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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
EFECTO INHIBITORIO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
PROPÓLEO AL 10%,20% Y 40% SOBRE BLOQUES DE RESINA
ACRÍLICA CONTAMINADOS CON CÁNDIDA ALBICANS;
ESTUDIO IN VITRO.
Proyecto de Investigación presentado como requisito previo a la
obtención del Título de Odontóloga.
Autora: Castro Herrera Clara Elizabeth
Tutor: Dr. Pablo Rubén Garrido Villavicencio
Quito. Septiembre 2016
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Clara Elizabeth Castro Herrera, en calidad de autor del trabajo de investigación
“EFECTO INHIBITORIO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE PROÓLEO AL
10%,20% Y 40% SOBRE BLOQUES DE RESINA ACRÍLICA CONTAMINADOS
CODEN CÁNDIDA ALBICANS; ESTUDIO IN VITRO”, autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso del contenido total o parcial
que me pertenece, con fines estrictamente académicos, o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8,19 y
demás pertinentes de la ley de propiedad intelectual y su reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Clara Elizabeth Castro Herrera
C.I: 0401125414
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo Pablo Rubén Garrido Villavicencio en mi calidad de tutor del trabajo de titulación,
modalidad Proyecto de Investigación,elaborado por CLARA ELIZABETH CASTRO
HERRERA: cuyo título es: EFECTO INHIBITORIO DEL EXTRACTO ETANÓLICO
DE PROPÓLEO AL 10%, 20% Y 40% SOBRE BLOQUES DE RESINA ACRÍLICA
CONTAMINADOS CON CANDIDA ALBICANS; ESTUDIO IN VITRO, previo a la
obtención de Grado de Odontóloga; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos
necesarios en el campo metodológico, para ser sometido a la evaluación por parte del tribunal
examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado
para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del
Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 1 días del mes de Julio de 2016
Dr. Pablo Rubén Garrido Villavicencio
DOCENTE-TUTOR
C.C.1311645095
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por el Dr. Wladimir Vicente Andrade Yépez, Dr. Fabricio Marcelo
Cevallos Gonzáles, Dr. Jaime Humberto Luna Herrera.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del
título de Odontóloga presentado por la señorita Castro Herrera Clara Elizabeth.
Con el título:
“EFECTO INHIBITORIO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE PROPÓLEO AL
10%, 20% Y 40% SOBRE BLOQUES DE RESINA ACRÍLICA CONTAMINADOS
CON CANDIDA ALBICANS; ESTUDIO IN VITRO”
Emite el siguiente veredicto: aprobado
Fecha: 27/09/2016
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Presidente: Dr. Wladimir Vicente Andrade Yépez …….18……… ……….………
Vocal 1: Dr. Fabricio Marcelo Cevallos Gonzáles ……..19……… ……….………
Vocal 2: Dr. Jaime Humberto Luna Herrera ……..19……… ……….………
v
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a mis Hermanos, quienes son las personas que me han motivado a lo
largo de mi vida y en la realización de esta investigación, a mis padres quienes siempre me
apoyaron y quienes se han sacrificado para darme la educación, a mis maestros, quienes se
empeñaron en lograr que acoja sus enseñanzas dentro de mi ser, a quienes me ayudaron a
conseguir los materiales y bibliografías, y en general a todos los que de alguna manera me
ayudaron a lo largo de estos años, para que yo pudiera culminar mi carrera.
Sé que estas palabras no son suficientes para expresar mi agradecimiento, pero espero
que, con ellas, se den a entender mis sentimientos de aprecio y cariño a todos ustedes.
Elizabeth Castro Herrera
vi
AGRADECIMIENTO
En primer lugar, a Dios por haberme guiado por el camino del bien y la responsabilidad
hasta ahora; en segundo lugar, a cada uno de los que son parte de mi familia a mi PADRE
Clifftón Castro y a mi MADRE Rosalba Herrera, a mis hermanos Geovanna y Alexander;
por siempre haberme dado su fuerza y apoyo incondicional que me han ayudado y llevado
hasta donde estoy ahora. Así también, a mi director de tesis quién me ayudó en todo
momento, Dr. Pablo Garrido.
