uji enumerasi (enumeration)

Acara II

ENUMERASI

LAPORAN RESMI PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI PANGAN

Disusun oleh :

Nama : Yeremia Adi Wijaya

NIM : 12.70.0152

Kelompok : E3

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATASEMARANG

2012

1. TUJUAN PRAKTIKUM

Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengetahui cara menghitung jumlah

koloni mikrobia dengan metode hitungan cawan (HC terdiri dari pour plate dan spread

plate) dan most probable number (MPN), mengetahui pengaruh pengenceran terhadap

jumlah koloni mikrobia, mengetahui perbedaan antara metode HC dan MPN,

mengetahui perbedaan antara pour plate dan spread plate, mengetahui fungsi dari

tabung Durham, mengetahui apa itu spreader, dan mengetahui mikroorganisme yang

dapat memecah LB.

2. TINJAUAN PUSTAKA

Teknik pengukuran secara kuantitatif suatu kultur mikroba yang digunakan untuk

menghitung jumlah mikroorganisme didalam suatu media didefinisikan sebagai

enumerasi. Pengukuran ini kuantitatif sering diperlukan didalam berbagai macam

penelaah mikrobiologi dimana pengukuran kuantitatif dibagi menjadi dua yaitu :

penentuan jumlah sel yang digunakan untuk organism yang bersel tunggal dan

penentuan massa sel yang dapat dilakukan tidak hanya untuk organisme bersel tunggal

tetapi juga organisme berfilamen. (Hadioetomo, 1993, 72:163). Perhitungan jumlah sel

dibagi hitungan mikroskopik langsung, hitungan cawan (HC), Most Propable Number

(MPN) sedangkan penentuan massa sel dibagi menjadi perhitungan volumetric,

gravimetric dan kekeruhan (turbidimetri). (Fardiaz, 1992, 118:308).

1. Metode Hitungan Cawan (HC)

Metode hitungan cawan mempunyai prinsip dimana jasad renik yang masih

hidup ditumbuhkan didalam media agar, yang kemudian mikroba tersebut akan

membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata. (Fardiaz, 1992, 123 :

320). Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan

hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi

indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik

pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan

mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi

dan kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk

1

2

penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi

30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung

dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor

pengenceran pada cawan bersangkutan. (Suriawiria, 2005, 101 : 172).

Hitungan cawan mempunyai kelemahan-kelemahan antara lain :

1. Hasil perhitungan tidak menunjukan sejumlah sel yang sesungguhnya

karena beberapa sel yang saling berdekatan mungkin membentuk satu

koloni.

2. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama.

3. Mikrobia yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan

membentuk koloni yang kompak dan jelas serta tidak menyebar

4. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang

berbeda.

(Fardiaz, 1992, 124:320)

Metode hitungan cawan dibedakan menjadi dua jenis yaitu metode tuang (pour

plate) dan metode permukaan (spread plate).

Metode pour plate

Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk

mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah

membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak

memerlukan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan

menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Pengenceran

dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal. Pengeceran

yang umum dilakukan adalah 10-1 hingga 10-8, walaupun pada tipe sampe

tertentu jarak tersebut dapat dilanggar. Sebagai contoh air yang tidak keruh,

pengenceran maksimal yang diperlukan adalah 10-6 karena diketahui jika ada 10-

7 atau lebih bakteri per milliliter, air akan menjadi keruh. Pada metode ini

inokulum mikroorganisme dicampur dengan agar cair (45°C - 50°C) sehingga

bakteri tercampur relatif merata pada media padat. Meskipun demikian tidak

3

semua bakteri dapat hidup pada temperature 45°C, dimana hal ini menunjukan

kelemahan dari prosedur ini. (Harmita & Radji, 2008, 127:171)

Metode Spread Plate

Metode spread plate merupakan salah satu teknik dari hitungan cawan yang

dilakukan dengan cara menyebarkan sampel yang telah diencerkan diatas

permukaan pelat agar didalam cawan petri. Umumnya antara 0,1 ml dan 1 ml

sampel disebarkan dipermukaan media padat dengan menggunakan hockey stick

steril. (Harmita & Radji, 2008, 129:171).Dalam metode ini pertumbuhan dari

koloni dipermukaan medium lebih banyak dibandingkan dengan metode pour

plate dimana biasanya metode ini pertumbuhan koloninya terlihat lebih sedikit

dan pertumbuhan koloninya terdapat didalam mediumnya. Lebih banyaknya

kolomi didalam metode spread plate disebabkan karena sampel yang

mengandung mikroba dituangkan kedalam medium yang padat sehingga antara

medium dengan sampel tidak akan bercampur dan juga koloni mikroba hanya

akan terbentuk pada bagian atas agar padat maka dari itu, pertumbuhan mikroba

yang terdapat dalam metode spread plate dapat lebih mudah diamati dan untuk

metode pour plate mikroba yang terkandung dalam sampel dengan medium akan

bercampur (Suriawiria, 2005, 105:172).

