uji deteksi cemaran daging babi pada bakso sapi di...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI DETEKSI CEMARAN DAGING BABI PADA

BAKSO SAPI DI KECAMATAN CIPUTAT

MENGGUNAKAN REAL TIME POLYMERASE CHAIN

REACTION (RT-PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

LAELA WULANDARI

NIM. 11141020000070

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

OKTOBER 2018

i



UJI DETEKSI CEMARAN DAGING BABI PADA

BAKSO SAPI DI KECAMATAN CIPUTAT

MENGGUNAKAN REAL TIME POLYMERASE CHAIN

REACTION (RT-PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

LAELA WULANDARI

NIM. 11141020000070

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

OKTOBER 2018

H A LAMA.N P0 RI'{ Y A TA AN ORffi [N idtr,"('il'Al$

Skripsi rini adalah hasil kanya sava sen'eliri,

dnn se.rmua surntret' baik y*ang dilrutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan d,engan benar.

Nama : Laela Wulandari

Nlll :1II-t1020000070

Tanda langan

: 2 Ol<tober 2018Tanggal

UlN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

HALANIAN PERSETUJUAN PEN'IBINIBING


NIM : 11141020000070

Plogram Studi : Fannasi

Judul : Uji Deteksi Cemararr Daging Babi pada Bakso Sapi di

Kecamatan Ciputat ir.4enggunak an Real Tinte Polynlerase

Chain Reacti on (RT-PCR)

Disetujui Oleh :

Punbimbing I

lhdDr. Zilhadia. M.Si.. Apt Chris Adhivanto.M.Biomed.. Ph.D.

NIP.197308222008012007 NIP:19695112003121001

Mengetahut,

Kepala Program Studi Famasi

Fakultas Ilmu Kesehata-n

UN Syarif Hidayatullah Jakarta

^)+,WNIP. 1 97 404302005012003

iii UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Nama

|.iIM

Program Studi

Judul

Ditetapkan di

Tanggal

Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterimasebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan,

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I Dr. Zilhadia" M.Si., Apt.

Pembimbing Il Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D

Penguji I Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc., Apt.

Penguji II Dr. Endah \\/ulandari, M.Biornecl.

HALAMAN PENGESAHAN

: Laela Wulandari

: ),1141020000070

: Famasi

: Uji Deteksi Cemaran Daging Babi pada Bakso Sapi di

Kecamatan Ciputat Mengg..rnakan Real Time Poiyrnerase

C hoin Re a c ti on (RT-PCR)

Ciputat

2 Oktober 2018

IV UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

v


ABSTRAK


Program Studi : Farmasi

Judul : Uji Deteksi Cemaran Daging Babi pada Bakso Sapi di

Kecamatan Ciputat Menggunakan Real Time Polymerase

Chain Reaction (RT-PCR)

Kehalalan suatu produk makanan ataupun minuman menjadi hal penting bagi

seorang muslim baik dari segi kesehatan maupun segi agama. Seiiring berjalannya

waktu harga kebutuhan pangan terus meningkat di Indonesia. Begitupun harga

daging sapi yang terus melonjak, hal ini dijadikan angin segar bagi oknum tidak

bertanggung jawab untuk mengoplos daging sapi dengan daging lain yang lebih

murah seperti daging babi. Banyaknya kasus pengoplosan daging ini yang

menjadi alasan peneliti untuk mengidentifikasi hal tersebut. Penelitian ini

dilakukan untuk mendeteksi cemaran daging babi pada produk bakso sapi di

Kecamatan Ciputat menggunakan teknik Real Time Polymerase Chain Reaction

(RT-PCR). RT-PCR merupakan teknik amplifikasi menggunakan primer spesifik

yang akan menghasilkan DNA dalam jumlah jutaan kalinya sehingga

memungkinkan DNA target dapat terdeteksi. Real Time PCR menggunakan

primer DNA babi dan primer DNA sapi menghasilkan nilai Cp berturut-turut

21.24 dan 21.82. Hasil kurva amplifikasi Real Time PCR menggunakan primer

babi pada 7 produk bakso sapi tidak menghasilkan kurva naik yang artinya tidak

terjadi amplifikasi DNA babi pada produk sapi tersebut.

Kata Kunci: RT-PCR, Bakso sapi, Cemaran daging babi.

vi


ABSTRACT

Name : Laela Wulandari

Program study : Pharmacy

Title of research : Test of Detection of Pork Meat Contamination on Beef

Meatballs in Ciputat District Using Real-Time Polymerase

Chain Reaction (RT-PCR)

Halal status of a food or beverage product is important for a Muslim both in terms

of health and religion. The price of food or beverage is increasing from time to

time, as well as price of beef because of it producer who do not have

responsibility for mixing beef with other cheaper meat such as pork. Many cases

of meat mixing is the reason for researchers to do this research. This study was to

analyzed pork meat contamination on beef meatballs in Ciputat District using Real

Time PCR. RT-PCR is an amplification technique using a specific primer that will

produce DNA in millions of times so that the target DNA can be detected. RT-

PCR using bovine specific primers and porcine specific primers respectively

produce amplification curve with Cp value 21.44 and 21.82. The results of the

RT-PCR amplification curve by using porcine specific primers on seven meatball

products did not show a curve. It means that there was no contamination of

porcine DNA in the seven meatball products.

Keyword: RT-PCR, meatball , contamination of pork meat.

vii


KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur tak terhingga selalu terpanjatkan atas segala

nikmat, karunia, dan ilmu yang diberikan oleh Allah Subhanahu wa ta’ala.

Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada junjungan Nabi Besar

Muhammad SAW. Berkat rahmat dan pertolongan Allah, penulis dapat

menyelesaikan proposal skripsi yang berjudul “Uji Deteksi Cemaran Daging

Babi pada Bakso Sapi di Kecamatan Ciputat Menggunakan Real Time

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)” yang bertujuan untuk memenuhi

persyaratan guna memperoleh gelar sarjana farmasi di Fakultas Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

“Tak ada gading yang tak retak” begitulah bunyi sebuah pepatah dimana

penulis pun menyadari banyaknya kekekurangan yang ada selama proses

penyusunan dan penulisan proposal ini serta banyaknya dukungan baik moril

maupun materil dari berbagai pihak dalam penyelesaian skripsi ini menjadi hal

yang sangat disyukuri penulis sehingga penulis menyampaikan penghargaan

setinggi-tingginya dan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Dr. Zilhadia, M. Si., Apt dan Bapak Chris Adhiyanto, M.Biomed.,

Ph.D selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran telah

banyak memberikan bimbingan, ilmu, waktu, dan tenaga dalam penelitian

ini.

2. Prof. Dr. Arief Sumantri, S.KM, M.KM., selaku Dekan Fakultas Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Nurmeilis, M.Si., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si. Apt selaku dosen Penasehat Akademik (PA)

atas motivasi dan bantuan selama empat tahun penulis menimba ilmu di

Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak dan Ibu dosen pengajar Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah

memberikan ilmu dan teladan selama masa perkuliahan.

(t Seluruh laboran Laboratoriurn Fakultas Ilrnu Kesehatan {Ka Wnlid. I(a

Zlinah- VIba l-ilis. I(l Eris. \'1ht Sr-rrvani clan llirtn-va',rltru tidak bisrr

penulis sebutkarr satr-t persatu).

1. I(a Rizki lvlarla S.Fann. Ka Atii-vanti S. Fami, I(ii Satlzah S.Ftrtn clau l(a

\.'estr, S.Fanr vans selillLr nternberikan sal'an. t-ttasukan darl ilrnr-r kcpatlll

penulis.

Sahabat tersayang (Sri, Nada. Ezi. Nuril, Putri, Aul. l\'la-va. Nun'tta clatr

Rika) telah trtetnbcrikan clukungatr, setnangzrt dan motir"asi selirtrla

penelitian berlaugsuug.

Rekarr seperjuzutgatt Khena Zwaeda yang selalu berjuang bersatra baik

cluka maupun suka selatrta penelitian ir-ri berlangsung.

10. Kedua orang tua tercinta, Bapak Zulian dan Ibu Sri Dervi atas cloa.

kesabaran, bin]bir]gan. c1r-rkungan moral. rlateri. sefia kasih sayang.

I l. Sauclara kernbar yang tercinta Laela Mustika Sari yang selalu metnberikart

semangat baik suka mallpun cluka kepacla penulis.

I ?. Teman-teman seperjr,rangan N{ahasisrva/i S I Fanr-rasi LrlN Syar if

Hidayatullah Jakarta angkatan 20 I 4.

13. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis dalarn penulisan

proposal skripsi ini.

Semoga Allah swT rnembalas kebaikan semua pihak yang telah

membantu. Akhirnya dengan segala kerendahan hati, penulis berharap kritik dan

saran atas kekurangan dan keterbatasan penelitian ini. Sernoga hasil perlelitian ini

bemanfaat untuk balyak pihak clan perkembangan ihnu pengetahuan.

CipLrtrt. 2 Oktober 201 8

Laela Wulandari

NIN,I. I I141020000070

8.

c)

vil UlN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

HALr\M,rrN PE RNYATA AN P E RS ET U.il Li A N {'Utsl. { KAS I

T U GAS A Ktl IIi. UN'l' U K K'l': P L- N'I-I N (l r-*iq A ]t'('\,il F- iri I 5

Sebagai civitas

Jakarta, Saya yar-rg berl

Nama

NIM

Prograrn Studi

Fakultas

Jenis Karya

akaciernik Uni vcrs i tas I sl atu Ne'g:ri S l'ari i' 1-l i ci ll 1'atu1 I n ir

anda ttuttarr dihr*alr irri:

Lae-ila Wulanclari

1 I r41020000070

Farmasi

llmu Kesehatan

Skripsi

Derni perkernbangan ihnu pellgetalruail' Sa\tEt lllenyctlliLli skliprsi'Ikar'1'ar

ihniah saya, dengan jud'ul:

Uji Deteksi Cenraran Daging Babi pad:r Bakso sapi cli Kec:rmatan

Ciputat Vlenggunakan Reul Time Polynterilse Chuin Recrcti.ort (RI'-PCR)

Ultgk rlipublikasikan atau sitampilkan di intentct ittiit-t lneclia laitr 1'aitr-l

Digitut Librctry Perpustakaan Universitas lslar.i Negeni SyariI I-lidayatullah

Jakarta untuk kepentingan akadernik sebatas sesuiti den-Qan L-irrclarrg - Llnclang

Hak Cipta.

De.nikian pernyataan persetujuan publikasi kary.r ilrniah ini sn-va buat clengan

sebenamya.

Dibuat di : Ciputat

Pader Tanggal : 2 Oktober 2018

Laela Wulaliclali

IX

Yang menyatakan.


x


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING iii

HALAMAN PENGESAHAN iv

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

KATA PENGANTAR vii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ix

DAFTAR ISI x

DAFTAR GAMBAR xii

DAFTAR TABEL xiii

DAFTAR LAMPIRAN xiv

DAFTAR ISTILAH xv

BAB I PENDAHULUAN 1

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Rumusan Masalah 2

1.3 Tujuan Penelitian 3

1.4 Manfaat Penelitian 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4

2.1 Bakso Sapi 4

2.2 Daging Babi dan Hukumnya dalam Islam 4

2.3 Sel 5

2.4 Deoxyribonucleic Acid (DNA) 7

2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA 7

2.4.2 Sifat Fisika DNA 9

2.4.3 DNA Mitokondria 10

2.4.4 Isolasi DNA 11

2.5 Elektroforesis Gel Agarosa 13

2.6 Spektrofotometri UV untuk Pemeriksaan DNA 14

2.7 Polymerase Chain Reaction (PCR) 15

2.7.1 Komponen PCR 16

2.7.2 Tahapan PCR 18

2.7.3 Real Time PCR 19

BAB III METODE PENELITIAN 23

xi


3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 23

3.1.1 Tempat 23

3.1.2 Waktu 23

3.2 Alat dan Bahan 23

3.3 Tahapan Penelitian 24

3.4 Prosedur Kerja 24

3.4.1 Pengumpulan sampel 24

3.4.2 Isolasi DNA 24

3.4.3 Analisis DNA Hasil PCR dengan Elektroforesis Agarosa 25

3.4.4 Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV 26

3.4.5 Uji Spesifitas Primer 27

3.4.6 Amplifikasi DNA dengan Metode RT-PCR 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 29

4.1 Hasil Analisis Isolat DNA 29

4.1.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa 30

4.1.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV 31

4.2 Hasil Uji Spesifitas Primer 33

4.3 Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR 33

4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi yang Optimal 33

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR

dengan Metode SYBR Green Menggunakan

Primer Sapi 34

4.3.3 Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time

PCR dengan Metode SYBR Green Menggunakan

Primer Babi 37

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 39

5.1 Kesimpulan 39

5.2 Saran 39

DAFTAR PUSTAKA 40

LAMPIRAN 46

xii


DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Sel Prokariot dan Eukariot 5

