universidad autÓnoma del estado de...
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I
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS AMBIENTALES
FACULTAD DE QUÍMICA
MODULACIÓN DEL DAÑO GENÉTICO POR LA PROTOPORFIRINA-
IX EN D. melanogaster DEFICIENTE EN Cat y Sod Y TRATADA CON
CASIOPEINA (Cas III-Ea) Y Cr (VI)”
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRA EN CIENCIAS AMBIENTALES
PRESENTA:
LUZ MARIA VIDAL ESCOBAR
DIRIGIDA POR:
DR. JUAN CARLOS SÁNCHEZ MEZA
DR. ADALBERTO EMILIO PIMENTEL PEÑALOZA
TOLUCA, MÉXICO, OCTUBRE DE 2014
II
III
ESTA TESIS SE REALIZO EN SU TOTALIDAD EN EL INSTITUTO NACIONAL DE
INVESTIGACIONES NUCLEARES, COMO PARTE DEL PROYECTO CB-306
“MODULACIÓN DEL DAÑO GENÉTICO POR LA PROTOPORFIRINA-IX EN D.
melanogaster DEFICIENTE EN Cat y Sod Y TRATADA CON CASIOPEINA (Cas III-Ea)
Y Cr (VI)”
Biol. Luz Maria Vidal Escobar
IV
EL PRESENTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN FUE REGISTRADO BAJO EL
TÍTULO DE “MODULACIÓN DEL DAÑO GENÉTICO POR LA PROTOPORFIRINA-
IX EN D. melanogaster DEFICIENTE EN Cat y Sod Y TRATADA CON CASIOPEINA
(Cas III-Ea) Y Cr (VI)”.
EL PROYECTO SE INSCRIBE EN LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN DE
FARMACOLOGÍA Y TOXICOLOGÍA EN EL ÁREA DE EVALUACIÓN
FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA DE SUSTANCIAS Y SU APLICACIÓN, DEL
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS AMBIENTALES.
V
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACYT por la beca otorgada con número
de registro 481415.
Al Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares ININ por la beca otorgada.
ÍNDICE
1. Resumen 1
2. Introducción 3
3. Antecedentes
3.1 Especies reactivas de oxigeno y estrés oxidante 6
3.2 Metales pesados como inductores de estrés oxidante 8
3.2.1 Cromo como inductor de daño genético 9
3.3 Antioxidantes endógenos y exógenos 13
3.3.1 Capacidad antioxidante de las porfirinas 17
3.4 Uso de las casiopeínas® como antineoplásicos 21
3.5 Drosophila melanogaster como sistema de prueba 25
4. Justificación 32
5. Hipótesis 32
6. Objetivos 33
7. Material y método 34
8. Resultados 38
9. Discusión 44
10. Conclusiones 47
11. Referencias 48
12. Carta de envió de artículo 57
13. Artículo 58
1
1. RESUMEN
La contaminación ambiental se ha asociado con el incremento de enfermedades crónico
degenerativas. Dentro de los contaminantes más peligrosos se encuentran los métales pesados,
uno de ellos es el cromo hexavalente, considerado por la FDA como carcinógeno. Ante el
incremento de enfermedades relacionadas con la contaminación, surgen estrategias encaminadas
a combatirlas, una de ellas es la “quimio-prevención. Dentro de los compuestos con
características quimio-preventivas se encuentra la PP-IX, que ha mostrado tener propiedades
antioxidantes. Sin embargo el incremento en la incidencia de cáncer ha inducido al desarrollo de
nuevos antineoplásicos, uno de ellos son las casiopeínas, que son moléculas que tienen un centro
activo de Cu2+
. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del pre-tratamiento con PP-
IX sobre el daño genético y la productividad inducido por el Cr (VI) y la (Cas III-Ea). Para
evaluar la toxicidad de la PP-IX, se cuantifico la viabilidad de larvas pre-tratadas 24 h con: 0.69,
6.9 y 69 mM, para medir su capacidad antimutagénica se siguió el mismo pre-tratamiento, una
vez concluido las larvas se trataron con 0.025, 0.25. 1.25, 2.0 y 2.5 mM de CrO3. La
mutagenicidad de la Cas III-Ea se midió tratando larvas de 48 h de edad con 0, 0.1, 0.5, 1.0 y 1.5
mM. La toxicidad se evaluó con la concentración 1.0 mM de Cas III-Ea, cuantificando el
número de cerdas y el tamaño del ala. La productividad se evaluó en células germinales de
machos tratados con 0, 0.1, 0.5 y 1.0 mM de Cas III-Ea. Los resultados aportaron que la
concentración de 6.9 mM de PP-IX fue la que presentó menor toxicidad. La concentración de 69
mM de PP-IX fue la única que incremento la frecuencia de mutación basal. Los resultados del
efecto de la PP-IX sobre la acción del cromo indicaron que el potencial antimutagénico lo tiene
la concentración de 0.69 Mm, al reducir el daño inducido por las concentraciones de 0.25, 1.25,
2.0 y 2.5 mM de CrO3, las concentraciones de 6.9 y 69 mM de PP-IX solo disminuyeron el daño
inducido por 2.5 mM de CrO3. El tratamiento con Cas III-Ea, mostro que las concentraciones de
0.1, 1.0 y 1.5 mM incrementaron significativamente el daño genético, sin embargo no se mostró
relación con dosis. La toxicidad de 1.0 mM de Cas II-Ea indicó que disminuye tanto el número
de células como el área del ala. Los tratamientos con Cas III-Ea en las cepas deficientes en Cat y
Sod no afectaron su productividad. Se concluye que la concentración de 0.69 mM es las más
eficiente en disminuir el daño genético inducido por el CrO3 y que la Cas III-Ea induce daño
genético sin mostrar relación con la dosis y la deficiencia en enzimas antioxidantes.
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ABSTRACT
The environmental pollution has been associated with the increase of chronic degenerative
diseases. The heavy metals are among the most dangerous polluters; one of them is hexavalent
chromium Cr (VI), which is widely used in industry and it is cataloged as a carcinogenic. Due to
this situation the need of establish strategist focused to reduce the occurrence of degenerative
diseases arises; one of them is the “chemoprevention” which consist of the consumption of a
chemical compound of natural origin that inhibits or reverses the carcinogenic or mutagenic in its
pre-malign estate. The porphyrins are among the compounds with chemoprevention properties,
one of them is the protoporphyrin-IX (PP-IX) which has been associated with the synthesis of
antioxidant enzymes. The increasing number of cancer incidents has promoted the development
of new less toxic chemotherapeutics, but that show at the same time higher antitumor capacity,
one of them is the casiopeinas. These molecules have an active center of 2+ copper and have
shown cytostatic and cytotoxic activity. The objective of this research was to evaluate the
inhibitory action of the PP-IX of genetic damages induced by CrO3 and elicit the mechanism of
action of casiopeina III-Ea. To evaluate the toxicity of PP-IX larvae of 48 h of age for 24 h with
0.69, 6.9 and 69 mM were pretreated. To measure its antimutagenic capacity the same protocol
was followed but once the pretreatment was completed, the larvae were treated with 0.025, 0.25,
1.25, 2.0 and 2.5 mM CrO3. The Cas III-Ea mutagenicity was measured by treating larvae of 48
h of age with 0, 0.1, 0.5, 1.0 and 1.5 mM. The preparations with 1.0 Mm treatment were
photographed to quantify the number of bristle and wing size. Male with 0, 0.1, 0.5 and 1.0 mM
of mutagenic were treated paired with three litters of females for the productivity test. The results
provided that the concentration of 69 mM of PP-IX is toxic, and that the potential antimutagenic
has the concentration of 0.69 mM. When the induced damage was reduced by the treatment with
CrO3, 6.9 and 69 mM of PP-IX it just decreased the damage induced by 2.5 mM of CrO3. The
concentration 0.1, 1.0 and 1.5 mM of Cas III-Ea significantly increased the genetic damage
without showing doses response, the 1.0 mM concentration decreases both the number of cells as
the wing area. Cas III-Ea treatments in strain deficient Cat and Sod do not affect productivity.
We conclude that the concentration of 0.69 Mm is the most efficient in reducing the genetic
damage induced by CrO3 and that the Cas III-Ea induce genetic damage without showing doses
response nor the antioxidants enzymes deficiency.
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MODULACIÓN DEL DAÑO GENÉTICO POR LA PROTOPORFIRINA-IX EN D.
melanogaster DEFICIENTE EN Cat y Sod Y TRATADA CON
CASIOPEINA (Cas III-Ea) Y Cr (VI)”
2. INTRODUCCION
La exposición a contaminantes ambientales, ha traído como consecuencia el incremento de
enfermedades crónico degenerativas. Entre los contaminantes ambientales con mayor impacto a
la salud se encuentran los metales pesados, que de forma natural están presentes en el ambiente,
sin embargo las actividades industriales y mineras incrementan su concentración, lo que
constituye un riesgo serio para el medio ambiente y la salud. En particular el cromo hexavalente
es un metal que contamina el ambiente de manera severa por su utilización amplia en la
industria. Actualmente se sabe que es un elemento peligroso por su capacidad oxido reductora,
ya que durante este proceso se generan especies reactivas de oxígeno que dañan macromoléculas
e interfieren con el funcionamiento normal de la célula (Téllez et al., 2004; Lauwerys, 2007). El
Cr (VI) está catalogado como carcinógeno por la International Agency for Research on Cancer
(IARC, 1990), lo que lo coloca dentro de los metales de mayor importancia toxicológica (Edling
et al., 1986).
Ante este panorama surge la necesidad de establecer estrategias encaminadas a reducir la
ocurrencia de las enfermedades degenerativas provocadas por la exposición. La primera, consiste
en evitar la exposición a aquellos agentes que tienen la capacidad de modificar el material
genético y por lo tanto incrementar el riesgo de contraer padecimientos como el cáncer. Sin
embargo, en la práctica esto es casi imposible, pues muchos de ellos se encuentran de manera
natural en la atmósfera (Jakszyn and González, 2006). La segunda alternativa consiste en
incrementar el consumo de sustancias, principalmente aquellas de origen natural, capaces inhibir
o revertir la mutagénesis o la carcinogénesis en su estado pre-maligno, a esto se le denomina
“quimio-prevención”. Este nivel de prevención, está dirigido a los individuos clínicamente sanos
con la finalidad de evitar la mutación y la iniciación del cáncer, interceptando o inactivando los
mutágenos y/o carcinógenos o incrementando la expresión de las enzimas encargadas de la
reparación al ADN o las antioxidantes tales como superóxido dismutasa (Sod), catalasa (Cat) y
glutatión peroxidasa (Gpx) (De flora y Ferguson, 2005).
4
Entre los compuestos naturales con propiedades quimio-preventoras se encuentran las porfirinas,
una de ellas es la clorofilina cupro sódica (CCS). Se ha demostrado que la CCS reduce el daño
genético inducido por mutágenos químicos, mezclas complejas, componentes de la dieta y
radiación (Egner, 2001; Dashwood, 2002; Ferguson y Philpott, 2008). Aunque la mayoría de las
investigaciones han aportado evidencia de que la CCS es un excelente antimutágeno y/o
anticarcinógeno, algunas otras han demostrado que también puede incrementar el daño al ADN
ya sea el espontáneo (Rigonato et al., 2004; Pimentel et al., 2000) o el inducido por otros agentes
(Pimentel et al., 2000; Xu et al., 2001; Cruces et al., 2003; Cruces et al., 2009). Otros resultados
han sugerido que la CCS puede actuar como antioxidante (Boloor et al., 2000; Zhang et al.,
2008) u oxidante (Cruces et al., 2003) y que este efecto dual está relacionado con la
concentración (Cruces et al., 2009).
Recientemente se estudió la contribución de los dos principales componentes de la CCS, una
porfirina sin centro metálico (PP-IX) y el cobre, los resultados de esta investigación sugirieron
que el cobre es responsable de prolongar el efecto antimutagénico, mientras que la acumulación
en el organismo de la parte orgánica de la molécula (el grupo porfirínico) incrementa el daño
genético inducido (Pimentel et al., 2011). Afonso y colaboradores (1999), encontraron que la PP-
IX incrementa la actividad de la enzima catalasa y de la enzima superóxido dismutasa después de
su administración. Recientemente Pimentel y colaboradores (2013) encontraron que la PP-XI
incrementa el periodo de vida de la cepa silvestre Canton-S de Drosophila melanogaster,
mientras que no lo modifica en la cepa deficiente en catalasa, lo que infiere que la PP-IX brinda
protección contra el estrés oxidante en específico contra el radical H2O2.
Una vez que los mecanismos de defensa celular y las acciones de prevención no hayan sido
suficientes para evitar el desarrollo del cáncer, se están desarrollando antineoplásicos menos
tóxicos pero con mayor capacidad antitumoral para su tratamiento, uno de ellos son las
casiopeinas, una gran familia de moléculas que tienen un centro de cobre 2+ y un aminoácido
similar que da especificidad tumoral (Mejía y Ruiz, 2008). Hasta el momento se han sintetizado
alrededor de 100 casiopeinas, algunas de ellas han mostrado una clara actividad citostática y
citotóxica en cultivo de tejidos tanto sanos como cancerosos. Se ha postulado que la posible
5
capacidad antineoplásica de las casiopeinas se deba a que este compuesto interactúa con el ADN
por intercalación de sus compuestos aromáticos, al demostrarse su capacidad de inhibir la
proliferación celular y producir muerte celular por apoptosis dependiendo de la dosis (Galindo et
al., 2011).
El presente estudio tiene como fin evaluar el efecto del pre-tratamiento con PP-IX, sobre el daño
genético y la productividad inducido por el Cr (VI) y la casiopeina (Cas III-Ea).
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3. ANTECEDENTES
3.1 Especies reactivas de oxígeno y estrés oxidante
Durante los procesos biológicos y en la constante interacción con el ambiente, se generan
especies químicas conocidas como radicales libres. Un radical libre es cualquier especie que se
caracteriza por presentar uno o más electrones desapareados y por ser muy reactivos (Halliwell y
Gutteridge, 2006). Dentro de los radicales libres se encuentran las especies reactivas de oxígeno
(ERO), que son moléculas cuyos radicales contienen oxígeno.
