un peu d'histoire: 1970: 1 è re greffe de moelle osseuse (gmo) pour 1 d é ficit...
DESCRIPTION
Maladies génétiques. Un peu d'histoire: 1970: 1 è re greffe de moelle osseuse (GMO) pour 1 d é ficit immunitaire 1983: GMO non HLA identique (d é pl é tion T) 1990: auto greffe de cellules souches p é riph é riques 1998: s é lection de cellules CD34+. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Un peu d'histoire:
• 1970: 1ère greffe de moelle osseuse (GMO)
pour 1 déficit immunitaire
• 1983: GMO non HLA identique (déplétion T)
• 1990: auto greffe de cellules souches
périphériques
• 1998: sélection de cellules CD34+
Maladies génétiques
Traitement par cellule souche patient-spécifique
Cellule souchedu nerf
Cellule souchedu nerf
Cellule souche
du sang
Cellule souche
du sang
NerfNerf
TransplantationTransplantationBiopsieBiopsie
NerfNerfCoeurCoeurMuscl
eMuscl
eSangSangIsoler et multiplier les
cellules souches pluripotentes
Isoler et multiplier les cellules souches
pluripotentes
Développer des blastocytes in vitro
Développer des blastocytes in vitro
« Reprogrammation »
« Reprogrammation »
Transfert dans le noyau
Transfert dans le noyau
Moelle osseuse
Sang
Lymphocytes
T
NK
B
Polynucléaires
Monocytes
Globules rougesPlaquettes
Cellule souche
Thérapie géniqueUn défi
complexe• Insérer le "bon gène" dans "les bonnes cellules" • Niveau d'expression ni trop faible ni trop fort• Obtenir une expression prolongée si nécessaire
(ou régulée…)• Eviter la toxicité
- mutagènèse insertionnelle- réaction inflammatoire dirigée contre le vecteur ou le produit du transgène
Thérapie génique des maladies héréditaires
du système hématopoïétique Points clé
• Identification du gène responsable
• Compréhension de la maladie : pourquoi cette mutation donne “ces signes cliniques”
• Durée de vie des cellules transduites
• Profil d’expression
• Une protéine mutée mais présente peut contrecarrer l’effet bénéfique du gène thérapeutique
Déficits immunitaires combinés sévères (DICS) : de bons modèles pour la thérapie
génique
• Maladies léthales dont le traitement n’est
que partiellement satisfaisant
• Bases génétiques connues
• Le produit génique confère un avantage
sélectif aux cellules des précurseurs
lymphoïdes transduites
• Grande capacité de prolifération des cellules
pro-T
• Les cellules T matures vivent longtemps ( >
années)
THYMUS
CLP
NK
CD8
B
Signaux c cytokine-dépendants cc, JAK-3, JAK-3, IL7Ra IL7Ra (53 %)
Recombinaison V(D)J Rag-1/-2, Artemis (30 %)
Prévention de l’apoptose cellulaireRéplication de l’ADN ADA ADA (11 %)
HSC
Compartiment myéloïde
SCID diseases
CD4
Signalisation Pre TCR/TCR CD45, CD3, (2 %)
Compatibilité donneur-receveur : probabilité cumulative de survie chez les
patients atteints de DICS après greffe de CSH
Registre Européen
. Rejet (cellules NK de l’hôte). Réaction du greffon contre l’hôte. Cellules T !
Survie sans événement (%)Survie sans événement (%)
Génotype identique n=89Génotype identique n=89
Apparentés, phénotype identique n=43Apparentés, phénotype identique n=43
Donneur non apparenté n=24Donneur non apparenté n=24
Quelle différence ?
Apparenté, HLA partiellement incompatible n=269Apparenté, HLA partiellement incompatible n=269
Temps après greffe de CSHTemps après greffe de CSH
MoisMois
Résultats à long terme
• Faible fonction des cellules T dans certains
cas
• Déclin à long des terme des fonctions des
cellules T
• Faible nombre de cellules NK
• Immunité des cellules B peu fréquente
Principe de la thérapie génique dans le DICS lié à l’X
Testé in vitro et in vivo(souris c KO)
.... ....