2.2 DNA untai ganda dan RNA untai tunggal 7

2.3 Struktur Kimia Nukleotida 8

2.4 Struktur Basa Nitrogen DNA 8

2.5 Struktur DNA double Helix 9

2.6 Mitokondria dengan Membran Bagian Dalam dan

Membran Bagian Luar 10

2.7 Perbedaan Prosedur PCR konvensional dengan Real Time PCR 16

2.8 Amplifikasi eksponensial DNA pada PCR 19

2.9 Siklus RT-PCR 20

2.10 Fase Kurva Amplifikasi PCR 21

2.11 Mekanisme SYBR Green I dan Hydrolisis Probe 22

4.1 Hasil Elektroforesis Gel Agarosa PCR DNA Daging Babi

dan Daging Sapi Percobaan ke-1 30

4.2 Hasil Elektroforesis Gel Agarosa PCR DNA Daging Babi

dan Daging Sapi Percobaan ke-2 31

4.3 Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi, Daging babi, NTC dan

Sampel Bakso dengan Metode SYBR Green Menggunakan

Primer Sapi 35

4.4 Kurva Melting Peaks Pada Hasil Amplifikasi dengan Primer Sapi 36

4.5 Urutan DNA babi 36

4.6 Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi, Daging babi, NTC dan


Primer Babi 37

4.7 Kurva Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Primer Babi 38

xiii


DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik 6

2.2 Kisaran Umum Konsentrasi Agarosa 13

3.1 Susunan Basa Primer dan Universal Probe Library untuk DNA Sapi

dan Babi 24

4.1 Konsentrasi dan Kemurnian DNA Hasil Isolasi 30

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Bagan Alur Penelitian 45

2. Alur Kerja Isolasi DNA Menggunakan Genomic DNA

Purification Kit 46

3. Nilai Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA 47

4. Perbandingan Pengenceran Isolat DNA Sampel, Daging Sapi

dan Daging Babi 48

5a. Hasil Uji Spesifitas Primer Babi dengan BLAST Melalui

Database NCBI 48

5b. Hasil Uji Spesifitas Primer Sapi dengan BLAST Melalui

Database NCBI 49

6. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer 49

7a. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, NTC,

Bakso 1, Bakso2, Bakso 3, Bakso 4, Bakso 5 dan Bakso 7 dengan

Primer Sapi pada Suhu annealing 50◦C 50

7b. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan

NTC dengan Primer Sapi pada Suhu annealing 55◦C 50

7c. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan

NTC dengan Primer Sapi pada Suhu annealing 60◦C 51

8. Hasil Optimasi Suhu Annealing Primer Sapi pada Suhu 65◦C 51

9. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer 52

10a.Program Amplifikasi untuk Primer Babi 53

10b.Program Amplifikasi untuk Primer Sapi 54

11. Campuran Reaksi Master Mix untuk Amplifikasi DNA 55

12. Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi, Daging babi, NTC dan

Sampel Bakso dengan Metode SYBR GreenMenggunakan

Primer Sapi 55

13. Kurva Melting Peaks Pada Hasil Amplifikasi dengan Primer Sapi 56

14. Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi, Daging babi, NTC dan


Primer Babi 56

15. Kurva Melting Peaks Pada Hasil Amplifikasi dengan Primer Babi 57

16. Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian 57

xv


DAFTAR ISTILAH

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan program

untuk menganalisis kesesuaian urutan basa query (DNA)

atau protein dengan sekuen DNA atau protein pada

database yang ada pada NCBI.

Fasa plateu : Fase ini merupakan fase akhir pada proses amplifikasi

yang menandakan sudah tidak adanya produk yang

terbentuk.

CP : Crossing Point merupakan nilai siklus ketika kurva

amplifikasi melewati garis threshold/noiseband.

CT : Crossing Threshold merupakan jumlah siklus yang

dibutuhkan untuk sinyal fluorosensi melewati garis

threshold.

Hairpin : Terbentuk struktur loop/hairin pada primer yang

disebabkan oleh intraksi intramlekuler yang dapat memicu

terbentuknya amplifikasi yang nonspesifik.

Melting Curve : Analisis data pada Real Time PCR digunakan untuk

menguji spesifisitas amplikon yang terbentuk.

Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehinga

mementuk produk amplifikasi yang nonspesifik.

NTC : No Template Control merupakan kondisi ketika tidak ada

DNA didalam well.

Tm : Temperature melting merupakan kondisi suhu saat 50 %

bagian DNA telah terbuka menjadi untai tunggal.

1


BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Manusia mengalami proses pertumbuhan dan perkembangan dalam

hidupnya, maka pemasukan nutrisi ke dalam tubuh merupakan hal yang penting

untuk kelangsungan hidup setiap manusia. Makanan dan minuman yang bergizi

merupakan syarat berlangsungnya pertumbuhan dan perkembangan yang baik.

Nutrisi untuk tubuh akan terpenuhi dengan mengkonsumsi makanan empat sehat

lima sempurna. Menurut Prof. Poerwo Soerdarmo makanan 4 sehat 5 sempurna

adalah makanan yang terdiri dari nasi, lauk pauk (ikan atau daging), sayur, buah

dan susu sebagai pangan penyempurna (Depkes, 2016).

Daging sapi adalah salah satu contoh dari lauk pauk yang mengandung

protein l6 - 22%, lemak 1,5 - l3%, senyawa nitrogen non protein l,5%, senyawa

anorganik l%, karbohidrat 0,5%, dan air antara 65- 80% (Soeparno, 2005). Namun

karena Indonesia adalah negara dengan bermacam ras, budaya, suku dan agama,

maka ada beberapa alasan yang mempengaruhi seseorang untuk memilih daging

yang akan dikonsumsi.

Mayoritas penduduk Indonesia adalah muslim, maka adalah wajib

hukumnya untuk memperhatikan aturan-aturan Agama Islam dalam setiap sektor

kehidupan khususnya dalam hal melindungi konsumen dari beredarnya makanan

haram yang ada di pasaran. Al Qur‟an menyebutkan aturan mengenai kehalalan

dan keharaman makanan untuk umat Islam, salah satunya pada surat Al-Baqarah

(2) : 173 :

“Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah,

daging babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain

Allah”.

Pada tahun 2017 ada beberapa kasus yang melaporkan pengoplosan daging babi

dengan daging sapi, seperti dibulan Agustus dilaporkan salah satu kios bakso di

Pekanbaru mengandung daging babi dalam olahan baksonya (Syukur, 2017), di

Bogor pada bulan Mei salah satu pabrik pemasok bakso dilaporkan telah

mencampurkan daging babi dalam olahan bakso yang diproduksi (Bempah, 2017)

1

2


dan kasus-kasus lainnya. Hal itu dilakukan oleh pedagang untuk mendapatkan

harga yang lebih murah untuk membeli daging (Siregar, 2017). Oleh karena itu

untuk menghindari adanya pencampuran bahan haram dalam makanan,

dibutuhkan pengembangan uji analisis yang akurat serta terpercaya dalam

pendeteksian bahan makanan.

Beberapa metode analisis yang telah digunakan untuk deteksi daging babi

atau lemak babi diantaranya e-nose GC-MS, spektrofotometri FTIR, ELISA, Gold

Nanoparticle (Wardhani, 2015). Ke empat metode tersebut memerlukan waktu

dan biaya yang banyak. Salah satu metode yang cukup akurat untuk mendeteksi

cemaran daging babi pada produk makanan yaitu dengan metode PCR

(Polymerase Chain Reaction) (Wardhani, 2015). Metode Real Time PCR

merupakan metode yang spesifik, sensitif, efisien dan cepat untuk mendeteksi

DNA dalam jumlah kecil (AW TG dan Rose JB, 2012). RT-PCR dapat

mendeteksi sampai dengan kadar 1 pg/ml (Cai et al., 2011). Kelebihan lain yang

dimiliki RT-PCR yaitu dapat mendeteksi sampel yang ada dalam campuran

makanan ataupun produk yang sudah diolah (Cawthraw, 2009; Fumiere et al.,

2009; Yancy et al., 2009). Maka jika dibandingkan dengan metode e-nose GC-

MS, spektrofotometri FTIR, ELISA, Gold Nanoparticle, metode RT-PCR sampai

saat ini yang paling efisien untuk digunakan.

Keunggulan metode RT-PCR jika dibandingkan dengan PCR

konvensional antara lain RT-PCR memiliki akurasi dan sensitivitas yang lebih

tinggi dan waktu analisa yang lebih singkat karena tidak memerlukan

elektroforesis (Liyana, K. et a.l, 2009).

Berdasarkan uraian yang telah dijelaskan maka penelitian ini dilakukan

untuk mendeteksi adanya cemaran daging babi didalam produk bakso sapi yang

dijual oleh pedagang keliling di Kecamatan Ciputat menggunakan Real Time

PCR.

1.2. Rumusan Masalah

Apakah bakso sapi yang dijual oleh pedagang keliling di Kecamatan

Ciputat terdeteksi mengandung daging babi?

3


1.3. Tujuan Penelitian

Mendeteksi cemaran daging babi pada bakso sapi yang dijual oleh

pedagang keliling di Kecamatan Ciputat menggunakan Real Time PCR.

1.4. Manfaat Penelitian

Memberikan informasi untuk masyarakat tentang kehalalan produk yang

dijual oleh pedagang keliling di Kecamatan Ciputat.

4


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Bakso Sapi

Menurut Kamus Besar Bahasa Indonesia, bakso merupakan jenis makanan

yang dapat terbuat dari udang, daging dan ikan yang dibuat dengan cara dicincang

lalu dihaluskan bersama tepung kanji dan putih telur, biasanya dibentuk bulat-

bulat. Definisi lain menyebutkan bakso daging adalah produk makanan yang

diolah menjadi bentuk bulatan umumnya, dengan kadar daging tidak kurang dari

50%, pati dengan atau tanpa bumbu BTP (bahan tambahan pangan) yang

dibolehkan.

Pada umumnya jenis bakso yang lebih sering dikonsumsi oleh masyarakat

adalah bakso sapi. Namun harga daging sapi yang mahal, membuat beberapa

pedagang mengoplos daging sapi dengan daging yang lebih murah seperti daging

babi. Pengujian cemaran ini telah dilakukan oleh beberapa peneliti (Erwanto et

al.,2014) telah melakukan pengujian terhadap 20 sampel bakso yang berada di

Yogyakarta dengan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment

Length Polymorphism (PCR-RFLP), dimana menunjukkan hasil positif pada 9

sampel uji. Penelitian lain (Febriana et al.,2012) juga melakukan pengujian pada

produk bakso di Kota Salatiga menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction

yang menunjukkan hasil positif pada salahsatu sampel uji.

2.2. Daging Babi dan Hukumnya dalam Islam

Babi merupakan jenis hewan ungulata yang hidup dengan memakan

daging maupun tumbuh-tumbuhan. Daging babi banyak mengandung lemak

karenanya daging babi sulit dicerna. Selain itu pada bagian punggung terdapat

lemak yang tebal dan bersifat oksidatif, sehingga bila dilihat struktur kimianya

merupakan bahan makanan yang tidak layak dikonsumsi. Dalam penelitian di

Negara Cina dan Swedia menyebutkan daging babi adalah penyebab utama

kanker anus dan kolon. Hal itu disebabkan karena babi banyak mengandung

parasit, bakteri bahkan virus yang berbahaya (Hilda, 2013).

4

5


Keharaman hewan ini telah jelas termaktub dalam Al Quran Q.S Al-

Maidah ayat 3: “Diharamkan bagimu (memakan) bangkai, darah, daging babi,

(daging hewan) yang disembelih atas nama selain Allah, yang tercekik, yang

dipukul, yang jatuh, yang ditanduk, dan yang diterkam binatang buas, kecuali

yang sempat kamu menyembelihnya, dan (diharamkan bagimu memakan hewan)

yang disembelih untuk berhala.” (QS. al-Ma’idah [5]: 3).

2.3. Sel

Sel merupakan tingkatan terendah dari sebuah organisme yang mampu

melakukan aktivitas kehidupan. Semua organisme terbentuk dari sel, yaitu unit

dasar dari struktur dan fungsi organisme tersebut. Setiap sel diselubungi oleh

lapisan membran yang mengatur mobilitas komponen sel dengan lingkungan

sekitarnya. Sel mengandung DNA yaitu materi yang dapat mewariskan sifat-sifat

tertentu (Campbell..,et al, 2008).

Dua jenis utama sel yaitu sel prokariotik dan sel eukariotik (gambar 2.1)

dibedakan secara struktural. Sel eukariotik memiliki komposisi yang lebih

kompleks dari sel prokariotik. Sel eukariotik memiliki nukleus yang dibungkus

oleh membran nukleus sedangkan sel prokariotik tidak memiliki membran

nukleus sehingga materi genetiknya (DNA) terpusat pada daerah yang disebut

nukleoid (Chatterjea dan Shinde, 2012).