La mayor parte de las ERO se produce por procesos como: la respiración, el transporte de
electrones en la mitocondria, la vía metabólica del citocromo P450, las respuestas inflamatorias y
las reacciones dependientes de oxígeno de diferentes enzimas. De forma exógena las ERO
pueden ser producidas por varios xenobióticos tales como: fármacos, compuestos clorados, iones
metálicos y la radiación (Valko et al., 2006).
El oxígeno molecular en su forma más estable (O2) se puede considerar como un radical libre por
tener dos electrones no apareados, lo que lo hace un potente agente oxidante, sin embargo, para
oxidar una molécula no radical y aceptar un par de electrones, estos deben estar paralelos a los
electrones del O2, esta condición hace que este acepte sólo un electrón a la vez, lo que explica
porqué reacciona lentamente con la mayoría de las moléculas no radicales.
La reducción parcial del oxígeno molecular genera otras ERO, que incluyen al anión superóxido
(O2-), al peróxido de hidrógeno (H2O2) y al radical hidroxilo (OH
·). El anión superóxido es un
radical simple, producido por el complejo uno y tres de la cadena transportadora de electrones en
la mitocondria, con la adición de un electrón al oxígeno molecular, el radical O2- puede ser
protonado a pH bajo (pKa = 4.8) para formar el radical perhidroxilo (HO2·). El H2O2 es estable y
menos reactivo que el O2 -, sin embargo, en presencia de metales de transición como el Fe
2+,
induce la formación del radical OH·. El OH
· es un oxidante muy fuerte y puede iniciar reacciones
en cadena con una gran variedad de moléculas orgánicas, que pueden originar la peroxidación de
lípidos, así como la inactivación de enzimas y la degradación de ácidos nucléicos (Halliwell y
Gutteridge, 2006) (Fig. 1).
7
Fig. 1. Química de las especies reactivas de oxigeno (ERO), (Tomado de Desikan et al., 2005).
Las ERO a concentraciones fisiológicas normales actúan como mensajeros secundarios, que
están involucrados en la regulación de la función y la actividad de varias vías de señalización
celular (Valko et al., 2007). Sin embargo el desequilibrio homeostático del proceso de oxido-
reducción (Redox) de la célula, induce a un estado conocido como estrés oxidante, que se origina
cuando los mecanismos de defensa antioxidante son sobrepasados (Martínez, 2005). El estrés
oxidante se ha relacionado con varias condiciones patológicas, que incluyen enfermedades
cardiovasculares, inflamatorias, envejecimiento celular, desórdenes neurológicos, diabetes y
cáncer (García et al., 1993, Valko et al., 2007).
La exposición a diferentes compuestos, principalmente aquellos de origen antropogénico son
responsables de la inducción de estrés oxidante en el hombre. Los individuos con mayor riesgo
son los trabajadores ocupacionalmente expuestos a agentes oxidantes. En el área farmacéutica
los más comunes son los anestésicos volátiles, que en el personal expuesto a ellos disminuye
significativamente la actividad antioxidante de los eritrocitos y los niveles de los elementos
trazas, concluyendo que el sistema antioxidante es afectado por el daño de los radicales libres en
anestesistas y enfermeros que han estado expuestos crónicamente. Otros compuestos que inducen
estrés oxidante por la inhibición del sistema antioxidante son el ozono, el disulfuro de carbono,
8
los petroquímicos y los plaguicidas. También los metales pesados como el plomo, el cromo, el
aluminio, el cobalto, el tungsteno, el níquel, el cadmio y el mercurio que son usados
ampliamente en la industria inducen estrés oxidante. (Georgieva et al., 2002; Zhou et al., 2003).
3.2 Los metales pesados como inductores de estrés oxidante
La contaminación atmosférica ha aumentado notablemente y su acción nociva se ha diseminado
sobre el planeta afectando a prácticamente todos los ecosistemas (EPA-600/1-78-023,1978).
Dentro de los contaminantes ambientales se encuentran los metales pesados, que tienen efectos
negativos en distintas etapas del desarrollo de los individuos, principalmente en el crecimiento y
supervivencia, el periodo más vulnerable son las primeras etapas del ciclo de vida. También
provocan alteración en el numero de descendientes y de eventos reproductivos, así como en la
ontogenia y en el periodo de vida (Natale et al., 2000; Boada et al., 2007).
Los metales han sido usados ampliamente en la industria debido a que tienen numerosas
aplicaciones comerciales, y en el diagnostico y tratamiento de enfermedades. Sin embargo varios
estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a algunos metales tiene efectos
tóxicos y carcinogénicos tanto en animales como en humanos (Valko et al., 2005).
La importancia de los metales en los sistemas vivos estriba en que participan en una gran
variedad de procesos biológicos. Se sabe que los metales modulan la expresión genética por
acción de varios factores transcripcionales que tienen importancia en el crecimiento, desarrollo y
muerte celular (Valko et al., 2006), a su vez la ausencia de los metales altera el crecimiento y
diferenciación celular (Evan y Vousden, 2001).
Es importante que los mecanismos encargados del almacenamiento, transporte y secreción de los
iones metálicos en la célula se encuentren en homeostasis (Bertini y Cavallero, 2008), ya que su
desequilibrio puede inducir a que el ion metálico en exceso se una a diferentes proteínas
reemplazando al metal original de su sitio de unión, o inducir estrés oxidante, incrementar la
peroxidación lipídica o interactuar con el ADN modificando su estructura (Halliwell y
Gutteridge, 2007; Valko et al., 2005).
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Algunos estudios se han enfocado en la toxicidad y carcinogenicidad que inducen los metales,
enfatizando su participación en la generación de especies reactivas de oxigeno, en la inhibición
de las enzimas antioxidantes y en la alteración de la permeabilidad de la membrana celular
(Jaime et al., 2007). Los metales tales como el hierro, el cobre, el cromo y el cobalto generan
radicales libres en los sistemas vivos, sin embargo se conoce poco de su participación en la
activación redox (Rahman, 2007; Mates et al., 2008). Posiblemente influyen en la reacción
cíclica durante la transferencia de electrones entre metales y sustrato, interviniendo en el
equilibrio homeostático (Lindeque et al., 2010).
3.2.1 Cromo como inductor de daño genético
El Cromo (Cr) es un metal con número atómico 24 y estados de oxidación +2, +3, +6 y peso
molecular 51.996, blanco plateado, brillante, duro, quebradizo y resistente a la corrosión (Marrett
et al., 1986). Los estados de oxidación del cromo más estables e importantes biológicamente son:
III, y VI (US Departament of Health, 1993), su efecto benéfico, la toxicidad y la
carcinogenicidad están relacionados con el estado de oxidación del metal.
El Cr (III) no es tóxico (Frausto da Silva y Williams, 1991; Gauglhofer y Bainchi, 1991), es
esencial para la dieta en dosis bajas y está presente en comida fresca como: pan, carne, vegetales
y agua potable (Vincent, 2010). El cromo (III) se requiere para potenciar la insulina y para el
metabolismo normal de la glucosa (Singh et al., 1998), colesterol y ácidos grasos (Téllez et al.,
2004). La carencia de Cr (III) en tejidos humanos se ha correlacionado con la incidencia de
diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, hiperglicemia, glucosuria, incremento de grasas
en el cuerpo y problemas de fertilidad (De Flora et al., 1995). Sin embargo, en concentraciones
altas es tóxico (Natale et al., 2000) ya que se ha encontrado que las especies de cromo (III) son
capaces de provocar peroxidación lipídica (Shi et al., 1993 b).
El estado hexavalente del cromo es más importante desde el punto de vista de la toxicología, es
considerado carcinógeno del grupo I por la International Agency for Research on Cancer (IARC,
1990), por lo tanto todos los compuestos de Cr (VI), independientemente de su grado de
10
solubilidad, son considerados carcinógenos, dependiendo de la dosis y del tiempo de exposición,
el órgano más susceptible a su carcinogenicidad es el pulmón y el riesgo se incrementa cuando
las concentraciones de Cr (VI) sobrepasan los mecanismos de defensa celular (Singh et al., 1998;
Quievryn et al., 2003).
El Cr (VI) ingresa al ambiente principalmente a través de residuos líquidos, debido a su amplia
utilización en la industria (Hamilton y Wheterhan, 1988). Está presente en los cromatos,
dicromatos y el ácido crómico (Edling et al., 1986) que se emplean en actividades tan diversas
como: la minería, la preservación de la madera, la soldadura, la fabricación de cemento, las
industrias del cuero, la fotográfica, la galvánica, la metalúrgica y la producción de acero
inoxidable (Casarett, 2001; Téllez et al., 2004), la industria textil, la industrias de papel y cartón,
la industria petroquímica, la fabricación de abonos, vidrio, pintura, asbesto, cerámica y
fungicidas (Bodar et al. 1990, Rengaraj et al., 2001). Todos estos procesos industriales
constituyen el 70% de emisión de Cr al ambiente.
Las vías de de exposición al Cr (VI) son: la inhalación, la ingestión y la absorción a través de la
piel. Durante la exposición ocupacional las vías respiratorias y la piel son la principal ruta de
entrada al cuerpo (De Flora et al., 1995). El mayor riesgo ocupacional es el procesamiento del
mineral cromita que se usa para producir cromatos, ya que se encontró que en los trabajadores
expuestos a este, la frecuencia de cáncer pulmonar fue muy elevada (Téllez et al., 2004;
Sunderman, 2001). Otro riesgo potencial lo constituyen las partículas liberadas por la quema de
soldaduras, especialmente de acero inoxidable que tiene entre 14 y 18% más contenido de cromo
(Frausto da Silva y Williams, 1991; Gauglhofer y Bainchi, 1991). El Cr (VI) se elimina
principalmente por vía renal (60%) y en menor grado por las heces, el cabello, las uñas, la leche
y el sudor (Can, 1995).
El Cr (VI) es reducido eficientemente por los jugos salivales y gástricos (De Flora, 2000) y
absorbido fácilmente por el intestino, posteriormente transportado por la sangre y distribuido a
nivel de médula ósea, pulmones, ganglios linfáticos, bazo, riñón, e hígado (ATSDR, 2006;
Lauwerys, 2007). El ascorbato es el reductor biológico más importante del Cr (VI) en células
bajo condiciones in vivo y tiene comportamiento dual en su toxicidad, propiedad antioxidante
11
fuera y pro-oxidante dentro de la célula (Quievryn et al., 2003). Un aspecto importante
descubierto por Standeven y Watterhahn en 1989, es que el cromo (VI) puede ingresar a la célula
a través de un canal iónico, impermeable al Cr (III). En este proceso el glutatión favorece la
absorción del cromo (VI) formando un aducto glutatión-Cr (VI). La conjugación con el glutatión
no siempre conduce a la eliminación del compuesto, contrariamente puede desempeñar un papel
importante como mediador de sus efectos adversos, convirtiéndose en el vehículo para el
transporte in vivo de ciertos metabolitos reactivos desde su sitio de formación a otros distantes
(Baillie y Slatter, 1991).
Los intermediarios reactivos que se forman durante su reducción son: Cr (V), Cr (IV) y Cr (III),
durante este proceso se generan los radicales hidroxilo, singulet de oxígeno, (ATSDR, 2006;
Lauwerys, 2007) y el anión superóxido que han sido detectados usando espectroscopia EPR.
También ha sido demostrado que el Cr (III) puede reducirse a Cr (II) por reductores biológicos y
generar el radical hidroxilo que se ha detectado por espectroscopia de resonancia de electrón
paramagnético y HPLA (Shi et al., 1993 b). Durante la reducción de Cr (VI) a Cr (III), los
radicales libres pueden quedar ligados a macromoléculas (ADN o proteínas) o pequeñas
moléculas (glutatión, cisteína) interfiriendo en el funcionamiento normal de la célula (Connett y
Whetterhahn, 1983) (Fig. 2). Las consecuencias más inminentes de su reducción son: daño o
ruptura a la cadena de ADN, formación de aductos cromo-ADN, enlaces cruzados del ADN,
enlaces cruzados entre ADN y proteínas, intercambio de cromátidas hermanas y aberraciones
cromosómicas (Singh et al., 1998; Téllez et al., 2004; Lauwerys, 2007). El daño al ADN es el
responsable de los cambios funcionales observados en la replicación y transcripción, aspectos
cruciales en el efecto carcinogénico de los compuestos de cromo (VI) (Standeven y Wetterhanh,
1989) (Fig. 3).
12
Fig. 2. Reducción biológica del Cr (VI), (Tomado de Jomovaa y Valko, 2011).
Fig. 3. Entrada del Cr (VI) a la célula y daño al ADN, (Tomado de Jomovaa y Valko, 2011).
Los procesos de reducción intracelular de Cr (VI) por los quelatos disminuyen potencialmente la
carcinogenicidad del ion metálico. En los eritrocitos, el proceso de destoxificación del Cr (VI),
se debe a que es reducido a estados de oxidación más bajos y forma complejos con proteínas
(Kerger et al., 1997), al acomplejarse no puede salir de la célula y dirigirse de nuevo al plasma
13
(Zhitkovich, 2005; De Flora et al., 1995). El proceso de reducción de cromo Cr (VI) a Cr (III)
por quelación no es absolutamente seguro, debido a que durante este proceso se generan varios
radicales libres, que pueden ser activados o destoxificados dependiendo del sitio de la reducción
intracelular y su proximidad al ADN.
La inhalación de niveles altos de Cr (VI) puede provocar irritación de la cavidad nasal y
dificultades para respirar (Izzotti et al., 1998). En la piel, el contacto con cromo puede causar
ulceras. También se ha asociado con el incremento en la taza de tumores estomacales en los
humanos y animales por beber agua contaminada con Cr (VI). En organismos de laboratorio se
ha observado daño a los espermatozoides y en el sistema reproductor de los machos.
