal KTI Validasi Metode Pemeriksaan Timbal Dara dengan

AAS, http://ninjabiru.wordpress.com/, diakses tanggal 5 September 2010.

Armala, M. M., 2009, Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir

(Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Backer, C.A., dan Bakhuizen van den Brink, 1963, Flora of Java, Vol. I, NV.

P.Noordhooff –Groningen, Groningen, the Netherlands, pp. 3-11. Backer, C.A., dan Bakhuizen van den Brink, 1965, Flora of Java, Vol. II, NV.

P.Noordhooff –Groningen, Groningen, the Netherlands, pp. 171-175. Blois, M.S., 1958, Antioxidant Determinations by the Use of A Stable Free

Radical, Nature, 181 , 1199-1200. Box, J.D., 1983, Investigation of the Folin-Ciocalteu Phenol Reagent for the

Determination of Polyphenolic Substances in Natural Waters, Water Res, 17, 511-525.

Ciz, Milan., Cizova, Hana., Denev, Petko., Kratchanova, Maria., Slavov, Anton.,

dan Lojek, Antonin., 2010, Different Methods for Control and Comparison of Antioxidant Properties of Vegetables, Food Control, 21, 518-523.

Dalimartha, S. dan Sudibyo, M., 1999, Awet Muda dengan Tumbuhan Obat dan

Diet Suplemen, Trubus Agriwidya, 36-40. Dalimartha, S., 2000, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid II, PT. Trubus

Agriwidya, Jakarta, pp. 172

71  

  

Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Applications of Thin Layer Chromatography, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London, New York, pp. 569, 608-611.

Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009,

Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60 (4), 405-412.

Dinis, T.C., Maderia, V.M., dan Almeida, L.M., 1994, Action of Phenolic

Derivates (Acetoaminophen, Salycilate and 5-Aminosalycilate) as Inhibitors of Membrane Lipid Peroxidation and as Peroxyl Radical Scavengers, Archives of Biochemistry and Biophysics 315, 161–169.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986, Sediaan Galenik,

Jilid 2, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 11-12. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7, 1061.

Ebrahimzadeh, M.A., Pourmorad, F., Hafezi, S., 2007, Antioxidant Activities of

Iranian Corn Silk, Turk J Biol, 32, 43-49. Folin, Octo, Ciocalteu, Vintila, 1944, On Tyrosine and Tryptophane

Determinations in Proteins, Jour.Bio.Chem., 73 : 627-650, 1927, in. Todd-Sanford, 10, 412.

Galati, Angie., McKay, Allan., dan Tan, Soon Chye., 2005, Minimising Post-

Harvest Losses of Carrots, Farmnote, 75, 95. Grieb, P., 1992, Antioxidant Systems – Physiology and Pharmacotherapy Trends,

Materia Medica Polona, Fasc. 4 (84), 217-222. Halliwell, B., 1994, Free Radicals and Antioxidants : a Personal View, Nutr. Rev.,

52, 253-265. Halliwell, B., dan Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and

Medicine, Third Edition, Oxford University Press, New York, pp. 368-369.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata K. dan Sudiro I., hal. 47-109, Penerbit ITB, Bandung.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungan,

Departemen FMIPA UI, Depok, pp. 5-13.

72  

  

Himawati, E.R., 2001, Antioksidan dan Peredam Radikal Bebas Biologis,

Majalah Farmasi Indonesia, 12 (1), 55-60. Huang, D., Ou, B., dan Prior, R. L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant

Capacity Assays, J. Agric. Food Chem., 53, 1841-1856. Iqbal, M., dan Endang Sulistyorini, 2008, Seledri (Apium graveolens L.),

http://ccrcfarmasiugm.wordpress.com/ensiklopedia-tanaman-anti-kanker/s/seledri/, diakses tanggal 30 April 2010.

Jansoon, Ninna, 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green

Tea, http://209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahidol.ac.th/scess/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+Folin-Ciocalteu+method+colorimetric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 5 Mei 2010.

Khadambi, T.N., 2007, Antimicrobial Activities of Sorghum CPE and The Effects

of Phenolic Compound Concentration and Bacterial Species on Inhibition, Thesis, 69, University of Pretoria.

Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N.,

2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis 13, 8-17.

Kurniasih, Kepundan, 2008, Daya Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Herba

Kenikir (Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, Fakultas MIPA Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Lopez, M., Martinez, F., Del Valle, C., Ferrit, M., dan Luque, R., 2003, Study of

Phenolic Compounds as Natural Antioxidants by a Fluorescence Method, Talanta, 60, 609-616.

Lu, Y., dan Foo, L.Y., 2000, Antioxidant and Radical Scavenging Activities of

Polyphenols from Apple Pomace, Food Chemistry, 68, 81-85. Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic

Identification of Flavonoid, Springer-Verlag, New York-Heidelberg-Berlin, pp. 1-343.

Madhavi, D.L., Deshpande, S.S., dan Salunkhe, D.K., 1996, Introduction. Food

Antioxidants : Technological, Toxicological, and Health Perspectives, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 1-4.

73  

  

Mann, J., Davidson, R.S., Hobbs, J.B., Banthorpe, D.V., dan Harborne, J.B., 1994, Natural Products: Their Chemistry and Biological Significance, Longman Group UK Limited, London England, pp. 361-367.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh

Padmawinata, K., hal. 15, Penerbit ITB, Bandung.

Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., dan Hansen, U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrophotometric Measurements, Sensors, 7, 2080-2095.

Masella, R., Di Benedeto, R., Vari, R., Filesi, C., dan Giovannini, C., 2005, Novel

Mechanism of Natural Antioxidant Compounds in Biological Systems : Involvement of Glutathione and Glutathione-Related Enzymes, J. Nutr. Biochem., 16, 577-586.

Mulja, H.M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang

Baik, Majalah Farmasi Indonesia, 3(2), 72, Airlangga University Press, Surabaya.

Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University

Press, Surabaya, pp. 26-33. Muth, J.E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Analysis, Marcel, Dekker,

Inc., New York, Basel, pp. 585. Niki, E., dan Noguchi, N., 2000, Evaluation of Antioxidant Capacity ; What

Capacity is Being Measured by Which Method?, IUBMB Life, 50, 323-329.

Nusarini, Ni Made Rahayu., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat

Ekstrak Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, 15-20, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Reyes, L. Fernando., Villarreal, J. Emilio., dan Cisneros-Zevallos, Luis., 2007,

The Increase of Antioxidant Capacity After Wounding Depends on the Type of Fruit or Vegetable Tissue, Food Chemistry, 101, 1254-1262.

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh

Padmawinata, K., hal.191-213, Penerbit ITB, Bandung. Rohdiana, D., 2001, Aktivitas Daya Tangkap Radikal Polifenol dalam Daun Teh,

Majalah Farmasi Indonesia, 12 (1), 53-58.

74  

  

Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolic with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147.

Sudarsono, Pudjoanto, A., Gunawan, D., Wahyuono, S., Donatus, I. A., Drajad,

M., Wibowo, S., dan Ngatidjan, 1996, Tumbuhan Obat, Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan, Pusat Penelitian Obat Tradisional, UGM, Yogyakarta, pp. 44-52.

Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa

Kecambah dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia, 2 (2), 53-61.

United States Pharmacopeial Convention, 2007, The United States Pharmacopeia

30th The National Formulary 25th, Vol II, United States Pharmacopeial Convention, Inc., New York, pp. 680, 2308.

Veeru, P., Kishor, M.P., dan Meenakshi, M., 2009, Screening of Medicinal Plant

Extracts for Antioxidant Activity, Journal of Medicinal Plants Research, 3(8), 608-612.

Waterhouse, A.L., 2002, Determination of Total Phenolics, Current Protocols in

Food Analythical Chemistry, John Wiley & Sons Inc, I1.1.1-I1.1.8. Windono,T., Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita, A., dan Erowati,

T.I., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinifera L.) Probolinggo Biru dan Bali, Artocarpus, Surabaya, 1 (1), 34-43.

