LUCAS MIYAKE OKUMURA

INVESTIGAO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS

DE ARABINOGALACTANA-PROTENAS EXTRADAS

DE Uncaria tomentosa Will DC.

CURITIBA

2008

2LUCAS MIYAKE OKUMURA

INVESTIGAO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS

DE ARABINOGALACTANA-PROTENAS EXTRADAS

DE Uncaria tomentosa Will DC.

CURITIBA

2008

Projeto de monografia apresentado ao Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran, como requisito do grupo PET Farmcia. Orientadora: Professora Dra Juliana Bello Baron Maurer.Co-orientadora: Profa Dra Fabiola R. Stevan Hancke (Universidade Positivo)Colaboradores: Acad. Andreia Beraldo (Cincias Biolgicas - UPPR)Enf. Snia Hutul e Dr Rui Cepil (Programa de Fitoterapia de Londrina)Profa Dra Iara Taborda de Messias (Dep Patologia Mdica - UFPR)Profa Fernanda Bovo (Dep de Farmcia - UNICENTRO)

3SUMRIO

1 TEMA............................................................................................................. 12 INTRODUO............................................................................................... 23 REVISO BIBLIOGRFICA......................................................................... 33.1 ARABINOGALACTANA-PROTENA (AGP): LOCALIZAO,

PROPRIEDADES QUMICAS E FUNES BIOLGICAS DA AGP............................................................................................................... 3

3.2 MODIFICADORES DA RESPOSTA BIOLGICA......................................... 43.2.1 Consideraes gerais sobre o sistema imune............................................... 53.2.2 Macrfagos.................................................................................................... 53.2.3 Sistema complemento................................................................................... 73.3 PLANTAS DE USO MEDICINAL E PROPRIEDADES

IMUNOMODULADORAS............................................................................... 83.4 MATERIAL VEGETAL EM ESTUDO: Uncaria tomentosa Will DC. (UNHA

DE GATO)...................................................................................................... 104 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS....................................................... 115 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 126 MATERIAIS E MTODOS............................................................................. 136.1 MATERIAL VEGETAL E AMOSTRAS-TESTE.............................................. 136.2 EXPERIMENTOS BIOLGICOS................................................................... 13

6.2.1 Procedimentos gerais utilizados no cultivo animal........................................ 146.2.2 Modelos experimentais utilizando macrfagos.............................................. 146.2.2.1 Obteno de macrfagos peritoneais............................................................ 146.2.2.2 Produo de xido ntrico.............................................................................. 156.2.2.3 Determinao da viabilidade celular e da contagem de clulas (Azul de

Tripan e MTT)................................................................................................15

6.2.2.4 Tcnica de anlise morfolgica atravs da microscopia de luz..................... 166.2.2.5 Reteno de lisossomos................................................................................ 176.2.3 Modelo experimental para avaliar o sistema complemento........................... 176.2.3.1 Preparo das suspenses de eritrcitos de carneiro e coelho........................ 176.2.3.2 Avaliao da via alternativa........................................................................... 186.2.3.3 Avaliao da via clssica............................................................................... 186.3 Delineamento experimental e anlise estatstica..................................... 196.4 Aspectos bioticos e de biosegurana..................................................... 196.5 Coleta de dados sobre a utilizao da Uncaria tomentosa Will DC. no

Programa de Fitoterapia de Londrina e sobre o conhecimento popular de plantas medicinais ..................................................................

20

7 CRONOGRAMA............................................................................................ 228 RECURSOS................................................................................................... 23REFERNCIAS............................................................................................................. 24ANEXO.......................................................................................................................... 29

41 TEMA

O tema do projeto a ser desenvolvido a investigao das propriedades

imunomoduladoras de arabinogalactana-protenas (AGPs), extradas da Uncaria

tomentosa DC. (unha de gato), utilizando modelos animais in vitro.

52 INTRODUO

Desde os primrdios, os povos antigos j faziam o uso de plantas para curar

feridas, doenas e infeces. Porm, na poca nada se sabia devido aos conceitos

primitivos sobre farmacologia alm da escassa tecnologia. Por isso, pouco se

compreendia sobre as molculas envolvidas nos processos biolgicos, e muito

menos sobre a sua estrutura (PAULSEN B. S., 2001). Com o avano da cincia,

novos mtodos de pesquisa foram criados e aperfeioados, e hoje, sabe-se que

certos constituintes de plantas, como polissacardeos e proteoglicanos, so

compostos bio-ativos no organismo. Estas substncias apresentam efeitos

biolgicos, como exemplo, a imunomodulao, a qual pode ter como resultado a

ativao ou supresso do sistema imune. Mleculas que atuam como moduladores

da resposta imunolgica so conhecidos como modificadores da resposta biolgica

(MRB). Uma das vantagens da utilizao destes biomoduladores seria por seus

ausentes ou diminudos efeitos colaterais. A avaliao da atividade bio-

farmacolgica de molculas e novas descobertas de MRB tem-se tornado um

promissor campo na pesquisa das cincias biomdicas.