En 1986, Kawanishi y colaboradores estudiaron la reactividad de compuestos de cromo con el
ADN y observaron que el cromo inducia rupturas a nivel de las bases nitrogenadas,
especialmente en la guanina y provocaba la formación de oligonucleótidos lo que indica la
ruptura del esqueleto de desoxi-ribosa fosfato. Un aspecto que cabe destacar es, que como
consecuencia de la interacción del cromato de sodio con agua oxigenada, se generan dos especies
altamente reactivas: el radical OH que reacciona con mononucleótidos y la desoxi-ribosa-5-
fosfato, y el radical O2 que reacciona con desoxiguanilato. La adición del agua oxigenada al
medio de reacción no es arbitraria, sino que responde al hecho de que en el cuerpo existen
fuentes de peróxido de hidrógeno.
En México el límite máximo permisible en la concentración de cromo en agua portable es de
0.05 mg/L. En el caso de la concentración en aire un ambiente seguro debe presentar menos de 5
µg de Cr (VI) por m3. La academia nacional de ciencia de EU ha establecido como seguro un
consumo en adultos de Cr (VI) de 50 a 200 µg por día (Institute of medicine, 2001).
3.3 Antioxidantes endógenos y exógenos
Halliwell y Gutteridge (1998) definieron como antioxidante a toda sustancia que cuando está
presente en una concentración menor, respecto a la de un sustrato oxidable, retarda o previene su
oxidación. Huang y colaboradores (2005), los definieron como aquellas sustancias que pueden
captar especies reactivas de oxígeno o de nitrógeno, o que tienen la propiedad de bloquear la
14
reacción redox y de inhibir los oxidantes reactivos que se forman, aparte algunos antioxidantes
realizan su función auto-oxidándose, acelerando la iniciación, propagación y terminación de la
reacción en cadena dando como resultado un radical antioxidante menos reactivo. Aunque los
antioxidantes difieren en su eficacia dependiendo del sustrato, algunos son muy eficaces
eliminando radicales libres y otros en formar quelatos (Niki y Noguchi, 2000).
El término antioxidante abarca una amplia gama de sustancias que se clasifican en endógenas y
exógenas (Fig. 4). Los primeros son los fabricados por el organismo como mecanismo de
protección celular y los exógenos son los que obtenemos de los alimentos.
Los organismos aeróbicos han desarrollado diferentes substancias para evitar el daño que
provoca el estrés oxidante, estos mecanismos antioxidantes son de carácter enzimático y no
enzimatico. Los antioxidantes no enzimáticos incluyen: al ácido ascórbico, el tocoferol, los
flavonoides, los alcaloides, la bilirrubina y los uratos. Estos eliminan directamente al anión
superóxido y al peróxido de hidrógeno por su capacidad antioxidante intrínseca (Halliwell,
2006). También se encuentra la vitamina E, presente en altas concentraciones en el germen de
trigo, la A en la zanahoria o el aceite de hígado de pescado y la C en los cítricos o la guayaba.
Los betacarotenos y flavonoides también son potentes antioxidantes exógenos (Potter, 1996).
Los antioxidantes enzimáticos incluyen a las enzimas: superóxido dismutasa (Sod), la ascorbato
peroxidasa (AP), la glutatión peroxidasa (Gpx) y la catalasa (Cat), las hemo proteínas y la
coenzima Q.
La Sod actúa como la primera línea de defensa en contra de las ERO, dismutando el O2.- en O2 y
H2O2, posteriormente la enzima Cat transforma al H2O2 en O2 y agua, mientras que la enzima
Gpx cataliza la reducción de peróxidos (ROOH, inclusive al H2O2) a alcoholes (ROH). El
tripéptido glutation (GSH, g-L-glutamil-Lcisteinil- glicina), debido a su alta concentración
intracelular (5-10 mM), se considera un regulador homeostático del estado de óxido- reducción
celular. Otras enzimas, tales como las quinonas reductasa y hemo oxigenasa también pueden
prevenir la formación de ERO mediante el intercambio de electrones.
15
Fig. 4. Compuestos antioxidantes (Tomado de Wootton y Ryan, 2011).
16
A la familia de la superóxido dismutasa la contituyen la Sod mitocondrial (Mn Sod) y la Sod
cobre/zinc (Zn/ Cu- Sod), estas dos enzimas dan cuenta del 100% de la actividad Sod
intracelular (Fridovich, 1997). En bacterias se ha identificado a la EC-Sod y la Cu/Zn-Sodp
o periplásmica en gram negativas cuya función es proteger a la célula contra el O2.- exógeno.
La última Sod descrita es una Ni Sod detectada en Streptomyces, es homotetramérica y no
tiene homología con las Sod antes descritas (Ríos, 2003)
La catalasa es una de las enzimas más abundantes en la naturaleza y se encuentra
ampliamente distribuida en los seres humanos, aunque su actividad varía dependiendo del
tejido; en el hígado y los riñones está más elevada, que en el tejido conectivo y el epitelial y
prácticamente no existe en el tejido nervioso. A nivel celular se localiza en las mitocondrias
y los peroxisomas (Chance et al., 1955). Esta enzima es una metaloproteína tetramérica
unidas por interacciones no covalentes, cuyo peso molecular se encuentra en el rango de
210-280 kD. Cada subunidad contiene un grupo prostético de protoporfirina IX, el contenido
protohémico y el hierro representan un 1,1 % y 0,09 % respectivamente del peso molecular
total de la enzima (Hadju et al., 1977).
Otro compuesto exógeno que ha mostrado capacidad antioxidante tanto in vivo como in
vitro es la clorofila, así como su derivado semi-sintético la clorofilina cupro-sódica (CCS),
que tiene un ión Cu+2
en el centro del anillo tetrapirrólico en lugar de Mg+2
como la clorofila
y tiene sustituido el grupo fitol por sodio que la hace más soluble que la clorofila. Ambas
moléculas son capaces de disminuir o inhibir el daño al ADN inducido por agentes
mutagénicos como la radiación ionizante (Zimmering et al., 1990; Pimentel et al., 1999;
Pimentel et al., 2000) la aflatoxina (Dashwood et al., 1991; Breinholt et al., 1995) y las
aminas heterocíclicas (Dashwood y Guo, 1995; Hayatsu et al., 1999). Se han propuesto
varios mecanismo de acción antioxidante, uno de ellos es que dona electrones a los radicales
libres provocando su inactivación (Boloor et al., 2000; Zhang et al., 2008), otro es mediante
el bloqueo de la peroxidación lipídica, o bien al inhibir las enzimas involucradas en la
activación de carcinógenos (Waters et al., 1996) y un último es que forma complejos con los
mutágenos o carcinógenos antes de que interactúen con el ADN (Chernomorsky et al.,
1999).
17
3.3.1 Capacidad antioxidante de las porfirinas
Las porfirinas son compuestos derivados de la porfina con sustituyentes químicos en la
periferia de su anillo. Están constituidas por cuatro anillos pirrólicos unidos a través de
cuatro puentes metilo para formar un macrociclo altamente conjugado (Fig. 5). (Smith,
1978).
Fig. 5. Estructura básica de las porfirinas
(Tomada de http://mazzally.wordpress.com/tag/heterociclicos/)
El diámetro del anillo pirrólico de las porfirinas es limitado y por lo tanto no puede
acomodarse fácilmente un metal cuyo radio iónico sea mayor a 2.01Å, lo que determina que
el ión central se encuentre o no en la molécula (Smith, 1978; Wei et al., 1992).
Las porfirinas desempeñan diferentes funciones metabólicas debido a sus sustituyentes
periféricos y al metal que ocupa el centro del macrociclo (Smith, 1978). Por ejemplo: el
grupo hemo está formado de un anillo de PP-IX con un ion hierro en el centro. El átomo de
hierro se encuentra en estado de oxidación +2 y puede formar cinco o seis enlaces de
coordinación dependiendo de la unión del O2 (Fig.6) (Lehmann y Carr, 1969).
18
Fig. 6. Molécula del grupo hemo
(Tomada de http://es.wikipedia.org/wiki/Hemo)
La clorofila, desempeña un papel esencial en la fotosíntesis, también contiene el anillo de
porfirina pero el ion metálico aquí es el Mg2+
(Fig 7). Su derivado semi-sintético la
clorofilina cupro-sódica contiene un ión Cu+2
en lugar de Mg+2
(Lai, 1979).
Fig. 7. Molécula de clorofila Fig. 8. Molécula de clorofilina
(Tomada de http://chemicalland21.com/lifescience/foco/CHLOROPHYLL.htm)
Las porfirinas más abundantes son las protoporfirinas y aunque pueden describirse 15
protoporfirinas isómericas, la protoporfirina-IX (PP-IX), es la única presente en la
naturaleza (Domínguez et al., 2003).
19
La PP-IX (Fig. 4) proviene de la biosíntesis del ácido 5-aminolevulínico (ALA) y es el
precursor inmediato del grupo hemo (Tschudy, 1983). Contiene dos grupos de ácido
propiónico, dos vinilos y cuatro metilos como cadenas laterales unidas a los anillos
pirrólicos de la estructura de la porfirina. Su síntesis se lleva acabo tanto en la mitocondria
como en el citosol.
Fig. 9. Estructura de la protoporfirina IX (PP-IX),
(Tomado de http://pt.wikipedia.org/wiki/Porfirina)
La protoporfirina-IX, forma complejos quelatos tetra-dentados con iones diversos como el
hierro, el zinc, el níquel, el cobalto, el cobre y el magnesio, en los que el metal se une por
enlaces coordinados a los cuatro nitrógenos de los anillos pirrólicos (Domínguez et al.,
2003).
La principal utilización que se le ha dado a la PP-IX es como fotosensibilizador (Kennedy et
al., 1990; Rick et al., 1997). La producción alta n de PP-IX, inducida al administrar ALA, se
refleja como una fuerte fluorescencia en ciertos tejidos, preferentemente en aquellos con
elevada proliferación celular como la piel, la mucosa oral del tracto respiratorio, la mucosa
vaginal, la cavidad anal, las glándulas salivales, los conductos biliares, la vejiga y la vesícula
seminal (Pottier et al., 1986; Kennedy et al., 1990).
20
La capacidad fotosensibilizadora de la PP-IX ha llevado al desarrollo de la terapia
fotodinámica (TFD), que es usada en los tratamientos contra daños superficiales en la piel,
principalmente carcinomas en células basales y escamosas (Kennedy et al., 1990; Fijan et
al., 1995). La TFD consiste en fotosensibilizar tejidos tumorales con PP-IX (Berger et al.,
2000) y posteriormente irradiarlos con luz de una longitud de onda apropiada, para generar
la formación de ERO con efectos citotóxicos, y conducir a la muerte selectiva de células
neoplásicas. La principal ventaja de la TFD es que el daño celular queda restringido a la
zona irradiada, con la consiguiente disminución de efectos secundarios sobre los tejidos
sanos próximos al tumor (Gibson y Hilf, 1985).
La importancia biológica de la PP-IX, radica en que la acumulación de éste pigmento
provoca las llamadas porfirias, que son un grupo de enfermedades causadas por
anormalidades metabólicas en la biosíntesis del grupo hemo, su efecto tóxico se debe al
desequilibrio de los sistemas Redox (Morehouse et al., 1987; van Steveninck et al., 1988),
por la sobreproducción de ERO, lo que conlleva a un incremento en la peroxidación lipídica,
que es la principal causa de daño al hígado (Comporti, 1985; Tribble et al., 1987; Kennedy
et al., 1990).
En ratas de la cepas CF1, la inducción de peroxidación lipídica, originada por la elevada
producción de PP-IX, incrementa la actividad de la enzima catalasa (Cat) en un 30%
después de 2h de su administración y de la enzima superóxido dismutasa (Sod) en un 70%
24 horas después, no obstante, esta ultima disminuye después de varias dosis de PP-IX. Este
estudio aporta evidencia de que la acumulación de PP-IX en el hígado induce estrés
oxidante, e incrementa la actividad de enzimas antioxidantes (Afonso et al., 1999).
La capacidad antioxidante de la PP-IX se probó recientemente en una cepa silvestre de D.
melanogaster, la PP-IX incrementó el periodo de vida, posiblemente por la capacidad
antioxidante del pigmento o por la inducción de enzimas antioxidantes. Mientras que en una
cepa deficiente en Sod el periodo de vida disminuyó, esto pudo deberse a la acción pro-
oxidante de la PP-IX por la producción del radical O2-, mientras que una cepa deficiente en
21
Cat el periodo de vida no se alteró, ya que posiblemente la PP-IX brinda protección contra el
estrés oxidante en específico contra el radical H2O2 (Pimente et al., 2013).
3.4 Las casiopeínas®, antineoplásicos de nueva generación
La alta incidencia de cáncer en el mundo requiere desarrollar compuestos menos tóxicos,
pero con mayor actividad antitumoral (Clarke et al., 1999). Dentro de estas moléculas se
encuentran los que contienen metales nobles como el cobre (Marzano et al., 2009).
Las casiopeínas (Cas) son una gran familia de moléculas que tienen como centro activo al
cobre 2+ y un aminoácido que las hace tumor específicas (Ruiz, 1994). Estas moléculas
fueron desarrolladas en el grupo de la Dra. Lena Ruiz Azuara en la facultad de Química de
la UNAM. La fórmula general de estos compuestos es [Cu(N-N)(N-O)]NO3 y [Cu(N-N)(O-
O)]NO3, donde N-N denota un sustituto de bipiridina o fenantrolina, N-O indica α-
aminoácido o péptido y O-O representa acetilacetonato o salicilaldehido. Para el diseño de
estas moléculas se consideraron varios factores, tales como: la existencia de un metal
esencial para disminuir la toxicidad y la presencia de quelatos hidrofóbicos que favorecen la
configuración cis alrededor del ion metálico, lo que las hace más estables y liposolubles
(García et al., 2001).
El cobre es un metal esencial en los sistemas vivos, debido a su participación en el
metabolismo energético, la respiración y la síntesis del ADN (De Vizcaya, 2003). La
actividad biológica del cobre involucra reacciones de óxido-reducción (Redox), provocadas
por su reacción directa con moléculas de oxigeno o peróxido de hidrógeno (H2O2) que
llevan a la producción de radicales libres (Rivero, 2007) y al incremento de ERO. Estas
reacciones redox a su vez son las responsables de la toxicidad del cobre (Sissi et al., 2005).