Prokariot Eukariot

Gambar 2.1. Sel Prokariot dan Eukariot

[Sumber: Widyastuti, 2012]

6


Tabel 2.1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik

Parameter Prokariotik Eukariotik

Ukuran sel 1-10 um 10-100 um

Contoh organisme Eubacteria Jamur, tumbuhan dan

hewan

Jumlah sel Bersel satu Bersel satu atau banyak

Organel, sitoskelet, alat

pembelahan sel

Tidak ada Ada, kompleks dan

terspesialisasi

DNA Kecil, sirkular, tidak

memiliki intron, terdiri

dari plasmid-plasmid

Besar, memiliki banyak

intron dan berada dalam

inti sel

RNA (sintesis dan

pematangan)

Sederhana, berada

didalam sitoplasma

Kompleks, berada

didalam inti sel

Protein (sintesis dan

pematangan)

Sederhana, terangkai

dengan sintesis RNA

Kompleks, didalam

sitoplasma dan

retikulum endoplasma

kasar

Metabolisme Anaerobik atau aerobic Lebih banyak aerobik

Endositosis dan

eksositosis

Tidak Ya

[Sumber: Koolman et al.,2005, yang telah diolah kembali]

Sel memiliki komponen utama yaitu protein, asam nukleat, lemak dan

polisakarida. Asam nukleat adalah kumpulan nukleotida yang membentuk polimer

yang berperan dalam penyimpanan dan pewarisan informasi genetik (Yuwono,

2009). Dua jenis asam nukleat dalam sel organisme yaitu DNA dan RNA (gambar

2.2) dapat dibedakan pada gula dan basa nitrogen penyusunnya (Chatterjea dan

Shinde, 2012). Basa nitrogen pada RNA yaitu urasil sedangkan pada DNA timin.

Gula yang menysusun DNA yaitu deoksiribosa sedangkan gula pada RNA yaitu

gula ribosa (Yuwono, 2009).

7


Gambar 2.2. DNA untai ganda dan RNA untai tunggal

[Sumber: Rettner, 2017]

DNA merupakan polimer deoxyribonukleotida yang dapat ditemukan pada

kromosom, mitokondria dan kloroplast. Inti DNA diketahui berikatan dengan

histon, yang merupakan protein dasar seperti kromatin (Albert et al., 2015).

Berdasarkan lokasinya DNA dibedakan menjadi dua tipe yaitu DNA kromosomal

yaitu DNA yang berada di dalam sel sedangkan DNA ekstrakromosomal yaitu

DNA yang berada di luar sel seperti DNA mitokondria, DNA kloroplas dan DNA

plasmid (Fatchiyah et al., 2011)

2.4. Deoyriboucleic Acid (DNA)

2.4.1. Struktur dan Sifat Kimia DNA

DNA, atau deoxyribonucleic acid merupakan materi genetik yang dimiliki

manusia dan sebagian besar organisme makhluk hidup. Hampir setiap sel yang

ada didalam tubuh organisme memiliki DNA yang sama. Molekul

deoxyribonuleic acid terbentuk dari dua rantai panjang polinukleotida yang tidak

bercabang dengan rantai polimer yang berpasangang tersusun dari empat molekul

8


dasar yang disebut nukleotida (gambar 2.3). Rantai tersebut bergerak antiparalel

dengan rantai lainnya serta ikatan hidrogen yang menghubungkan antar basa dari

nukleotida yang berbeda. Nukleotida adalah monomer DNA yang terdiri dari

molekul gula pentosa (deoksiribosa), basa nitrogen dan gugus fosfat. Basa

nitrogen tersebut dapat berupa adenin (A), sitosin (C), guanin (G), atau timin (T)

(gambar 2.4). Nukleotida ini akan terhubungkan satu sama lain melalui ikatan

fosfodiester antara gugus 5‟fosfat dengan gugus 3‟hidroksil (Albert et al., 2015).

Gambar 2.3. Struktur Kimia Nukleotida

[Sumber: Campbell, N.A et al., 2002]

Gambar 2.4. Struktur Basa Nitrogen DNA

[Sumber: Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al., 2000]

DNA adalah molekul untai ganda disebut juga double helix yang terdiri

dari dua pasang polinukleotida (gambar 2.5). Pasangan tersebut merupakan hasil

9


interaksi antara basa-basa yang terhubung oleh ikatan gula-fosfat disetiap unit

DNA membentuk struktur “anak tangga” yang kaku. Ikatan gula-fosfat disebut

dengan ikatan hidrogen. Masing-masing basa memiliki jumlah ikatan hidrogen

yang berbeda. Basa dengan dua cincin (purin) berpasangan dengan basa dengan

tiga cincin (pirimidin): adenin (A) berpasangan dengan timin (T) dengan dua

ikatan hidrogen sedangkan guanin (G) berpasangan dengan sitosin (C) dengan tiga

ikatan hidrogen (Albert et al., 2015).

Gambar 2.5. Struktur DNA double Helix

[Sumber: Hardin, 2015]

2.4.2. Sifat Fisika DNA

DNA dapat mengalami denaturasi yaitu peristiwa terpisahnya untai DNA

dari kompelennya. Pemisahan tersebut dapat terjadi karena adanya pemanasan

pada suhu tinggi (>90‟C) dan suasana pH ekstrim (pH < 3 atau pH > 10). Proses

denaturasi ini terjadi secara reversible (renaturasi) pada suhu +-60‟C, yaitu proses

terbentuknya kembali struktur untai ganda DNA (Yuwono, 2009).

10


Selain itu komposisi yang lebih banyak dari kandungan antara pasangan

basa nukleotida G-C terhadap A-T akan memperlambat proses denaturasi molekul

DNA. Sebaliknya, kandungan pasangan basa A-T yang lebih banyak akan

menyebabkan pita DNA mudah terputus (Fatchiyah et al., 2011)

2.4.3. DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel dari sel yang menghasilkan energi kimia

yang diperlukan oleh sel eukariotik. Setiap mitokondria dilapisi oleh selubung

yang terdiri dari sebuah membran dalam dan membran luar (gambar 2.6). Bagian

luar mitokondria dilapisi oleh sebuah membran yang disebut krista sedangkan

bagian dalamnya dikenal sebagai matriks (Marks, Dawn B., et al., 2000)

Gambar 2.6. Mitokondria dengan Membran Bagian Dalam

dan Membran Bagian Luar

[Sumber: Davidson, 2000]

Mitokondria menjadi tempat berlangsungnya tahap akhir oksidasi bahan

bakar dan sebagian besar terbentuknya ATP yang berasal dari zat-zat yang masuk

ke dalam tubuh. Selain itu didalam mitokondria juga terdapat enzim siklus asam

trikarboksilat yang bertanggung jawab untuk tahap akhir oksidasi bahan bakar dan

terdapat pula komponen rantai transport elektron (Marks, Dawn B,et al., 2000).

ATP merupakan komponen penting dalam berbagai aktivitas biokimia sel.

Mitokondria memiliki genom subselular organel yang terpisah dari kromatin

nuklear yang disebut DNA mitokondria (mtDNA), yang sangat umum digunakan

11


dalam studi filogenik molekular (Moritz et al., 1987). Selain didalam kromosom,

DNA juga dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplast. (Albert et al., 2015).

DNA mitokondria adalah suatu molekul polimer untai ganda, rantai kesatu

yang mengandung banyak molekul guanin atau heavy chain strand dan rantai

lainnya mengandung banyak sitosin atau light strand. DNA mitokondria ini

mengkode 13 protein, 22 RNA transfer (tRNA) dan 2 RNA ribosom (rRNA),

yaitu 12S rRNA dan 16 rRNA (Syukriani, 2012). Solihin, 2014 menyebutkan 13

protein yang dikode adalah URF1. URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L,

Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase

unit III, Cytochrome b dan ATPase 6.

Beberapa gen mtDNA digunakan sebagai target untuk mengisolasi spesies

hewan tertentu dalam bentuk daging segar. Hal tersebut dilakukan karena mtDNA

memiliki ribuan kopi per sel serta memiliki beberapa titik mutasi yang

membedakan spesies yang berdekatan (Lockey & Bardsley, 2000)

2.4.4. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap awal yang harus dilakukan untuk

menganalisis suatu DNA. Keberhasilan proses isolasi DNA sangat menentukan

hasil analisisnya. Prinsip dasar eksraksi DNA/isolasi DNA adalah pemisahan

DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Pada proses isolasi yang harus

diperhatikan yaitu komposisi dari buffer ekstraksi dan pH, hal tersebut penting

karena jika komposisimya tidak sesuai, DNA akan terdegradasi (Maftuchah et al.,

2014).

Fungsi larutan buffer yaitu menjaga struktur DNA selama tahap isolasi dan

purifikasi, memudahkan dalam penghilangan senyawa protein dan RNA serta

mencegah degradasi DNA oleh enzim. Fungsi larutan buffer dapat dioptimalkan

dengan meningkatkan konsentrasi, pH, kekuatan ion dan deterjen. Salahsatu

contoh dari deterjen pekat yaitu SDS (Sodium Doecyl Sulphate) yang berperan

sebagai penghambat semua aktivitas enzim nuclease yang ada selama proses

ekstraksi, yang mana enzim ini merupakan enzim pendegradasi DNA (Nugroho

dan Dwi, 2017). Aktivitas enzim nuclease juga dapat dihambat dengan

menambahkan buffer yang mengandung sodium sitrat dan EDTA karena senyawa

12


tersebut akan berikatan dengan Ca2+

dan Mg2+

yang merupakan kofaktor bagi

DNase (Buwono, 2018).

Ada tiga prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu penghancuran sel (lisis),

pemisahan DNA dari padatan seperti selulosa dan protein (ekstraksi) dan

permunian DNA.

1) Penghancuran Sel (lisis)

Penghancuran sel dilakukan untuk mengeluarkan organel-organel yang

ada didalam sel. Tahap penghancuran ini dapat dilakukan dengan cara fisika

seperti menghaluskan sampel menggunakan mortar dan pistil dalam nitrogen

cair atau menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lainnya

yakni cara kimiawi dengan menggunakan senyawa deterjen yang sifatnya

melarutkan lipid pada membran sel sehingga mengakibatkan destabilisasi

membran sel. Cara enzimatik yakni menggunakan proteinase K yang akan

melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular

maupun rantai polipeptida dalam sel (Nugroho dan Dwi, 2017).

2) Pemisahan DNA (ekstraksi)

Tahap ekstraksi ini dilakukan untuk memisahkan DNA dari bahan-

bahan lain seperti RNA dan protein. Proteolitik (Proteinase K) digunakan

untuk menghilangkan kontaminasi pada larutan DNA dan untuk

menghilangkan kontaminasi RNA digunakan enzim RNAase (ribonuklease).

Selanjutnya dilakukan pengendapan DNA dengan proses sentrifugasi yang

akan mengendapkan asam nukleat dengan penambahan etanol dingin. Tahap

terakhir pellet yang terbentuk dilarutkan kembali dengan buffer yang

mengandung SDW (Nugroho dan Dwi, 2017).

3) Pemurnian DNA

Pellet DNA yang telah terbentuk selanjutnya dimurnikan dengan

menambahkan etanol. Adanya kandungan garam (kation monovalent seperti

Na+), pada suhu -20‟C etanol absolut mampu mengendapkan DNA dengan

baik (Radji, 2011).

13


2.5. Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan suatu molekul

bermuatan yang diinduksi oleh medan listrik dalam medium gel agarosa. DNA

merupakan molekul bermuatan negatif sehingga dalam elektroforesis DNA akan

bergerak menuju kutub positif. Teknik ini dipilih karena mediumnya yang tidak

toksik, mudah dipreparasi, baik untuk memisahkan molekul DNA yang besar dan

sampel yang telah dielektroforesis dapat diperoleh kembali dengan melelehkan gel

agarosa kemudian ditambahkan enzim agarose atau garam chaotropic (Barril,

2012).

Proses pemisahan fragmen DNA pada elektroforesis gel agarosa

dipengaruhi oleh beberapa faktor (Sambrook et al., 2001), yaitu:

1. Konsentrasi agarosa

Molekul DNA akan bermigrasi lebih cepat pada gel yang memiliki

konsentrasi lebih rendah dibandingkan gel dengan konsentrasi tinggi.

Tabel 2.2. Kisaran Umum Konsentrasi Agarosa

Konsentrasi agarosa

(%)

Efisiensi pemisahan

DNA (kb)

0,3 5-60

0,6 1-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7

1,2 0,4-6

1,5 0,2-3

2,0 0,1-2

(Sumber: Muladno, 2010)

2. Ukuran molekul DNA

Molekul DNA dengan ukuran yang lebih kecil akan bermigrasi lebih

cepat dibandingkan dengan molekul DNA berukuran lebih besar.