Vrios exemplos de polissacardeos e glicoconjugados vegetais que

apresentam efeitos biolgicos como imunomoduladores j foram descritos (DIALLO

D. et al., 2000; CLASSEN B. et al., 2005; CLASSEN B., 2007, entre outros). Estes

estudos relataram o efeito biolgico imunomodulador, utilizando diferentes sistemas

animais, de arabinogalactanas, pectinas e/ou arabinogalactana-protenas (AGPs),

obtidas de espcies vegetais com interesse fitoterpico como, por exemplo,

Echinaceae purpurea Moench, Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitag., Malva

silvestris lus. nivea Priszter, Panax ginseng C. A. Mey, Plantago major L. e

Calendula officinalis Hohen .

63 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 ARABINOGALACTANA-PROTENA (AGP): LOCALIZAO, PROPRIEDADES

QUMICAS E SUAS FUNES BIOLGICAS

Arabinogalactana-proteinas so uma famlia de proteoglicanas complexas,

includas no grupo de glicoprotenas vegetais ricas em hidroxiprolina (HRGPs),

encontradas em vegetais inferiores e superiores, de vrios grupos taxonmicos

(CLARKE et al., 1979). Em plantas superiores, as AGPs ocorrem em folhas, caules,

razes, orgos florais, sementes, e em grandes quantidades em troncos de algumas

angiospermas e gimnospermas (FINCHER et al., 1983). As AGPs esto presentes

em membranas celulares, na matriz extracelular e em gomas de exsudatos. Culturas

de clulas derivadas de diferentes tecidos vegetais produzem AGPs e as secretam

no meio de cultura (FINCHER et al., 1983; KREUGER & VAN HOLST, 1993).

Do ponto de vista estrutural, a poro glicdica (90% m/m) das AGPs

apresenta-se constituda, principalmente, de D-galactopiranose e L-arabinofuranose.

A cadeia principal constituda de unidades de -D-galactopiranose unidas por

ligaes do tipo O-3, O-6 e O-3,6, podendo estar substitudas por unidades de L-

arabinofuranose, podendo tambm apresentar outros monossacardeos menos

abundantes, como -L-Arap, -L-Rhap, -D-Glcp e -D-GlcpA, como extremidades

terminais no redutoras (FINCHER et al., 1983). Considerando a estrutura qumica

da poro glicdica, as AGPs so classificadas como arabinogalactanas tipo , que

correspondem as arabino-3-6-galactanas (FINCHER et al., 1983). Com relao

poro protica, as AGPs geralmente apresentam menos de 10% (m/m) de

contedo protico, o qual , usualmente, rico em hidroxiprolina/prolina (Hyp)/(Pro),

alanina (Ala), serina (Ser) e treonina (Thr) (CLARKE et al., 1979).

7Tem-se atribudo s AGPs vrias funes como lubrificante, umectante e

agente de adeso, baseando-se na sua localizao extracelular e em suas

propriedades fsicas e qumicas (CLARKE et al., 1979; FINCHER et al., 1983).

Recentemente, tem-se relatado que as AGPs apresentariam vrias funes

relacionadas com o crescimento e desenvolvimento vegetal, tanto em nvel

vegetativo, como reprodutivo e celular (SERPE & NOTHNAGEL, 1996; MAJEWSKA-

SAWKA & NOTHNAGEL, 2000; SHOWALTER, 2001). Vrios estudos sugerem que

as AGPs podem estar envolvidas, por exemplo, na formao de xilema, no

crescimento e na germinao do tubo polnico, nos processos de expanso e

proliferao celular, no estabelecimento de identidade celular, no controle de

embriognese somtica e da morte celular programada (SERPE & NOTHNAGEL,

1996; MAJEWSKA-SAWKA & NOTHNAGEL, 2000; SHOWALTER, 2001; MOTOSE

et al., 2004; PETTOLINO et al., 2006).

3.2 MODIFICADORES DA RESPOSTA BIOLGICA

Mleculas que atuam como moduladores da resposta imunolgica so

conhecidos como modificadores da resposta biolgica (MRB) (BOHN & BEMILLER,

1995). Os MRB podem atuar, por exemplo, na mediao da atividade de

macrfagos, do sistema complemento e nos mecanismos de adeso celular. Esta

importante classe de biomoduladores principalmente utilizada como agentes anti-

neoplsicos (BOHN & BEMILLER, 1995). Neste grupo esto includos frmacos que

atuam direta ou indiretamente sobre as clulas tumorais. O efeito indireto dos

biomoduladores est relacionado com a intensificao da resposta imunolgica a

clulas neoplsicas. Uma das vantagens da utilizao destes biomoduladores seria

8por seus ausentes ou diminudos efeitos colaterais. Desta forma, a avaliao da

atividade bio-farmacolgica de molculas e novas descobertas de MRB tem-se

tornado um promissor campo na pesquisa das cincias biomdicas (BOHN &

BEMILLER, 1995; MORETO et al., 2003).