La presencia del átomo de Cu2+
en su estructura, sugiere que su modo de acción puede estar
relacionado con la generación de ERO (Trejo et al., 2005), a través de la reducción de Cu
(II) a Cu (I) mediante la reacción de Fenton (Bravo et al., 2009) que incluye la generación
de los radicales hidroxilo y superóxido (Fig. 10) (Trejo et al., 2005). La interacción de estos
radicales con el material genético, son probablemente los principales inductores de la
22
oxidación de bases y del rompimiento de las cadenas del ADN (Alemon et al., 2007),
también se asocian con la disfunción mitocondrial, el daño a la membrana lipídica y la
inhibición de la fosforilación oxidativa (Trejo et al., 2005; Rivero et al., 2007; Alemon et
al., 2008). Las casiopeinas que se han sintetizado se han probado en células in vitro y
provocan inhibición de la proliferación celular y cambios morfológicos en la célula (Mejia y
Ruiz, 2008) que conducen finalmente a su muerte por necrosis (De Vizcacaya et al.2000)
apoptosis o por la activación tardía de las vías dependientes o independientes de caspasas
(Trejo et al., 2005).
Fig. 10. Acción intracelular de las Casiopeinas, ejemplificado con la Cas IIgly.
(Tomado de Kachadourian et al., 2010)
Se han llevado a cabo experimentos para conocer los mecanismos de acción de las
casiopeinas, uno de ellos evaluó la acción de cuatro casiopeinas: la casiopeina II-gly (Cas II-
gly), la casiopeina III-Ea (Cas III-Ea), la casiopeina III-Ha (Cas III-Ha) y la casiopeina III-ia
(Cas III-ia) en células HeLa y Linfocitos, y se encontró que por si solas, no producen
fragmentación del ADN, pero cuando se les adiciona ácido ascórbico se origina una
degradación masiva, probablemente por la reducción del cobre por la generación de
radicales. En ambos tipos de células el daño al ADN por la Cas II-gly y la Cas III-ia, fue
completamente reparado después de 4 horas al periodo de incubación, las células expuestas
a Cas III-Ea tardaron más en repararse y las tratadas con Cas III-Ha no se recuperaron. El
efecto oxidante de las casiopeínas probadas se produjo en la siguiente relación: la Cas III-ia
muestra poco efectos, la Cas II-gly y Cas III-Ea genera alto porcentaje de oxidación
23
intracelular mientras que la Cas III-Ha es tan tóxica que no se puede evaluar su efecto. Por
medio del ensayo cometa se probó que todas las casiopeinas producen rompimiento en el
ADN con una relación dosis respuesta (Serment et al., 2011).
Las casiopeinas, exhiben capacidad antineoplásica, citostática y citotóxica en varias líneas
de células tumorales in vitro, así como en tumores implantados en ratón (Trejo et al., 2005;
Rodríguez et al., 2006; Carvallo et al., 2008) teóricamente, debido a que en las células
tumorales, los niveles de estrés oxidante están incrementados por su elevada actividad
metabólica, en comparación con las células normales por lo tanto, son más sensibles a
cambios en el balance redox (Nicco et al., 2005; Schumacker, 2006) se ha sugerido que las
casiopeinas pueden traspasar la membrana celular y entrar a la célula sin disociarse
moviéndose libremente al núcleo e interactuar con el ADN genómico (Alemon et al., 2007;
Serment et al., 2011).
En células de meduloblastoma también se ha documentado que las Cas II-gly y la Cas III-ia
produjeron alteraciones morfológicas tales como: contracción celular y formación temprana
de cuerpos apoptóticos. Su efecto antineoplásico se produjo por la inhibición de la
proliferación celular, por el incremento del número de núcleos con características
apoptóticas y a por la reducción de la permeabilidad de la membrana mitocondrial. La
elevada inducción de apoptosis que ejercen la Cas II-gly y III-ai, en células de
meduloblastoma las convierte en candidatos para el tratamiento del cáncer (Mejia y Ruiz,
2008).
La Cas IIgly (5µM/6 hr) induce la producción de ERO específicamente de H2O2 y a su vez
disminuye los niveles intracelulares de GSH y produce daño al ADN mitocondrial en células
H157 y A549 de cáncer de pulmón (Kachadourian et al., 2010). Rivero y colaboradores
(2007) también reportaron que la Cas II-gly es capaz de degradar el ADN de un plásmido en
presencia de ascorbato, dicho daño no es inhibido por la superóxido dismutasa (Sod) ni por
la Glutatión (GSH), pero si por la Catalasa (Cat) a una concentración de 40µg/ml frente a
una concentración de 10µM de Cas II-gly. La combinación de la Sod y la Cat inhiben la
degradación del ADN pero muy probablemente se deba únicamente a la participación de la
24
Cat. Los autores sugieren que el daño al ADN no es causado por la interacción directa de la
Cas II-gly con el ADN ya que la producción de ERO se origina cuando la Cas II-gly es
reducida por el ascorbato.
La casiopeina III-Ea (Fig. 11) cuya fórmula es [Cu(4,7-dimetil-
1,10fenantrolina)(acetilacetonato)]NO3, tiene alto efecto sobre células tumorales (Bravo et
al., 2009) y fuerte actividad antineoplásica, se ha reportado que esta casiopeína induce
apoptosis y reduce la talla y el volumen de tumores cultivados o implantados (Trejo et al.,
2005). También reduce la tasa de replicación e induce el desarrollo de pliegues a lo largo de
la membrana plasmática, otro efecto importante que se ha reportado es que la Cas III-Ea
afecta el metabolismo respiratorio en las células de mamíferos, al disminuir
aproximadamente el 25% de consumo de O2. La Cas III-Ea disminuye la actividad
mitocondrial y aparentemente no induce daño en la integridad del ADN mitocondrial, sin
embargo provoca disminución en su diámetro (López et al., 2011). La actividad de la Cas
III-Ea también ha sido evaluada en ratas con carcinoma hepático AS-30D mostrando
actividad antineoplásica a una dosis de 0.8 mg/kg.
Fig.11. Molécula de Casiopeina III-Ea
(Tomado de Vertiz et al., 2012)
Se ha demostrado que la actividad antineoplásica de las casiopeinas es entre 10 y 100 veces
mayor que la otros antineoplásicos conocidos como el cisplatino y que tienen un buen índice
terapéutico en tumores en modelos animales (Leal et al., 2007). Todo lo anterior hace de las
25
casiopeinas buenos candidatos para su utilización en humanos (Ruiz y Bravo, 2010; Trejo et
al. 2005).
3.5 Drosophila melanogaster como sistema de prueba
Drosophila melanogaster conocida también como mosca de la fruta o del vinagre, es un
organismo eucarionte, holometábolo, cosmopolita, que comparte los mismos ambientes que
el hombre (Vogel, 1987). Posee solamente 4 pares de cromosomas que han sido mapeados.
Su genoma fue secuenciado en 1998 y actualmente se sabe que está compuesto por 18
millones de pares de bases que codifican para 14 mil genes y que el 60% de estos, tienen
homología con genes que provocan enfermedades genéticas conocidas en el hombre y un
50% de sus secuencias proteicas tienen un análogo con mamíferos (Adams et al., 2000).
El vasto conocimiento de su biología y genética han hecho de este organismo un excelente
candidato para realizar estudios en diferentes disciplinas, entre los que destacan procesos
celulares, genéticos, biología del desarrollo, así como de genotoxicidad y anti-genotoxicidad
(Graf et al., 1998; Vogel et al., 1999; Andrade et al., 2004). Cabe señalar que las primeras
evidencias de mutagénesis inducida por agentes física y química en eucariontes, se probaron
en Drosophila melanogaster (Muller, 1927).
Drosophila melanogaster posee una serie de ventajas para la investigación, entre las que
destacan: su dimorfismo sexual, su tasa elevada de fecundidad, su tamaño, que permite
cultivar un número considerable de individuos en un espacio reducido; además de ser un
sistema económico y de fácil manipulación, su ciclo de vida es corto (10-12 días) (Fig. 6) en
condiciones controladas (25°C y 60% de humedad relativa) (Würgler et al., 1984).
Comparte gran cantidad de genes homólogos con los vertebrados (Bier, 2005). Se cuenta
con una gran cantidad de mutantes con los que se pueden diseñar diferentes protocolos.
También ofrece la posibilidad de realizar pruebas tanto en células somáticas como
germinales (Vogel, 1987). Otra de las ventajas del sistema, es la posibilidad de emplear
varias vías de administración de las sustancias: inhalación, inyección y principalmente la vía
26
oral, además se pueden combinar diferentes protocolos de administración: pre-tratamiento,
post-tratamiento, etc. (Würgler et al., 1984).
Fig. 6. Ciclo de vida de Drosophila melanogaster, (Tomado de
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Genenzima/Genenzima.htm).
Drosophila melanogaster permite detectar muchos eventos mutagénicos entre los que
destacan: sustitución de pares de bases, mutaciones génicas con efectos deletéreos,
mutaciones puntuales, pérdida de cromosomas, deleciones pequeñas que podrían ser
transmitidas como amorfas, re-arreglos cromosómicos, como inversiones y translocación; no
disyunción, recombinación mitótica, inducción de genes letales etc. (Zijilstra, 1987).
Drosophila melanogaster posee las enzimas dependientes de citocromo P450 necesarias
para activar metabólicamente una gran cantidad de promutágenos y procarcinógenos; estas
funciones enzimáticas son equivalentes a las que efectúa la fracción microsomal del hígado
del humano y se ha encontrado que contiene hidroxilasas, dimetilasas y transferasas. En el
sobrenadante mitocondrial se ha encontrado glutatión-S-transferasa y actividad de
fosfotransferasas, este proceso de bioactivación se encuentra en algunas regiones del tracto
27
digestivo, ciertas regiones del tejido gonadal y los tubos de Malpigio (Hodgson y Randy,
1991).
Prueba de mutación y recombinación somáticas (SMART)
La prueba de mutación y recombinación somáticas (SMART) en D. melanogaster es un
ensayo in vivo que permite la detección rápida y económica de agentes genotóxicos. Se
basan en la detección y cuantificación de eventos mutagénicos y recombinogénicos en
células somáticas (Graf et al., 1984; Vogel y Zijlstra 1987a).
Esta prueba fue desarrollada por Graf et al., (1984) y constituye el único ensayo descrito que
utiliza marcadores de alas para el estudio de mutación y recombinación somáticas. El ensayo
se lleva a cabo con larvas trans-heterocigotas para los marcadores multiple wing hairs
(mwh) y flare (flr), exponiéndolas al compuesto de prueba por periodos de tiempo de 1-96hr.
La prueba se basa en la perdida de la heterocigocidad de los genes marcadores, dando lugar
a las expresiones de los genes recesivos, mwh y flr (Graf et al., 1992) (Fig. 7).
Fif. 7. Fenotipos de los tricomas en la superficie del ala: a) fenotipo normal, b) tricomas no considerados mwh
o flr3, c) genotipo mwh, d) genotipo flr
3 (Tomado de Graf et al., 1984).
28
Las células blanco utilizadas en este ensayo son los discos imagales, que son las primeras
células de la larva que darán origen a las estructuras del adulto: ojos, antenas, alas y patas
(Atkins y Mardon, 2009). Si se produce una mutación en una de las células del disco imagal
dan lugar a la formación de clones mutantes que se detectan en los organismos adultos como
grupo de células o manchas en la superficie del ala.
La mutación mwh se ubica en el cromosoma 3, es recesiva, su origen es espontáneo y resulta
viable en homocigosis. Su manifestación fenotípica se caracteriza por la presencia de tres o
más tricomas en cada célula del ala en lugar de uno por célula, que es el fenotipo normal.
Los individuos de esta cepa presentan la siguiente configuración genética mwh, mwh. Las
alteraciones genéticas que pueden originar este fenotipo son las siguientes: mutación
puntual, deleción, recombinación mitótica entre los loci mwh y flr.
El gen flr3 está situado también en el cromosoma tres en la región 38.8, es recesivo y es
letal en homosigosis en la línea germinal, pero no en células somáticas. El fenotipo es
bastante variable ya que se pueden observar desde pelos cortos, gruesos y deformes, hasta
pelos amorfos con aspecto globular. En la cepa el gen flr presentan la constitución genética
flr/TM3, Ser. El marcador Ser da el fenotipo aserrado al borde del ala. El hecho de que las
mutaciones sean letales en homocigosis posibilita el mantenimiento de la heterocigosidad de
la cepa. Este fenotipo se debe, principalmente, a mutación puntual o a la deleción del alelo
silvestre y el centrómero.
El tamaño y el tipo de una mancha están determinados por el número de células que exhiben
el fenotipo mwh o flr3. Teóricamente, el número de células una mancha refleja el número de
divisiones celulares que ocurrieron después de la inducción del daño genético en la línea
celular. Las manchas se clasifica en dos grupos dependiendo de su tamaño: manchas chicas
con una o dos células afectadas y manchas grandes con tres o más células afectadas.
Dependiendo del fenotipo las manchas pueden ser sencillas: manchas mwh (Fig. 8), manchas
flr3
(Fig. 9), y manchas gemelas (Fig. 10), estas últimas se caracterizan porque en la misma
área tienen el fenotipo mwh y flr3 (Graf et al., 1984).
29
Fig. 8. Muestra los tricomas con el fenotipo normal de la superficie del ala y una mancha con tricomas con el
fenotipo mwh.
Fig. 9. Tricomas con el fenotipo flr3 en la superficie del ala de Drosophila melanogaster (mancha flr).
Fig. 10. Mancha gemela, se muestra en la misma área el fenotipo mwh y flr
Como se ha indicado anteriormente, D. melanogaster ofrece un conjunto de ventajas que la
hacen un organismo modelo para los estudios de genotoxicidad, habiendo desempeñado un
Tricomas con el
fenotipo normal en
el ala de Drosophila
Mancha con el
fenotipo mwh
Mancha con el
fenotipo flr
Mancha
gemela
30
papel muy importante en el desarrollo de la Toxicología genética. Las ventajas del uso de D.
melanogaster en la prueba SMART además de las antes descritas son:
Al exponer los discos imagales hay literalmente mayor número de células diana que
están potencialmente expuestas a los agentes genotóxicos a evaluar.