Metode perhitungan dengan melalui pengenceran dan ditumbuhkan pada media

mempunyai keuntungan karena cara ini mudah dan murah tanpa harus menggunakan

peralatan yang khusus yang kadang mahal, serta dari koloni biakan yang tumbuh dapat

diteruskan untuk pengamatan atau penelitian lebih lanjut. Selain itu juga mempunyai

kerugian yaitu bahwa sel yang terhitung adalah masih hidup, sedang yang sudah mati

tidak terhitung. (Suriawiria, 2005, 101 : 172).

Perhitungan jumlah koloni dapat dilakukan dengan menggunakan Quebec colony

counter dan dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

(Fardiaz, 1992, 125:320).

npengenceraFaktorcawanperkoloniJumlahmlperKoloni

1

4

Didalam perhitungan pour plate dan spread plate ada yang disebut sebagai spreader

yaitu suatu kondisi dimana jumlah koloni yang terbentuk lebih dari 300 koloni. Koloni

dihitung menjadi satu koloni bila koloni yang bergabung menjadi satu atau merupakan

koloni besar dimana jumlah koloninya. Selain itu suatu rantai koloni yang membentuk

suatu garis tebal juga dapat dianggap sebagai satu koloni. Hal yang mempengaruhi

kondisi ini antara lain jumlah kultur yang digunakan, tingkat pengenceran, maupun

tingkat keaseptisan lingkungan. (Waluyo,2010, 211:305).

2. Metode Mikroskopik Langsung

Merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengamati struktur sel yang masih

hidup maupun yang sudah mati. Sel yang akan diamati diletakkan pada

hemasitometer dan pengamatan dapat dilakukan dengan menggunakan mikroskop.

Metode ini biasa dilakukan dengan menggunakan coulter counter. (Hadioetomo,

1993, 72 : 163). Metode hitungan mikroskopik langsung dibagi menjadi dua yaitu

metode Petroff-Hauser dan metode Breed. (Fardiaz, 1992, 119: 320).

Keuntungan dari metode ini adalah :

Metode yang mudah dilakukan, cepat dan sederhana serta membutuhkan

peralatan yang sedikit.

Morfologi bakteri dapat diamati bersamaan saat dihitung.

Dapat digunakan untuk menghitung suspensi yang sangat padat

Kekurangan dari metode ini adalah :

Sel mati tidak dapat dibedakan dengan sel hidup

Sel yang berukuran sangat kecil sangat susah dihitung, dan dapat

terlewatkan

Presisinya susah dicapai

tidak cocok untuk sel dengan tingkat kepadatan yang rendah

Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam bahan harus cukup

tinggi

(Fardiaz, 1992, 122-123 : 320)

5

3. Metode MPN (Most Probable Number)

Metode MPN merupakan metode dengan menggunakan medium cair dalam

tabung reaksi dan perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung reaksi

yang positif yang ditandai dengan tumbuhnya jasad renik setelah diinkubasi

pada suhu dan waktu tertentu. (Fardiaz, 1992, 126-127 : 320).

Media yang digunakan didalam metode ini adalah Lactose broth, dimana lactose

broth biasa digunakan untuk menumbuhkan dan mendeteksi keberadaan dari

bakteri koliform dan Salmonella dalam makanan, air, dan hasil ternak juga

digunakan untuk mendekteksi bakteri pemecah laktosa. (Merck & Darmstadt,

1998, 70 : 133). Didalam metode MPN didalam tabung reaksi biasa digunakan

tabung durham. Tabung Durham merupakan tabung yang mempunyai bentuk

yang serupa dengan tabung reaksi hanya mempunyai ukuran yang lebih kecil.

Dalam penggunaannya tabung durham diletakkan secara terbalik dalam tabung

reaksi. Bila mikroba yang ditumbuhkan didalam media tersebut menghasilkan

gas maka gas tersebut akan terkumpul dan tampak sebagai gelembung pada

tabung durham dimana gelembung atau gas. Gas yang biasa dihasilkan oleh

mikroba adalah CO2 dan H2 dan keberadaan gas CO2 inilah yang menyebabkan

kekeruhan. Kekeruhan dan keberadaan gas atau gelembung ini menunjukan

tabung reaksi yang positif. (Bartram & Pedley, 1996).

Contoh perhitungan metode MPN misalnya pada pengenceran pertama 3 tabung

menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran kedua tabung 2 tabung

positif, pada pengenceran ketiga 1 tabung positif, dan pada pengenceran terakhir

tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0, dan jika diambil 3

pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini

kemudian dicocokan dengna tabel MPN

Rumus yang digunakan didalam perhitungan MPN adalah :

MPN sampel = Nilai MPN dari tabel × 1pengenceran tabung tengah

(Waluyo, 2010, 213-214 : 305)

6

SPC (Standart Plate Count) merupakan suatu standart perhitungan yang biasa

digunakan didalam analisa mikrobiologi dimana Standart Plate Count menjelaskan

tentang cara perhitungan koloni dalam cawan serta pemilihan data yang ada yang

digunakan untuk menghitung suatu jumlah koloni yang ada didalam suatu contoh.

