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Unidad9. Principios de Ingeniería GenéticaAplicaciones de Biología Molecular
• Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos
• Generación de moléculas de DNA recombinante
• Ingeniería Genética
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA) Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA)
(detergentes, proteasas, cambios de presión)
Separación del DNA del resto de los componentes celulares(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas,
solventes (fenol-cloroformo)
Repetir la extracción. Eliminación del fenol.
Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol
Disolver el DNA (Se concentra)
Análisis del DNA
Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría
Espectro de absorción de DNA
Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría
A260 = 1
50 µg/ml DNA dc
33 µg/ml DNA cs
40 µg/ml RNA
También se mide la relación de abs.
A260/ A280 => 1.8-2.0
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Separación en geles de agarosa (1–4%)
Electroforesis horizontal.
Migran al ánodo
Tinción con bromuro de etidio
Intercala entre las bases del DNA
Forman complejos fluorescentes
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Herramientas para el análisis de DNA.Enzimas de restricción y sus sitios de corte
• Son purificadas de bacterias
•Las enzimas de restricción son endonucleasas
•Rompen en sitios específicos del DNA
•Reconocen secuencias palíndromicas específicas de 4; 6 o 8 pb
•Algunas generan extremos romos y otros extremos cohesivos en el DNA al que cortan
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDOEXTREMOS COHESIVOS “STICKY”
DNA de un plásmido digerido con EcoRI
DNA genómico digerido con EcoRI
Extremos son compatibles
Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasaforma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas
VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS
INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR)
Corte del DNA con enzimas de restricciónLigación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector
Plásmido
DNA de interés
Tratamiento con enzima de restricción
Fragmentos de DNA con extremos cohesivos compatibles
Mezclar los fragmentos en presencia de una DNA ligasa
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CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA
Una biblioteca de DNA genómicoes un conjunto de fragmentos de DNA de un organismo y empaquetados en vectores (plásmidos), que son mantenidos en células bacterianas.
Digestióncon enzimasde restricción
DNA fragmentadoy clonado en plásmidos
Introducción de los plásmidos en bacterias
TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA
DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN
DNA de doble hélice
Desnaturalización: se genera DNA de cadena sencilla
Renaturalización: se forma DNA duplex
BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cDNA
Caja Petri con colonias de bacterias
Se hace una réplica de las colonias en la membrana
Lisis de las bacterias y desnaturalización del DNA con NaOH
Sonda: DNA de cadena sencilla marcado con 32P
Incubación con las sonda y
lavadoColonias con el plásmido de interés
Exposición a un film fotográfico. Detección de colonias con el plásmido de interés.
Membrana de nylon o nitrocelulosa
SÍNTESIS DE cDNA y construcción de una biblioteca de cDNA
Selección del tejido Extracción de RNAm
Hibridar con oligo-dT
Síntesis de cDNA con una transcriptasa
reversa
Síntesis de la segunda cadena de DNA
Eliminación del RNA
Las transcriptasasreversas son enzima virales. Sintetizan DNA usando RNA como molde
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Transferencia en Southern
Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Great Fountain Geyser,
Yellowstone. Manantial
Temperatura 55-80°C
Thermus aquaticus
TaqDNA Polimerasa
El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente
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La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones
• Detección de alelos mutantes caracterizados.• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.• Identificación de microorganismos patógenos.
– Caracterización de cepas del virus de la influenza
• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cDNA (Clonación de genes)
• Secuenciación de DNA• Generación de mutantes puntuales.• Estudiar la expresión génica.
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La era genómica. Secuenciación de DNA
La era genómica. Secuenciación de DNA
SECUENCIACIÓN DE DNA
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Secuenciación de Genomas
Aplicaciones de Biología Molecular
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción)
Diagnóstico genético. PCR
Producción de proteínas recombinantes en bacterias
Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas
Terapia génica
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción)
A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base.
Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser único.