Wiyatsih, Esti., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform Ekstrak

Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Wong, Shih Peng., Leong, Lai Peng., dan Koh, Jen Hoe William., 2005,

Antioxidant Activities of Aqueous Extracts of Selected Plants, Food Chem, 10, 775-783.

Zhu, Q.Y., Hackman, R.M., Ensunsa, J.L., Holt, R.R., dan Keen, C.L., 2002,

Antioxidative Activities of Oolong Tea, J.Agric.Food Chem, 50, 6929-6934.

  

75  

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman

76  

 

Lampiran 2. Foto tanaman seledri

77  

 

Lampiran 3. Foto percobaan

Penyaringan dengan bantuan Maserasi dengan bantuan shaker corong Buchner dan pompa vakum

Pengeringan fraksi uji di waterbath Ekstrak etanol herba seledri

78  

 

Lampiran 4. Perhitungan rendemen

Bobot herba seledri = 1 kg

Bobot ekstrak etanol = 27,3421 g

Rendemen =

=

= 2,7342% b/b

Bobot fraksi etil asetat = 0,5446 g

Rendemen =

=

= 0,0545% b/b

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan stok DPPH

Pembuatan larutan stok DPPH

Bobot kertas : 0,2455 g

Bobot kertas + DPPH : 0,2495 g

Bobot kertas + sisa : 0,2456 g

Bobot DPPH : 0,0039 g

Konsentrasi larutan stok DPPH = 0,4 mM

79  

 

Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan stok rutin

Pembuatan larutan stok rutin

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Bobot kertas 0,2473 g 0,2362 g 0,2574 g

Bobot kertas + rutin 0,2499 g 0,2389 g 0,2599 g

Bobot kertas + sisa 0,2475 g 0,2363 g 0,2574 g

Bobot rutin 0,0024 g 0,0026 g 0,0025 g

Konsentrasi larutan stok rutin yang dibuat

Rep I = = 240 µg/mL Rep III = = 250 µg/mL

Rep II = = 260 µg/mL

Lampiran 7. Spektra pelarut metanol

80  

 

Lampiran 8. Penentuan OT rutin

Penentuan Operating Time (OT)

Waktu (menit) 2,4 µg/mL 7,2 µg/mL 12 µg/mL

5 0,752 0,501 0,220

10 0,748 0,495 0,208

15 0,745 0,484 0,185

20 0,743 0,478 0,173

25 0,741 0,472 0,159

30 0,740 0,470 0,156

35 0,740 0,470 0,156

40 0,740 0,470 0,156

45 0,740 0,470 0,156

OT yang diperoleh adalah 30 menit.

Lampiran 9. Spektra larutan pembanding rutin

81  

 

Lampiran 10. Perhitungan pembuatan stok larutan uji

Pembuatan larutan stok fraksi uji

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Bobot cawan 22,1305 g 23,0473 g 25,2348 g

Bobot cawan + fraksi uji 22,2307 g 23,1474 g 25,3348 g

Bobot cawan + sisa 22,1306 g 23,0474 g 25,2348 g

Bobot fraksi uji 0,1001 g 0,1000 g 0,1000 g

Konsentrasi larutan stok fraksi yang dibuat

Rep I = = 4004 µg/mL Rep III = = 4000 µg/mL

Rep II = = 4000 µg/mL

Lampiran 11. Penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri

Penentuan Operating Time (OT) larutan fraksi uji

Waktu (menit) 400 µg/mL 1200 µg/mL 2000 µg/mL

5 0,689 0,615 0,488

10 0,683 0,590 0,473

15 0,676 0,567 0,451

20 0,665 0,545 0,428

25 0,656 0,525 0,412

30 0,643 0,507 0,389

35 0,643 0,507 0,389

40 0,643 0,507 0,389

45 0,643 0,507 0,389

OT yang diperoleh adalah 30 menit.