Elizabeth Castro Herrera
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DERECHOS DE AUTOR ..................................................................................................... ii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN .................................. iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL ....................................... iv
DEDICATORIA .................................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS ............................................................................................... vii
ÍNDICE DE TABLA ............................................................................................................. x
ÍNDICE DE FIGURA .......................................................................................................... xi
ÍNDICE DE ANEXOS ....................................................................................................... xiii
RESUMEN .................................................................................................................. xiv
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
CAPÍTULO I ..................................................................................................................... 2
1 PROBLEMA ............................................................................................... 2
1.1 Planteamiento del problema ........................................................................ 2
1.2 Objetivos ...................................................................................................... 4
1.2.1 Objetivo General.......................................................................................... 4
1.2.2 Objetivos Específicos .................................................................................. 4
1.3 Justificación ................................................................................................. 5
1.4 Hipótesis ...................................................................................................... 7
CAPÍTULO II ..................................................................................................................... 8
2 Marco Teórico ............................................................................................. 8
2.1 Antecedentes ................................................................................................ 8
2.2 Bases Protésicas ........................................................................................... 9
2.2.1 Resinas Acrílicas ....................................................................................... 10
2.2.2 Clasificación .............................................................................................. 11
2.2.2.1.1 De acuerdo con el tiempo de curado: ........................................................ 11
2.2.2.1.2 De acuerdo con el método de procesado: .................................................. 11
2.2.3 Composición de resinas de termocurado ................................................... 11
2.2.4 Características de las resinas acrílicas de termocurado para bases ........... 13
2.3 Género Cándida ......................................................................................... 13
viii
2.3.1 Cándida Albicans ....................................................................................... 14
2.3.1.1 Características generales de la Cándida Albicans ..................................... 14
2.3.1.2 Factores de Virulencia ............................................................................... 15
2.3.1.3 Candidiasis orales ...................................................................................... 16
2.3.1.3.1 Clasificación .............................................................................................. 17
2.3.1.3.2 Etiopatogenia ............................................................................................. 19
2.3.1.3.3 Clasificación .............................................................................................. 21
2.3.1.3.4 Clínica ........................................................................................................ 21
2.3.1.3.5 Tratamiento y mantenimiento .................................................................... 22
2.4 Propóleo ..................................................................................................... 23
2.4.1 Definición .................................................................................................. 23
2.4.2 Características organolépticas del propóleo .............................................. 24
2.4.3 Características Físicas................................................................................ 25
2.4.4 Características Químicas ........................................................................... 25
2.4.5 Mecanismo de acción ................................................................................ 26
2.4.6 Propiedades biológicas del propóleo ......................................................... 27
2.4.7 Reacciones Adversas ................................................................................. 29
2.4.8 Usos del propóleo en odontología ............................................................. 29
CAPÍTULO III ................................................................................................................... 32
3 Metodología ............................................................................................... 32
3.1 Lugar de la Investigación .......................................................................... 32
3.2 Tipo y diseño de la investigación .............................................................. 32
3.3 Población y muestra .................................................................................. 32
3.3.1 Población ................................................................................................... 32
3.3.2 Muestra ...................................................................................................... 32
3.4 Criterio de inclusión y exclusión ............................................................... 33
3.4.1 Criterio de Inclusión .................................................................................. 33
3.4.2 Criterio de Exclusión ................................................................................. 34
3.4.3 Estandarización .......................................................................................... 34
3.5 Operacionalización de variables ................................................................ 35
3.5.1 Conceptualización de las Variables ........................................................... 35
3.5.1.1 Variable Independiente .............................................................................. 35
3.5.1.2 Variable Dependiente: ............................................................................... 36
ix
3.6 Procedimiento y Técnica ........................................................................... 36
3.6.1 Unidades de estudio ................................................................................... 36
3.6.2 Características de la unidad experimental ................................................. 36
3.6.3 Obtención del Extracto Etanólico de propóleo .......................................... 37
3.6.3.1 f) Obtención de las cepas bacterianas y resinas ........................................ 41
3.6.4 Diseño Experimental ................................................................................. 42