Individuo 1 Individuo 2
Homocigoto Homocigoto
Este es el fundamento de pruebas de paternidad.
heterocigoto
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Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener la “huella genética”
Se utiliza la técnica de Southernblot
Mancha de Sangre
El DNA se extrae de las células sanguíneas
Digestión del DNA con enzimas de restricción
Los fragmentos de DNA se separan por electroforesisSouthern blot
Sonda de DNA marcada se une específicamente
La membrana se lava y se revela para detectar bandas de
interacción DNA-DNA
El patrón de DNA se compara con el de
“sospechosos”
Distrofia Muscular
Hemofilia
Neurofibromatosis
Esclerosis lateral
Inmunodeficiencia ADA
Hipercolesterolemia
Amiloidosis
Cáncer de mama
Enfermedad policística de hígado
Enfermedad de Tay-Sachs
Alzheimer
Retinoblastoma
Fenilcetonuria
Anemia falciforme
Neoplasia endócrina
Melanoma maligno
Exostosis múltiple
Fibrosis cística
Hemocromatosis
Poliposis
Enf. Huntington
Retinitis pigmentosa
Cáncer de colon
Enf. de Gaucher
Se han mapeado genes anormales causantes de enfermedades
Diagnóstico genético. PCR
Debido a que las mutaciones más comunes que son responsables de estas enfermedades ya están caracterizadas, se han establecido algunas pruebas genéticas:
Pruebas diagnósticas. Establecen o confirman el diagnóstico de un individuo que ya está afectado.
Pruebas pre-sintomáticas. Determinan con un alto grado de certeza si un individuo va a desarrollar alguna enfermedad.
Pruebas predictivas. Indican un elevado riesgo de una enfermedadpero no pueden establecer con certeza si un individuo va a estarafectado.
Estas pruebas genéticas son especializadas pues muchas de ellas involucran la amplificación del fragmento de DNA correspondiente al gen que se busca y la secuenciación del gen.
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Producción de proteínas recombinantes en bacterias.
Escalamiento y purificación de la proteína
Aplicaciones en Biotecnología Vegetal
• Plantas transgénicas que expresan proteínas que le confieren alguna propiedad agronómica importante:– Resistencia a plagas de insectos– Resistencia a herbicidas– Resistencia a virus
• Detección de microorganismos patógenos en plantas por métodos moleculares.– Virus, bacterias, micoplasmas
El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruza entre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacer selección y autocruzas para obtener un homocigoto.
Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hasta obtener el homocigoto con los caracteres deseados.
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La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de un gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para que tengan una nueva característica.
Una limitación importante es la transformación (introducción del DNA) de céluals vegetales.
Transformación por bombardeo
Transformación por Agrobacterium tumefaciens
Resistencia a plagas de insectos. Gusano barrenador en maíz.
En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) con actividad insecticida.
Toxinas Bt
El insecto ingiere la protoxina al alimentarse del tejido de la planta
La protoxina sufre proteólisis en el intestino del insecto y se genera la toxina activa
La toxina se une a receptores en las cel. epiteliales del intestino
La toxina se oligomeriza y forma poros en la MP de la cel. epitelial
Mecanismo de acción de las toxinas Bt
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La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable
Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos:
Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas.
Se incrementa el rendimiento
El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en los últimos años:
Controversias sobre plantas transgénicas.
• Los vectores para la transformación de plantas tienen marcadores de resistencia a antibióticos como marcadores de selección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar la transferencia resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas.
• Generalmente los marcadores de selección son KanR y NeoR
• Escape de genes del cultivo transgénico a malezas. Generación de supermalezas resistentes a herbicidas.
El caso de maíz en México.
México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y especies de maíz silvestre en México.
Transferencia de genes a estas especies.
Reducción en la diversidad?
Aislar el gen de interés y clonarlo en un vector.
Interrumpir el gen con una secuencia de DNA que confiera resistencia a un antibiótico.
Transformar células embrionarias totipotenciales con la secuencia quimérica de DNA.
Seleccionar las células transformadas en presencia del antibiótico.
Inyectar las células a embriones de ratón.
Transferir los embriones a una hembra para su desarrollo.
En la camada se obtendrán ratones heterocigotos (x/-)
Hacer una cruza entre dos heterocigotos.
El 25% será (-/-).
Animales transgénicos. Ratones “knock-out”