Permite mantener las moscas tratadas en alcohol al 70%, para posteriormente ser
montadas.
Se hacen preparaciones permanentes de las alas, por lo tanto, la verificación y
reconsideración es posible en base al material original.
El ensayo SMART es una excelente herramienta, debido a su alta sensibilidad,
rapidez y bajo costo.
Estas ventajas han hecho que el ensayo SMART sea ampliamente utilizado para la
evaluación genotóxica de un gran número de agentes químicos y físicos, con diferentes
mecanismos de acción (Graf et al., 1989). Además dada su alta versatilidad también se ha
aplicado para el estudio de los efectos antimutagénicos y otros efectos moduladores de
compuestos químicos y de mezclas complejas (Graf et al., 1998).
Se ha postulado que la recombinación es uno de los principales pasos de la carcinogénesis,
la cual puede detectarse con esta prueba (Wijnhoven et al., 2003; Wang et al., 2006).
Prueba de viabilidad huevo-adulto
Posiblemente entre de los componentes más importantes de la adaptación de los organismos
se encuentre la viabilidad y la fertilidad, ya que son indispensables para la sobrevivencia del
individuo y de las generaciones siguientes. Algunos factores importantes que influye en la
adaptación son las condiciones ambientales ya que de estas depende el tiempo de desarrollo
y la productividad de las hembras, (Fisher, 1930). Otro factor son los recursos, debido a que
una población en un ambiente limitado está en competencia, lo que afecta características
como la fertilidad en la hembra y el apareamiento en los machos (Pimentel et al., 2007;
Fong et al., 2008).
31
Algunos índices que se han medido para evaluar efectos deletéreos provocados al material
genético de alguna población, que son inducidos por diferentes alteraciones ambientales o
por la influencia de agentes antropogénicos que llegan al medio son: la velocidad de
desarrollo, que comprende el periodo de huevo a adulto; la viabilidad, que se define como
el porcentaje de individuos que alcanzan la madurez sexual con las características necesarias
para la sobrevivencia y la reproducción y la productividad, que se define como el número de
progenie producida por una hembra (Hiraizumi, 1961).
En una población de D. melanogaster se ha visto que la exposición crónica al gas radón,
actúa como un factor selectivo aumentando la viabilidad huevo-adulto (Pimentel et al.,
2006). Pero la sobrevivencia y la fecundidad no dependen de la densidad, mientras que la
viabilidad si depende de la fecundidad de los organismos.
32
4. Justificación
Recientemente en D. melanogaster, se encontró que la protoporfirina-IX tiene acción dual
anti y mutagénica. También se encontró que puede actuar como una molécula Cat mimética
ya que incrementa el periodo de vida de individuos deficientes en esta enzima y en
individuos sensibles al estrés oxidante. Uno de sus posibles mecanismos de acción, es a
través de la inducción de ERO y/o reduciéndolos. Para evaluar esta posibilidad, y basados en
que el Cr (VI) y posiblemente la Cas III-Ea ejercen su acción genotóxica y citotóxica a
través del aumento de los niveles de ERO, la presente investigación tiene como propósito
evaluar el papel de la protoporfirina-IX ante el daño inducido por el Cr (VI) en células
somáticas, así como evaluar la inducción de daño genético por la Cas III-Ea y su efecto en la
productividad de cepas deficientes en enzimas antioxidantes endógenas. Con el fin de
conocer, mediante este sistema de prueba si la PP-IX puede ser una alternativa para
utilizarse como tratamiento en individuos laboralmente expuestos a Cr VI, en caso de que la
PP-IX actúe como un agente anti-genotóxico y conocer si efectivamente el mecanismo de
acción de la Cas III-Ea es por la inducción de ERO al comparar su daño con el provocado
por el del Cr VI y asociarlo con la productividad de las cepas deficientes en antioxidantes
endógenos.
5. Hipótesis
El daño genético inducido por el Cr VI en los individuos pre- tratados con PP-IX será menor
que en los que no lo recibieron, y el daño genético inducido por la Cas III-Ea será
equivalente al de los individuos tratados únicamente con PP-IX y asociado a una baja
productividad de las cepas deficientes en antioxidantes endógenos tratadas con Cas III-Ea.
33
6. Objetivos
Objetivo general
Evaluar el efecto del pre-tratamiento con PP-IX sobre el daño genético y la productividad
inducido por el Cr (VI) y la (Cas III-Ea).
Objetivos particulares
1.- Evaluar la modulación de la PP-IX del daño genético inducido por el Cr (VI) en células
somáticas de Drosophila.
2.- Evaluar el efecto antioxidante de la PP-IX, sobre los radicales libres inducidos por el Cr
(VI).
3.- Evaluar el daño genético inducido por la Cas III-Ea en células somáticas de Drosophila.
4.- Medir la productividad de los individuos tratados con Cas III-Ea en cepas deficientes en
enzimas Cat y Sod.
34
7. Materiales y Métodos
Material biológico
Se utilizaron cepas de Drosophila melanogaster tales como: mwh +/mwh +; flr3/In (3LR)
TM3; Bds; Sod [n1] red [1]/TM3, Sb [1] Ser [1] y Cat [n1]/TM3, Sb [1] Ser [1] y Canton-S
(C-S). De cada una de ellas se aumentó el número de individuos mediante dos trasvases cada
dos días, en frascos lecheros de 1/4 L con medio regular. Se mantuvieron en el cuarto de
cultivo a 25°C y 60% de humedad relativa. Completado el ciclo de vida se utilizaron los
adultos.
Prueba de toxicidad de la PP-IX
Se cruzaron hembras vírgenes de la cepa mwh+ / mwh+ de 4 a 5 días de edad con machos
de la cepa flr3/In (3LR) TM3; Bds; de la misma edad, en frasco lechero de ¼ L con alimento
regular. Los huevos depositados durante 2 h de esta cruza se mantuvieron durante tres días
en un cuarto de cultivo a 25º C y 60% de humedad relativa. Cumplido el tiempo, se
colectaron larvas de segundo estadio mediante diferencia de densidad con una solución de
sacarosa al 20%. Con las larvas colectadas se hicieron grupos para pre-tratarse siguiendo la
metodología de Pimentel et al., (2011). Las concentraciones de pre-tratamiento de PP-IX
fueron: 0, 0.69, 6.9 y 69 mM (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) vía oral durante
24 h en frascos de ¼ L con un papel filtro impregnado con la solución correspondiente y se
mantuvieron en obscuridad en una estufa a 25º C y 60% de humedad relativa. Cumplido el
tratamiento se enjuagaron con agua corriente y se hicieron 10 grupos de 50 larvas por
tratamiento y se colocaron en tubos homeopáticos con 1.5 g de medio de cultivo sintético
hidratado. Las larvas concluyeron su desarrollo en el cuarto de cultivo a 25º C y 60% de
humedad relativa. Cumplido su desarrollo se conto el numero de adultos emergidos. Las
comparaciones entre tratamientos se analizaron con la prueba de X2.
35
Prueba de genotoxicidad
En el caso de los resultados dudosos, se empleó la prueba de mutación y
recombinación somáticas en el ala de Drosophila, SMART por sus siglas en inglés (Somatic
Mutation and Recombination Test) (Graf et al., 1984).
Tratamiento con trióxido de cromo (CrO3): Se aislaron hembras vírgenes de la cepa
mwh+ / mwh + y se dejaron madurar de 4 a 5 días, para cruzarlas con machos de la cepa
flr3/In (3LR) TM3; Bds; de la misma edad, en grupos de 10 parejas por frasco lechero de ¼ L
con alimento regular. Los huevos depositados durante 2 h se mantuvieron en un cuarto de
cultivo a 25º C y 60% de humedad relativa durante 3 días. Las larvas se colectaron y pre-
trataron de la misma forma y con las mismas concentraciones que se emplearon en la prueba
de toxicidad, siguiendo el protocolo de Pimentel et al., (2011). Después del pre-tratamiento
se enjuagaron con agua corriente y cada grupo se dividió en subgrupos para tratarlos
crónicamente con: 0, 0.025, 0.25, 1.25, 2.0 ó 2.5 mM de CrO3. El tratamiento con el
mutágeno se hizo en tubos homeopáticos con 1.5 g de medio de cultivo sintético hidratado
con 5 mL de agua destilada o la solución de Cr (VI) correspondiente y se dejaron desarrollar
en condiciones de laboratorio y obscuridad en una incubadora a 25°C y 60% de humedad
relativa. Cuando los adultos emergieron se fijaron en alcohol al 70%.
Con las alas de los descendencia mwh+/+ flr3 se hicieron preparaciones permanentes con
solución de Faure (goma arábiga, glicerol, hidrato de cloral y agua) (Graf et al., 1984). Las
alas de las preparaciones, se analizaron bajo un microscopio compuesto a 40X.
Tratamiento con Casiopeína III-Ea: Se siguió el mismo procedimiento de cruzas y colecta
de larvas que en los tratamientos anteriores. De las larvas colectadas se hicieron grupos para
tratarlas crónicamente con: 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0 y 1.5 mM de Cas III-Ea sintetizada y
proporcionado por la Dra. Lena Ruiz de la facultad de Química de la UNAM, y se continúo
con el método descrito anteriormente. Se hicieron tres experimentos de cada concentración,
tanto de Cr (VI) como de Cas-II-Ea.
36
El análisis estadístico de los resultados se realizó con el programa SMART a un nivel de
significancia de p < 0.05
Prueba de Productividad
Después de la propagación de las cepas C-S, Sod y Cat, se colectaron 300 machos de 1 día
de edad de cada cepa, para hacerles un seguimiento mediante un sistema de camadas, que
consiste en monitorear sus células germinales (espermatozoides, espermátidas y
espermatogonias).
Los machos de cada cepa se hambrearon durante 6 h. Después de este tiempo se trataron 24
h con: 0, 0.1, 0.5 y 1.0 mM de Cas III-Ea en tubos homeopáticos con medio de cultivo
sintético e hidratado con la solución correspondiente. Setenta y cinco machos por
experimento fueron probados por cada concentración. Después del tratamiento los machos
se aparearon con el mismo número de hembras de la misma edad durante tres días (camada
uno, colecta de espermatozoides) en frascos de vidrio de ¼ de L con medio de cultivo
regular. Después los machos se transfirieron a un segundo frasco con otro grupo de hembras
vírgenes por un periodo de tres días (camada dos, colecta de espermátidas), cumplido el
tiempo se transfirieron a un tercer frasco con otro grupo de hembras por tres días (camada
tres, colecta de espermatogonias). Los huevos depositados por camada se dejaron desarrollar
en condiciones de laboratorio a 25°C y 60% de humedad relativa. Cumplido su desarrollo se
conto el numero de descendientes.
El análisis de los resultados se hizo con la prueba de X2 y t-test a un nivel de significancia
de p < 0.05, para determinar diferencias entre cepas, camadas y tratamientos.
Pruebas de toxicidad de la Cas III-Ea
De las preparaciones permanentes se fotografiaron 40 alas tanto del control como de los
individuos tratados con la concentración 1.0 mM de Cas III-Ea, para contar el número de
cerdas de la región C' (ver Fig. 11), para calcular el número de cerdas totales. También se
calculó el área del ala con ayuda del programa Image J 1.46a (Collins, 2007). Estos datos se
37
extrapolaron para el cálculo de células y área total del ala. El análisis estadístico de los
resultados se hizo con la prueba t-test a un nivel de significancia de p < 0.05.
38
8.- Resultados
La Tabla 1 muestra los resultados de la toxicidad de las diferentes concentraciones de PP-
IX. El análisis estadístico indicó que la concentración más baja (0.69 mM) no disminuyó la
viabilidad, sin embargo sí disminuyó significativamente los sub-letales. La concentración de
6.9 mM fue la que presento menor toxicidad y menos letalidad (p < 0.05). La concentración
de 69 mM, incrementó significativamente los sub-letales (p < 0.05), sin disminuir la
viabilidad significativamente.
Tabla 1. Toxicidad de larvas mwh/flr3 de 48 h de edad, tratadas por 24 h con PP-IX.
Tratamiento
PP-IX (Mm)
No. De larvas No. De
larvas
viables + EE
% de
viabilidad
No. de sub-
letales + EE
% de toxicidad
0 500 387 ± 0.9 77.4 65 ± 1.0 22.6 0.69 500 394 ± 1.7 78.8 14 ± 0.5 21.2
6.9 500 447 ± 0.6 89.4* 23 ± 0.5 10.6 69 500 368 ± 0.5 73.6 115 + 1.2 26.4
*= significativo con respecto al control
La inducción de daño genético por las diferentes concentraciones de CrO3 se presenta en la
Tabla 2. Se puede observar que únicamente la concentración de 0.025 mM no incrementó el
daño genético, no obstante, el resto lo incrementaron con respecto a la dosis (p < 0.05).
Tabla 2. Frecuencia de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas en larvas de 48 h
de la cepa mwh +/+ flr3 por diferentes concentraciones de trióxido de cromo (VI).
Número de manchas por ala
Número
de alas
Manchas pequeñas
Manchas grandes
Manchas gemelas
Total de manchas
Tratamiento
CrO3 (mM) (1-2 células), m=2
(>células), m=5
m=5
m=2
0 160 0.24 (39)
0.09 (14)
0.01 (1)
0.34 (54)
0.025 120 0.26 (31) -
0.04 (5) -
0.03 (4) i
0.33 (40) -
0.25 150 0.43 (64) +
0.11 (16) -
0.05 (8) +
0.59 (88) +
1.25 118 0.63 (74) +
0.36 (42) +
0.14 (16) +
1.12 (132) +
2.0 40 0.87 (35) +
0.55 (22) +
0.55 (22) +
1.98 (79) +
2.5 94 2.86 (269) +
1.97 (185) +
2.12 (199) +
6.95 (653) +
Diagnostico estadístico de acuerdo a Frei and Wüergler (1988): + = positivo; - = negativo; w = débilmente positivo; i =
inconcluso; m = factor de multiplicación. Nivel de probabilidad: alfa = beta = 0.05.Prueba estadística de una cola.