3.6.4.1 Obtención y preparación de cepas bacterianas .......................................... 43
3.6.4.2 Determinación del efecto inhibitorio del propóleo por el método del
Coeficiente fenólico y Difusión en agar .................................................... 45
3.7 Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos .................................... 60
CAPÍTULO IV ................................................................................................................... 61
4 Análisis Estadístico ................................................................................... 61
4.1 Resultados y Análisis de datos .................................................................. 61
4.2 Discusión ................................................................................................... 66
CAPÍTULO V ................................................................................................................... 69
5 Conclusiones y Recomendaciones ............................................................ 69
5.1 Conclusiones .............................................................................................. 69
5.2 Recomendaciones ...................................................................................... 70
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 71
ANEXOS ................................................................................................................... 76
x
ÍNDICE DE TABLA
Tabla 1 Factores de Virulencia de C. Albicans ................................................................... 16
Tabla 2. Desarrollo de Estomatitis Protésica asociada con Cándida ................................... 20
Tabla 3: Flavonoides presentes en el propóleo .................................................................... 26
Tabla 4 Operacionalización de Variables ............................................................................ 35
Tabla 5: Fase 1 - 24 horas .................................................................................................... 61
Tabla 6: Fase 1 - 48 horas .................................................................................................... 61
Tabla 7: Correlación lineal .................................................................................................. 62
Tabla 8: Diámetros de los halos de Inhibición de los extractos etanólicos de propóleo y de
los grupos control ........................................................................................................ 63
Tabla 9: Informe de comparación de 2 variables con SPSS ................................................ 64
Tabla 10: Análisis de la Varianza ANOVA con SPSS ........................................................ 64
Tabla 11: Media de halos de Inhibición para los extractos etanólicos de propóleo ............ 65
xi
ÍNDICE DE FIGURA
Figura 1 Estructura de los ácidos acrílicos tomado de (Anusavice K. J., 2008) ................. 10
Figura 2 Esquema de las relaciones entre C. Albicans y su hospedador (Laforet, 2010, pág.
13) ................................................................................................................................ 16
Figura 3 Estomatitis protésica: a) Grado 1, b) Grado 2, c) Grado 3 tomado de (Preti, 2008)
..................................................................................................................................... 21
Figura 4 Balanza para pesar la muestra de Propóleo ........................................................... 37
Figura 5: Filtro para colocar la muestra de propóleo........................................................... 38
Figura 6: Pesaje del propóleo .............................................................................................. 38
Figura 7: Equipo Soxhlet ..................................................................................................... 38
Figura 8: Proceso de evaporación ........................................................................................ 39
Figura 9: Muestra pura del extracto etanólico de propóleo ................................................. 39
Figura 10: Balanza analítica con propóleo al a) 10%, b) 20% , c) 40% .............................. 40
Figura 11: Colocación de etanol sobre las muestras de propóleo ....................................... 40
Figura 12: Recipientes para el almacenamiento de las muestras......................................... 41
Figura 13: Clasificación de los bloques de Resina acrílica ................................................. 41
Figura 14: Bloques de resina acrílica antes de ser esterilizados .......................................... 42
Figura 15: a) Rotulación del frasco con bloques de resina, b) colocación del mismo en el
área del autoclave ........................................................................................................ 42
Figura 16: Autoclave a 121°C por 15 minutos .................................................................... 43
Figura 17: Liberación del fluido de la ampolla ................................................................... 43
Figura 18: Transferencia con hisopo estéril a un medio de agar ......................................... 44
Figura 19: Uso de asa estéril para aislamiento de colonias ................................................. 44
Figura 20: Recipientes con Agar Nutritivo y Agar Bacto Agar .......................................... 45
Figura 21: Colocación de cada Porción de Agar en los recipientes .................................... 46
Figura 22: Pesaje de porciones de: a) Agar Nutritivo TSB, b) Agar Bacto Agar ............... 46
Figura 23: Frascos de vidrio con 700 ml de Agua destilada c/u ......................................... 46
Figura 24: Frascos de vidrio con Agar Nutritivo TSB + Agua destilada + Agar Bacto Agar
..................................................................................................................................... 47
Figura 25: Cajas Petri rotuladas........................................................................................... 47
Figura 26: Recipiente con bloques de resina acrílica .......................................................... 48
Figura 27: Recipientes con EPP, agua, etanol ..................................................................... 48
Figura 28: Colocación de los bloques de resina en los frascos con los diferentes EEP ...... 49
xii
Figura 29: Recipientes con EPP y Bloques de resina acrílicas ........................................... 49
Figura 30: Contaminación de las resinas con C albicans ................................................... 49
Figura 31: Colocación de muestras de resina acrílica en cajas petri. .................................. 50
Figura 32: Colocación del agar sobre las muestras de resina cubriendo sus ¾ partes ........ 50
Figura 33: Cajas Petri con muestras incubadas ................................................................... 51
xiii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo No. 1 Certificado de consolidación de tutorías ........................................................ 76
Anexo No. 2 Certificado de propiedad intelectual por parte del estadístico ....................... 77
Anexo No. 3 Solicitud de conformación de tribunal para la defensa de tesis. .................... 78
Anexo No. 4 Solicitud dirigida a la Facultad de Ingeniería Química para realizar la
extracción del propóleo. ............................................................................ 79
Anexo No. 5 Certificado de autorización otorgado por la Facultad de Ingeniería Química.
