UJI MUTAGEN(AMES TEST)

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy ITB

Pendahuluan

Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawakarsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, polutan industri, pestisida, food additives dan produktobacco Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin harisemakin banyak digunakan, menjadi perhatian utamapeneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadapkemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkanoleh senyawa tersebut. Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker karenamereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA

MUTAGENMutagen adalah zat atau senyawa yang dapatmeningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhireproduksi sel, bahkan kadangkala menyebabkankerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidakterkendaliBeberapa contoh mutagen, antara lain senyawakimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll. Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasi

Beda MUTAGEN dan KARSINOGEN

Karsinogen menyebabkan KANKER

Mutagen menyebabkan MUTASI, tidak selalu menyebabkanKANKER

Klasifikasi senyawa karsinogen menurutaktivitasnya dalam tahapan karsinogenesis

Initiating agent (incomplete carcinogen) : Senyawa kimia yang hanya menginisiasi selPromoting agent : senyawa yang menyebabkan ekspansi sel yang terinisiasiProgressor agent : senyawa yang dapatmengubah sel yang terinisiasi atau sel yang ada dalam tahap promosi menjadi sel yang berpotensi menjadi sel kankerKarsinogen lengkap (complete carcinogen) : senyawa yang mampu menginduksi kankerdari sel normal, biasanya memiliki sifatinisiasi, promosi dan progessor

Epidemiologi karsinogenesisepidemiologi adalah studi tentangdistribusi dan determinan penyakitmelalui observasi terhadap eksperimenyang terkontrol. Observasi atau pengamatan termasuk :

pengamatan episodikpengamatan retrospektifpengamatan prospektif

Hubungan faktor karsinogenik dengan kanker yang terjadi

Penyebab senyawakarsinogen

Kemungkinan kanker yang dapat terjadi

Bukti karsinogenitas

Minuman beralkohol Esophagus, hati, orofaring, laring Cukup

aflatoksin Hati cukup

Makanan (lemak, protein, kalori) Payudara, kolon, endometrium, kemih cukup

merokok Mulut, faring, laring, paru-paru, esophagus, kemih

cukup

Senyawa pengalkil Kemih, leukemia cukup

Senyawa arsen Kulit, hati cukup

Kloramfenikol leukemia terbatas

Estrogen premonopause Sel hati cukup

Estrogen postmonopause Endometrium Terbatas

Penyebab kematian karena kankerMakanan : 35%Rokok : 30%Infeksi : 10%Perilaku seksual : 7%Pekerjaan : 4%Faktor geofisik : 3%Alkohol : 3%Polusi : 2%Produk industri < 1%Zat penambah makanan < 1%

Uji senyawa karsinogenUji jangka pendek (short-term test) : dikembangkan untuk mengidentifikasi senyawakarsinogenik yang berpotensi atas dasarkapasitasnya untuk menginduksi mutasi padaDNA di dalam sel secara in-vitro atau in-vivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test, digunakan mikroba Salmonella typhimurium. Selain uji mutasi bakteri, ada pula uji mutasi selmamalia secara in-vitro, uji mutasi gen secarain-vivo menggunakan mencit, uji kerusakanDNA secara in-vitro.Uji jangka menengah : uji kronis 1 tahun : Ujimenggunakan 50 ekor tikusUji jangka panjang : uji kronis 2 tahun : Multi stage models pada perkembangan neoplasti

AMES Test

• Ames test adalah uji untuk menentukan apakahsuatu senyawa adalah mutagen. Nama test inidiambil dari nama penemunya yaitu Bruce Ames. Bruce Ames dkk pada tahun 1970an menemukansuatu metode uji dengan menggunakan bakterikhusus yang sangat sensitif terhadap senyawa2 mutagen

• Penggunaan Ames test adalah berdasarkanasumsi bahwa setiap senyawa yang bersifatmutagenik terhadap bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi karsinogen yang dapatmenyebabkan kanker

• The Food and Drug Administration (FDA) USA saat ini menggunakan metode ygdikembangkan Ames untuk menapissenyawa2 kimia secara cepat dan murah

• Walaupun demikian, pada kenyataannya, beberapa senyawa yang menyebabkankanker pada hewan percobaan (misalnyadioksin) tidak menunjukkan positif padaAmes test (atau kebalikannya)

Ames test sangat murah dan mudah, sehingga banyak yang beranggapanbahwa test ini tidaklah valid

Bakteri yang digunakan : Galurmutan Salmonella typhimurium

Mengapa menggunakan galur mutan?

Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpapenambahan asam amino. Hal ini dimungkinkankarena mereka membuat asam amino merekasendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2Pada mutan Salmonella typhimurium , tidakdapat tumbuh tanpa asam amino histidin karenamutasi ditujukan pada gen yang mengkode salahsatu dari 9 enzim yang digunakan pada jalurbiosintesis histidin

.