39
En la Tabla 3 se muestran los resultados del efecto de la PP-IX (Sección 1 = 0.69 mM;
sección 2 = 6.9 mM y sección 3 = 69 mM) sobre la acción del cromo. La comparación del
efecto de la PP-IX indicó que solo la concentración de 69 mM incrementó la frecuencia de
mutación basal (p < 0.05). En cada panel se muestra la acción de la PP-IX contra el daño
genético inducido por las diferentes concentraciones de CrO3. El análisis estadístico se hizo
comparando los tratamientos combinados con su respectivo control positivo de la Tabla 2.
La concentración de 0.69 mM de PP-IX disminuyo significativamente el daño genético
inducido por las concentraciones de 0.25, 1.25, 2.0 y 2.5 mM de CrO3 (p < 0.05). El pre-
tratamiento con 6.9 mM de PP-IX solo redujo la frecuencia de mutaciones inducidas por 2.0
y 2.5 mM de CrO3 (p < 0.05). La concentración de 69 mM únicamente redujo el daño
genético inducido por 2.5 mM de CrO3 (p < 0.05).
40
Tabla 3. Frecuencia de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas por el
tratamiento de trióxido de cromo en larvas de 48 h mwh +/+ flr3 pre-tratadas 24 h con
0.69, 6.9 ó 69 mM de PP-IX.
Tratamiento
(mM)
Número de manchas por ala
PP-IX (+)
CrO3
Número
de alas
Manchas
pequeñas
Manchas
grandes
Manchas
gemelas
Total de
manchas
(1-2 células), m=2
(>células), m=5
m=5
m=2
Pre-tratamiento con PP-IX 0.69 mM (Sección 1)
0.69 120 0.33 (40) i
0.05 (6) -
0.03 (3) i
0.41 (49) -
+ 0.025 80 0.16 (13)i
0.02i (2) i
0.02 (2) i
0.21 (17) i
+ 0.25 76 0.30 (23)i
0.07 (5) -
0.01 (1) i
0.38 (29)+
+1.25 80 0.41 (80)+
0.10 (8) +
0.14 (11)-
0.65 (52)+
+ 2.0 40 0.80 (32)-
0.30 (12) -
0.10 (4)+
1.20 (48)+
+ 2.5 120 0.57 (69)+
0.32 (38) +
0.28 (33)+
1.17 (140)+
Pre-tratamiento con PP-IX 6.9 mM (Sección 2)
6.9 120 0.23 (28) -
0.05 (6) -
0 (0)
0.28 (34) -
+ 0.025 40 0.26 (8) i
0.08- (3) -
0 (0)
0.28 (11) i
+ 0.25 80 0.31 (25) i
0.14 (11) -
0.04 (3) i
0.59 (88) -
+ 1.25 78 0.51 (40) -
0.37 (29) -
0.12 (9) -
1.0 (78) -
+ 2.0 40 0.68 (27) i
0.35 (14) i
0.47 (19) -
1.50 (60) w
+ 2.5 120 0.64 (77) +
0.32 (38) +
0.23 (28) +
1.19 (143) +
Pre-tratamiento PP-IX 69 mM (Sección 3)
69 160 0.51 (81) +
0.14 (23) -
0.01 (2) i
0.66 (106) +
+ 0.025 120 0.37 (45) -
0.08 (10) -
0 (0)
0.46 (55) -
+ 0.25 120 0.32 (39) -
0.08 (9) -
0.02 (2) i
0.42 (50) i
+ 1.25 80 1.51 (121) -
0.56 (45) -
0.40 (32) -
2.47 (198) -
+ 2.0 40 1.0 (40) -
0.68 (24) -
0.55 (22) -
2.15 (86) -
+ 2.5 140 0.92 (129) +
0.46 (64) +
0.4 (56) +
1.78 (249) +
Diagnostico estadístico de acuerdo a Frei and Wüergler (1988): + = positivo; - = negativo; w = débilmente positivo; i =
inconcluso; m = factor de multiplicación. Nivel de probabilidad: alfa = beta = 0.05.Prueba estadística de una cola. La
comparación se realizo entre cada una de las concentraciones de PP-IX+ CrO3 con respecto a su control positivo incluido
en la tabla 1. Los signos que se indican en la concentración de PP-IX, resultan de la comparación con el control negativo.
41
Los resultados relacionados con el efecto genotóxico de la Cas III-Ea se muestran en la
Tabla 4. Las concentraciones de 0.1, 1.0 y 1.5 mM incrementaron significativamente la
frecuencia de daño genético (p < 0.05). Aunque no se observa una relación dosis respuesta.
Tabla 4. Frecuencia de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas por diferentes
concentraciones de la Cas III-Ea en larvas de Drosophila melanogaster.
Manchas por ala (número de manchas)
Número
de alas
Manchas pequeñas
Manchas grandes
Manchas gemelas
Total de manchas
Tratamiento
Cas III-Ea
(Mm) (1-2 células), m=2
(>células), m=5
m=5
m=2
0 184 0.25 (46) 0.08 (15) 0.01 (1) 0.34 (62)
0.01 36 0.33 (12) i
0.06 (2) -
0 (0) i
0.39 (14) -
0.1 239 0.49 (116) +
0.06 (15)-
0.02 (4) i
0.57 (135) +
0.5 158 0.39 (61) +
0.05 (8) -
0.03 (4) i
0.46 (73) -
1 311 0.44 (136) +
0.5 (17) -
0.01 (4) i
0.5 (175) +
1.5 142 0.44 (62) +
0.06 (9)-
0.03 (4) i
0.53 (75) + Diagnostico estadístico de acuerdo a Frei and Wüergler (1988): + = positivo; - = negativo; w = débilmente positivo; i =
inconcluso; m = factor de multiplicación. Nivel de probabilidad: alfa = beta = 0.05.Prueba estadística de una cola.
Los resultados de la productividad en la cepa control C-S y las cepas Cat y Sod se muestran
en la Tabla 5. El efecto de la Cas III-Ea en el desarrollo de las células germinales de los
machos, se puede ver con los resultados organizados por camadas. La camada uno
corresponde al daño en espermatozoides, la dos en espermátidas y la tres en
espermatogonias. En la camada uno de la cepa C-S, las concentraciones 0.5 y 1.0 mM,
incrementaron significativamente (p < 0.05) la productividad de los machos, sin embargo no
fue con respecto a la dosis, en la camada dos la concentración de 1.0 mM la disminuyó (p <
0.05). Para el caso de las cepas deficientes en Cat y Sod las diferentes concentraciones de
Cas III-Ea no afectaron la productividad.
42
Tabla 5. Productividad de los machos de las cepas tratadas con Cas III-Ea.
Cepa
Tratamiento
Cas III-Ea (mM)
Camada I Camada II Camada III
MT D
P Valor
de p
MT D
P Valor
de p
MT D
P Valor
de p (D/ MT) (D/ MT) (D/ MT)
C-S
0 150 1545 10.3
140 1690 12.07
133 1970 14.81
0.1 150 1643 10.95 0.21
143 1351 9.448 0.07
146 1458 9.986 0.17
0.5 150 1792 11.95 0.02↑
146 1685 11.54 0.49
141 1753 12.43 0.37
1.0 150 1791 11.94 0.03↑ 145 1326 9.145 0.05↓ 134 1847 13.78 0.42
Sod
0 150 935 6.233
147 1251 8.51
147 1307 8.891
0.1 150 953 6.353 0.4
142 1029 7.246 0.09
142 1391 9.796 0.35
0.5 145 959 6.614 0.33
137 1178 8.599 0.34
127 1197 9.425 0.31
1.0 150 1000 6.667 0.17 144 1245 8.646 0.49
139 1415 10.18 0.32
Cat
0 150 839 5.593
138 816 5.913
132 934 7.076
0.1 150 824 5.493 0.47
142 755 5.317 0.36
129 946 7.333 0.48
0.5 150 691 4.607 0.13
143 962 6.727 0.24
132 984 7.455 0.43
1.0 150 868 5.787 0.41
119 935 7.857 0.3 115 1125 9.783 0.26
*MT=machos tratados, D= descendencia, P= productividad.
En la Tabla 6, se muestra el efecto de 1.0 mM de Cas III-Ea sobre el número de cerdas por
ala y el tamaño de los individuos. La Cas III-Ea disminuyó 10% (p < 0.001) el número de
cerdas por ala. Las hembras, redujeron su tamaño 19% (p < 0.001) y los machos 16.7% (p <
0.01) (Fig. 11).
Tabla 6. Efecto del tratamiento con 1 mM de Cas III-Ea en el tamaño y número de
cerdas por ala.
Tratamiento Cas III-Ea
(mM)
No. de alas analizadas
No. de cerdas/ala No de alas Tamaño del ala
♀ ♂
0
40
15461 ± 4.1
42
3.70 ± 0.03 2.79 ± 0.06
1 40 13949 ± 6.3 *↓ 42 2.31 ± 0.07*↓ 1.75 ± 0.03 *↓ *= p < 0.001, ↓= indica disminución en el número de cerdas
43
Fig. 11. Muestra la dimensión de las alas de D. melanogaster con dos tratamientos: a) control, b) tratamiento
con 1mM de Cas III-Ea.
44
9. Discusión
La PP-IX es una molécula esencial para los sistemas vivos, que en homeostasis con el
organismo no le provoca efectos adversos. Si embargo se ha reportado que su acumulacion
en el higado debido a la incapacidad de eliminarla provoca un grupo de enfermedades
llamadas porfirias (Kennedy et al., 1990). Su efecto toxico se debe al desequilibrio de los
sistemas redox por la sobreproduccion de ERO, lo que provoca peroxidación lipídica y que
constituye la principal causa de daño al hígado (Comporti, 1985; Tribble et al., 1987). Lo
anterior podría explicar porque la concentracion de 69 mM de PP-XI, en esta investigación,
fue la que indujo mayor toxicidad, provocada principalmente por dañó genetico ya que
también provocó un mayor número de subletalidad. En el caso de las concentraciones más
bajas, 0.69 y 6.9 mM la toxicidad fue menor comparada con el control aunque nó
significativamente, sin embargo el número de subletales fue significativamente menor (14 y
23 respectivamente). Se ha reportado que la PP-IX estimula la síntesis de las enzimas
antioxidantes como la catalasa y la superóxido dismutasa (Afonso et al., 1999).
Probablemente las concentraciones bajas de PP-IX están estimulando los sistemas de
defenza antioxidante del organismo, lo que podría explicar el incremento en la viabilidad y
la disminucion de subletales.
La agencia internacional de investigación del cancer (1990) ha clasificado al Cr (VI) como
carcinógeno del grupo I. Los antecedentes indican que uno de los mecanismos por el que
inducen daño al material genético, es por la producción de radicales libres durante su
reducción de Cr (VI) a Cr (III) (Singh et al., 1998; Téllez et al., 2004; Lauwerys, 2007). Los
resultados obtenidos en esta investigación confirman su alto potencial mutagénico; a partir
de la concentración de 0.25 mM la frecuencia de daño se incrementó con relación a la dosis.
De las tres concentraciones de PP-IX probadas, la concentración más baja (0.69mM) fue la
más eficiente. Es probable que la reducción del daño genético inducido por el CrO3 se debe
a la capacidad de la PP-IX de donar electrones a las ERO generadas por el cromo. Sin
embargo, también se ha reportado que la PP-IX al carecer de centro metálico tiene gran
capacidad de formar complejos con diversos metales, se sabe que la ferroquelatasa puede
45
catalizar la incorporación de algunos metales en el centro de la molécula de PP-IX (Smith,
1978).
Otro mecanismo por el que la concentración de 0.69 mM pudiera ejercer mayor efecto
antimutagénico puede deberse a que la cantidad de moléculas de PP-IX es equivalente con
las de CrO3 evitando así que el exceso de PP-IX pueda inducir daño oxidante. Los resultados
obtenidos con las concentraciones de 6.9 y 69 mM dan evidencia de la explicación anterior,
la disminución de daño genético posiblemente no se deba completamente al
acomplejamiento de la PP-IX con el cromo, sino que el exceso de PP-IX y la elevada
concentración de CrO3 ejercen un efecto sinérgico incrementando la toxicidad y la
ineficiencia para disminuir el daño genético a medida que aumenta la concentración de PP-
IX. La baja viabilidad podría indicar muerte celular como se observa con la concentración
más alta de 69 mM de PP-IX (ver Tabla 1), no obstante se observó una disminución
importante del daño genético lo que confirma la acción inhibidora neta de la PP-IX.
Con relación a los resultados obtenidos con los tratamientos de Cas III-Ea, observamos que
las concentraciones de 0.1, 1.0 y 1.5 mM de Cas III-Ea incrementaron significativamente la
frecuencia de mutaciones, sin embrago a pesar de que el aumento fue significativo no hubo
un efecto mutagénico relacionado con la concentración. Se ha propuesto que uno de los
mecanismos de acción de las casiopeinas, es a través de la generación de radicales libres
durante el proceso de reducción de Cu (II) a Cu (I) (Trejo et al., 2005), momento en el cual,
los radicales al interactuar con el material genético pueden provocar diversos eventos como
la oxidación de bases y el rompimiento de la hebras de ADN (Alemon et al., 2007). Para
comprobar esta explicación, se midió la productividad de los machos deficientes
(hipomorfos) en Sod o Cat tratados con Cas III-Ea. Se observó un cambio mínimo en la
productividad de los machos de la cepa C-S, las concentraciones de 0.5 y 1.0 mM de Cas
III-Ea, deóbido a que incrementan significativamente la productividad de los machos,
probablemente es el resultado de un aumento de la calidad de los espermatozoides, no
obstante, las espermátidas (camada 2), fueron afectadas por la concentración de 1.0 mM ya
que disminuyó drásticamente su productividad. En el caso de las cepas deficientes en
enzimas antioxidantes, la productividad no se alteró con ninguno de los tratamientos de Cas
III-Ea, por lo que podemos sugerir que el daño genético de las casiopeinas es debido a la
46
inducción de radicales libres aunque no se pudo comprobar con estos resultados. El daño
inducido al ADN observado no es producido en su totalidad por daño oxidante, la falta de un
efecto relacionado con la dosis tanto en la inducción de daño genético como en la
productividad, no permite apoyar que el mecanismo de la Cas III-Ea sea por inducción de
estrés oxidante como ha sugerido Alemon et al. (2008) y Trejo et al. (2005).