................................................................................................................... 80
Anexo No. 6 Certificado de aprobación del anteproyecto por el Subcomité De Ética En
Seres Humanos De La Universidad Central Del Ecuador ......................... 81
Anexo No. 7 Certificado del Laboratorio de Microbiología de la Universidad San
Francisco de Quito ..................................................................................... 82
Anexo No. 8 Certificado de traducción ............................................................................... 83
xiv
TEMA: “Efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo al 10%,20% y 40% sobre bloques de
resina acrílica contaminados con cándida albicans; estudio in vitro”
Autora: Clara Elizabeth Castro Herrera
Tutor: Dr. Pablo Rubén Garrido Villavicencio
RESUMEN
La Cándida albicans en un ambiente óptimo para su crecimiento excesivo se pueden
volver patógena y causar la estomatitis subprotésica. La capacidad antimicrobiana del
propóleo desempeña un papel muy importante por su mecanismo de acción en patologías de
la cavidad bucal. El propósito de esta investigación fue evaluar el efecto inhibitorio del
extracto etanólico de propóleo (EEP) al 10%, 20% y 40% sobre bloques de resina acrílica
contaminados con cándida albicans. Para ello se usó EEP sobre bloques de resina acrílica de
termocurado de 1.5 x 1.5 mm y de 3mm de grosor, contaminadas con Cándida albicans
ATCC® 10231, para comprobar la inhibición se realizó la parte experimental en dos fases:
la primera mediante técnica del coeficiente fenólico y la segunda mediante técnica de disco
difusión en agar, observado en la primera prueba ausencia de crecimiento de cándida
albicans en los cuatro tiempos 5min, 10 min, 15min, y 8 horas y en las tres concentraciones
y en la segunda la formación de halos de inhibición. Concluyendo que el EEP al 10%, 20%
y 40% posee un efecto inhibitorio sobre los bloques de resina acrílica contaminados con
Cándida albicans.
PALABRAS CLAVE: EXTRACTO ETANÓLICO DE PROPÓLEO, CÁNDIDAS ALBICANS,
EFECTO INHIBITORIO, RESINAS ACRÍLICAS.
xv
TITLE: “Inhibitory effect of ethanolic extract of propolis to 10%, 20% and 40% on acrylic
resin blocks contaminated with candida albicans; in vitro study”
Author: Clara Elizabeth Castro Herrera
Tutor: Dr. Pablo Rubén Garrido Villavicencio
ABSTRACT
The Candida albicans on an optimal environment for its excessive growth can become
pathogenic, and it provoke subprosthetic stomatitis. The antimicrobial capacity of propoli
plays a very important role because of its mechanism of action on pathologies buccal
cavity.The purpose of this research was to evaluate the inhibitory effect of ethanolic extract
of propoli (PEE) to 10%, 20% and 40% on acrylic resin blocks contaminated with Candida
albicans. Type on which PEE on blocks of thermosetting acrylic resin of 1.5 x 1.5 mm and
3 mm thick, contaminated with Candida albicans ATCC® 10231; in order to verify the
inhibition, the experimental part was carried out in two phases: the first phase by phenol
coefficient technique, and the second phase via a agar diffusion disk technique, under the
first test it was observed absence of growth of Candida albicans into the four times 5 min,
10 min, 15 min, and 8 hours and in the three concentrations, and into the second phase, it
was observed the formation of halos of inhibition. As a result, the PEE 10%, 20% and 40%
has an inhibitory effect on acrylic resin blocks contaminated with Candida albicans.