DICS T- B+
AR X-L
RIL2 /CD19
CD
3
CONTROLE PATIENT
CD19
DICS-X1. un défaut du récepteur c
le défaut en le défaut en cc
TTCD4CD4
NKNK
HSCHSC
BB
TTCD8CD8
CLPCLP
IL-15IL-15
IL-7IL-7
IL-2IL-2 IL-4IL-4 IL-7IL-7 IL-15IL-15 IL-21IL-21
cIL-2RIL-2R
IL-4R c c c cIL-7R IL-2RIL-15R
IL-9IL-9
cIL-9R IL-21R
Développement Développement de lymphocytes Tde lymphocytes T
Développement Développement de lymphocytes NKde lymphocytes NK
Absence de lymphocytes T et NK
Léthal en l’absence de traitement
La greffe de moelle allogénique guérit mais …
Absence de lymphocytes T et NK
Léthal en l’absence de traitement
La greffe de moelle allogénique guérit mais …
Probability of survival of SCID patients according to date of HSCT and to compatibility
2000: 73 %
< 2000: 61 %
Geno-id.: 83 %
URD: 66 %
Pheno-id.: 64 %
Haplo-id. : 50 %Haplo-id.: 50 %
Months
Su
rviv
al %
Months
Su
rviv
al %
What makes the difference ?
. Rejection (host NK cells)
. GVHD
. T cells !
Thérapie Génique du DICS-XI : Etudes précliniques
In vitro: Lymphocytes B c(-) - faisabilité - Etude de l’expression et de la fonction
Cellules CD34(+) c(-) - Etude de l’expression dans les progéniteurs et à long terme - Différenciation cellulaire NK, T In vivo : Souris c(-) - Toxicité, faisabilité - Avantage sélectif
Voie de signalisation c / JAK / STAT
IL-2
JAK3
JAK1
PP
PP
JAK3
JAK1P
P
STA
T5
STAT3
Dimérisation de STATDimérisation de STAT
NoyauP
P
Fixation de STATs sur des sites spécifiquesde l ’ADN
15
STA
T5
Etudes pré-cliniques
Cellules EBV-B des patients DICS-X1 c+ 0%
c+ 100%
J180
c+50%
J30
Avant transduction
Après transduction
IL-2IL-2
PP
JAK3
JAK1JAK1P
P
P
P
STAT3
0 IL2 0 IL2 0 IL2
Contrôle c- c+
WBA
Transduction de cellules Sca1+ Rag ou Artemis-/-
(Rétrovirus dérivé de MFG)
Moelle Osseuse
Sélection positivede Sca1+
SCF, Flt-3 L,Tpo, Il-6, Il-11, Il-7
(3 Cycles, 5j)
RAG2-/- C57BL/6
3 GyIrradiation
RAG2-/- C57Bl/6
Transplantation (106 cellules)
Surnageant rétroviral
MFG- c ou RAG ou Artémis
Pourcentage de SurviePourcentage de Survie
SemainesSemaines
Recherche Translationnelle
Secteur spécifique de la thérapie cellulaire, chargé de traduire une expérience réalisée à l’échelle de laboratoire dans une expérience à large échelle utilisable pour l’homme
2 4 6 8 10 12
1. Selection of reagents,
materials and devices
Mois
2. Test grandeur nature
3. Scale-up
4. Rédaction des
procédures de laboratoire
Calendrier de la phase translationnelle
Manipulation cellulaire de grade cliniqueDescription du processus : depuis le concept
jusqu’à la transplantation
1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
Follow upSuivi
Année
Infrastructures
Transplantation
Contrôle qualité
Formation de l'équipe
Points réglementaires
Autorisation par les
autorités réglementaires
Sécurité et Réglementation (1)
• Laboratoire accrédité pour la production du vecteur
• Absence de micro-organismes dans les cellules de production du vector et dans le surnageant
• Absence de virus compétent pour la réplication dans les lots cliniques ainsi que dans les échantillons des patients
• Le laboratoire doit être accrédité par les autorités compétentes et doit recevoir l’autorisation du Ministère
Autorisation obtenue pour le protocole par :
1) Administration de l’AP-HP
2) Agence française du médicament:
Sécurité et Réglementation (2)
AFSSAPSAFSSAPS
3) CCPAP
Comité d’Ingéniérie Génétique
Comité de Génétique et deBiologie Moléculaire
Comité Essais Cliniques
Enfant
Purification decellules précurseurs(CD34)
J1 « Activation
» J2
Injection I.V.