A pesar de que los resultados de la mutagenisidad de la Cas III-Ea no fueron concluyentes,
resulta interesante el efecto que tuvo el tratamiento de 1 mM. La toxicidad fue muy elevada
y los individuos que lograron sobrevivir tuvieron una talla reducida. Tanto los machos
como las hembras, presentaron una disminución entre el 16.7 y el 19% respectivamente; el
número de cerdas por zona de las alas también disminuyó en un 10% (ver Fig. 11), estos
resultados aportan mayor información sobre la toxicidad elevada de la Cas III-Ea. Con la
disminución en el número de cerdas de las alas analizadas se confirma su alta citotoxicidad
y no solo una reducción en el tamaño celular. Más aún, los individuos que presentaron un
menor tamaño y número celular, fueron completamente fértiles y muy productivos. Cabe
mencionar que esta es la primera vez que se reporta este efecto de la Cas III-Ea. Con estas
observaciones, quedan abiertas muchas preguntas relacionadas con la explicación de estos
efectos.
Otros posibles mecanismos de acción de la Cas III-Ea pueden estar relacionados con el daño
a la mitocondria, el daño a la membrana lipídica o la inhibición de la fosforilación oxidativa
(Trejo et al., 2005; Rivero et al., 2007; Alemon et al., 2008), lo que en nuestro sistema no
pueden probarse, sin embargo sí se corroboran los resultados reportados por Mejia y Ruiz
(2008) quienes encontraron en células in vitro que la Cas III-Ea provocan inhibición de la
proliferación y cambios morfológicos en la célula.
47
10. Conclusiones
El tratamiento con 0.69 y 6.9 mM de protoporfirina-IX no fueron genotóxicos, mientras que
la concentración de 69 mM incrementó dos veces la frecuencia basal de daño genético.
Solo la concentración más baja de PP-IX (0.69 mM) redujo el daño genético inducido por 4
de las cinco concentraciones de cromo (VI) probadas.
La acción antimutagénica de la PP-IX muy probablemente se deba a su capacidad de formar
complejos con el CrO3.
La Cas III-Ea provocó daño genético sin mostrar relacionado con la dosis.
La Cas III-Ea provocó la muerte y la disminución del tamaño de las células del ala de los
individuos tratados en estado larvario con una concentración de 1 mM. No obstante, fueron
viables y su fertilidad no fue afectada.
El hecho de no haber encontrado ninguna afectación en la productividad de los individuos
deficientes en enzimas antioxidantes tratados con la Cas III-Ea, no podemos descartar que
esta molécula sí induce estrés oxidante, sin embargo, no es el mecanismo principal por el
que provoca la genotoxicidad. Estos resultados, no apoyan el mecanismo de acción por
estrés oxidante de la Cas III-Ea propuesto por Trejo et al. (2005).
48
11. Referencias
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57
12. CARTA DE ENVIÓ DE ARTÍCULO
Adalberto Emilio Pimentel Peñaloza
De: [email protected] en nombre de Toxicology Letters
Enviado el: domingo, 10 de agosto de 2014 05:37 a.m.
Para: Adalberto Emilio Pimentel Peñaloza; [email protected]
Asunto: Submission Confirmation for
Dear Dr. Emilio Pimentel,
Your submission entitled "Genetic damage induced by CrO3 can reduce by low doses of
Protoporphyrin-IX in somatic cells of Drosophila melanogaster" has been received by Toxicology
Letters
You may check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier Editorial System as an
author. The URL is http://ees.elsevier.com/toxlet/.
Your username is: [email protected]. If you need to retrieve password details, please
go to: http://ees.elsevier.com/toxlet/automail_query.asp.
Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned.
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Elsevier Editorial System
Toxicology Letters
58
13. Artículo
Genetic damage induced by CrO3 can reduce by low doses of Protoporphyrin-IX in
somatic cells of Drosophila melanogaster
Luz M. Vidal E.1 Emilio Pimentel P.
1*, M. Patricia Cruces M.
1 and Juan C. Sánchez
2
1 Departamento de Biología, Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ),
Ocoyoacac, México 2 Facultad de Química, Universidad Autónoma del Estado de México, Toluca, México
*Corresponding author: [email protected]
59
Abstract
Several epidemiological studies have reported the relation between chromium exposure
(used in different industrial processes) and cancer risk. Evidence indicates that the hexavalent
form is mutagenic and carcinogenic. Chemoprevention has emerged as a good strategy for
reducing the risk for exposure to xenobiotics including heavy metals. There is evidence that
some tetra-pyrrols such as protoporphyrin IX (PP-IX), a porphyrin without a metal center and
which is a precursor of hemoglobin and cytochrome, acts as an antioxidant modulating the
induction of antioxidant enzymes. The present study was performed to evaluate their
antimutagenic potential against genetic damage induced by chromium trioxide (CrO3). The wing
spot test (SMART) was used. Groups of 48h-old larvae were pretreated for 24 h with 0, 0.69, 6.9
or 69 mM of PP-IX, after which groups of larvae were fed 0.025 to 2.5 mM CrO3 solution in
Drosophila instant medium. The results indicated that the lower PP-IX concentration (0.69 mM)
significantly reduced the genetic damage induced by all CrO3 concentrations tested. In contrast,
6.9 and 69 mM only inhibited the damage induced by CrO3 2.5 mM. Absence of an inhibitor
effect of PP-IX against 20 Gy gamma rays suggested that this porphyrin acted preferably
forming complexes with chromium at low doses, inactivating its genotoxic action rather than
capturing or inactivating the reactive oxygen species generated by the chromium.
Key words: Protoporphyrin-IX; hexavalent chromium; reactive oxygen species; SMART;
Drosophila melanogaster
60
1. Introduction
Exposure to environmental pollutants of anthropogenic origin is associated with an important
increase of chronic degenerative diseases including cancer [De Flora and Ferguson, 2005].
Heavy metals are considered to be the most dangerous of xenobiotics, due to their chemical
stability and high bioaccumulation in organisms [Llugany et al., 2007, Thomann, 1982]. They
have also been associated with diseases such as pneumonia, renal dysfunction, emphysema, and
bone cancer [Bernard and Lauwerys, 1984], as well as with an impaired nerve function system
[Lebel et al., 1996].
Given this situation, the need arises to implement strategies to reduce the occurrence of
degenerative diseases. The first, and the most obvious, is to avoid exposure of human beings to
those agents that have the ability to modify the genetic material and therefore increase the risk of
diseases such as cancer. However, in practice this is almost impossible since many of such
agents are found naturally in the atmosphere (as ultraviolet or ionizing radiation), and others are
the products of the metabolism of innocuous compounds such as nitrates [Jakszyn and González,
2006]. The second alternative is to increase the consumption of substances capable of preventing
or reducing the adverse effects of mutagenic and carcinogenic agents. This strategy refers to
chemoprevention and it is defined as the use of chemical compounds, especially those of natural
origin that cause inhibition or reversal of mutagenesis or carcinogenesis in the pre- malignant
state [De Flora and Ferguson, 2005].
Among heavy metals, chromium is considered one of the most dangerous. More than one
hundred years ago, the International Agency of Research on Cancer (IARC, 1990) recognized
the carcinogenicity of chromium [De Flora, 2000]. One of the biggest sources of Cr VI exposure
is through the release of particles during stainless steel solder [Frausto de Silva and Williams,
1991; Gauglhofer and Bianchi, 1991]. Exposure pathways include the following: oral, respiratory
and dermal [de Flora et al., 1995]. Chromium has been reported to be distributed into the body
through the bone marrow, lungs, lymph nodes, spleen, kidney and liver [ATSDR, 2006;
Lauwerys, 2007]. The danger of this element is known to occur during the reduction process of
Cr (VI) to Cr (III), generating reactive oxygen species (ROS) that interact with the genetic
material and are able to induce various alterations, for example: sister chromatid exchanges,
chromosomal aberrations and cross links in double-stranded DNA [Telles, 2004]. Not only
workers in manufacturing industries are exposed to chromium compounds; the general public is
61
also exposed to chromium through cigarette smoke, automobile emissions, landfills and
hazardous waste disposal sites (Wu et al., 2012).
Among the natural compounds with chemo-prevention properties, porphyrins are
aromatic heterocyclic macrocycles derived from the porphine base structure. They are considered
promising mainly because of their low toxicity. These molecules have the ability of forming
complexes directly with planar polycyclic structures preventing their interaction with DNA;
however, tetrapyrroles can also be interspersed in the molecule [Lauwerys, 2007]. In the case of
porphyrins containing some metal ion, their antimutagenic activity is due to its antioxidant effect
[Young et al., 2000; Hayatsu et al., 1993; Odin, 1987]. Protoporphyrin-IX, is a molecule with no
metal core coming from the biosynthesis of 5-aminolevulinic acid (ALA) and it is the immediate
precursor of heme [Tschudy, 1983]. The toxic effect of PP-IX could probably be due to the
imbalance of the redox systems for the over production of ROS [Morehause et al., 1987; Van
Steveninck et al., 1988], leading to an increase in lipid peroxidation, which in turn is the main
cause of damage to the liver [Comeorti, 1985; Tribble et al., 1987]. In rats of the CF1 strain, PP-
IX induced lipid peroxidation and increased the activity of CAT 30% after 2 hours of
administration while the SOD enzyme increases 24 h after administration, yet peroxidation
decreases after several doses of PP- IX [Afonso et al., 1999]. Chronic treatment with PP- IX was
recently found to prolong the lifespan of a wild Drosophila strain. In contrast, half life was
reduced in the Sod deficient strain; these data provide information that the PP- IX can act as an
antioxidant and as a pro-oxidant [Pimentel et al., 2013]. Based on these previous works, the aim
of the present study was to evaluate the antimutagenic capacity of PP-IX against the genetic
damage induced by CrO3 (VI), an agent that induced genetic damage especially through ROS.
2. Materials and Methods
Somatic Mutation and Recombination Test. In order to test DNA damage, the wing spot
test [Graf et al., 1984] was performed as follows: three-day-old mwh +/mwh + females and flr3 /
in (3LR), TM3, Bds males, were mated for 2 h and then transferred to an egg-laying surface.
Oviposition was restricted to a 2 h period in order to obtain more homogeneous samples in the
age of individuals under test. Then 48h-old larvae were collected by density gradient using a
20% sucrose solution. They were subsequently washed with 24 + 1 ºC tap water and pretreated
for 24 h in the dark, in flasks (1/4 L) with a paper filter (Whatman # 2), saturated with PP-IX 0,
62
0.69, 6.9 or 69 mM dissolved in a 5% sucrose solution. Distilled water was used for all solutions.
PP-IX and CrO3 were purchased form Sigma Chemicals Company (St. Louis, MO).
On completion of the pretreatment period, the larvae were washed with tap water at 24 +
1°C. At this time, aliquots of larvae from each pretreatment concentrations of PP-IX were treated
with 0.025, 0.25, 1.25, 2.0 or 2.5 mM CrO3 in plastic vials (9.5 cm height and 2.5 cm diameter)
with 1.5g of Drosophila instant medium (formula 4-24 Carolina Biol. Supply Co.). Experiments
were carried out in triplicate for each pretreated PP-IX solution and for each treatment CrO3
solutions. All treatments were conducted in the dark.
Upon eclosion, organisms were fixed in 70% alcohol and the wings of the mwh +/+ flr3
flies (i.e., non-Ser) were mounted on slides for 40X microscopic analysis. The wings were
examined to identify small single spots (one or two cells), large single spots (more than two
cells) of either mwh or flr, and mwh-flr twin spots. Single mwh spots are expected to be produced
following mutation at the mwh + locus or by an interchange between the mwh and flr3 loci
succeeded by homozygosis for mwh. Single flr3 spots may arise by mutation at the flr
3+ locus or
by double exchange. Twin spots are the result of an interchange between the flr3 and the
centromere [Graf et al., 1984]. For a description of the mutants see Lindsley and Zimm (1992).
All data for each group represent at least two experiments performed in triplicate. Results
from the groups treated with PP-IX and CrO3 were compared with the group corresponding to
each CrO3 concentration. The SMART statistical program proposed by Frei and Würgler (1988)
was used to determine differences between treatments. The criterion for significance was set at p
< 0.05.
Toxicity test: In order to quantify the toxicity provoked by the PP-IX and CrO3 by
themselves, groups of 50 48h-old larvae mwh +/+ flr3 were collected and treated following the
above described method using the same concentrations of PP-IX and CrO3. To evaluate the
toxicity of the combined treatment of the different PP-IX concentrations, we selected the higher
CrO3 concentration (2.5mM). Chi square test was used for statistical analysis at p < 0.05 level.
Treatment with gamma rays: To explore the activity of the PP-IX as a radical scavenger,
we collected 48h-old mwh +/+ flr3 larvae and pretreated them for 24 h with PP-IX following the
method described above. On completion of the pretreatment, larvae from each concentration
were divided into two groups, one of each was irradiated with 20 Gy gamma rays in a
Transelektro LGI-01, Co-60 irradiator, with a dose rate of up to 1259.44 Gy/h. and the other
63
served as control. After irradiation, larvae were put into a plastic vial with hydrated medium
formula 4-24. All the vials were introduced into a culture room until the development concluded.
The analysis of the wings was done as described before.
3. Results
The frequencies of all kinds of spots induced by the different concentrations of CrO3 are
presented in Table 1. Statistical significant differences were found for all kinds of spots from
0.25 mM concentration. Noticeably, the higher concentration provoked a frequency of mutation
that represents 23 times the frequency found for the control group.
Table 2 includes the results obtained with the pre-treatment of 0.69, 6.9 or 69 mM of PP-
IX and with the combined treatment of PP-IX + CrO3: sections 1, 2 and 3 respectively.
Comparison of the action of PP-IX alone indicated that only 69 mM doubled the basal mutation
frequency.