3. Voltase yang digunakan

Kecepatan migrasi DNA berbanding lurus dengan tingkat voltase yang

digunakan. Namun, bila penggunaan voltase terlalu tinggi migrasi

14


DNA akan menjadi sangat cepat sehingga menurunkan efektifitas

pemisahan molekul DNA.

4. Konformasi DNA

Konformasi molekul DNA yang berbeda akan menghasilkan kecepatan

yang berbeda dibandingkan dengan DNA bentuk linier.

5. Etidium Bromida

Etidium bromida adalah salah satu pewarna yang umum digunakan

sebagai visualisasi DNA.

6. Komposisi Larutan Buffer

Larutan buffer merupakan salah satu komponen yang penting dalam

proses pemisahan molekul DNA karena ion berkekuatan tinggi akan

meningkatkan panas sehingga aliran listrik akan maksimal.

2.6. Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA

Pengukuran kemurnian dan jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan

menggunakan spektrofotometri UV dengan mengukur absorbansi sampel pada

panjang gelombang antara 200 – 320nm. Nilai kemurnian didapatkan dengan

menghitung ratio nilai A260/280 dan nilai A260/230. Kedua nilai ini

menunjukkan jenis kontaminasi yang berbeda dengan pengaplikasian yang

berbeda pula (Wilfinger WW, 2006).

Sebagai contoh nilai ratio absorbansi A260/230 lebih baik digunakan

sebagai indikator kemurnian untuk analisis dengan microarrays sedangkan

A260/280 lebih baik digunakan untuk analisis menggunakan PCR (Ning J, 2009).

Isolat DNA dikatakan murni apabila nilai kemurniannya antara 1.8 – 2.0 untuk

A260/280 (Sambrook J, 2006). Nilai ratio yang lebih rendah dari 1.8

menunjukkan adanya kontaminasi protein sedangkan nilai rasio yang melebihi 2.0

menunjukkan adanya kontaminasi RNA (Teare et al.,1997). Sedangkan untuk

rasio A260/A230 dikatakan murni jika nilainya masuk dalam rentang 1.8-2.2

(Sambrook J, 2006).

15


2.7. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction merupakan teknik biologi yang dilakukan

secara enzimatik untuk mengamplifikasikan sekuen DNA spesifik menjadi ribuan

bahkan jutaan kopi DNA secara in vitro, sekitar 106-10

7 kali (Fatchiyah et al.,

2011). Prinsip dasar PCR adalah sekuen DNA spesifik diamplifikasi menjadi dua

kopi selanjutnya menjadi empat kopi dan seterusnya. Pada setiap n siklus PCR

akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Proses amplifikasi ini

membutuhkan enzim spesifik yang dikenal dengan enzim polymerase. Polymerase

adalah enzim yang akan menggabungkan DNA cetakan tunggal membentuk untai

DNA helix ganda yang panjang (Hewajuli et al., 2014). Enzim ini membutuhkan

primer serta DNA cetakan seperti nukleotida yang terdiri dari Adenin (A), Timin

(T), Sitosin (C) dan Guanin (G) (Gibbs, 1990).

Reaksi amplifikasi ini diawali dengan proses denaturasi DNA cetakan

menjadi rantai tunggal, selanjutnya suhu diturunkan sehingga primer akan

menempel (annealing) pada DNA cetakan yang berantai tunggal. Kemudian

setelah proses annealing selesai, suhu dinaikkan kembali sehingga enzim

polymerase dapat melakukan proses polymerase rantai DNA yang baru. Rantai

DNA yang baru selanjutnya akan menjadi cetakan bagi reaksi polymerase

berikutnya (Yuwono, 2006).

Teknik PCR ini dibedakan menjadi dua yaitu PCR konvensional dan Real

Time PCR. Perbedaan kedua teknik ini terletak pada visualisasi hasil fragmen

DNA hasil amplifikasi. Pada PCR konvensional analisis hasil amplifikasinya

dilakukan pada agar elektroforesis. Sedangkan analisis hasil fragmen DNA pada

Real Time PCR dilakukan dengan menghitung dan mendeteksi pada setiap siklus

yang berlangsung (Hewajuli et al.,2014). Perbedaan dapat dilihat pada gambar

2.7.

16


Gambar 2.7. Perbedaan Prosedur PCR konvensional dengan Real Time PCR

[Sumber: Fraga et al., 2008]

2.7.1. Komponen PCR

Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR diantaranya

templet DNA (DNA yang akan diamplifikasi); sepasang primer (oligonukleotida

pendek yang memiliki urutan nukleotida komplementer dengan urutan nukleotida

DNA templet); dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium

klorida (MgCl2) dan enzim DNA polymerase (Handoyo et al., 2001).

a. DNA template

DNA hasil isolat harus memiliki kemurniann yang baik jika tidak

murni dapat mengganggu proses amplifikasi serta menghambat kerja enzim

DNA polymerase. Pemilihan DNA target juga memperhatikan kestabilan

genetik dari urutan nukleotida yang menjadi target (Handoyo et al., 2001).

Dua hal penting pada DNA template ini yaitu kemurnian dan kuantitasnya

(Yusuf, 2010). Konsentrasi yang terlalu rendah akan menyulitkan primer

untuk menemukan DNA template dan bila konsentrasi terlalu tinggi akan

meningkatkan kemungkinan adanya mispriming (Sulistyaningsih, 2007).

17


b. Sepasang Primer

Primer merupakan susunan dari urutan nukleotida yang dapat disintesis

berdasarkan susunan nukleotida yang diinginkan. Pada teknik PCR, primer

adalah komponen yang akan membatasi fragmen DNA target yang akan

diamplifikasi (Handoyo dan Ari, 2001). Sebelum digunakan dalam proses

amplifikasi, ada beberapa hal yang harus diperhatikan agar primer dapat

menempel secara spesifik pada fragmen DNA target. Pertimbangan tersebut

meliputi panjang primer, %GC, Tm, dimer pada ujung 3‟, stabilitas, jumlah

runs, repeats, hairpins dan false priming (Bartlett dan Stirling, 2003; Borah,

2011).

Menurut Innis dan Gelfand (1990), primer yang baik tersusun atas 18-

28 nukleotida. Jika nukleotida terlalu pendek akan mengakibatkan

berkurangnya spesifitas primer. Sedangkan, jika primer terlalu panjang tidak

akan meningkatkan spesifitas primer secara bermakna (Handoyo dan Ari,

2001).

c. dNTPs

dNTPs adalah suatu campuran yang berisi dATP (deoksiadenosin

trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan

dGTP (deoksiguanin trifosfat). Dalam proses PCR, dNTPs akan menempel

pada gugus –OH diujung rantai 3‟ pada primer, lalu membentuk untai baru

yang komplementer dengan untai DNA template (Handoyo et al., 2001).

d. Enzim DNA polymerase

DNA Taq Polymerase yang diisolasi dari Thermus aquaticus

merupakan salahsatu dari banyak jenis DNA Polymerase yang berhasil

diidentifikasi oleh peneliti sebelumnya. DNA Taq polymerase adalah DNA

Polymerase yang pertama digunakan dalam teknologi PCR karena sifatnya

yang stabil dalam kondisi suhu apapun.

Enzim DNA polymerase ini akan mengikat untai tunggal DNA dengan

membentuk DNA komplennya sehingga terbentuk untai DNA double helix

yang baru. Dalam teknik PCR proses ini dilakukan secara in vitro. Proses ini

berlangsung pada tahap ketiga siklus PCR yaitu dalam proses perpanjangan,

18


setelah primer menempel pada untai DNA tunggal template menjadi untai

DNA ganda yang baru.

e. Buffer dan MgCl2

Reaksi polymerase hanya dapat berlangsung pada kondisi pH tertentu.

Maka dibutuhkan buffer agar kondisi pH dalam proses reaksi terjaga. Selain

buffer diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion ini berasal dari larutan MgCl2

dimana larutan ini berperan sebagai kofaktor yang menstimulasi aktivitas

DNA polymerase (Handoyo et al., 2001).

2.7.2. Tahapan PCR

Terdapat tiga tahapan penting dalam proses PCR yang akan terjadi secara

berulang dalam 30-40 siklus, yaitu denaturasi, annealing (penempelan primer) dan

extention (pemanjangan primer ).

Denaturasi, merupakan proses awal yang dilakukan sebelum enzim taq

polymerase ditambahkan ke dalam tabung uji. Proses denaturasi berlangsung

sekitar 3 menit sampai semua DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal.

Apabila denaturasi tidak lengkap akan mengakibatkan gagalnya proses PCR.

Waktu denaturasi yang terlalu lama juga dapat mengurangi aktivitas enzim taq

polymerase. Aktifitas enzim tersebut memiliki waktu paruh lebih dari 2 jam, 40

menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5◦C; 95◦C dan 97,5◦C (Yusuf, 2010).

Suhu pada tahap denaturasi adalah 92-95◦C yang berlangsung selama 30-60 detik,

dengan suhu 94◦C merupakan pilihan standar (Fatchiyah et al., 2011).

Selanjutnya tahap annealing atau disebut juga penempelan primer, waktu

annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30-45 detik. Semakin panjang

ukuran primer, semakin tinggi temperature yang dibutuhkan. Berkisar anatara

36◦C sampai 72◦C, suhu yang umumnya dipakai yaitu anatara 50-60◦C (Yusuf.,

2010). Tahap yang terakhir yaitu extention atau pemanjangan primer. Pada tahap

ini enzim Taq polymerase akan mulai memperpanjang DNA primer dari ujung 3‟.

Kecepatannya diperkirakan 35-100 nukleotida/detik pada suhu 72◦C (Yusuf.,

2010).

19


Gambar 2.8. Amplifikasi eksponensial DNA pada PCR

[Sumber: Lazaro, 2013]

2.7.3. Real-Time PCR

Ada dua jenis PCR yaitu PCR konvesional dan Real time PCR. Beberapa

tahun terakhir metode Real Time PCR yang berdasarkan fluoresensi lebih banyak

digunakan oleh peneliti untuk mendekteksi RNA, DNA dan cDNA. Real time

PCR memiliki beberapa keunggulan bila dibandingkan dengan PCR konvensional

diantaranya memiliki sensitivitas lebih tinggi, lebih dinamis, resiko kontaminasi

silang lebih sedikit serta kemampuan aplikasi penggunaannya untuk pengujian

lebih banyak (Black et al., 2002). Spesifitasnya juga dapat ditingkatkan dengan

penggunaan probe yang spesifik (Chantratita et al., 2008). Namun Real Time PCR

juga memiliki kelemahan yaitu diperlukannya peralatan dan reagen yang mahal

serta pemahaman teknik yang benar untuk mendapatkan hasil yang akurat.

Tahapan-tahapan yang dilakukan selama pengujian Real Time PCR

diawali dari isolasi RNA atau DNA sampai analisis data. Prinsip kerja instrumen

ini yaitu dengan mendeteksi dan mengkuantifikasi reporter fluoresen. Sinyal

fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya jumlah amplifikasi DNA.

Jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus akan dicatat untuk melihat terjadinya

reaksi selama fase eksponensial. Peningkatan hasil amplifikasi pada fase

eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. Semakin tinggi

20


tingkat ekspresi target gen maka deteksi emisi fluoresen akan semakin cepat

terjadi (Pardal, 2010).

Gambar 2.9. Siklus RT-PCR

[Sumber: Gafar, 2007]

Kuantitas urutan DNA target dicapai dengan menentukan jumlah siklus

amplifikasi. Jumlah siklus amplifikasi dibutuhkan untuk menghasilkan produk

PCR berdasarkan fluoresensi di awal fase eksponensial PCR serta untuk melewati

garis ambang fluoresensi/siklus threshold (Ct). Jumlah siklus yang dibutuhkan

untuk mencapai ambang batas disebut Ct. Siklus Ct merupakan prinsip dasar dari

Real time PCR dan bagian yang sangat penting untuk mendapatkan data yang

akurat. Nilai Ct Real time PCR sangat berkaitan dengan kuantitas urutan DNA

target (Giglio et al., 2003).

Kurva amplifikasi pada Real time PCR memiliki tiga fase yang berbeda

(gambar 2.10). Fase pertama adalah fase inisiasi, fase ini berlangsung selama

siklus PCR ketika pancaran fluoresens tidak bisa dibedakan dari baseline. Fase

kedua disebut fase eksponensial atau fase log, pada fase ini terjadi peningkatan

eksponensial fluoresens sebelum fase plateau tercapai. Fase terakhir terjadi ketika

reagen telah berhenti bereaksi dan tidak tampak peningkatan fluoresens.

Kuantifikasi hanya dapat dilakukan pada fase eksponensial (Lazaro, 2013).