3.2.1 Consideraes gerais sobre o sistema imune

O sistema imunolgico dividido em dois grandes ramos: o sistema inato e o

adaptativo. O sistema inato caracteriza-se por responder aos estmulos de maneira

no especfica (ABBAS et al., 2003). Este composto por clulas, como neutrfilos,

eosinfilos, basfilos, moncitos, macrfagos e clulas NKs (natural killers), e por

fatores solveis, incluindo, o sistema complemento, protenas de fase aguda, e

enzimas (ABBAS et al., 2003). O sistema imune adaptativo caracteriza-se por

responder ao antgeno de modo especfico, apresentando memria, no qual, se

incluem as clulas linfcitos T e B e as imunoglobulinas (ABBAS et al., 2003). Essa

diviso didtica e elementos do sistema inato podem agir como efetores do

sistema adaptativo. Considerando os objetivos do presente projeto, sero

enfatizados aspectos mais relevantes sobre os macrfagos e o sistema

complemento.

3.2.2 Macrfagos

Os macrfagos tm um papel crtico na resposta imunolgica, pois, so

clulas efetoras importantes para a eliminao de microorganismos, exercendo um

papel central como mediadores entre o sistema imune inato e a adquirido. As

9principais funes dos macrfagos demonstram que estes estariam envolvidos com

o processo inflamatrio, capacidade fagoctica, processamento e apresentao de

antgenos, co-ativao de linfcitos T e B, angiognese, processo de cicatrizao,

alm da atividade citotxica contra clulas tumorais e microorganismos (ABBAS et

al., 2003). O mecanismo microbicida utilizado pelo macrfagos, inclui duas vias

oxidativas, NADPH oxidase e oxido ntrico sintase, as quais, respectivamente, esto

envolvidas na sntese de nion superxido (O2-) e xido ntrico (NO) (ABBAS et al.,

2003). Os macrfagos tambm so capazes de produzir uma variedade de citocinas

como as interleucinas (IL), interferon (IFN) e fator de necrose tumoral- (TNF-). Os

macrfagos realizam essas funes efetoras somente depois que so ativados por

ligantes exgenos (p. ex, microorganismos) ou endgenos (p. ex, citocinas, clulas

tumorais). A expresso de uma grande diversidade de molculas de superfcie, ou

seja, vrias classes de receptores, capacita os macrfagos em reconhecer uma

variedade de ligantes tanto endgenos como exgenos (GORDON, 2002). Vrias

classes de receptores j foram identificadas (GORDON, 2002), cada classe

apresenta uma determinada especificidade e a interao entre o ligante e o receptor

tambm provocar uma resposta especfica. Apesar dos diferentes receptores

exercerem funes distintas, o objetivo final culmina na ativao de respostas

celulares convergentes. Vrias classes de receptores apresentam especificidade de

reconhecimento mediada por carboidratos. Pode-se sugerir que este tipo de

especificidade explicaria em parte, o efeito de vrios polissacardeos sobre

diferentes aspectos de ativao de macrfagos (SUZUKI et al. 1985; ARINAGA et al.

1992; JOHNSON et al. 1992; ROSS & VETVICKA, 1993; GORDON, 2002). Uma vez

que os macrfagos agem como clulas efetoras e mediadoras do sistema imune,

estudos visando a aplicao de molculas que modulem o aumento da funo

10

macrofgica podem contribuir na teraputica de doenas infecciosas bacterianas e

neoplasias (POPOV et al., 1999).

3.2.3 Sistema complemento

O sistema do complemento compreende um grupo de, pelo menos, 18

protenas plasmticas que atuam em conjunto com o sistema imunolgico, na defesa

do organismo contra infeces ou invaso por substncias estranhas (ABBAS et al.,

2003). A reao do sistema do complemento ocorre em cadeia e completa a defesa

organizada pelo sistema imunolgico. Freqentemente, as protenas do

complemento conferem proteo imunitria, at que os anticorpos sejam produzidos;

o complemento tambm potencializa os efeitos da resposta dos linfcitos T e das

imunoglobulinas. Considerando, principalmente, os eventos de reconhecimento que

iniciam a ativao do sistema complemento, este dividido em trs vias, sendo

estas a via Clssica, Alternativa e da Lectina (ABBAS et al., 2003). Na via clssica

de ativao do complemento, esta ocorre em resposta ligao das

imunoglobulinas IgM ou IgG aos microorganismos invasores. A via alternativa de

ativao do complemento corresponde sua ativao pelos microorganismos cuja

superfcie tm antgenos protegidos por cpsulas de polissacardeos. Esta via

alternativa permite a fagocitose pelos macrfagos, independente da fixao dos

anticorpos. Outra via do complemento a via mediada por lectina, que ativada

pela ligao de uma protena ligadora de manose, nas superfcies de bactrias e

fungos. As trs vias levam ligao covalente de um fragmento particular de um

componente do complemento (fragmento C3b de C3) a superfcie do patgeno. Os

fragmentos do C3 so tambm opsoninas, molculas que podem ser reconhecidas

11

pelos receptores de superfcies dos macrfagos. Os receptores C3R mediam a

interao entre os macrfagos e neutrfilos com os patgenos; assim, a

opsonizao de um patgeno pelo complemento facilita a fagocitose e a destruio

da mesma forma que a opsonizao com anticorpos (ABBAS et al., 2003). As

Arabinogalactanas tipo II, pectinas cidas, AGPs obtidas de diferentes plantas de

uso medicinal mostraram-se molculas moduladoras do sistema complemento

(YAMADA et al., 1985; CLASSEN et al., 2002; THUDE et al., 2006). Desta forma,

considerando que o sistema complemento um importante mediador do processo

de inflamao, a investigao da atividade biolgica de molculas que possam

modular o sistema complemento, mais especificamente, inibir a cascata de ativao

deste sistema, torna-se de grande relevncia teraputica para diversas doenas

como artrite reumtica e desordens degenerativas.