The statistical analysis of comparing the combined treatments with their respective
positive control in Table 1 indicated that pretreatment with 0.69 mM of PP-IX caused a reduction
in the frequency of all kinds of spots from PP-IX + 0.025 mM CrO3, unless this reduction were
not statistically significant for all kinds of spots. A statistically significant reduction was found
from PP-IX 0.69 + CrO3 0.25 mM, which decreased the twin spots induced by all concentrations
of CrO3 with the exception of PP-IX + 1.25 mM group. Pre-treatment with PP-IX 6.9 mM
caused only a slight reduction in the frequency of the different kinds of spots from the PP-IX +
0.25 mM group, and only a weak decrease with respect to damage caused by 2.0 mM CrO3;
however, this concentration of PP-IX plus 2.5 mM CrO3 fell six times the frequency of total
spots induced by the mutagen alone (2.5 mM). Comparison of the effect of pre-treatment with
the 69 mM concentration and the previous two indicated that the combined treatment PP-IX +
CrO3 2.5 mM group decreased four times the frequency of total spots induced by CrO3 alone.
Results of toxicity for different concentrations of PP-IX, CrO3 (0.25, 2 and 2.5 mM)
combined treatments are shown in Table 3. The analysis showed that PP-IX was non-toxic at the
three concentrations tested compared to the control. CrO3 was toxic at 2 and 2.5 mM; the latter
reduced viability 53% over the control. In contrast the combined treatments reduced toxicity, but
69 PP-IX+ 2.5 CrO3 increased viability 7% compared with the 2.5 mM CrO3 control group.
Table 4 presents the results obtained for somatic mutation when larvae were pretreated with
64
different concentrations of PP-IX and then treated with 20 Gy of gamma rays. The results
indicated that PP-IX in all tested concentrations had no effect on damage induced by gamma
rays.
4. Discussion
Cr [VI] is well known to produce breaking in one or both strands of DNA; DNA-DNA
bonds; DNA cross-links with proteins, besides modifying the nucleotides as is the case of
guanine, 8-hidroxiguanina links. Although the mechanisms involved are not yet very clear, all
DNA alterations can cause chronic degenerative diseases, including cancer (De Flora, 2000).
Genetic damage induced by chromium is mainly produced as a result of its ability to
induce free radicals, especially during the reduction from Cr VI to Cr III. Such radicals are the
superoxide anion (O2-
), hydrogen peroxide (H2O2) and hydroxyl radical (OH•) [Jomovaa and
Valko, 2011]. To counteract the action of ROS, cells have a system of endogenous enzymes such
as Sod, Cat and glutathione. Furthermore, the cell face radicals attack using exogenous
antioxidants such as vitamins. The main subject of the present study was to evaluate the
antioxidant capacity of PP-IX avoiding the genetic damage induced by CrO3. There is evidence
that the antioxidant action of this tetrapyrrol depends on its concentration [20-Afonso et al.,
1999; Gibson and Hilf, 1985; Kennedy, 1990]. The results obtained in our study provided
evidence of this effect: although the PP-IX was not toxic by itself (Table 3) and concentrations of
0.69 and 6.9 mM did not induce genetic damage, the fact that the second concentration decreased
toxicity and the basal mutation frequency by itself (Table 3) suggested that protoporphyrin can
act as a true antimutagen. Moreover, the highest concentration (69 mM) proved to be mutagenic
and induced damage comparable with 0.25 mM of CrO3. In agreement with this, PPIX has been
proven to induce oxidative stress [Afonso et al., 1999] via production of superoxide ions and
more efficiently of singlet oxygen in organic solutions [Cox et al., 1979]. Our results are in
accord with this finding. Pimentel et al. (2011) found that this pigment at 69 mM can be
mutagenic 24 h after its administration in combination with 0.5 mM N-nitroso-N-ethylurea
(ENU) and that such activity may persist for 72 h. However, the evidence found in this study
indicated that in organisms pretreated with PP-IX and subsequently treated with CrO3, the
frequency of genetic damage was reduced in most of the treated groups.
65
Worth noting is the effect of the lowest concentration of PP-IX, (0.69 mM) which caused
a significant decrease of damage in four of the five concentrations of CrO3 tested. In comparison,
6.9 mM significantly decreased the frequency of damage induced by 2 and 2.5 mM of the
mutagen, and the highest concentration (69 mM) only reduced the damage induced by 2.5 mM.
Even so, 2.5 mM of CrO3 provoked high mortality (61%) which could result in loss of
information; in combination with PP-IX, 69 mM increased viability 7% and provoked a net
effect of reducing 3 times inhibition of the genetic damage induced by CrO3 2.5 mM (p < 0.05).
Explaining the increase in mutation frequency obtained in the groups 69 + 1.25 and 2
mM CrO3 is not simple. However, this increase could suggest a synergistic effect of CrO3 plus
the pro-oxidant action of PP-IX for its accumulation generating superoxide, as suggested by
Afonso et al. [1999]. PP-IX reacts with molecular oxygen producing peroxide radicals that cause
lipid peroxidation and lead to different cell damage such as structural changes in the cell
membrane, damage to proteins, inactivation of receptors, enzymes and ion channels, all of which
can lead to cell death [Girotti, 1985]. Other studies have demonstrated that porphyrins can bind
to DNA via a specific insertion within only one strand of DNA, i.e., by hemi-intercalation
[Lipscomb et al., 1996] with a binding constant of around 106 M−1
[Fiel et al., 1976; Sari et al.,
1990] In this way, these extra-helical structural elements could be a factor in certain pathways of
mutagenesis [Afonso et al., 1999].
The fact that the lowest concentration of PP-IX provoked a significant decrease in
damage could be due to the fact that the porphyrin ring could make complexes or act as a
chelator, introducing the chromium into the ring. PP-IX has been reported to be able to bind
other metals such as zinc and nickel [Peixsoton et al., 2005]. The different studies on the role of
ferrochelatase have revealed that this enzyme catalyzes zinc as well as the iron chelating activity
of protoporphyrin [Lauwerys, 2007; Hayatsu et al., 1993]. Ferrochelatase is known to catalyze
insertion of divalent transition metal ions other than iron in vitro, most notably zinc, but cobalt,
nickel, and copper have also each been reported to act as substrates, although species-specific
differences have been noted [Gora et al 1996, Hanson et al 1984, Taketani, S., and Tokunaga
1982]. Ferrochelatase could participate in the chelating chromium, provoking a reduction in its
mutagenic effect. The work performed by Pimentel et al. [1996] and Gaivão et al. [1999], have
demonstrated that the somatic mutation and recombination test in Drosophila is a useful tool that
detects the very low doses of alpha particles and the ROS induced by oxidants agents,
66
respectively; a possibility to explain our results is the ability of PP-IX to release electrons [Fijan
et al., 1995], which may have inactivated the free radicals generated by chromium thereby
avoiding DNA damage. The studies performed by Afonso et al. (1999) provide evidence of the
action of PP-IX for generating superoxide and hydrogen peroxide, causing activation of
superoxide dismutase and catalase enzymes that help to inactivate the ROS produced by the
chromium oxide-reduction reactions. In contrast, Cruces et al., (2009) found that a pretreatment
with very low doses of sodium copper chlorophyllin increased the somatic mutation frequency
induced by 10 Gy gamma rays.
Results from the present work showed evidence that the lower concentration of PP-IX
reduced the genetic damage of the radiomimetic agent CrO3. To evaluate the ability of PP-IX as
a radical scavenger, we tested its action against the effect of 20 Gy of gamma rays (Table 4). The
comparison of the effect of PP-IX against the two agents revealed that the action of PP-IX could
be preferable through the formation of chemical complexes with chromium rather than
decreasing reactive oxygen species. These findings placed PP-IX as an effective mutagen at low
doses.
Acknowledgements
The work was supported in part by a grant (No. 167461) to Cruces M.P. from the Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), México, and it involved in part research carried
out by L.M. Vidal to obtain the Master's Degree in Environmental Sciences at the Universidad
Autónoma del Estado de México (UAEM). The authors wish to acknowledge the splendid
technical assistance provided by Hugo Suarez Contreras and Alicia Hernández Arenas.
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70
Table 1. Spots frequency induced in 48 h larvae mwh +/+ flr3 by different concentrations of
chromium trioxide (VI)
Spots per wing (number of spots)
Treatment
(mM)
Small single
spots
Large single
spots
Twin spots Total spots
CrO3 No. of
wings
(1-2 cells), m=2 (>cells), m=5 m=5 m=2
0 160 0.24 (39) 0.09 (14) 0.01 (1) 0.34 (54)
0.025 120 0.26 (31) - 0.04 (5) - 0.03 (4) i 0.33 (40) -
0.25 150 0.43 (64) + 0.11 (16) - 0.05 (8) + 0.59 (88) +
1.25 118 0.63 (74) + 0.36 (42) + 0.14 (16)+ 1.12 (132)+
2.0 80 0.81 (65) + 0.52 (42) + 0.45 (36)+ 1.79 (143)+
2.5 120 2.87 (344) + 1.97 (236) + 2.11 (254)+ 6.95 (834)+
Statistical diagnoses according to Frei and Würgler (1988): + = positive; - = negative; w = weak
positive; i = inconclusive; m = multiplication factor. Probability levels: alpha = beta = 0.05. One
side statistical test.
71
Table 2. Spots frequency induced by chromium trioxide (VI) treatment in 48 h larvae mwh
+/+ flr3 pre-treated 24 h with 0.69, 6.9 or 69 mM of PP-IX
Spots per wing (number of spots)
Treatment
(mM)
Small single
spots
Large single
spots
Twin spots Total spots
PP-IX (+)
CrO3
No.
of
wings
(1-2 cells), m=2 (> cells), m=5 m=5 m=2
Pre-treatment with PP-IX 0.69 mM (Section 1)
0.69 120 0.33 (40) i 0.05 (6) - 0.03 (3) i 0.41 (49) -
+0.025 80 0.16 (13)i 0.02i (2) i 0.02 (2) i 0.21 (17) i
+0.25 80 0.30 (24)i 0.06 (5) - 0.01 (1) i 0.37 (30)+
+1.25 80 0.41 (80)+ 0.10 (8) + 0.14 (11)- 0.65 (52)+
+ 2.0 80 0.70 (56)- 0.32 (26) - 0.26 (21)+ 1.30 (103)+
+ 2.5 120 0.57 (69)+ 0.32 (38) + 0.28 (33)+ 1.17 (140)+
Pre-treatment with PP-IX 6.9 mM (Section 2)
6.9 120 0.23 (28) - 0.05 (6) - 0 (0) 0.28 (34) -
+ 0.025 40 0.26 (8) i 0.08- (3) - 0 (0) 0.28 (11) i
+ 0.25 80 0.31 (25) i 0.14 (11) - 0.04 (3) i 0.59 (88) -
+ 1.25 80 0.51 (41) - 0.37 (30) - 0.12 (9) - 1.00 (80) -
+ 2.0 80 0.59 (47) + 0.31 (25) - 0.30 (24) - 1.20 (96)
w
+ 2.5 120 0.64 (77) + 0.32 (38) + 0.23 (28)
+
1.19 (143) +
Pre-treatment with PP-IX 69 mM (Section 3)
69 160 0.51 (81) + 0.14 (23) - 0.01 (2) i 0.66 (106) +
+ 0.025 120 0.37 (45) - 0.08 (10) - 0 (0) 0.46 (55) -
+ 0.25 120 0.32 (39) - 0.08 (9) - 0.02 (2) i 0.42 (50) i
+ 1.25 80 1.51 (121) - 0.56 (45) - 0.40 (32) - 2.47 (198) -
+ 2.0 80 1.10 (87) - 0.60 (48) - 0.54 (43) - 2.22 (178) -
+ 2.5 140 0.92 (129) + 0.46 (64) + 0.40 (56)
+
1.78 (249) +
Statistical diagnoses according to Frei and Würgler (1988): + = positive; - = negative; w = weak
positive; i = inconclusive; m = multiplication factor. Probability levels: alpha = beta = 0.05. One
side statistical test. The comparisons were between each group PP-IX+CrO3 concentration with
the respective positive control concentration included in Table 1. The signs indicated in the PP-
IX concentration alone are the results from the comparisons with the negative control.
72
Table 3. Toxicity of 48 h age larvae mwh+/ +flr3 after the treatment for 24 h with PP-IX,
CrO3 or combined treatment
Treatment
(mM)
No. of
larvae
No. Viable
larvae ± EE
% of
toxicity
0 500 420 ± 0.9 16
PP-IX
0.69 500 394 ± 1.7 21
6.9 500 447 ± 0.6 11
69 500 368 ± 0.5 26
CrO3
0.25 500 448 ± 0.3 10
2.0 300 194 ± 2.8 35*
2.5 500 194 ± 0.8 61*
PP-IX + CrO3
0.69 + 2.5 400 164 ± 1.2 59
6.9 + 2.5 500 216 ± 2.0 57
69 + 2.5 500 230 ± 1.8 54**
*: Significant to p < 0.05. Compared with control.
**: Significant to p < 0.05.Compared with CrO3 2.5 mM.
Table 4. Spots frequency induced in 48 h old mwh +/+ flr3 larvae pretreated 24 h with
different concentrations of PP-IX and subsequently treated with 20 Gy of gamma rays
Treatment Spots per wing (number of spots)
PP-IX (mM) No. of Small single spots Large single spots Twin spots Total spots
+ 20Gy wings (1-2 cells), m=2 (> cells), m=5 m=5 m=2
0 40 0.27 (11) 0.05 (2) 0.02 (1) 0.35 (14)
20 Gy 80 0.70 (56) 1.57 (126) 0.06 (5) 2.33 (187)
0.69 + 80 0.82 (66) - 1.16 (93) w 0.08 (7) - 2.07 (166)-
6.9 + 80 0.69 (55) - 1.84 (147) - 0.15 (12) - 2.67 (214)-
69 + 80 1.16 (93) - 1.52 (122) - 0.07 (6) - 2.76 (221)-
Statistical diagnoses according to Frei and Wüergler (1988): + = positive; - = negative; w = weak
positive; i = inconclusive; m = multiplication factor. Probability levels: alpha = beta = 0.05. One
side statistical test.