21


Gambar 2.10. Fase Kurva Amplifikasi PCR. Merah: kurva amplifikasi sampel

positif. Biru: threshold. Hitam: baseline.

[Sumber: Lazaro, 2013]

Dalam reaksi Real Time PCR umumnya terdapat tiga jenis penanda yang

digunakan untuk menganalisis hasil fragmen DNA diantaranya SYBR Green,

Hydrolysis probes, Hybridization probes, dan Molecular beacons. Pewarna yng

umum digunakan yaitu SYBR Green dan Hydrolysis probe.

a. SYBR Green

SYBR Green merupakan jenis Fluorescent DNA binding dye yang akan

menghasilkan warna ketika terikat pada untai ganda DNA (Ma et al., 2006).

Pendaran warna akan tampak pada akhir fase extension (gambar 2.11) selama

proses Real Time PCR berlangsung (Shipley, 2007). Metode SYBR Green lebih

banyak dipakai karena memiliki keunggulan dapat digunakan untuk semua

jenis primer, tidak membutuhkan probe sehingga lebih sederhana, dan harga

pewarna fluoresensi yang terjangkau (Shipley, 2007). Disisi lain SYBR Green

memiliki kelemahan yaitu dapat mengikat untai ganda DNA yang tidak spesifik

sehingga primer-dimer juga akan terikat oleh SYBR Green. Namun, produk

yang tidak spesifik dapat dianalisis pada melting curve (Kubista et al., 2006).

b. Hydrolysis probe

Probe tersebut dirancang untuk mengikat urutan DNA yang diapit oleh primer

forward dan primer reversed. Probe terdiri dari reporter yang terletak pada

ujung 5‟ yang merupakan pewarna fluoresensi dan quencher yang terletak pada

ujung 3‟ yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Prinsip kerja

22


(gambar 2.11) dari probe yaitu sinyal yang berfluoresensi dari reporter akan

dilepaskan dan diidentifikasikan ketika dua pewarna terpisah melalui

hibdridisasi atau aktivitas nuclease (Ma et al., 2006).

Gambar 2.11. Mekanisme (A) SYBR Green I dan (B) Hydrolisis Probe

[Sumber: Thermoscientificbio.com]

23


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1. Tempat

Penelitian dilaksanakan dilaboratorium Analisa Obat dan Pangan Halal

dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2. Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Januari 2018 hingga

Agustus 2018.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Real Time PCR (LightCycler® 480- Roche), Wizard

® Genomic DNA

Purification Kit (Promega), Multiwell Plate 96 (Roche®), tabung mikrosentrifuge

volume 1,5 (Biogenix), Mikropipet 0,5-10 µl (Biorad), Mikropipet 20-200 µl

(Biorad), Mikropipet 100-1000 µl (Biorad), Mikrotip volume 10 µl, 200 µl, dan

1000 µl (Genfollower), Sentrifugator (5417R-Eppendrof), Vortex, Digital

Waterbath (SB-100 Eyela), Freezer, Autoklaf, Spektrofotometer UV DNA

(DeNovix®), Timbangan Analitik, Spatula, Gelas beaker, Kertas perkamen, Pipet

tetes, Lumpang dan Alu.

3.2.2. Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, produk bakso yang beredar di

Kecamatan Ciputat (bakso sapi AW, bakso sapi BB, bakso sapi CR, bakso sapi

WL, bakso sapi GN, bakso sapi R dan bakso sapi WS) satu set kit komersial

Wizard®

Genomic DNA Purification Kit, (meliputi: Nuclei Lysis Solution, Protein

Precipitation Solution, DNA Rehydration Solution, RNase Solution), Etidium

23

24


Bromida, Agarosa, Loading dye, SYBR Green I Master, Isopropanolol absolut,

NaOH, NaCl, Etanol 70%, TAE buffer, Aquabidest, dan Primer (Tabel 3.1).

Tabel 3.1. Susunan Basa Primer untuk DNA Sapi dan Babi

Spesies Primer Sequencing

Babi Forward 5'- CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3‟

Reverse 5'- CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3„

Sapi Forward 5'- CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3„

Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3„

[Sumber: Tanabe et al., 2007]

3.3. Tahapan Penelitian

1. Pengumpulan sampel

2. Isolasi DNA

3. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Elektroforesis Agarosa

4. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

5. Uji Spesifitas Primer

6. Amplifikasi DNA menggunakan metode Real Time PCR

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1. Pengumpulan sampel

Pengumpulan sampel dilakukan dengan memilih secara acak 7 sampel

bakso sapi dari pedagang bakso yang menjual produknya dengan berkeliling di

Kecamatan Ciputat.

3.4.2. Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard®

Genomic

DNA Purification Kit (Promega). Masing-masing sampel bakso sapi, daging sapi

dan daging babi dilakukan isolasi secara triplo, dimana pengambilan sampel

dilakukan pada satu buah bakso dengan tiga titik pada bagian yang berbeda.

25


a) Preparasi Jaringan Hewan

Sebanyak 20 mg dari masing-masing daging sapi segar, daging

babi segar, dan sampel bakso sapi dihancurkan sampai halus menggunakan

pisau steril, lumpang dan alu. Masing-masing daging dan sampel

dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600 μl

Nuclei Lysis Solution. Masing-masing campuran tersebut di homogenkan

selama 10 detik kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit.

b) Pelisisan Sel dan Presipitasi Protein

Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3

μl larutan RNAse lalu diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30

menit. Selanjutnya ditambahkan 200 μl Protein Precipitation Solution dan

divortex, kemudian didiamkan dalam ice selam 5 menit lalu disentrifuse

dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.

c) Presipitasi dan Rehidrasi DNA

Endapan dan supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu

ditambahkan 600 μl isopropanol kedalam supernatan tersebut. Campuran

dikocok dan disentrifuse dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit.

Supernatan yang terbentuk dibuang lalu ditambahkan 600 μl etanol 70%.

Campuran dikocok dan disentrifus kembali dengan kecepatan 16.000 rpm

selama 1 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol lalu

endapan dikeringkan selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 100 μl

Rehidration DNA Solution dan didiamkan selama 1 jam pada suhu 650C

atau selama semalam pada suhu 40C.

3.4.3. Analisis DNA Hasil PCR dengan Elektroforosis Agarosa

a) Pembuatan Buffer TAE 1x dari buffer TAE 50x, 1 liter (Biorad, 2012)

Sebanyak 20 ml TAE buffer 50x dimasukan ke dalam labu ukur 1

liter lalu ditambahkan 980 ml aquades. Larutan kemudian dihomogenkan

dengan cara membolak-balikan labu ukur.

b) Pembuatan Gel Agarosa 1% (Sambrok et al., 2001)

Sebanyak 0,5 gram agarosa dilarutkan dengan 50ml TAE 1x di

dalam Erlenmeyer. Kemudian dimasukan ke dalam microwave hingga

26


serbuk agarosa larut serta larutan tampak bening. Selanjutnya larutan

agarosa dan 2,5 μl etidium bromida 10mg/ml dituangkan pada gel caster

kemudian comb disisipkan untuk membuat cetakan sumur sampel. Setelah

gel membentuk agar, gel diletakkan pada wadah electrophoresis dengan

posisi sumur pada sisi muatan negatif. Kemudian larutan buffer TAE 1x

dituang hingga gel terendam.

c) Loading Sampel

Tiap-tiap sumur dimasukan 5 μl isolat DNA daging sapi dan 5 μl

isolat DNA daging babi. Masing-masing sumur ditambahkan 1 μl loading

dye. Selanjutnya dimasukan 5 μl loading dye (DNA ladder 100bp) ke

dalam sumur yang berisi isolat DNA.

d) Running Sampel (Sambrook et al., 2001)

Setalah tahap loading sampel kemudian kabel elektroforesis

dihubungkan dengan sumber listrik. Kabel merah dihubungkan pada

lubang merah (muatan positif) dan kabel hitam dihubungkan pada lubang

hitam (muatan negatif). Running sampel dilakukan selama 25 menit

dengan voltase 90 Volt 400 mA.

e) Visualisasi Gel Agarosa (Atto, 2009)

Gel agarosa yang telah dielektroforesis selanjutnya

didokumentasikan melalui Gel Doc. Pada Saver, Printer dan

Transiluminator tekan tombol ON, dipilih Stand by LED untuk

memastikan posisi gel agarosa sudah tepat. Selanjutnya exposure Time,

Focus dan aperture cahaya diatur. Expose UV. Freeze ditekan dan Save.

Gambar lalu dicetak dengan menekan tombol Print.

3.4.4. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

DNA yang sudah diisolasi dianalisis menggunakan Spektrofotometri UV

DNA (DeNovix®). Proses analisis dilakukan dengan cara pada layar

Spektrofotometri UV DNA (DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Kemudian Sample

port dibersikan menggunkan tisu steril. Siapkan DNA Rehidration Solution yang

digunakan sebagai blanko sebanyak 1 μl lalu ditaruh di atas Sample port dan

dianalisis. Sample port dibersihkan kembali menggunakan tisu steril. Identitas

27


sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 1 μl DNA sampel

tersebut ditaruh di atas Sample port. Analisis dilakukan untuk mengukur

kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol “Measure”. DNA

dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tunggu beberapa detik

akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.

3.4.5. Uji Spesifitas Primer

Uji spesifisitas primer dilakukan dengan melakukan BLAST melalui

database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih menu “nucleotide blast”.

Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence” dimasukkan urutan basa primer

yang akan diuji. Tombol “BLAST” kemudian diklik.

3.4.6. Amplifikasi DNA dengan Metode Real-Time PCR

a) Pembuatan Primer 50 μM dari Larutan Induk 100 μM

Sebanyak 50 μl larutan induk primer 100 μM dimasukkan kedalam

Mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 50 μl

aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut

dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet.

b) Pembuatan Primer 5 μM dari Seri Larutan Induk 50 μM

Sebanyak 3 μl larutan induk primer babi 50 μM dimasukkan

kedalam microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 27

μl aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut

dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet.

c) Pembuatan Primer 10 μM dari Seri Larutan Induk 50 μM

Sebanyak 20 μl dari larutan primer sapi 50 μM dimasukan kedalam

microsentrifuge tube 1,5 ml kemudian ditambahkan 80 μl aquabidest.

Larutan lalu dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada

mikropipet.

d) Pembuatan SYBR Green Mastermix Real Time PCR

Mastermix dibuat dengan volume total 20 μl yang terdiri dari 5 μl

DNA template; 3 μl Aquabidest; 1 μl primer forward (5 μM untuk primer

babi dan 10 μM untuk primer sapi); 1 μl primer reverse (5 μM untuk

28


primer babi dan 10 μM untuk primer sapi); dan 10 μl LightCycler® 480

SYBR Green I master (enzim Taq DNA Polymerase, SYBR Green 1, dNTP

mix, dan 6,4 mM MgCl2).

e) Loading Sampel dan SYBR Green Mastermix kedalam Multiwell Plate

(Roched, 2008)

Campuran reaksi dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well

yang diinginkan. Kemudian dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas

secara perlahan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses

pengaturan program LightCycler® 480 Real Time PCR yang akan

digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR

dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan

pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian

diletakkan pada mesin real time PCR. Instrumen real time PCR akan

mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil

amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva.

29


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini merupakan uji kualitatif untuk mendeteksi adanya cemaran

daging babi pada bakso sapi yang berada di Kecamatan Ciputat, menggunakan

RealTime PCR dengan metode SyberGreen. Naiknya kurva amplifikasi dalam

Real Time PCR menunjukkan dalam produk bakso sapi yang diuji positif

mengandung daging babi.

4.1. Hasil Analisis Isolat DNA

Isolat DNA diperoleh dari proses ekstraksi sampel menggunakan Wizard®

Genomic DNA Purification Kit Promega. Penggunaan kit komersial ini

dikarenakan lebih efisien dalam hal waktu dan sederhana dalam preparasinya

dibandingkan metode isolasi lainnya seperti metode ekstraksi fenol atau kloroform

(Djurkin et al., 2015). Proses ekstraksi menyesuaikan dan mengacu pada protokol

Wizard® Genomic DNA Purification Kit Promega (Lampiran 2) yang terdiri dari

beberapa tahap yaitu preparasi jaringan hewan, pelisisan sel, degradasi RNA,

presipitasi protein, presipitasi dan purifikasi DNA, dan rehidrasi DNA.

Tahap pertama yaitu pelilisan sel menggunakan Nucleic Lysis Solution,

yang akan menghancurkan barrier dinding sel sehingga terpisah dari nucleus,

mitokondria dan komponen lainnya. Senyawa kimia yang terkandung dalam

Nucleic Lysis Solution yaitu EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid), Tris

HCl, NaCl (Natrium Klorida), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) (Fatchiyah et

al.,2011; Utami et al., 2012). EDTA merupakan agen pengkhelat ion yang

berperan sebagai kofaktor dengan cara mengikat kation divalent sehingga DNA

akan terlindung dari aktivitas endogenous nuclease (Muladno, 2010) sedangkan

SDS merupakan golongan deterjen kationik yang akan melarutkan kandungan

lipid serta merusak struktur sekunder maupun tersier protein yang berada dalam

membran sel (Kesmen et al.,2009).