3.3 PLANTAS DE USO MEDICINAL E PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS

A utilizao de plantas com efeitos medicinais objetivando promover a cura de

doenas, vem desde pocas muito antigas. Recentes estudos indicam um aumento

no uso de plantas como medicamentos alternativos ou complementares aos

industrializados. A crise econmica, o alto custo das medicaes industrializadas,

alm dos efeitos colaterais causados pelas drogas sintticas, so alguns fatores que

contriburam para o aumento da fitoterapia (SIMES, 1989). considerado

fitoterpico toda preparao farmacutica (extratos, tinturas, pomadas e cpsulas)

que utiliza como matria-prima parte de plantas, como folhas, caules, razes, flores e

sementes, com conhecido efeito farmacolgico. O uso adequado dessas

preparaes traz uma srie de benefcios para a sade humana ajudando no

12

combate a doenas infecciosas, disfunes metablicas, doenas alrgicas e

traumas diversos, entre outros. Associado s suas atividades teraputicas est o

seu baixo custo; a grande disponibilidade de matria-prima principalmente nos

pases tropicais; e a cultura relacionada ao seu uso.

Em relao aos componentes glicdicos presentes em plantas medicinais,

vrios estudos tm sugerido que as AGPs apresentam potenciais aplicaes na

medicina (PAULSEN, 2001; PETTOLINO et al., 2006). Tm sido descritos vrios

estudos relatando diferentes efeitos biolgicos imunomoduladores de AGPs

(PAULSEN, 2001 e 2002; CLASSEN, 2002; PETTOLINO et al., 2006). As principais

atividades biolgicas encontradas esto relacionadas com modulao da atividade

de macrfagos (fagocitose e liberao de citocinas), do sistema complemento e

atividade tumoral. Assim, importante destacar que apesar das vrias atividades

biolgicas relatadas, poucos trabalhos enfocam especificamente a atividade

biolgica de AGPs, exceo verificadas para as espcies vegetais Echinaceae

purpurea e Echinaceae pallida Britton (CLASSEN et al., 2000, 2002, 2005; THUDE

et al., 2006; PETTOLINO et al., 2006; CLASSEN, 2007). Outro fator de extrema

relevncia a falta da correlao entre a atividade biolgica observada e a estrutura

qumica das molculas testadas. Desta forma, imprescindvel a caracterizao

prvia da estrutura qumica de molculas a serem testadas para que possa ser

possvel estabelecer uma relao entre os eventuais efeitos biolgicos observados e

a estrutura qumica das molculas (BOHN & BEMILLER, 1995). Deve-se considerar

que aspectos relacionados estrutura da molcula, como composio

monossacardica neutra e cida, tipos de ligaes glicosdicas, presena ou

ausncia de ramificaes, presena e caractersticas de grupos substituintes,

13

tamanho da massa molecular e conformao tridimensional, tm correlaes entre o

tipo de atividade biolgica e o grau de eficincia das molculas testadas.

3.4 MATERIAL VEGETAL EM ESTUDO: Uncaria tomentosa (UNHA DE GATO)

Esta planta medicinal, pertencente Famlia Rubiaceae, pode ser encontrada

em toda a amaznia peruana e principalmente nas bacias dos rios da selva central

do Peru. Apresenta vrias propriedades medicinais, sendo utilizada primariamente

pelos Incas e ndios locais da no tratamento de doenas como artrite, gastrite,

reumatismo e inflamaes em geral. A planta tambm benfica para o tratamento

de doenas reumticas e musculares, principalmente na terceira idade e indicada

no tratamento de enfermidades reumticas como a osteoartrite artrite reumatide.

Os princpios ativos de maior interesse so os alcalides oxindlicos pentacclicos

(rinocofilina, mitrafilina, isoteropodia A, pterodifina, isorincofilina e isomitrafilina) e os

compostos glicosdeos do cido quinvico que demonstram ser os responsveis

pelos efeitos antiinflamatrios. Atualmente, unha-de-gato est sendo estudada tanto

como agente microbiano como no tratamento de doenas como o cncer e Aids, em

razo de seu poder modulador do sistema imunolgico (BIESKI, 2006).

14

4 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS

O objetivo geral desse projeto estudar as propriedades imunomoduladoras

de AGPs obtidas de Uncaria tomentosa. De forma mais especfica, os objetivos so:

1. Avaliar o efeito de AGPs sobre a atividade de macrfagos, avaliando

alteraes de morfologia celular e do burst respiratrio (produo de xido

ntrico e reteno e lisossomos);

2. Avaliar o efeito modulador de AGPs sobre o sistema complemento;

3. Correlacionar a estrutura qumica das molculas-teste com as atividades

biolgicas encontradas;

4. Coletar informaes sobre o conhecimento e a utilizao popular da Uncaria

tomentosa;

5. Coletar os dados sobre aplicao da Uncaria tomentosa na fitoterapia clnica;

6. Divulgar os resultados obtidos com o intuito de reforar a utilizao da U.

tomentosa como fitoterpico.