82  

 

Lampiran 12. Spektra larutan uji

83  

 

Lampiran 13. Perhitungan pembuatan stok asam galat

Penimbangan larutan stok asam galat

Bobot kertas : 0,2369 g

Bobot kertas + asam galat : 0,2495 g

Bobot kertas + sisa : 0,2370 g

Bobot asam galat : 0,0125 g

Konsentrasi larutan stok asam galat = = 500 µg/mL

Lampiran 14. Spektra asam galat

84  

 

Lampiran 15. Penimbangan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik

total

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Bobot cawan 23,0473 g 22,1305 g 25,2348 g

Bobot cawan + fraksi 23,0675 g 22,1506 g 25,2548 g

Bobot cawan + sisa 23,0474 g 22,1306 g 25,2348 g

Bobot fraksi 0,0201 g 0,0200 g 0,0200 g

Lampiran 16. Penentuan OT untuk penentuan kandungan fenolik total

Waktu (menit)

Absorbansi 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL

5 0,311 0,446 0,583 10 0,317 0,452 0,591 15 0,317 0,452 0,591 20 0,317 0,452 0,591 25 0,317 0,452 0,591 30 0,317 0,452 0,591

OT yang diperoleh adalah 10 menit.

Lampiran 17. Perhitungan kandungan fenolik total

Penentuan kandungan fenolik total larutan uji (ekivalen dengan massa asam galat)

Replikasi I

y = 0,0027 x + 0,1786

0,613 = 0,0027 x + 0,1786

x = 160,889 µg/mL

Replikasi II

y = 0,0027 x + 0,1786

0,609 = 0,0027 x + 0,1786

x = 159,407 µg/mL

85  

 

Replikasi III

y = 0,0027 x + 0,1786

0,607 = 0,0027 x + 0,1786

0,607 = 0,0027 x + 0,1786

Kandungan fenolik total = GAE

Replikasi I

GAE = 160,889 µg/mL = 0,161 mg/mL

= 0,161 mg/mL = 3,284 mg GAE/g

Replikasi II

GAE = 159,407 µg/mL = 0,159 mg/mL

= 0,159 mg/mL = 3,275 mg GAE/g

Replikasi III

GAE = 158,667 µg/mL = 0,159 mg/mL

= 0,159 mg/mL = 3,25 mg GAE/g

86  

 

Lampiran 18. Hasil uji statistik menggunakan program PASW Statistics 18

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

% IC rutin .159 15 .200* .908 15 .127

% IC fraksi etil asetat .152 15 .200* .910 15 .137

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality

of

Variances t-test for Equality of Means

F

Sig

. t df

Sig.

(2-

taile

d)

Mean

Difference

Std.

Error

Differenc

e

95% Confidence

Interval of the

Difference

Lower Upper

IC5

0

Equal

variance

s

assume

d

6.39

9

.06

5

-

144.15

1

4 .000 -

308.2196

67

2.13817

6

-

314.1561

94

-

302.2831

39

Equal

variance

s not

assume

d

-

144.15

1

2.00

2

.000 -

308.2196

67

2.13817

6

-

317.4091

09

-

299.0302

24

 

87  

BIOGRAFI PENULIS

Andy Kurniawan, penulis skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Herba Seledri (Apium graveolens L.)”, lahir di Surakarta pada tanggal 9 Februari 1989. Penulis adalah putra dari Bapak Irawan dan Ibu Lo Lan Fie. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK Kristen Widya Wacana IV Kartasura pada tahun 1995, SD Kristen Widya Wacana X Kartasura pada tahun 2001, SMP PL Bintang Laut Surakarta pada tahun 2004, dan SMA Negeri 3 Surakarta pada tahun 2007. Penulis melanjutkan studi di program S1 Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama menjadi mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Penulis pernah menjadi asisten dosen untuk mata kuliah Praktikum Spektroskopi pada semester ganjil 2009-2010, Praktikum Kromatografi dan Farmakognosi Fitokimia II pada semester genap 2009-2010, Praktikum Farmakognosi Fitokimia I dan Analisis Sediaan Obat Tradisional pada semester ganjil 2010-2011. Penulis juga pernah mengirimkan karya tulis untuk Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) dengan judul “Uji Aktivitas Antikanker Herba Ketul (Bidens pilosa) Secara In Vitro Terhadap Kultur Sel Kanker Leher Rahim (HeLa) Dengan Metode MTT”.