Aturan didalam melaporkan data sebagai SPC adalah :

1. Data yang dilaporkan harus terdiri dari dua angka

2. Apabila pengenceran yang dibuat menunjukan hasil kurang dari 30 koloni maka

hanya jumlah koloni yang terendah yang dihitung

3. Apabila pengenceran yang dibuat menghasilkan lebih dari 300 koloni maka

hanya pengenceran yang tertinggi yang dihitung.

4. Apabila hasil yang ditunjukan ada diantara 30 dan 300 dengan perbandingan

pengenceran tertinggi dan terendah sama dengan 2 atau lebih kecil maka yang

dihitung rata-rata dari kedua nilai pengenceran tersebut dan apabila

perbandingannya menunjukan lebih dari 2 maka pengenceran yang terkecil yang

dilaporkan

5. Bila menggunakan system duplo per pengenceran, data yang diambil harus dari

kedua cawan tersebut dan tidak boleh salah satu.

(Fardiaz, 1992, 126 : 320)

Pengenceran merupakan suatu peristiwa penurunan molaritas larutan dengan

penambahan volume larutan. (Chang, 2005, 108:433). Dalam perhitungan cawan

apabila bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel jasad renik per

ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan)

memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar dalam

cawan petri yang kemudian diinkubasi dan terbentuk koloni pada cawan dalam jumlah

yang dapat dihitung. Jumlah koloni yang baik adalah antara 30 hingga 300 koloni.

Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal seperti 1:10 atau 1:100 dan seterusnya

dimana hal ini dilakukan dengan tujuan untuk mempermudah perhitungan. semakin

tinggi seri pengencerannya maka akan tampak bahwa titik-titik koloni yang terbentuk

semakin jelas dan menyebar rata baik pada permukaan, di bawah, dan di dalam media

(Waluyo, 2010, 210:305). Larutan yang umum digunakan didalam pengenceran adalah

7

larutan garam fisiologi 0,85% atau larutan ringer, larutan buffer fosfat. (Fardiaz, 1992,

124 : 320).

Steril merupakan suatu keadaan dimana tidak adanya kontaminasi oleh mikroorganisme

yang tidak diharapkan baik pada peralatan maupun bahan yang digunakan didalam

percobaan mikrobiologi. (Suriawiria, 2005, 79:172).

Media NA (Nutrient Agar) Merupakan media pertumbuhan mikrobiologi yang

umumnya digunakan untuk budidaya bakteri non-fastidious, dan digunakan untuk

menguji air dan juga produk diary. Selain itu NA juga dapat digunakan untuk

menganalisa bakteri dalam air yang biasanya digunakan untuk mengisolasi bakteri

koliform. (Merck & Darmstad, 1998, 73 : 133). NA merupakan media padat yang

disebabkan karena adanya agar sebagai zat pemadat, selain itu NA juga tetap dalam

bentuk bentuk padat meski berada pada suhu yang relatif tinggi. Bakteri yang

ditumbuhkan pada media NA tumbuh pada bagian permukaannya dan tampak sebagai

koloni kecil. (Lapage et al, 1970, 4:357). Dalam Nutrient Agar mengandung : 0,5%

pepton, 0,3% ekstrak daging sapi, 1,5% agar, 0,5% NaCl dan mempunyai akhir pH 8,0

(Lapage et al, 1970, 117:357).

Media LB (Lactose Broth) biasa digunakan untuk menumbuhkan dan mendeteksi

keberadaan dari bakteri koliform dan Salmonella dalam makanan, air, dan hasil ternak

juga digunakan untuk mendekteksi bakteri pemecah laktosa. Lactose Broth memiliki

komposisi yaitu 10 gram pepton dan laktosa, 5 gram garam dapur, 3 gram ekstrak

daging sapi dan 0,02 gram bromocresol purple yang dilarutkan dalam 1 liter air suling.

Ekstrak daging sapi dan pepton digunakan sebagai nutrisi essensial untuk metabolisme

bakteri dan laktosa digunakan sebagai sumber karbohidrat. (Merck & Darmstadt, 1998,

70 : 133).

3. MATERI METODE

3.1. Materi

3.1.1. Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi,

tabung durham, kapas, bunsen, korek api, cawan petri steril, pemanas elektrik, jarum

ose, vortex, kertas pembungkus, pipet, masker, colony counter, inkubator 30°C-32°C,

erlenmeyer, dan neraca.

3.1.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah aquades, alkohol, kultur Acetobacter

aceti, media NA cair, media Lactose Broth, air kolam udang.