Tahap selanjutnya adalah degradasi RNA menggunakan RNAase, reagen

ini akan melarutkan RNA tanpa merusak struktur DNA (Fatchiyah et al., 2011).

Sedangkan untuk tahap presipitasi protein digunakan reagen Protein Precipitation

29

30


Solution (PPS) yang mengandung garam berkonsentrasi tinggi seperti 0,25 M

natrium asetat atau 0,1 M natrium klorida, ammonium sulfat, ammonium asetat

dan pelarut organik seperti fenol, kloroform atau isoamil alkohol (Fatchiyah et al.,

2011).

Tahapan ekstraksi dilanjutkan dengan presipitasi DNA menggunakan

isopropanol dan etanol 70%, dimana DNA tidak larut dalam isopropanol dan

etanol sehingga DNA akan mengalami pengendapan (Madhad dan Sentheil,

2014). Tahap terakhir yaitu resuspensi isolat DNA dengan DNA Rehydration

Solution yang bertujuan agar DNA berada dalam bentuk solution sehingga akan

lebih mudah digunakan untuk analisis.

4.1.1. Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa

Isolat DNA yang sudah diamplifikasi lalu dianalisis keberadaannya

dengan elektroforesis gel agarosa menggunakan pewarna etidium bromida.

Etidium bromida dipilih karena lebih umum dipakai dalam proses visualisasi untai

DNA. Larutan etidium bromida akan berinterkalasi dengan untai ganda DNA dan

akan tampak di bawah lampu UV (Gaffar, 2007). Analisis ini bertujuan untuk

memastikan primer sapi dan primer babi yang dipakai dapat mengamplifikasi

sampel daging sapi dan daging babi. Visualisasi dilakukan sebanyak 2 kali

percobaan dengan hasil PCR DNA yang berbeda. Hasil PCR DNA percobaan

pertama dapat dilihat pada gambar 4.1.

Gambar 4.1. Hasil Elektroforesis Gel Agarosa PCR DNA Daging Babi dan

Daging Sapi Percobaan ke-1

*(Keterangan: (DS) Daging sapi; (DB) Daging babi dan (M) DNA marker)

31


Pada gambar 4.1 pita DNA daging sapi menunjukkan pita yang jelas

sempurna dibandingkan dengan pita DNA daging babi. Hal ini menunjukkan

primer sapi dapat mengamplifikasi DNA daging sapi dengan baik. Sedangkan

pada pita DNA daging babi tampak sedikit berbayang di bagian bawah pita namun

tetap menghasilkan pita yang jelas.

Gambar 4.2. Hasil Elektroforesis Gel Agarosa PCR DNA Daging Babi dan

Daging Sapi Percobaan ke-2

*(Keterangan: (DS) Daging sapi; (DB) Daging babi dan (M) DNA marker)

Percobaan kedua dilakukan untuk memastikan hasil PCR DNA yang

dihasilkan akan menunjukkan visualisasi gambar yang sama dengan percobaan

pertama. Pada gambar 4.2 pita DNA daging sapi menggambarkan hasil pita yang

smear. Smear pita DNA tersebut disebabkan adanya DNA yang terpotong

sehingga menghasilkan DNA dengan ukuran pita yang tidak sama (Lewis, 2001).

Hal tersebut dapat disebabkan juga oleh teknik pemipetan yang kurang baik

sehingga DNA akan terpotong. Hasil pita DNA daging babi memgambarkan pita

yang lebih jelas dan tidak smear. Hal itu menunjukan DNA daging babi

teramplifikasi dengan baik.

4.1.2. Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV

Nilai kemurnian dan konsentrasi tiap-tiap isolat DNA dianalisis

menggunakan spektrofotometri UV DeNovix yang memiliki limit deteksi 10 pg/μl

(DeNovix, 2018). Analisis dilakukan pada panjang gelombang 260nm dan 280nm

32


dimana DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260nm dan

kontaminan protein akan menyerap pada panjang gelombang 280nm (Fatchiyah et

al., 2011), dari kedua nilai tersebut akan didapat rasio angka yang menunjukkan

tingkat kemurnian DNA terhadap protein.

Selanjutnya dari hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian (Lampiran

3) dipilih masing-masing satu sampel isolat yang memiliki nilai konsentrasi paling

tinggi diantara ketiganya serta nilai kemurnian yang masuk dalam range 1.8-2.0

atau masih dibolehkan pengukurannya dengan PCR. Konsentrasi DNA daging

sapi yang diperoleh yaitu 28,563ng/μl dan daging babi sebesar 76,635ng/μl serta

konsentrasi isolat DNA sampel bakso berturut-turut yaitu 30,810 (bakso 8);

167,235 (bakso 9); 33,659 (bakso 10); 29,742 (bakso 11); 10,580 (bakso 12);

33,462 (bakso 13) dan 34,350 (bakso 14) ng/μl. Dapat dilihat masing-masing

sampel bakso memiliki kadar konsentrasi yang berbeda-beda. Konsentrasi setiap

isolat DNA sampel, daging sapi dan daging babi dibuat dalam pengenceran

sebanyak lima kali (Lampiran 4), hal ini bertujuan agar kurva amplifikasi yang

didapatkan tidak terlalu cepat mencapai fasa plateu pada awal siklus (Roche,

2008).

Tabel 4.1. Konsentrasi dan Kemurnian DNA Hasil Isolasi

33


Kemurnian hasil isolat DNA daging sapi, daging babi dan sampel bakso

(tabel 4.1) menunjukkan bahwa DNA yang didapatkan masih terkandung

pengotor lain yang ditunjukkan dengan nilai rasio A260/A280 di bawah 1,8.

Beberapa faktor yang menyebabkan nilai kemurnian dibawah 1,8 diantaranya

perubahan pH dalam larutan sampel DNA yang akan menghasilkan rasio

kemurnian yang bervariasi (NanoDrop, 2007) serta kemungkinan yang disebabkan

karena adanya kontaminasi protein pada proses pencucian menggunakan

isopropanol (Akhmad, 2016). Isolat DNA yang memiliki kemurnian di atas 1,0

masih dapat diterima dan dilanjutkan ke proses analisis menggunakan real-time

PCR (Kusumadewi et al., 2012).

4.2. Hasil Uji Spesifitas Primer

Pada penelitian digunakan urutan basa primer sapi dan urutan basa primer

babi yang diperoleh dari penelitian Tanabe et al., (2007). Kedua desain primer ini

telah digunakan sebelumnya oleh Zilhadia (2017) dan telah dianalisis

spesifitasnya menggunakan software NCBI BLAST. Hasil BLAST dari penelitian

Zilhadia (2017) menunjukkan dari database NCBI pada primer babi forward dan

primer babi reversed yang digunakan spesifik untuk DNA babi dengan nilai

maksimum identitas 100%. DNA target yang akan diamplifikasi yaitu pada DNA

mitokondria sitokrom b dengan panjang amplifikasi 120 pasang basa (Lampiran

5a). Hasil BLAST untuk primer sapi forward dan primer sapi reversed

menunjukkan urutan primer spesifik untuk mengamplifikasi DNA mitokondria

sitokrom b sapi dengan panjang amplifikasi 131 pasang basa (Lampiran 5b).

4.3. Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR

4.3.1. Penetapan Metode Amplifikasi yang Optimal

Pada penelitian ini modifikasi suhu annealing hanya dilakukan pada

primer sapi karena terdapat perbedaan jauh nilai Tm teoritis pada primer sapi

forward dan primer sapi reverse (Lampiran 6) yakni 60◦C dan 70◦C dengan nilai

Ta 65◦C. Pasangan primer yang baik yaitu yang memiliki perbedaan Tm tidak

lebih dari 2◦C (Scmittgen, 2007). Nilai Tm primer akan mempengaruhi nilai Ta

34


karena suhu annealing yang digunakan biasanya 5◦C di bawah nilai Tm

(Muladno, 2010). Optimasi dilakukan pada suhu 50◦C, 55◦C, 60◦C dan 65◦C.

Pada kurva (Lampiran 7a, 7b dan 7c) menunjukkan terjadinya amplifikasi pada

DNA yang mengandung sapi dan DNA non-target yaitu DNA yang mengandung

babi maupun NTC (No Template Control). Hal ini diduga karena suhu annealing

yang digunakan terlalu rendah untuk primer reverse dengan nilai Tm 70◦C,

sehingga terjadi mis-priming atau primer-dimer. Berdasarkan Zilhadia (2017),

optimasi suhu annealing dengan urutan primer sapi yang sama didapatkan hasil

suhu optimal 65◦C (Lampiran 8) sehingga peneliti menggunakan suhu 65◦C

sebagai suhu annealing primer sapi.

Pada primer babi tidak dilakukan optimasi suhu annealing karena nilai Tm

teoritis pada primer forward babi dan primer reverse babi memiliki nilai yang

sama yakni 66◦C (Lampiran 6). Berdasarkan Rachmawati (2012), optimasi suhu

annealing primer babi dengan urutan basa yang sama menggunakan metode

gradient PCR, diperoleh hasil suhu optimal 60◦C.

Selain suhu annealing, konsentrasi primer yang digunakan juga berperan

penting pada keberhasilan amplifikasi. Nilai konsentrasi primer babi dan primer

babi didasari pada hasil optimasi serta perhitungan (Lampiran 9) yang telah

dilakukan dan mengacu pada SYBR Green I Protocol yaitu 0,2-1 μm (Roche,

2005). Sehingga didapatkan nilai konsentrasi primer sapi yang digunakan yaitu

0,5 μm dan konsentrasi primer babi yaitu 0,25 μm. Sedangkan suhu denaturasi

yang digunakan yaitu 95◦C selama 10 detik dan suhu ekstensi yaitu 72◦C selama

30 detik, yang mengacu pada SYBR Green I Protocol (Lampiran 10a, 10b).

4.3.2. Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR dengan Metode

SYBR Green Menggunakan Primer Sapi

Analisis dilakukan pada sampel bakso 8, bakso 9, bakso 10, bakso 11,

bakso 12, bakso 13, bakso 14, daging sapi, daging babi dan NTC menggunakan

primer sapi. Pada gambar 4.2 menunjukan kenaikan kurva amplifikasi pada isolat

DNA daging sapi dengan Cp sebesar 21.82 diikuti isolat DNA bakso 8, bakso 9,

bakso 10, bakso 11, bakso 12, bakso 13, dan bakso 14 dengan nilai CP berturut-

turut 21.34; 24.99; 24.09; 19.95; 25.36; 22.65; dan 16.93. Hal ini menunjukkan

35


adanya DNA sapi yang teramplifikasi pada sampel bakso. Nilai CP yang berbeda

pada tiap sampel dikarenakan sampel memiliki konsentrasi dan kemurnian yang

berbeda-beda. Spesifitas amplifikasi juga dilihat pada gambar 4.4 kurva melting

peaks dimana hanya terdapat satu puncak melting point dimana turut menandakan

DNA yang teramplifikasi adalah DNA sapi.

Gambar 4.3. Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi(DS), Daging babi(DB),

No Template Control(NTC) dan Sampel Bakso dengan Metode SYBR Green

Menggunakan Primer Sapi.

Pada gambar 4.3 juga menunjukan adanya kenaikan kurva amplifikasi

pada NTC dengan nilai CP 26.73 dan pada DNA daging babi namun tidak

menghasilkan nilai CP. Naiknya kurva amplifikasi pada DNA daging babi dan

NTC dapat disebabkan oleh banyak hal diantaranya terdapat kontaminan protein,

RNA, kontaminasi pada area preparasi running sampel, primer dimer serta tidak

spesifiknya primer yang digunakan. Kurva melting peaks tidak menghasilkan dua

peaks dimana peaks DNA daging babi dan NTC memiliki peaks yang sedikit lebih

rendah gambar 4.4 dari DNA sampel bakso dan DNA daging sapi. Maka false

positive tidak berasal dari primer dimer. Proses preparasi master mix hingga

running sampel juga dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) dengan

peralatan yang steril untuk memperkecil kemungkinan adanya kontaminasi.

Spesifitas primer yang digunakan juga mempengaruhi terjadinya false positive,

36


seperti yang disebutkan dalam metodologi tabel 3.1 urutan primer sapi forward

dengan urutan DNA babi pada gambar 4.5 memiliki urutan yang hampir mirip

hanya berbeda dua basa saja yaitu basa “a dan a” pada DNA babi sedangkan “c

dan g” pada primer forward sapi.