15

5 JUSTIFICATIVAS

As plantas medicinais tm sido a base dos principais produtos indicados para

a sade desde a Antigidade. O reconhecimento do valor delas como recurso

clnico, farmacutico e econmico cresce progressivamente em vrios pases. O

Brasil um pas de grande biodiversidade vegetal. Alm disso, possui uma rica

diversidade tnica e cultural e detm valioso conhecimento tradicional relacionado

ao uso de plantas medicinais. Desta forma, considerando os vrios aspectos como:

(a) efeitos biomoduladores de AGPs encontradas na parede celular vegetal, como

mediadores do resposta imunolgica; (b) propriedades fisco-qumicas das AGPs,

como alta solubilidade em solues aquosas ou salinas; (c) relevncia na

descoberta de novos modificadores da resposta biolgica para uso na teraputica de

vrias doenas; (d) escassez de dados na literatura sobre as propriedades

imunomoduladoras de AGPs presentes na espcie vegetal Uncaria tomentosa

(unha de gato) e o conhecimento popular sobre essa planta sobre o seu uso como

fitoterpico; e finalmente (e) aspectos scio-econmicos da utilizao de plantas

medicinais. Ento de forma resumida, o presente projeto prope a avaliao da

atividade bio-imunomoduladora de AGPs, em modelos animais in vitro, respeitando

sempre os aspectos bioticos. Afim de reforar e/ou desmistificar o uso da Uncaria

tomentosa como planta medicinal de acordo com o uso popular.

16

6. MATERIAIS E MTODOS

6.1 MATERIAL VEGETAL E AMOSTRAS-TESTE

O material vegetal da espcie Uncaria tomentosa (unha-de-gato) (raiz) ser

gentilmente cedido pela Fundao Herbarium, Colombo (PR).

O material vegetal in natura ser submetido extrao para obteno da

frao de protenas solveis (SPF), de acordo com a metodologia descrita por

SCHULTZ et al (2002). A frao SPF ser submetida precipitao seletiva com

reagente de Yariv (-glucosil)3 (GANE et al., 1995), para obteno da frao de

AGPs. O reagente de Yariv ser preparado de acordo com o mtodo de YARIV et al.

(1962).

Para os ensaios biolgicos, alm das fraes de AGPs da unha de gato,

tambm sero utilizadas como fonte AGPs, a goma arbica (Sigma Chem. Co.) e o

extrato de Echinacea purpurea L. Moench (Bioherb, Laboratrio Qumico

Farmacutico Tiaraju Ltda).

6.2 EXPERIMENTOS BIOLGICOS

O estudo da ativao do sistema imune por arabinogalactana-protenas ser

realizado com pesquisas bibliogrficas, reviso de artigos e prticas laboratoriais na

Universidade Positivo e Hospital de Clnicas. Os experimentos biolgicos sero

constitudos por uma anlise, detalhada a seguir, os quais verificam a

imunomodulao mediada por AGPs em macrfagos e eritrcitos. Vale ressaltar que

todos os procedimentos respeitaro os princpios bioeticos em todas as etapas.

17

6.2.1 Procedimentos gerais utilizados no cultivo animal

Todas as solues utilizadas para o cultivo celular sero preparadas com

gua ultra pura ou bidestilada. Todo o material utilizado, como vidrarias e solues

aquosas no-termolbeis, ser esterilizado em autoclave a temperatura de 120C e

1 atm de presso por 30 min. A esterilizao das solues termolbeis, tais como

meio de cultura, sero realizadas por filtrao sob presso atravs de membranas

de acetato-nitrato de celulose (0,22 m).

6.2.2 Modelos experimentais utilizando macrfagos

6.2.2.1 Obteno de macrfagos peritoneais

Ratos albinos Wistar (Rattus norvegicus) do biotrio da Universidade Positivo,

com aproximadamente trs meses de vida, pesando em torno de 300-350 g sero

utilizados para a obteno dos macrfagos peritoneais. Aps o sacrifcio dos animais

em cmara de gs, ser inoculado 10 ml de uma soluo estril de salina

tamponanda (PBS) mantida a 0C na cavidade peritoneal. As clulas do exsudato

peritoneal sero aspiradas e acondicionadas em tubos plsticos estreis, mantidos a

4 C at sua utilizao. As clulas sero centrifugadas por 1200 rpm por 7 minutos a

4 C e as clulas (pellet) sero ressuspensas em PBS estril. Para os experimentos,

a suspenso celular (105 clulas.ml-1) ser distribuda em placas de cultura estreis

de 24 poos com o meio de cultura essencial de Earle, na ausncia (controle) e na

presena das molculas-teste e, em seguida, as placas sero mantidas em estufa

incubadora de CO2 por 48 horas (MORETO et al., 2003).