KEYWORDS: ETHANOLIC EXTRACT OF PROPOLI, CANDIDA ALBICANS, INHIBITORY
EFFECT, ACRYLIC RESINS.
1
INTRODUCCIÓN
Desde el momento del nacimiento se forma la microbiota de la cavidad oral estableciendo
una homeostasis entre los microorganismos y el huésped, sin embargo, existen algunos
factores que pueden afectar el equilibrio, dando paso a la colonización de microorganismos
oportunistas como Cándida albicans que formando parte de la cavidad oral llega a causar el
90% de infecciones por hongos, teniendo como factores predisponentes un deterioro en el
estado inmunológico de las personas. Sin embargo, se ha comprobado que por las
condiciones de humedad y ph de la cavidad bucal en personas no inmunodeprimidos pero
que utilizan prótesis dentales por largos períodos de tiempo (incluyendo la noche) y la mala
higiene bucal son factores predisponentes para infecciones fúngicas (Sapp, 2005) (Balarezo,
2014).
En la búsqueda para encontrar soluciones útiles y efectivas en las personas que usan
prótesis dentales se ha realizado varios estudios que comprenden experimentos y revisiones
bibliográficas exhaustivas, en donde se encontró que en la actualidad el propóleo, que es un
producto natural fabricado por abejas y de fácil acceso por su mecanismo de acción y su
capacidad antimicrobiana, antiséptica es eficaz para el tratamiento de infecciones bacterianas
y fúngicas entre las que se encuentra la estomatitis subprotésica causada por la colonización
de Cándida albicans por el uso de prótesis dentales. (Farre R, 2004) (García, Ucar, & Lelis,
2014)
Muchos autores, han reportado que la actividad antimicrobiana del propóleo depende de
sus componentes, los cuales varían en su composición química, según la región y la estación
de recolección. Así mismo, existen muchas especies del género cándida, pero solo nueve se
consideran patógenas para el hombre, siendo la cándida albicans la más frecuente en cavidad
oral (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013) (Ceccotti E. S., 2007).
Este estudio nos permitirá establecer una comparación de la inhibición del extracto
etanólico de propóleo al 10%, 20% y 40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con
cándida albicans en diferentes tiempos 5min, 10min, 15min,y 8h y así poder determinar
cuál de las tres concentraciones es más efectiva.
2
CAPÍTULO I
1 PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
En la actualidad se han desencadenado una serie de investigaciones orientadas a
identificar las diferentes propiedades que poseen algunos productos naturales que nos
pueden ayudar a mejorar la calidad de salud de las personas, por lo que el campo de la
odontología no es la excepción, siendo el propóleo uno de los productos más estudiados
dentro de las diferentes ramas de la odontología por sus múltiples beneficios terapéuticos.
La capacidad antimicrobiana del propóleo en la medicina natural se ha utilizado
tradicionalmente y desde hace siglos para beneficiar la salud humana, utilizándolo para la
curación de heridas y en el tratamiento de infecciones a nivel general, tomando gran
importancia por su mecanismo de acción en patologías de vías de respiraciones altas y de la
cavidad bucal (Farre R, 2004). Hoy en día en el campo de la odontología se sabe que
contribuye en el tratamiento o prevención de algunas lesiones tanto de carácter bacteriano
viral o fúngico, la estomatitis subprotésica es un ejemplo de ello (Herrera, Alvear,
Barrientos, Montenegro, & A, 2010). Esta patología, como se mencionó anteriormente, se
encuentra íntimamente asociada a la proliferación de la especie fúngica Cándida albicans y
se presenta como una zona enrojecida de la mucosa de la cavidad oral debajo de la superficie
de la prótesis (Marsh, 2011).