Gambar 4.4. Kurva Melting Peaks Hasil Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi,

Daging babi, NTC dan Sampel Bakso dengan Primer Sapi

Gambar 4.5. Urutan DNA babi

[Sumber: Tanabe et al., 2007]

Perbedaan tersebut dapat menyebabkan primer sapi mengamplifikasi isolat

DNA daging babi yang seharusnya merupakan kontrol negatif sehingga kurva

amplifikasi DNA daging babi mengalami kenaikan. Hal itu terjadi juga pada

kurva amplifikasi NTC, dimana seharusnya NTC (Non template control) tidak

menghasilkan kurva naik. Seperti yang tampak pada gambar 4.4 melting peaks

NTC juga berada pada peaksi yang sama seperti kontrol positif. Metode SYBR

Green I memiliki beberapa kekurangan salah satunya tidak dapat mengamplifikasi

37


dengan spesifik sehingga kontaminan pun dapat diamplifikasi walaupun bukan

target yang dituju (Kubista et al., 2006). Munculnya nilai CP juga dapat

disebabkan karena nilai threshold yang digunakan terlalu besar yaitu 3,00.

Pengambilan angka threshold yang terlalu tinggi akan menyebabkan nilai CP

yang tidak logis namun angka threshold yang terlalu rendah juga menyebabkan

teridentifikasinya sampel yang sebelumnya tidak teridentifikasi. Pengaturan batas

threshold dilakukan untuk menghilangkan noiseband sehingga akan diketahui

lebih tepat pada siklus keberapa kurva amplifikasi terpotong.

4.3.3. Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

SyberGreen menggunakan Primer Babi

Pengujian dilakukan pada isolat DNA sampel bakso 8, bakso 9, bakso 10,

bakso 11, bakso 12, bakso 13, bakso 14, daging sapi (kontrol negatif), daging babi

(kontrol positif) dan NTC (blanko) menggunakan primer babi. Keberadaan DNA

hasil amplifikasi pada gambar 4.6 diamati dari grafik yang muncul sebagai

akumulasi fluoresensi yang menghasilkan nilai CP pada grafik. Pada gambar,

hanya dihasilkan grafik naik pada hasil amplifikasi DNA daging babi dengan nilai

CP sebesar 21,24. Sedangkan pada hasil amplifikasi sampel bakso tidak

menunjukkan grafik naik hal ini menunjukkan tidak adanya cemaran daging babi

pada bakso sapi. Begitu juga dengan hasil grafik pada DNA daging isolat NTC

yang tidak mengalami kenaikan grafik, dimana menunjukan bahwa metode SYBR

Green I dengan primer babi dapat mengamplifikasi DNA babi secara spesifik.

38


Gambar 4.6. Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi(DS), Daging babi(DB),

No Template Control(NTC) dan Sampel Bakso dengan Metode SYBR Green

Menggunakan Primer Babi

Gambar 4.7. Kurva Melting Peaks Hasil Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi,

Daging babi, NTC dan Sampel Bakso dengan Primer Babi

Spesifitas hasil amplifikasi juga dapat dianalisa dari melting peaks pada

Gambar 4.7 Produk yang spesifik hanya akan menghasilkan satu peaks dengan

nilai Tm yang sama atau mendekati. Pada kurva melting peaks menghasilkan satu

peaks yaitu peaks produk primer babi dengan isolat DNA daging babi.

39


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Kesimpulan yang didapatkan berdasarkan kurva amplifikasi pada running

sample primer babi, tidak didapatkan hasil positif untuk sampel DNA bakso 8,

bakso9, bakso 10, bakso 11, bakso 12, bakso 13 dan bakso 14. Maka sampel

bakso yang beredar di wilayah Ciputat dan diambil pada Juli 2018 tidak

mengandung cemaran daging babi.

5.2. Saran

a. Metode pengambilan sampel bakso sebaiknya lebih diperjelas.

b. Perlu dilakukan penelusuran sumber pemasok bakso pada setiap

pedagang, sehingga sampel bakso tidak berasal dari sumber yang sama.

c. Apabila pada penelitian selanjutnya digunakan urutan primer sapi dan

primer babi yang sama, sebaiknya terlebih dahulu dilakukan uji spesifitas

pada kedua primer. Pengujian harus dilakukan dengan kontrol negatif,

kontrol positif dan sampel.

d. Uji spesifitas sebaiknya dilakukan dengan PCR konvensional lalu

divisualisasi dengan elektroforesis, jika hasil PCR pada primer dengan

kontrol negatif menghasilkan pita maka harus dilanjutkan dengan

sequencing DNA.

e. Diharapkan dapat dilakukan pengembangan lebih lanjut terkait metode

yang digunakan untuk lebih efisien dan efektif sehingga kedepannya

dapat digunakan sebagai rujukan utama pengujian kehalalan produk

bakso.

39

40


DAFTAR PUSTAKA

Akhmad, M. A. 2016. Pengembangan Analisis Listeria monocytogenes untuk

Jajanan Pempek dengan Real-time PCR. (Tesis Institut Pertanian Bogor).

Alberts, B., Bray, D., Watson, J., Lewis, J. 2015. Molecular Biology of The cell

6th Edition. New York: Garland Science.

Aw, T.G., & Rose, J.B. 2012. Detection of Phatogens in Water: from Phylochips

to qPCR to Pyrosequencing. Biotechnol. 23:422-430.

Barril, P., & Silvia, N. 2012. Gel Electrophoresis-Principle and Basics. Rijeka:

InTech.

Bempah, R. T. 2017. Polisi Amankan Ratusan Kilogram Daging Babi dari Kios

Bakso di Bogor. Regional Kompas. Diakses pada 13 Maret 2018 melalui

http://regional.kompas.com/read/2017/05/30/15242211/polisi.amankan.rat

usan.kilogram.daging.babi.dari.kios.bakso.di.bogor pukul 12.34.

Black, E.M., Lowings, J.P., Smith, J., Heaton, P.R., McElhinney, L.M. 2002. A

rapid RT-PCR method to differentiate six established genotypes of rabies

and rabies-related viruses using TaqMan technology. J Virol Methods.

105:25-35.

Buwono, I.D. 2018. Buku Ajar Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan untuk

Perakitan Konstruksi Vektor Ekspresi Ikan Lele Transgenik. Yogyakarta:

Deepublish.

Cai, H. 2012. Real Time PCR Assays for Detection and Quantification of Porcine

and Bovine DNA in Gelatine Mixtures and Gelatine Capsules. USA:

Journal of Food Composition and Analysis. 25:83-87.

Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G. 2002. Biologi. Jilid 1. Edisi Kelima.

Alih Bahasa: Wasmen. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Cawthraw, S., Saunders, G. C., Martin, T. C., Sawyer, J., Windl, O.,Reaney, S. D.

2009. Real-time PCR Detection and Identification of Prohibited

Mammalian and Avian Material in Animal Feeds. Journal of Food

Protection.

Chantratita, W., Sukasem, C., Kaewpongsri, S., Srichunrusami, C., Pairoj, W.,

Thitithanyanont, A., Chaichoune, K., Ratanakron, P., Songserm, T.,

Damrongwatanapokin, S., Landt, O. 2008. Qualitative detection of Avian

Influenza A (H5N1) viruses: a comparative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods. Mol Cell Probes. 22:287-293.

http://regional.kompas.com/read/2017/05/30/15242211/polisi.amankan.ratusan.kilogram.daging.babi.dari.kios.bakso.di.bogor

http://regional.kompas.com/read/2017/05/30/15242211/polisi.amankan.ratusan.kilogram.daging.babi.dari.kios.bakso.di.bogor

41


Davidson, M.W. 2000. Aricle: Mitochondria. Diakses pada 13 Maret 2018 pukul

8.30 melalui http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria.html.

David, R., Hernandez, M. 2013. Real-time PCR in Food Science: Introduction.

Curr Issue Mol Bio. 15: 25-38.

Depkes. 2016. Artikel: Inilah Perbedaan “4 Sehat 5 Sempurna” Dengan “Gizi

Seimbang”. Diunduh pada 13 Maret 2018, melalui

http://www.depkes.go.id/pdf.php?id=16051300001.

DeNovix. 2018. DS-11 Spectrophotometer. Diunduh pada 9 September 2018

pukul 12.42 melalui https://www.denovix.com/ds-11/.

Djurkin, K. 2015. Comparison of Commecial DNA KITS and Traditional DNA

Extraction Procedure in PCR Detection of Pork in Dry/Fermented

Sausages. Poljoprivreda. 21:199-202.

Fatchiyah. 2011. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Fumière, O., Veys, P., Boix, A., Vonholst, C., Baeten, V., Berben, G. 2009.

Methods of Detection, Species Identification and Quantification of

Processed Animal Proteins in Feedingstuffs. Biotechnology, Agronomy,

Society and Environment.

Fraga, D., Meulia, T., Fenster, S. 2008. Real-Time PCR. In: Current protocols

essential laboratory techniques. New York (US): John Wiley & Sons,

Inc. p. 10.3.110.3.33.

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA-Universitas

Padjajaran.

Gibbs, R.A. 1990. DNA amplification by the polymerase chain reaction. Anal

Chem. 62: 1202-1214.

Giglio, S., Monis, P.T., Saint, C.P. 2003. Demonstration of preferential binding of

SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR.

Nucleic Acids Res. 31:e136.

Griffiths,A.J.F., Miller, J.H., Suzuki, D.T. 2000. An Introduction to Genetic

Analysis. 7th edition. New York: W. H. Freeman.

Handoyo, D., Ari, R. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain

Reaction (PCR). Surabaya: Universitas Surabaya.

Hewajuli, D. A., Dhamayanti, N.L. 2014. Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase- Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi

Genom Avian Influenza dan Newcastle Disease. Bogor: Balai Besar

Penelitian Veteriner.

http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria.html

http://www.depkes.go.id/pdf.php?id=16051300001

https://www.denovix.com/ds-11/

http://www.whfreeman.com/

42


Kesmen, Z., Gulluce, A., Yetim, H. 2009. Identification of Meat Species by

Taqman Based Real-Time PCR Assay. Meat Science 82: 444-449.

Koolman, J., Klaus, H.R. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Edisi kelima.

Germany: Georg Thieme Verlag.

Kubista, M., Andrade, J.M., Bengtsson, M., Forootan, A., Jonak, J., Lind, K.

2006. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27,

95–125. Diunduh pada 20 Juli 2018 pukul 15.30 melalui

10.1016/j.mam.2005.12.007Lazaro.

Kusumadewi. 2013. Analisis DNA Jaringan Lunak Manusia yang Terpapar

Formalin dalam Interval Waktu 1 Bulan Selama 6 Bulan pada Lokus

D13S317 dengan Metode STR-PCR. Surabaya: JBP, 14(2): 115-121.

Liyana, F.K., Shuhaimi, M., Cheman, Y.B., Sazili A.Q., Aida A.A., Raha A.R.

2009. Porcine Specific Real time Polymerase Chain Reaction (PCR) for

Halal Verification. Proceedings of the 3rd

IMT-GT International

Symposium on Halal Science and Management 2009. Malaysia : UPM

Serdang, Selangor.

Lewis, Matt. 2001. Agarose Gel Electrophoresis (Basic Method). Diunduh Pada

tanggal 19 Agustus 2018 pukul 13.50 melalui

http://www.methodbook.net/.

Lockley, A.K., Bardsley, R.G. 2000. DNA-based Methods for Food

Authentication. Trends Food Sci. Technol. 11: 67-77

Ma, H., Kuan-Jiunn, S., Geroge, C., X,Tracy Qiao., Mei-Ying, C. 2006.

Application of Real Time Polimerase Chain Reaction (RT-PCR). The

journal of American science: 2 (3): 1-15.

Madhad, V.J., Sentheil, K. P. 2014. The Rapid and Non-enzimatic Isolation of

DNA from The Human Peripheral Whole Blood Suitable for Genotyping.

India: Departement of Biotechnology Saurashtra University.

Maftuchah., Winaya, A., Zainudin, A. 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi

Molekuler. Sleman: Deepublish Publisher.

Marks, D.B. 2000. Biokimia kedokteran dasar: sebuah pendekatan klinis; alih

bahasa, Brahm U. Pendit; editor edisi bahasa Indonesia, Joko Suyono, Vivi

Sadikin, Lydia I. Mandera. Jakarta: EGC.

Moritz,C., Dowling,T.E., Brown,W.M. 1987. Evolution of Animal Mitochondrial

DNA: Relevance for Population Biology and Systematics. Annu. Rev.

Ecol. Syst.18:269–292.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor: IPB Press.

http://www.methodbook.net/

43


NanoDrop. 2007. ND-1000 Spectrophotometer V3.5 User’s Manual. Diunduh

pada 29 Agustus 2018 pukul 21.20 melalui http://nanodrop.com.

Ning, J., Liebich, J., Kastner, M., Zhou, J., Schaffer, A., Burauel, P. 2009.