3.2. Metode

3.2.1. Pengenceran Kultur

Mula-mula sebanyak 10 ml aquades yang sudah disterilkan ditambahkan kedalam

tabung reaksi bersama dengan kultur Acetobacter aceti kemudian tabung tersebut

divortex hingga didapatkan pengenceran 100. Dari pengeceran tersebut diambil 1 ml

kemudian dituangkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril lalu

divortex lagi dan didapatkan pengenceran 10-1 untuk kelompok 1. Lalu dari hasil

pengenceran 10-1 tersebut diambil lagi sebanyak 1 ml dan ditambahkan kedalam tabung

reaksi yang berisi 9 ml aquades steril dan di vortex lagi sehingga didapatkan

pengenceran 10-2 untuk kelompok 2. Pengenceran dilanjutkan hingga mendapatkan

pengeceran 10-6 .

3.2.2. Metode Hitungan Cawan

3.2.2.1. Metode Pour Plate

Sebanyak 1 ml kultur Acetobacter aceti diambil dari masing-masing pengenceran dan

dimasukan kedalam cawan petri dan diputar-putar hingga merata. Kemudian media

yang sudah disterilkan dan duturunkan suhunya dituangkan kedalam cawan petri dan

diputar-putar hingga merata, setelah itu biarkan sejenak hingga medianya memadat dan

bungkus kembali dengan kertas buram. Setelah dibungkus, diinkubasikan pada selama

8

9

24 jam dengan posisi terbalik. Setelah proses inkubasi selesai amati dan hitung jumlah

koloni per ml dengan menggunakan rumus :

Koloni per ml = Jumlah koloni per cawan × 1Faktor pengenceran

3.2.2.2. Metode Spread Plate

Mula-mula tuangkan media LB kedalam cawan petri kemudian tunggu hingga

memadat. Setelah memadat ambil kultur Acetobacter aceti sebanyak 1 ml dari masing-

masing pengenceran dan dimasukan kedalam cawan petri, lalu cawan petri diputar-putar

untuk meratakan kulturnya lalu cawan tersebut dibungkus dengan menggunakan kertas

buram dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah proses inkubasi amati hasilnya dan

hitung jumlah koloni dan jumlah koloni per ml nya dengan menggunakan rumus :

Koloni per ml = Jumlah koloni per cawan × 1Faktor pengenceran

3.2.2.3. Metode Most Probable Number (MPN)

Mula-mula siapkan 9 buah tabung reaksi yang berisi media LB dan diisi dengan tabung

durham. Pada saat memasukan tabung durham pastikan tidak terdapat gelembung pada

tabung durham dan apabila terdapat gelembung maka percobaan harus diulang. Setelah

itu media disterilisasi dan diturunkan suhunya. Kemudian pada masing-masing tabung

ditambahkan 1 ml sampel air kolam udang; 3 tabung pertama diisi dengan pengenceran

10-1, 3 tabung kedua diisi dengan pengenceran 10-2, 3 tabung ketiga diisi dengan

pengenceran 10-3. Setelah selesai semua tabung tersebut diinkubasi selama 1 hari dan

keberadaan gelembung pada masing-masing tabung tersebut diamati. Apabila pada

10

tabung durham dengan pengenceran 10-1 hanya terdapat 1 gelembung maka pada hasil

pengamatan kolom 10-1 ditulis 1, apabila hasilnya terdapat 2 gelembung maka pada

hasil pengamatan ditulis 2 dan seterusnya. Setelah didapatkan hasilnya, ketiga angka

tersebut dicocokan dengan tabel nilai MPN untuk 3 seri tabung.

4. HASIL PENGAMATAN

4.1. Metode Spread Plate

Hasil pengamatan metode spread plate dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Metode Spread Plate

Kelompok Pengenceran Jumlah koloni/ml

E1 10-1 Spreader

E2 10-2 Spreader

E3 10-3 Spreader

E4 10-4 Spreader

E5 10-5 37 x 105

E6 10-6 11 x 106

Pada Tabel 1 dapat dilihat hasil perhitungan jumlah koloni per ml yang dilakukan oleh

kelompok E1 – E4 dengan menggunakan pengenceran 10-1 - 10-4 didapatkan hasil

spreader. Kelompok E5 dengan menggunakan pengenceran 10-5 didapatkan hasil 37 x

105. Kelompok E6 dengan menggunakan pengenceran didapatkan 10-6 hasil 11 x 106.

4.2. Metode Pour Plate

11

12

Hasil pengamatan metode pour plate dapat dilihat pada tabel 2.

Tabel 2. Metode Pour Plate

Kelompok Pengenceran Jumlah koloni / ml

E1 10-1 Spreader

E2 10-2 Spreader

E3 10-3 Spreader

E4 10-4 Spreader

E5 10-5 117 x 105

E6 10-6 50 x 106

Pada tabel 2 dapat dilihat hasil perhitungan jumlah koloni per ml yang dilakukan oleh

kelompok E1 – E4 dengan menggunakan pengenceran 10-1 - 10-4 didapatkan hasil

spreader. Kelompok E5 dengan menggunakan pengenceran 10-5 didapatkan hasil 117 x

105. Kelompok E6 dengan menggunakan pengenceran 10-6 didapatkan hasil 50 x 106.

4.3. Metode Most Probable Number (MPN)

Hasil pengamatan metode most probable number (MPN) dapat dilihat pada tabel 3.