18

6.2.2.2 Determinao da contagem e da viabilidade celular (mtodos de Azul de

Tripan e do MTT)

Na determinao da viabilidade celular e da contagem das clulas, ser

realizada pela tcnica do corante vital azul de Tripan (PHILLIPS, 1973). Este corante

penetra apenas em clulas em que a membrana plasmtica perdeu sua integridade.

As clulas coradas portanto, so consideradas como no viveis. A suspenso de

clulas ser diluda 50 vezes em soluo salina tamponada (PBS), e contadas

utilizando cmaras de Neubauer e microscpio ptico. A soluo de Azul de Tripan

ser preparada a 0,4% (m/v) em PBS. Para cada ml da suspenso celular ser

utilizado 0,1 ml da soluo do corante. A percentagem de clulas viveis ser

calculada atravs da seguinte relao: % clulas viveis = n de clulas no

coradas/n de clulas totais x 100. Neste trabalho sero utilizadas somente as

suspenses celulares com viabilidade acima de 95%.

Outro mtodo para se determinar a viabilidade celular, ocorrer pelo mtodo

do MTT (brometo de (3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazlio, Sigma Chem.

Co., St. Louis, USA) ser realizada de acordo com a metodologia descrita por

REILLY et al. (1998). Segundo o princpio do mtodo, as clulas viveis e

metabolicamente ativas reduzem o sal tetrazlio, formando cristais de formazan

solveis em 0,1ml de DMSO, possuindo cor roxa caracterstica. Para anlise da

viabilidade as clulas sero incubadas por 3 h a 37 C em atmosfera de 5% CO2 em

180 ml de soluo balanceada de Hanks (HBSS) mais 20 ml de soluo de MTT a

500 mg.ml-1, de modo a obter-se uma concentrao final em MTT de 5 mg.ml-1. A

seguir, o excesso de MTT ser removido e os cristais de formazan formados sero

dissolvidos em DMSO. A leitura da absorbncia em 550 nm, com filtro de 655 nm

19

como referncia, ser realizada em leitor de microplacas, utilizando-se o solvente

DMSO como branco (REILLY et al., 1998).

6.2.2.3 Produo de xido ntrico

A avaliao da produo de xido ntrico (NO) ser realizada indiretamente, a

partir da determinao da concentrao de nitrito, o qual um produto estvel da

reao de produo de NO no sobrenadante das culturas de macrfagos. Alquotas

de 100 l de cada sobrenadante sero centrifugadas (2000 rpm, por 5 min),

transferidas para placas de 96 poos e misturadas em igual proporo com o

reagente de Griess. Este reagente, na presena de nitrito, reage produzindo um

composto de cor lils. A densidade ptica (D.O.) de cada amostra ser ento

determinada em leitor de microplaca em 540nm. A concentrao de nitrito, presente

no sobrenadante das amostras ser calculada em relao a curva padro (10 M

80 M), utilizando como padro de nitrito de sdio diludo em meio de cultura

(MORETO et al., 2003).

6.2.2.4 Reteno de lisossomos

Para esta anlise ser utilizado o mtodo descrito por PIPE et al. (1995), onde

em uma placa do tipo ELISA ser depositado 100 l da soluo de macrfagos, 100

l de extrato nas respectivas diluies e 20 l de vermelho neutro a 2%. Aps 30

minutos, a placa ser centrifugada por 5 minutos a 1.500 rpm. O sobrenadante ser

descartado e os poos lavados com PBS para eliminar o vermelho neutro que no

ser internalizado pelas clulas. Posteriormente, 100 l de soluo de extrao ser

20

adicionado para solubilizar o vermelho neutro que estava dentro dos lisossomos.

Esta solubilizao possvel porque o vermelho neutro um corante catinico que

se difunde atravs da membrana celular e, uma vez presente no lisossomo, fica

aprisionado devido mudana de cargas causada pelo pH cido do sistema

lisossomal. Finalmente, aps 30 minutos, a placa ser analisada a 550 nm utilizando

o espectrofotmetro (Microplate reader Bio-rad - Benchmark). Vale ressaltar que os

dados sero expressos em nm/ 2x105 clulas.

6.2.2.5 Tcnica de anlise morfolgica atravs da microscopia de luz

As lamnulas que sero obtidas dos poos sero fixadas com soluo de

Bouin, durante 5 minutos temperatura ambiente e rotineiramente coradas com

Hematoxilina-Eosina, Giemsa e Hematoxilina-Azul de Alcian. A montagem da lmina

permanente ser realizada com resina Entelan (CUNHA, 2006).

6.2.3 Modelo experimental para avaliar o sistema complemento Modelo experimental

utilizando eritrcitos

6.2.3.1 Preparo das suspenses de eritrcitos de carneiro e coelho

Para a avaliao da hemlise sero utilizadas suspenses de eritrcitos de

carneiro (via clssica) e de coelho (via alternativa). Para o preparo da suspenso de

eritrcitos de carneiro sero colhidos, por puno venosa, 5 mL de sangue de

carneiro em tubos plsticos contendo o mesmo volume da soluo anticoagulante

Alsever. O material ser centrifugado por 15 minutos a 1000 g. Os eritrcitos do

21

pellet sero lavados trs vezes com tampo HEPES e aps a centrifugao final,

ressuspendidos no mesmo tampo na concentrao final de 0,6%. Para o preparo

da suspenso de eritrcitos de coelho foram colhidos, por puno cardaca, 5 mL de

sangue de coelho em tubos plsticos contendo o mesmo volume da soluo

anticoagulante Alsever. O material ser centrifugado por 15 minutos 1000 g. Os

eritrcitos do pellet sero lavados trs vezes com Tampo HEPES/EGTA com Mg+2

aps a centrifugao final, ressuspendidos no mesmo tampo na concentrao final

de 0,6%.