Lavage des cellules
Infection par le rétrovirus
contenant le gène gc
J4
J3
Moelle osseuse
Essai Clinique de TG pour le DICS-XI (1er Janvier, 2012)
PatientSuivi
(années)
Expression
de c
T B
Etat cliniqueImmunité
1 10.6 +++ ++ ++ Vivant, va bien
2 10.4 +++ ++ + Vivant, va bien
3 .7 + - - Vivant, va bien (greffe de MO)
4 (4.9) +++ ++ ++ Décédé, "leucémie"
5 10.8 +++ ++ ++ Vivant, va bien ,"leucémie",chimio
6 9.8 +++ ++ + Vivant, va bien
7 9.6 +++ ++ + Vivant, va bien "leucémie",chimio
8 9.0 +++ ++ ++ Vivant, va bien
9 (3.1) ++ + - Décédé, infection (greffe de MO)
10 8.7 +++ ++ + Vivant, va bien,"leucémie",chimio
Moyenne du suivi = 11 ans, 8 patients vivants qui vont bien
Restoration of immune parameters
Correction of humoral function: normal serum Ig levels (except for 2 patients)
Full correction of T-cell immunodeficiency
months after gene therapy
P1100
1000
3000
5000
7000
00 10 20 30 40 50 60
P7
P9
P10
P4
P5P6.
*
**
70 80
9000
P8
90
*
*
P2
Phenotype, function, TCR repertoire diversity
Differentiation of functional NK cells but subsequent decrease = HSCT (Limited expansion capacity of NK cell precursors ?)
0
20
40
60
80
100
SC
ID d
isease-f
ree s
urv
ival (%
)
0 20 40 60 80 100 120
Time (months)
83.1%
Outcome of gene therapy trials in 20 patients with SCIDX1
(Paris-London data combined)
Transduction de progéniteurs multipotents (?)
CLP
HSC
CMP
T
NK
B
PMN
Monocyte
Sites d’intégrationpartagésProgeniteur
rs multipotents
- Nbre de copies de vecteur dans les cellules B < 0.1% 7 à 10 ans après TG- CD15+ négatives pour le transgène
- Nbre de copies de vecteur dans les cellules B < 0.1% 7 à 10 ans après TG- CD15+ négatives pour le transgène
Essai clinique TG SCID-X1: caractéristiques des 4 effets indésirables
graves (EIG)
P4 P5 P7 P10
Age au traitement (mois)
1 3 8 8
Survenue de l’EIG (mois)
30 34 68 33
Prolifération clonale T T
matures T matures
T Immatures
Thymocyte cortical
Oncogène LMO2 LMO2 CCND2 LMO-2, BMI-1
2ème modifications génétiques
t6:13SIL-TAL
notch mut, p16 del.
p16 del.notch mut,
p16 del.
Sensibilité au traitement - + + +
Un effet indésirable sévère chez 4 patients à Paris et chez 1 patient en
Angleterre• Prolifération monoclonale des lymphocytes T
provoquée par l'insertion du rétrovirus dans un oncogène
• Facteurs associés : infection virale, réponse immune, susceptibilité génétique…
• Quelle attitude adopter ?suspension de l'essai,analyse du risque confrontée au
bénéfice,changement du vecteurretour à la recherche fondamentale
autour du virus etautour de la maladie
Structure du gène LMO-2 et intégration du provirus
M. ery
thro
leukem
iaLMO-2 RNA Transcript
(Northern blot analysis)
LMO-2 Protein expression
(Western blot analysis)
LMO
-1
leukem
iaH
. ery
thro
leukem
ia
P4
T
CH
O
CH
O/L
MO
-2LM
O-1
le
ukem
iaM
-ery
thro
leuke
mi
a
TP4
LMO-2LMO-2 LMO-2LMO-2
11 22 33 44 55 66
11 22 33 44 55 66
MFG MFG cc
LMO-2 mRNA2. 3 kb
MFG MFG cc
P5 P4
Enhancer activity
MFG MFG cc
P10
Comment améliorer la Sécurité ?
• Sélection des patients ??
• Utilisation d’un LTR self-inactivé (SIN)
MoLV U5U5 Y
RSD SA
RQ
IL2RG
U5U5 Y
R RQ
MP ΔSD
PREProm. IL2RG
EF1(S)
RSV
Vecteur rétroviral LTR-dirigé: MFG c
Nouveaux vecteurs retroviraux SIN: Sin11 / SRS11
MoLV
Le promoteur EF1 est moins mutagénique
P<0.001
détection limite
SF EFS SF.HS4Etude de clonogenicité in vitro (C. Baum’s lab.)
Comment améliorer l’efficacité ?
•Pas indispensable pour le DICSIndispensable pour les maladies dans lesquelles le transgène ne fournit pas d’avantage sélectif
•Vecteurs lentiviraux : du taux de transduction des cellules souches: important pour les protocoles de TG pour ALD et -thalassémie
• Compétition avec les cellules non transduites
cytoréduction (+/- sélection) access to stem cell niches (anti c-kit
ab…)