Tabel 3. Metode Most Probable Number (MPN)

KelompokTabung Positif

MPN number

Keterangan

13

E1 3 3 2 53

Positif : keruh dan ada

gelembung

Negatif : jernih, tidak

ada gelembung

E2 3 3 1 160


gelembung


ada gelembung

E3 3 2 1 150


gelembung


ada gelembung

E4 3 0 3 95


gelembung


ada gelembung

E5 3 2 0 93


gelembung


ada gelembung

E6 3 1 1 75 Positif : keruh dan ada

14

gelembung


ada gelembung

Pada tabel 3 dapat dilihat bahwa pada kelompok E1 pada pengenceran 10-1 didapatkan

3 tabung positif, pada pengenceran 10-2 didapatkan 3 tabung positif, dan pada

pengenceran 10-3 didapatkan 2 tabung positif dengan nilai MPN 53. Pada kelompok E2

pada pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada pengeceran 10-2 didapatkan

3 tabung positif dan pada pengenceran 10-3 didapatkan 1 tabung positif nilai MPN 160.

Pada kelompok E3 pada pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada

pengenceran 10-2 didapatkan 2 tabung positif, pada pengenceran 10-3 didapatkan 1

tabung positif nilai MPN 150. Pada kelompok E4 pada pengenceran 10-1 didapatkan 3

tabung positif, pada pengenceran 10-2 didapatkan 0 tabung positif, dan pada

pengenceran 10-3 didapatkan 3 tabung positif nilai MPN 95. Pada kelompok E5 pada

pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada pengenceran 10-2 didapatkan 2

tabung positif, dan pada pengenceran 10-3 didaptkan 0 tabung positif nilai MPN 93.

Pada kelompok E6 pada pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada

15

pengenceran 10-2 didapatkan 1 tabung positif, dan pada pengenceran 10-3 didapatkan 1

tabung positif nilai MPN 7.

5. PEMBAHASAN

Didalam melakukan praktikum enumerasi keaseptisan adalah salah satu hal yang perlu

diperhatikan dimana hal ini dilakukan dengan tujuan untuk menghindari terjadinya

kontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan. (Suriawiria, 2005, 79:172).

Keaseptisan ini dapat dilakukan dengan menyemprotkan tangan dengan menggunakan

alkohol sebelum melakukan pengambilan kultur, menggunakan masker, dan selalu

mendekatkan tabung reaksi dan peralatan yang digunakan dekat dengan api bunsen.

Pada praktikum ini dilakukan tiga jenis percobaan yaitu metode pour plate, metode

spread plate dan metode most probable number (MPN). Berdasarkan pada teori yang

dikatakanoleh Fardiaz (1992, 118:308) yang mengatakan bahwa perhitungan jumlah sel

terdiri dari hitungan mikroskopik langsung, hitungan cawan dan most probable number

(MPN) maka dapat disimpulkan bahwa semua percobaan ini dilakukan untuk

menghitung jumlah sel.

5.1. Pengenceran Kultur

16

17

Pada percobaan ini mula-mula yang dilakukan adalah mencampurkan kultur

Acetobacter aceti dengan 10 ml aquades steril, setelah dicampurkan kemudian kultur

tersebut dipanen dengan menggunakan jarum ose yang sudah dipijarkan pada nyala api

bunsen dan dipindahkan pada tabung reaksi lain lalu divortex. Vortex dilakukan dengan

tujuan mencampurkan kultur tersebut dengan aquadesnya. Pada saat pemanenan kultur

dilakukan secara aseptis untuk mencegah terjadinya kontaminasi, pemanasan jarum

osepun dilakukan dengan tujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Setelah

divortex maka akan didapatkan pengenceran 100. Dari pengenceran 100 tersebut

diambil 1 ml dan pindahkan kedalam tabung reaksi yang sudah berisi aquades steril 9

ml kemudian di vortex. Setelah divortex maka akan didapatkan pengenceran 10-1 dan

dilanjutkan hingga 10-6. Prosedur pengenceran yang dilakukan ini sesuai dengan teori

yang dikatakan oleh Chang (2005, 108:433) yang mengatakan bahwa pengenceran

merupakan suatu peristiwa penurunan molaritas larutan dengan penambahan volume

larutan. Pengenceran yang semakin rendah ini dilakukan dengan tujuan supaya koloni

bakteri dapat terlihat lebih jelas sesuai dengan teori yang dikatakan oleh Waluyo (2010,

210:305) yang mengatakan bahwa semakin tinggi seri pengenceran maka titik koloni

18

yang terbentuk akan tampak semakin jelas dan menyebar rata baik pada permukaan,

dibawah maupun didalam media. Selain itu pengenceran yang dilakukan juga

menggunakan desimal sesuai dengan yang dikatakan oleh Fardiaz (1992, 124:308) yang

mengatakan bahwa pengenceran umumnya dilakukan secara desimal.