6.2.3.2 Avaliao da via alternativa

Alquotas de 100 l dos soros dos camundongos (grupos controle e teste)

sero incubados em tubos do tipo eppendorfs com 50 l da suspenso de

eritrcitos de coelho 0,6% em HEPES/EGTA com Mg+2, seguido da adio de 50 l

do mesmo tampo. Os tubos sero incubados durante 90 minutos a 37 C Os tubos

sero centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos e o sobrenadante transferido para

placas de fundo chato para posterior leitura a 405 nm.

6.2.3.3 Avaliao da via clssica

Para obteno de anticorpos anti - hemcias de carneiro, sero inoculados IP

em camundongos suos com peso entre 20-30g, 200 l de suspenso estril, de

eritrcitos de carneiro 2%. O soro desses animais ser obtido seis dias aps a

inoculao. O soro obtido ser incubado a 50C por 30 minutos para inativao do

complemento. Sero incubados em tubos do tipo eppendorfs 80 l dos soros de

22

camundongos (duplicata para cada grupo experimental) com 50l da suspenso de

eritrcitos de carneiro 0,6% em Tampo Hepes e ainda 50 l de anticorpo anti-

eritrcitos de carneiro diludo 1/10 em mesmo tampo. Os tubos sero incubadas

por 90 minutos 37 C e ento centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos. O

sobrenadante transferido para placas de fundo chato para leitura a 405 nm. Os

resultados obtidos de ambas as vias (percentagem de inibioda hemlise) sero

comparados com soros controles incubados apenas som o veculo dos extratos

onde a hemlise ser considerada como 100% de hemlise (sistema complemento

100% ativado).

6.3 Delineamento experimental e anlise estatstica

Para os ensaios biolgicos em macrfagos, cada tratamento consistir de 10

repeties (1 repetio = 1 poo da placa de cultura). Cada experimento ser

repetido pelo menos duas vezes. Para os ensaios biolgicos utilizando eritrcitos

humanos, cada experimento ser realizado em duplicata sendo repetido pelo menos

quatro vezes. Para os experimentos de ensaios de hemlise, os experimentos sero

repetidos trs vezes para concentrao a ser escolhida. Todos os dados obtidos nos

ensaios com macrfagos, viabilidade celular e teste de fixao de complemento e

inibio de hemlise sero submetidos a anlise de varincia ANOVA. Para avaliar

as diferenas entre os tratamentos e controle ser utilizado o teste de Tukey, que

permite estabelecer a diferena mnima significante entre duas mdias. Os

resultados sero expressos como mdia desvio padro (mdia dp) sendo

considerados estatisticamente significativos os valores comparados ao nvel de

significncia de p0,05.

23

6.4 Aspectos bioticos e de biosegurana

As atividades referentes ao bio-ensaios utilizando animais de laboratrios ou

sangue humano sero realizadas respeitando os critrios exigidos pelo conselho de

tica e pesquisa da Universidade Federal do Paran.

6.5 Coleta de dados sobre a utilizao da Uncaria tomentosa no Programa de

Fitoterapia de Londrina e sobre o conhecimento popular de plantas medicinais

A coleta das informaes sobre a utilizao da Uncaria tomentosa no

Programa de Fitoterapia de Londrina ser realizada empregando o uso de formulrio

ou questionrio semi-estruturado (MARTIN, 1995), destacando os aspectos com

relao s indicaes, modo de administrao, efeitos colaterais, contra-indicaes

e principais resultados obtidos. O pblico alvo para esta etapa ser os profissionais

envolvidos no Programa de Fitoterapia de Londrina.

A metodologia empregada para coleta de informaes sobre o conhecimento

e a utilizao popular da Uncaria tomentosa, incluir o uso de formulrio semi-

estruturado (MARTIN, 1995), abordando os aspectos como tipos de plantas

utilizadas e suas propriedades medicinais, tipos de doenas, o modo de

administrao e o conhecimento sobre efeitos txicos ou colaterais das plantas

utilizadas (Anexo 1).

O pblico alvo para esta etapa estaro localizados em centros comunitrios

ou associaes de bairro, de preferncia populao de adultos e idosos, os quais,

trazem consigo os conhecimentos populares adquiridos por herana. A escolha da

comunidade ser feita em momento oportuno.

24

importante destacar que a divulgao das informaes tcnico-cientficas

sobre a Uncaria tomentosa, ou qualquer outra espcie medicinal no tero o

propsito de incentivar a automedicao, nem indicar qualquer forma de tratamento

de quaisquer doena, nem substituir ou alterar qualquer tratamento sem o

consentimento mdico. Todo o material bibliogrfico dever ser publicado ou

transmitido de acordo com as normas tcnicas das legislaes vigentes*.