Different influence of DNA purity indices and quantity on PCR-based

DGGE and functional gene microarray in soil microbial community study.

Appl Microbiol Biotechnol. 82:983-993.

Nugroho, E.D., Dwi, A.R. 2017. Pengantar Bioteknologi (Teori dan Aplikasi).

Ed.1, Cet.1. Yogyakarta: Deepublish.

Olson, N. D., Morrow, J. B. 2012. DNA extract characterization process for

microbial detection methods development and validation. BMC Research

Notes, 5, 668. Diunduh pada 21 Juli 2018 pukul 13.42 melalui

http://doi.org/10.1186/1756-0500-5-668.

Pardal, S.J. 2010. Menguji ekspresi gen menggunakan real time PCR. Warta

Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 32:13-14.

Rachmawati, P. 2012. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng Sapi

yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA

Menggunakan Real-time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Radji, M. 2011. Rekayasa Genetika. Jakarta: ISBN: 978-602-8674-40-9

Rettner, R. 2017. Article: DNA: Definition, structure dan discovery. Diunduh

pada 13 Maret 2018 pukul 14.35 melalui

https://www.livescience.com/37247-dna.html.

Rochec

. 2005. The LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master. Diunduh pada

21 Agustus 2018 pukul 17.20 melalui www.rocheapplied-science.

Rochee

. 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual. Diunduh

pada 2 September 2018 pukul 18.31 melalui www.rocheapplied-

science.com

Sambrook, J. 2006. The condensed protocols from molecular cloning: a

laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor

Laboratory Press.

Shipley, G.L. 2007. Quantitative Real-Time RT PCR. Research Department of

Integrative Biology & Pharmacology. University of Texas.

Siregar, R.A. 2017. Artikel: Polisi Ciduk Pengoplos Daging Sapi dan Babi di

Lubuklinggau. NewsDetik. Diunduh pada 13 Maret 2018 pukul 13.50

http://nanodrop.com/

https://www.livescience.com/37247-dna.html

http://www.rocheapplied-science/

http://www.rocheapplied-science.com/

http://www.rocheapplied-science.com/

44


melalui https://news.detik.com/berita/d-3519736/polisi-ciduk-pengoplos-

daging-sapi-dan-babi-di-lubuklinggau.

Soeparno. 2005. Ilmu dan Teknologi Daging. Yogyakarta: Gadjah Mada

University Press.

Solihin, D.D. 1994. Ulas balik Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi

keragaman genetic dan biologi populasi pada hewan. Bogor: FMIPA IPB.

ISSN 0854-8587.

Sulistyaningsih, E. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis

dan Manajemen Penyakit Infeksi. Jember: Laboratorium Fisiologi Fakultas

Kedokteran Universitas Jember.

Syukriani, Y.F. 2012. DNA Forensik. Bandung: Departemen Ilmu Kedokteran

Forensik dan Medikolegal Fakultas Kedokteran Unpad Rumah Sakit Dr.

Hasan Sadikin.

Syukur, M. 2017. Artikel: BBPOM Temukan Bakso Mengandung Babi di

Warung Terkenal Pekanbaru. Liputan6. Diakses pada 18 Maret 2018

pukul 12.45 melalui https://www.liputan6.com /bbpom-temukan-bakso-

mengandung-babi-di-warung-terkenal-pekanbaru.

Tanabe, S. 2007. A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork,

Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan: Setagaya-ku,

Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007

Teare, J.M., R. Islam., R. Flanagan., S. Gallagher., M.G Davies., C. Grabau. 1997.

Measurement of Nucleic Acid Concentrations Using the DyNA QuantTM

and the GeneQuantTM. BioTechniques 22: 1170-1174.

Utami, A. 2012. Variasi Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma

xanthorrhiza Roxb.). Bogor: Departemen Biokimia FMIPA ipb.

Wardani, A.K., Sari, E.P. 2015. Deteksi Molekuler Cemaran Daging Babi pada

Bakso Sapi di Pasar Tradisional Kota Malang Menggunakan PCR

(Polymerase Chain Reaction). Malang:Jurnal Pangan dan Agroindustri

Vol. 3 No 4 p. 1294-1301. Diunduh pada 3 April 2018 pukul 15.21.

Widyastuti, E. 2012. Sel Struktur dan Fungsi. Fakultas Teknologi Pertanian UB.

Diunduh pada 13 Maret 2018 pukul 14.13

Wilfinger, W.W., Mackey, K., Chomczynski, P. 2006. Assesing the quantity,

purity and integrity of RNA and DNA following nucleic acid purification.

In DNA sequencing II optimizing preparation and clean up. Edited by

Sudbury KJ. MA: Jones and Bartlett Publisher: 291-312.

45


Yancy, H. F., Washington, J. D., Callahan, L., Mason, J. A., Deaver, C. M.,

Farrell, D. E., et al. 2009. Development, Evaluation, and Peer Verification

of a Rapid Real-time PCR Method for the Detection of Animal Material.

Journal of Food Protection.

Yusuf, Z.K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek vol.5 No:6, 2010,

FIKK-Universitas Gorontalo.

Yuwono, T. 2009. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.

Zilhadia. 2017. Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam

Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR.

Jurnal Sains Farmasi & Klinis: 4(2): 16-23.

46


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian

Pengumpulan sampel bakso sapi secara

stratified random sampling

Isolasi DNA sampel bakso sapi,

daging babi dan daging sapi.

Cek kemurnian dan konsentrasi DNA

dengan Spektrofotometri DNA

Analisis DNA dengan Elektroforesis

Gel Agarosa

DNA terisolasi DNAtidak

terisolasi

Amplifikasi isolat DNA

menggunakan Real Time PCR

Analisis hasil amplifikasi

Kesimpulan

47


Lampiran 2. Alur kerja isolasi DNA menggunakan Genomic DNA

Purification Kit

48


Lampiran 3. Nilai konsentrasi dan kemurnian isolat DNA

Isolat DNA Konsentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280)

Daging segar

Daging sapi 1 28,563 1,64



Daging babi 1 3.068 1,54

Daging babi 2 8,044 1,32

Daging babi 3 76,635 1,49

Sampel Bakso

Bakso AW 1 29,463 1,15

Bakso AW 8 30,810 1,68

Bakso AW 15 9,785 1,50

Bakso BB 2 12,609 1,63

Bakso BB 9 167,235 1,59

Bakso BB 16 27,437 1,59

Bakso CR 3 23,692 1,60

Bakso CR 10 33,659 1,61

Bakso CR 17 22,631 1,70

Bakso WL 4 23,763 1,55

Bakso WL 11 29,742 1,62

Bakso WL 18 29,415 1,64

Bakso GN 5 7,277 1,09

Bakso GN 12 10,580 1,60

Bakso GN 19 3,118 1,45

Bakso R 6 19,588 1,75

Bakso R 13 33,462 1,65

Bakso R 20 29,385 1,59

BaksoWS 7 3,668 1,20

Bakso WS 14 34,350 1,59

Bakso WS 21 10,325 1,49

Ket. : isolat yang dirunning pada RT-PCR

49


Lampiran 4. Perbandingan pengenceran isolat DNA sampel, daging sapi dan

daging babi.

Isolat DNA Konsentrasi (ng/μl) Perbandingan

Pengenceran

Daging segar

Daging sapi 1 28,563 2:3

Daging babi 3 76,635 1:4

Sampel bakso

Bakso 8 30,810 2:3

Bakso 9 167,235 1:4

Bakso 10 33,659 2:3

Bakso 11 29,742 2:3

Bakso 12 10,580 3:2

Bakso 13 33,462 2:3

Bakso 14 34,350 2:3

Lampiran 5a. Hasil Uji Spesifitas Primer Babi dengan BLAST Melalui Database

NCBI

50


Lampiran 5b. Hasil Uji Spesifitas Primer Sapi dengan BLAST Melalui Database

NCBI

Lampiran 6. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

*) Suhu annealing yang digunakan biasanya 5◦C di bawah nilai Tm (Muladno,

2010)

Primer Sapi

Primer sapi forward

Tm = 2◦C (2+8) + 4◦C (2+8)

= 60◦C

Primer sapi reverse

Tm = 2◦C (5+8) + 4◦C (6+5)

= 70◦C

Tm rata-rata Primer sapi:

Tm = (60+70)/2

= 65◦C

Ta* = 60◦C

Primer Babi

Primer babi forward

Tm = 2◦C (6+5) + 4◦C (4+7)

= 66◦C

Primer babi reverse

Tm = 2◦C (8+7) + 4◦C (6+3)

= 66◦C

Tm rata-rata Primer babi:

Tm = (66+66)/2

= 66◦C

Ta* = 61◦C

Rumus : Tm = 2◦C (A+T) + 4◦C (G+C)

51


Lampiran 7a. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, NTC,

dan Bakso 1, Bakso2, Bakso 3, Bakso 4, Bakso 5 dan Bakso 7 dengan Primer Sapi

pada Suhu annealing 50◦C

Lampiran 7b. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan

NTC dengan Primer Sapi pada Suhu annealing 55◦C

52


Lampiran 7c. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan

NTC dengan Primer Sapi pada Suhu annealing 60◦C

Lampiran 8. Hasil Optimasi Suhu Annealing Primer Sapi Pada Suhu 65◦C

[Sumber: Zilhadia et al., 2017]

53


Lampiran 9. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer

1. Membuat larutan primer sapi 10 µm dari larutan induk 100 µm

V1.M1 = V2.M2

X . 100 µm = 100 µl . 10 µm

X = 1000/100

X = 10 µl

Maka diambil 10 µl dari larutan induk primer sapi lalu ditambahkan 90 µl

aquabidest.

2. Membuat larutan primer babi 5 µm dari larutan induk 100 µm

V1.M1 = V2.M2

X . 100 µm = 100 µl . 5 µm

X = 500/100

X = 5 µl

Maka diambil 5 µl dari larutan induk primer babi lalu ditambahkan 95 µl

aquabidest.

3. Menghitung volume primer sapi yang diambil dari larutan primer sapi 10

µm

Acuan konsentrasi primer yang digunakan yaitu berkisar antara 0,2-1 µm

(Roche, 2005), dipilih konsentrasi primer sapi yaitu 0,5 µm untuk tiap

primer forward dan reverse.

VI.M1 = V2.M2

X . 10 µm = 20 µl . 0,5 µm

X = 10/10

X = 1 µl

Maka, diambil 1 µl dari masing-masing primer forward dan primer

reverse.

4. Menghitung volume primer babi yang dia00000mbil dari larutan primer

babi 5 µm

Acuan konsentrasi primer yang digunakan yaitu berkisar antara 0,2-1 µm

(Roche, 2005), dipilih konsentrasi primer babi yaitu 0,25 µm untuk tiap

primer forward dan reverse

54


(Lanjutan lampiran 9)

V1.M1 = V2.M2

X . 5 µm = 20 µl . 0,25 µm

X = 5/5

X = 1 µl

Maka, diambil 1 µl dari masing-masing primer forward dan primer

reverse.

Lampiran 10a. Program Amplifikasi untuk Primer Babi

55


Lampiran 10b. Program Amplifikasi untuk Primer Sapi

56


Lampiran 11. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA

Konsentrasi Akhir Larutan

Induk

Jumlah yang

Digunakan

Primer forward 0,5 µm (primer sapi)

0,25 µm (primer babi)

10 µm 1 µl

Primer reverse 0,5 µm (primer sapi)

0,25 µm (primer babi)

10 µm 1 µl

LightCycler 480

SYBR Green I

- - 10 µl

ddH2O - - 3 µl

DNA template - - 5 µl

Total volume reaksi 20 µl

Lampiran 12. Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi, Daging babi, NTC

dan Sampel Bakso dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi.

57


Lampiran 13. Kurva Melting Peaks Pada Hasil Amplifikasi dengan Primer Sapi

Lampiran 14. Kurva Amplifikasi Isolat DNA Daging sapi, Daging babi, NTC

dan Sampel Bakso dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi

58


Lampiran 15. Kurva Melting Peaks Pada Hasil Amplifikasi dengan Primer Babi

Lampiran 16. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian

Spektrofotometri DNA Kit Ekstraksi (Promega)

Masker, Glove Mikrotips, Mikrosentrifuge, tube

59


Mikrosentrifugasi Vortex

Mikropipet (1) Vol 1000 µl; (2)

Vol 200 µl; (3) Vol 20 µl

Multiwell Plates, Sealing Foil

Real Time PCR

Timbangan Analitik

Mikrosentrifugase 5417R

Lemari pendingin suhu -21

Autoklav

60


Daging Babi

Daging Sapi

Etidium bromida Serbuk agarosa DNA marker

Chamber dan gel caster Alat elektroforesis

Gel documentation

Bakso sapi

uji deteksi cemaran daging babi pada bakso sapi di...

Documents