5.2. Metode Hitungan Cawan

Didalam metode hitungan cawan ini percobaan yang dilakukan adalah dengan metode

pour plate dan spread plate. Kedua metode ini dilakukan karena menurut Fardiaz (1992,

124-125:320) menyatakan bahwa metode hitungan cawan (HC) dibagi menjadi dua

yaitu metode pour plate dan metode spread plate.

Menurut Fardiaz (1992, 124:320) mengatakan apabila metode perhitungan cawan ini

merupakan metode perhitungan yang sensitif untuk menentukan jumlah mikroba karena

hanya sel hidup saja yang dapat dihitung, beberapa jenis mikrobanya dapat dihitung

sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia. Perhitungan dari

metode hitungan cawan ini, baik metode spread plate maupun pour plate dapat dihitung

dengan menggunakan Quebec Colony Counter. (Fardiaz, 1992, 125:320)

19

5.2.1. Metode Spread Plate

Menurut Harmita & Radji (2008, 129:171) metode spread plate merupakan salah satu

teknik dari hitungan cawan yang dilakukan dengan cara menyebarkan sampel yang telah

diencerkan pada permukaan pelat agar didalam cawan petri. Hal ini sesuai dengan

percobaan yang dilakukan dimana mula-mula 1 ml kultur Acetobacter aceti pada

masing pengenceran dituangkan kedalam cawan petri yang sudah mengandun media

yang sudah memadat. Media yang digunakan didalam metode spread plate ini adalah

Lactose Broth (LB), digunakannya Lactose Broth (LB) dikarenakan mengandung unsur-

unsur yang sesuai dengan kebutuhan dari kultur Acetobacter aceti sendiri.

Pada hasil pengamatan yang dilakukan oleh kelompok E1 – E4 didapatkan jumlah

koloni berupa spreader. Spreader menurut Waluyo (2010, 211:305) didefinisikan

sebagai suatu kondisi dimana jumlah koloni yang terbentuk lebih dari 300 koloni.

Keadaan spreader ini bisa disebabkan oleh beberapa hal yang menurut waluyo (2010,

211:305) antara lain adalah jumlah kultur yang digunakan, tingkat pengenceran, juga

tingkat keaseptisan. Kemudian pada kelompok E5 didapatkan hasil 117 x 105 dan pada

kelompok 6 didapatkan hasil 11 x 106. Berdasarkan hasil yang didapatkan oleh

20

kelompok E5 dan E6 maka dapat disimpulkan bahwa pengenceran akan membuat

jumlah koloni per ml nya semakin sedikit.

5.2.2. Metode Pour Plate

Menurut Harmita & Radji (2008, 129:171) metode pour plate ini mempunyai

kelemahan dimana mebutuhkan waktu dan bahan yang relatif lama dan banyak akan

tetapi tidak terlalu membutuhkan ketrampilan tinggi.

Metode pour plate ini dilakukan dengan menuangkan 1 ml kultur Acetobacter aceti

kedalam cawan petri bersama dengan media yang sudah disterilkan dan diturunkan

suhunya. Media yang digunakan didalam metode pour plate ini adalah NA (Nutrient

Agar). Penggunaan NA sebagai media dikarenakan mengandung komponen yang

mendukung perkembang biakan dari kultur Acetobacter aceti sendiri. NA menurut

Lapage et al (1970, 117:357) merupakan media padat yang disebabkan karena adanya

penambahan zat pemadat. Dan baktei yang ditumbuhkan didalam media ini akan

tampak sebagai suatu koloni kecil.

21

Berdasarkan pada hasil pengamatan yang dilakukan oleh kelompok E1 – E4 didapatkan

hasil spreader. Kondisi spreader ini menurut waluyo (2010, 211:305) disebabkan oleh

antara lain adalah jumlah kultur yang digunakan, tingkat pengenceran, juga tingkat

keaseptisan. Sedangkan pada kelompok E5 mendapatkan hasil 117 x 105 dan pada

kelompok E6 mendapatkan hasil 50 x 106. Jumlah koloni per ml yang didapat oleh

kelompok E5 dan E6 ini menunjukan bahwa pengenceran didalam metode pour plate

akan mempengaruhi jumlah koloni per ml nya dimana semakin banyak pengenceran

yang dilakukan maka jumlah koloni per ml nya pun akan semakin sedikit.