*(http://www.anvisa.gov.br, ANVISA Resoluo - RE n 88, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004

Determina a publicao da "Lista de referncias bibliogrficas para avaliao de segurana e eficcia

de fitoterpicos", Resoluo - RE n 89, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a

publicao da "Lista de registro simplificado de fitoterpicos" Resoluo - RE n 90, de 16 de maro

de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Guia para a realizao de estudos de

toxicidade pr-clnica de fitoterpicos" Resoluo - RE n 91, de 16 de maro de 2004

D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Guia para realizao de alteraes, incluses,

notificaes e cancelamentos ps registro de fitoterpicos", http://www.ibpm.org.br/legislao)

25

7 CRONOGRAMA

PERODO DE EXECUO

ETAPA MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ

Reviso bibliogrfica X X X X X X X X X X

Elaborao do projeto X X X X

Apresentao do projeto X

Preparo de materiais, solues e

reagentes

X X X X X X

Isolamento e caracterizao de

AGPs presentes em Uncaria

tomentosa

X X X X X

Experimentos biolgicos em

macrfagos: produo de xido

ntrico, reteno de lisossomos e

anlises morfolgicas

X X X X

Experimentos biolgicos em

eritrcitos: via clssica e via

alternativa do sistema

complemento

X X X

Anlises dos resultados e

redao de trabalhos cientficos

X X X X X

Coleta de informaes

etnobotnicas em comunidades

nativas e no programa de

fitoterapia

X X X

Elaborao da monografia X X X X X

Defesa da monografia X

26

8 RECURSOS FINANCEIROS

Os equipamentos e reagentes dos experimentos sero todos cedidos pelas

instituies de ensino: Universidade Federal do Paran (Departamento de

Bioqumica e Biologia Molecular; Departamento de Patologia Mdica), Universidade

Positivo e UNICENTRO (campus Guarapuava).

27

REFERNCIAS

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32

ANEXO

FORMULRIO PARA PESQUISA DE CAMPO ETNOBOTNICA E ETNOFARMACOLGICA DA UNHA DE GATO (Uncaria tomentosa Will DC.)

1. IDENTIFICAO DO ENTREVISTADO N: ________________________1.1. Nome....................................................................................................................................................1.2. Sexo [ ] masculino [ ] feminino1.3. Endereo: R: .........................................................................Bairro: ..................................................1.4. [ ]rea urbana [ ] rea rural1.5. Religio ou Crena...............................................................................................................................1.6. Idade: .............anos 1.7. Profisso:.............................................................................................................................................1.8. Estado civil [ ] solteiro(a) [ ] casado(a) outro:............................................................................1.9. Idade e nmero de pessoas que vivem na mesma casa:......................................................................1.10. Local de Nascimento, cidade e estado:..............................................................................................1.11. Onde foi criado (a), cidade e estado: ................................................................................................1.12. Grau de instruo ou escolaridade: [ ] analfabeto [ ] alfabetizado [ ] 1 grau completo [ ] 2 grau completo [ ] 3 grau completo Outros:.......................................................................1.13. Renda familiar [ ] 3SM [ ] conta prpria*SM salrio mnimo

2. CONHECIMENTO GERAL SOBRE A FITOTERAPIA E PLANTAS MEDICINAIS2.1. Compare a alopatia com a fitoterapia, citando vantagens e desvantagens.

2.2. Voc acredita que o uso de plantas medicinais no tratamento complementar alopatia? Pode ser usado como terapia nica?

2.3. Voc conhece e utiliza alguma planta de carter medicinal? E a unha de gato? Cite a(s) outra(s).

2.4. Qual(is) a(s) doena(s) que voc conhece na(s) qual(is) utiliza o tratamento base de plantas medicinais ?

2.5. Cultiva alguma planta medicinal? Como cultiva essas plantas?

2.6. Voc acredita na fitoterapia? Voc acha que esta terapia seja utilizada no combate ou controle de alguma doena?

2.7. Como adquiriu informaes sobre o tratamento de sintomas ou doenas usando plantas?[ ] Com familiar que conhecia o assunto [ ] Em livros [ ] Experincia pessoal Outros:....................................................................................................................................................

2.8. Sabe qual a origem do conhecimento da pessoa que lhe ensinou, caso tenhaaprendido com algum?..........................................................................................................................

2.9. Ensina para outras pessoas? [ ]Sim [ ] NoComo:.....................................................................................................................................................

33

3. CONHECIMENTO ESPECFICO DAS PLANTAS MEDICINAIS

Nome popular da planta

Descrio da planta(Como a reconhece)

Indicao no tratamento, contra-indicao e efeitos

colaterais (sintomas)

Parte utilizada da planta e melhor poca de

colheita*

Modo de extrao para no matar a planta (se

for raiz ou caule)

Freqncia e quantidade da dose administrada

Modo de preparo

Modo de Conservao

Observaes

* Estao do ano, fase da lua, hora do dia e/ou estado da florao

4. IDENTIFICAO DO ENTREVISTADOR4.1. Nome: ..................................................................................................................................................4.2.Idade:..............................................................4.3.Profisso:................................................................4.4. Contato:................................................................................................................................................