La Cándida albicans puede adoptar varias formas clínicas, una de ellas, es la candidiasis
que es una infección oportunista, es decir que se manifiesta cuando los factores
predisponentes son apropiados, uno de estos factores es el uso prolongado o mala higiene de
las dentaduras protésicas (Sapp, 2005), esto se debe a que la Cándida tiene la capacidad de
formar una matriz extracelular conocida como biofilm sobre la prótesis dental con
propiedades diferentes a las que generan sobre otras superficies (Baillie GS, 2000). Es
importante recalcar que afecta con mayor intensidad a pacientes inmunodeprimidos y con
sida, en los cuales las infecciones causadas por este hongo pueden llegar a ser muy graves y
3
dar paso a grandes complicaciones tanto en la mucosa oral como en el esófago y en otras
localizaciones (Guillen, 2008).
Existen evidencias de que se puede evitar o reducir la proliferación de este hongo
oportunista con el uso bucal del propóleo. Por este motivo es importante recurrir a la
utilización de los productos naturales para encontrar nuevas alternativas de tratamiento
terapéutico en el campo odontológico.
Es por eso que nos planteamos la incógnita en relación a si se puede impedir o reducir la
proliferación del hongo oportunista Cándida Albicans, que ha colonizado prótesis dentales,
mediante la utilización de productos naturales como el propóleo, para encontrar nuevas
alternativas de tratamiento bucal en el campo odontológico y por ello, en el presente trabajo
se pretende comprobar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20%
y 40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con Cándida albicans.
4
1.2 Objetivos
1.2.1 Objetivo General
Determinar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y 40%
sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans utilizando dos técnicas.
1.2.2 Objetivos Específicos
Determinar a que tiempo actúa el extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans
mediante técnica del coeficiente fenólico gelificado.
Medir el halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40% en el cultivo bacteriano de cándida albicans a las 48 horas, mediante técnica
de difusión en agar.
Comparar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo sobre el
crecimiento in vitro de cándida albicans entre las diferentes concentraciones al
10%, 20% y 40%.
Comparar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40% con el efecto inhibitorio del etanol al 96% (grupo control) sobre bloques de
resina acrílica contaminados con cándida albicans.
5
1.3 Justificación
La Cándida Albicans es uno de los microorganismos oportunistas más comunes que se
encuentran formando parte de la microflora de la cavidad oral por lo que su colonización en
mucosas de pacientes que son portadores de dentaduras protésicas es muy frecuente ya sea
por el uso prolongado o la mala higiene de las mismas.
En pacientes que son edéntulos totales y susceptibles a la candiasis oral se les puede
recomendar la limpieza de sus dentaduras protésicas con agentes antifúngicos que pueden
ser de origen natural o sintético los cuales se los va a colocar en la superficie de la prótesis
para de esta manera eliminar al microrganismo oportunista.
El propóleo también conocido como cola de abeja, es una sustancia pegajosa, no tóxica y
resinosa producida por las abejas a través de la mezcla de las secreciones de sus glándulas
de la hipofaringe, el producto es digerido de resinas recogidas de hojas, flores de plantas,
árboles y ciertas cortezas, que se utiliza como sellador y esterilizador en los nidos de las
abejas, ya que mantiene la asepsia y la temperatura adecuada en la colmena, además que
actúa como un biosida para matar a las bacterias invasoras, hongos o incluso larvas (Vagish,
2014).
El propóleo está compuesto por una gran diversidad de componentes químicos, su
composición varía según la procedencia, se caracteriza por tener un 55% de resinas y
bálsamos aromáticos, 30% de ceras, 10% de aceites esenciales y 5% granos de polen. Entre
sus componentes principales están los de tipo flavonoide, entre los que tenemos, las
flavonas, flavones y las flavononas (Tolosa, 2002).
El control de microorganismos presentes en cavidad oral con agentes naturales como es
el propóleo no se utiliza frecuentemente en nuestro país a pesar de conocer que posee varias
propiedades que son muy importantes en el campo odontológico como es la actividad
anticariogénica, anestésica, antiinflamatoria, antimicrobiana, cicatrizante, desinfectante,
entre otras (García, Ucar, & Lelis, 2014)
6
La efectividad del propóleo va a variar según su concentración y siempre se debe tomar
en cuenta que está compuesto por una diversidad de agregados químicos, los cuales no suelen
ser constantes y pueden variar de acuerdo al lugar de procedencia (Farre R, 2004).