Berdasarkan pada perbandingan hasil antara spread plate dan pour plate didapatkan

hasil dimana jumlah pada pour plate lebih banyak dibandingkan pada metode spread

plate. Hal ini tentu tidak sesuai dengan teori yang dikatakan oleh Suriawiria (2005,

105:172) yang mengatakan bahwa metode spread plate akan menghasilkan jumlah

koloni yang lebih banyak dibandingkan metode pour plate dimana banyaknya jumlah

koloni pada metode spread plate disebabkan karena sampel yang dicampurkan kedalam

suatu media padat. Kesalahan pada hasil yang didapatkan ini bisa disebabkan oleh

jumlah kultur yang digunakan dimana seharusnya penggunaan kultur sebanyak 1 ml

22

akan memberikan hasil spreader, akan tetapi pada percobaan ini tetap dianggap dapat

dihitung, hal ini sangatlah subjectif karena pandangan seseorang terkadang berbeda-

beda.

Berdasarkan percobaan spread plate dan pour plate keduanya mempunyai kelebihan dan

juga kelemahan. Untuk seorang yang masih dalam tahap belajar akan lebih baik bila

menggunakan metode pour plate karena meskipun membutuhkan waktu yang relatif

lama akan tetapi metode ini tidak begitu membutuhkan keterampilan (Harmita & Radji,

2008, 129:171). Hal ini tampak pada materi metode yang dilakukan, pada metode

spread selain dibutuhkan ketelitian didalam melakukan pengenceran, waktu yang

dibutuhkan untuk memadatkan medianya juga lebih lama dibandingkan metode pour

plate karena pada metode spread plate digunakan media LB yang pada dasarnya adalah

media cair.

5.3. Metode Most Probable Number (MPN)

Menurut Fardiaz (1992, 126-127:320) mengatakan bahwa metode MPN merupakan

metode dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi. Teori yang dikatakan

23

ini sesuai dengan metode yang dilakukan dimana pertama-tama menyiapkan 9 tabung

reaksi yang berisi media LB (Lactose Broth) dan diberi tabung durham. Dimana LB

(Lactose Broth) merupakan media cair yang disebabkan karena tidak adanya zat

pemadat. Tabung durham menurut Bartram & Pedley (1996) adalah tabung yang

mempunyai bentuk yang serupa dengan tabung reaksi hanya saja mempunyai ukuran

yang lebih kecil. Tabung durham ini digunakan sebagai penanda adanya reaksi positif

pada tabung reaksi dimana reaksi positif ini ditandai dengan adanya gelembung atau gas

dan kekeruhan. Menurut Bartram & Pedley (1996) gas ini dihasilkan oleh mikroba

dimana gas yang terbentuk adalah CO2 dan H2. Keberadaan dari gas CO2 inilah yang

menyebabkan kekeruhan. Didalam percobaan ini dilakukan 3 dari tabung reaksi yang

berisi media tersebut diisi dengan 1 ml sampel yang berasal dari pengenceran yang

berbda-beda, pengenceran ini bertujuan sesuai dengan nama metodenya yaitu untuk

mengetahui berapa nilai MPN berdasrkan kemungkinan yang ada yang didapatkan

berdasarkan kombinasi tabung reaksi positif yang dihasilkan oleh ketiga tabung

tersebut. Sampel yang digunakan disini adalah air kolam udang. Setelah dilakukan

pengenceran kemudian semua tabung reaksi diinkubasikan dengan tujuan untuk

24

membiakan mikroorganisme yang terkandung didalam air kolam udang tersebut.

Mikroorganisme yang menghasilkan gas berasal dari air kolam udang tersebut.

Berdasarkan pada hasil pengamatan yang dilakukan didapatkan hasil nilai MPN dari E1

– E6 adalah 53, 160, 150, 95, 93, 75. Nilai-nilai MPN ini menunjukan jumlah mikroba

yang tumbuh atau membentuk koloni. Pada hasil pengamatan ada yang jumlah

gelembungnya 0 (reaksi negatif) dan tampak jernih. Hal ini sesuai dengan teori yang

dikatakan oleh Bartram & Pedley (1996) yang mengatakan bahwa tabung reaksi yang

positif akan ditandai dengan terbentuknya gelembung atau gas serta tampak keruh.

Berdasarkan pada percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode MPN

mempunyai kelemahan dimana untuk mendapatkan ketelitian yang tinggi maka

dibutuhkan jumlah seri tabung yang banyak, akan tetapi metode ini juga mempunyai

kelebihan dimana hasil yang didapatkan lebih akurat dibandingkan dengan

menggunakan metode hitungan cawan karena dalam metode hitungan cawan sangat

sensitif dalam menghitung jumlah mikroba dan banyak hal yang mempengaruhi yang

membuat keakuratannya menurun.

6. KESIMPULAN

Perhitungan jumlah koloni pada metode hitungan cawan dilakukan dengan

menggunakan quebec colony counter.

Dikatakan spreader pada metode hitungan cawan apabila jumlah koloni yang

terbentuk lebih dari 300 koloni.