Oleh karena itu, mutan Ames hanya akantumbuh bila ada histidin di dalam medium pertumbuhan karena mutan tersebut tidakdapat mensintesis sendiri histidin tersebut. Mutan ini adalah mutan auxotroph yang disebut mutan histidine-dependent or his -(baca : hiss-minus)

Mutan auxotroph yang berinteraksidengan senyawa sample , berubahmenjadi prototrophMutan prototroph dapat tumbuh baikdalam media tanpa histidin

Contoh Ames test untuk uji kualitatifSuatu suspensi biakan Salmonella typhimurium galur histidine-requiring (his−) ditumbuhkandalam pelat agar yang mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak mengandunghistidinSebuah filter paper di impregnasidengan 10µg 2-aminofluorene, suatu karsinogen. Efek mutageniksenyawa ini dapat menyebabkanbakteri tersebut memperolehkembali kemampuannya untuktumbuh walaupun di dalam media tidak ada histidinnya. Hal inimenyebabkan tumbuhnya kolonibakteri disekitar disk filter paper.

Mengapa medium untuk Ames test ditambahkan ekstrak hati (liver extract)?

Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen atau karsinogen, tetapi dapat berubah menjadimutagen atau karsinogen setelah dimetabolismedi dalam tubuh (hati)Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkanmanusia adalah eukaryot, oleh karena itu perluditambahkan campuran enzim2 hati organismeeukaryot (dalam hal ini hati tikus)

Bagaimana menghitung hasilAmes test ?

Jumlah koloni bakteri yang tumbuhmerupakan ukuran aktivitas mutagenik(potensi) dari senyawa yang digunakanAngka ini biasanya merepresentasikanjumlah revertants (bakteri yang termutasi) per mikrogram of mutagen atau per gram sampel yang mengandungmutagen

Koreksi terhadap hasil Ames testPada umumnya mutasi spontan terjadi pada awalpembiakan bakteri dalam medium yang tidakmengandung histidinHal ini perlu diperhitungkan sebelum mengujisenyawa kimia yang dianalisis.Pada awal pengujian ditumbuhkan 108 selbakteri, maka setelah beberapa waktu dihitungjumlah bakteri yang tumbuh, dan angka inidigunakan untuk pengurangan jumlah bakteriyang memang termutasi oleh senyawa kimia.Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan ujimutagen dengan menggunakan senyawa kimiayang diuji di dalam media yang ditambahkancampuran enzim hati tikus

Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam di tempat gelapJumlah koloni yang terbentuk menunjukkanrevertans yang terbentuk yang sebanding denganpotensi senyawa mutagen

Galur mutan Salmonella typhimurium

Galur mutan dari Salmonella typhimuriumyang digunakan dalam Ames test memilikisensitivitas yang berbeda-bedaGalur TA 1535 memiliki satu substitusi basa yang menyebabkan missense mutation di dalam genyang mengkode enzim pertama dalam sintesishistidin. Enzim yang dimiliki mutan mengandungproline sementara biakan induk mengandungleucineGalur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapatmendeteksi jenis-jenis mutagen yang berbeda

Galur lain yang digunakan misalnya galuryang mengalami mutasi yang berbeda-beda ( bisa frameshift, missense ataunonsense), pada operon histidinBeberapa galur yang digunakan jugatermutasi pada uvrB, rfa , yang berakibatmeningkatkan permeabilitas sel terhadapsenyawa kimia tertentu

PROSEDUREkstrak homogenate rat liver (S9) dicampur dengan

strain dari bakteri his-. Dengan tidak adanyahistidin, bakteri tidak dapat tumbuh di dalammedium minimum (control).

Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang diduga mutagen (X), terbentuknya revertantcolonies menunjukkan bahwa beberapa his-bacteria telah termutasi (reverted) menjadi his+dan dapat disimpulkan bahwa senyawa X adalahsuatu mutagen.

Gambar uji mutagen

Jumlah koloni yang dihasilkansetara dengan besarnyaefisiensi mutagen mengembalikan sifat mutanke asalnyaSuatu mutagen A menghasilkan jumlahrevertans yang lebih tinggidari kontrol, berarti mutagen A adalah betul-betul mutagen dan mungkin suatukarsinogen.Suatu mutagen B tidakmenghasilkan jumlahrevetans lebih banyak darikontrol, maka dapatdikatakan bahwa senyawa B bukanlah suatu mutagen.

Metode lain untuk uji mutagen

Menggunakan mencit transgenik yang disuntikkan dengan senyawa kimia (kandidatmutagen)DNA dari jaringan tertentu diisolasi lalu disisipkandalam bakteriofaga, lalu ditransformasikan kedalam E.coliE.coli ditumbuhkan dalam medium tertentu, dandihitung frekuensi mutasi berdasarkanperbandingan jumlah koloni yang berwarnaterhadap yang tidak berwarna