Spreader dapat disebabkan oleh faktor pengenceran, jumlah kultur yang digunakan

dan tingkat keaseptisannya

Metode spread plate dan pour plate mempunyai perbedaan pada media yang

digunakan dan jumlah koloni yang dihasilkan, dimana spread plate akan

menghasilkan jumlah koloni lebih banyak dari pour plate.

Metode pour plate merupakan metode yang lebih mudah dilakukan daripada

metode spread plate karena tidak terlalu membutuhkan keterampilan.

Metode MPN merupakan metode yang dilakukan dengan mencocokan

kemungkinan yang ada berdasarkan tabung reaksi yang positif

Metode MPN dilakukan dengan menggunakan Lactose Broth yang merupakan

media cair.

Tabung durham merupakan tabung yang serupa dengan tabung reaksi hanya

berukuran lebih kecil

Tabung durham digunakan sebagai alat bantu didalam menunjukan adanya suatu

reaksi positif didalam tabung reaksi.

Reaksi positif dalam metode MPN ditandai dengan munculnya gelembung dan

adanya kekeruhan.

Gas yang terbentuk didalam metode MPN adalah gas CO2 dan H2

Pengenceran mempengaruhi jumlah koloni yang terbentuk dimana semakin banyak

faktor pengenceran yang dilakukan maka jumlah koloni yang terbentuk juga akan

semakin sedikit.

Metode hitungan cawan merupakan metode yang sangat sensitif oleh berbagai

macam faktor oleh karena kurang akurat apabila dibandingkan dengan metode

MPN.

25

26

Didalam tiap percobaan enumerasi aseptis adalah salah satu faktor yang paling

mempengaruhi.

Semarang, 5 Juni 2013 Asisten Dosen :

Yeremia Adi Wijaya - Stefany Widjaya

12.70.0152 - Seteven George

7. DAFTAR PUSTAKA

Bartram, J. & Pedley, S.(1996). Microbiological Analyses. Published on behalf of United Nations Environment Programme and the World Health Organization

Chang, R. (2003). Kimia Dasar : Konsep-Konsep Inti edisi ketiga. Erlangga. Jakarta.

Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan I. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hadioetomo, R.S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Harmita, A & Radji M. (2008). Analisis Hayati edisi 3. EGC. Jakarta.

Lapage, S ; Shelton, J & Mitchell,T. (1970). Methods in Microbiology', Norris J. and Ribbons D edition. Vol. 3A. Academic Press. London

Merck, E. & Darmstadt. ( 1998 ). Handbook of microbiology 1st Suplement. Federal Republic Germany.

Suriawiria, U. (2005). Mikrobiologi Dasar. Penerbit Papas Sinar Sinanti. Jakarta.

Waluyo, L. (2010).Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi.UMM Press.Malang.

27

8. LAMPIRAN

8.1. Perhitungan

8.1.1. Metode Spread Plate

Kelompok E1 :

Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1

Faktor Pengenceran

Jumlah koloni per ml=Spreader x1

10−1

Jumlah koloni per ml=Spreade r

Kelompok E2 :


Faktor Pengenceran


10−2

Jumlah koloni per ml=Spreader

Kelompok E3 :


Faktor Pengenceran


10−3


Kelompok E4 :

Jumlah kolo∋ per ml=Jumlah koloni x1

Faktor Pengenceran


10−4


Kelompok E5 :

28

29


Faktor Pengenceran

Jumlah koloni per ml=37 x1

10−5

Jumlahkoloni per ml=¿ 37 x105

Kelompok E6 :

Jumlah koloni per ml=J umlah koloni x1

Faktor Pengenceran


10−6

Jumlah koloni per ml=37 x 106

8.1.2. Metode Pour Plate

Kelompok E1 :

Jumlah koloni per ml=Jumlahko loni x1

Faktor Pengenceran


10−1


Kelompok E2 :


Fak tor Pengenceran


10−2


Kelompok E3 :


Faktor Pengen ceran


10−3


30

Kelompok E4 :


Faktor Pengenceran


10−4


Kelompok E5 :


Faktor Pengenceran


10−5


Kelompok E6 :


Faktor Pengenceran


10−6


8.1.3. Metode Most Probable Number (MPN)

Kelompok E1 :

MPN Count=Nilai MPN x1

Pengencerantabung yangditengah

MPN Count=53 x1

10−2

MP N Count=5,3 x 103

Kelompok E2 :



MPN Count=160 x1

10−2

MPN Count=1,6 x 104

31

Kelompok E3 :

MPN Count=Nilai MP N x1


MPN Count=150 x1

10−2

MPN Count=1,5 x 104

Kelompok E4 :



MPN Count=95 x1

10−2

MPN Count=9,5 x103

Kelompok E5 :



MPN Count=93 x1

10−2

MPN Count=9,3 x103

Kelompok E6 :



MPN Count=75 x1

10−2

MPN Count=7,5 x 103

8.2. Tabel MPN

8.3. Laporan Sementara

uji enumerasi (enumeration)

Documents