En la actualidad la medicina alternativa es una opción muy viable para aliviar las
molestias ocasionadas por Cándida Albicans en pacientes portadores de prótesis dentales
(Tolosa, 2002), por lo que es importante determinar la efecto inhibitorio in vitro del extracto
etanólico de Propóleo sobre cepas de Cándida Albicans y de esta manera poder recomendar
el uso del propóleo a nuestros pacientes por sus importantes características y por su bajo
costo en el mercado.
Es por este motivo que en el presente estudio se pretende analizar las propiedades
inhibitorias antifúngicas que se le atribuyen al propóleo las mismas que se pueden utilizar
en distintos tratamientos entre ellos para la desinfección de las prótesis dentales.
Este estudio nos permitirá establecer una comparación de la inhibición del extracto
etanólico de propóleo al 10%, 20% y 40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con
cándida albicans en diferentes tiempos 5min, 10min, 15min, y 8h y así poder determinar
cuál de las tres concentraciones es más efectiva.
7
1.4 Hipótesis
Hi: Existe diferencia significativa en el efecto inhibitorio del extracto etanólico de
propóleo al 10%, 20% y 40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida
albicans utilizando las técnicas del coeficiente fenólico gelificado y técnica de difusión en
agar.
H0: No existe diferencia significativa en el efecto inhibitorio del extracto etanólico de
propóleo al 10%, 20% y 40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida
albicans utilizando las técnicas del coeficiente fenólico gelificado y técnica de difusión en
agar.
8
CAPÍTULO II
2 Marco Teórico
2.1 Antecedentes
De las 150 especies del género Cándida solo nueve de ellas se consideran patógenas para
el ser humano (Ceccotti E. S., 2007), siendo la cándida albicans la más frecuente en cavidad
oral. Según Marsh (2011) las diferentes especies de hongos son residentes habituales de la
microflora oral de individuos sanos y como tales se pueden considerarse normales en la
cavidad bucal. Estas especies se pueden volver patógenas cuando el sistema inmunológico
del huésped se encuentra deficiente (Sapp, 2005).
Ibsen. Olga A. C. Andersen Phelan (2014) Explican que la candidiasis es una patología
que se da por el excesivo crecimiento del hongo, tipo levadura Cándida Albicans. Existen
varios tipos de candidiasis oral entre ellas Bascones (2004) menciona a la “candidiasis
atrófica crónica” conocida también como estomatitis subprotésica que afecta a un 50% de
los individuos portadores de prótesis dentales, ya que es un medio propicio para la
colonización y adherencia de Cándida Albicans, por tal motivo, esta se da con mayor
facilidad, los autor García, Ucar, & Lelis (2014) señalan que las personas por el solo hecho
de ser portadores de prótesis dentales totales o parciales, ya están predispuestas a la
colonización por Cándida albicans de los tejidos de soporte.
Sapp en el (2005), explica que cuando la Cándida ha colonizado la prótesis dental, se
debe colocar agentes antifúngicos como tratamientos empíricos sobre la superficie tisular de
la prótesis y eliminar los posibles factores predisponentes esto ayudara a la desinfección de
la prótesis dental. Herrera (2010) comenta que se han realizado investigaciones para
identificar cual es la actividad antifúngica del propóleo sobre el hongo de la Cándida
albicans, resultando en efectos satisfactorios en la totalidad de ellos.
El control de microorganismos presentes en cavidad oral con agentes naturales como es
el propóleo no se utiliza frecuentemente en nuestro país a pesar de conocer que posee varias
propiedades que son muy importantes en el campo odontológico como es la actividad
9
anticariogénica, anestésica, antiinflamatoria, antimicrobiana, cicatrizante, desinfectante,
entre otras (García, Ucar, & Lelis, 2014).
2.2 Bases Protésicas
La función principal de las bases protésicas es cubrir el “reborde residual existente,
conformar el contorno facial” y la retención de los dientes artificiales (Rahn, Ivanhoe, &
Plummer, 2009, pág. 8). También ayudan con la distribución de las fuerzas de masticación
lo que reduce la presión sobre los rebordes edentulos de los pacientes, esto puede ayudar a
la reabsorción subyacente del hueso y sustituyen a los tejidos ausentes, en el caso de las
prótesis totales la base constituye un sellado periférico hermético que colabora con la
retención protésica (Dixon, 2012), colaborando con la fijación de la prótesis mediante acción
capilar. Deben poseer características similares a las de los tejidos naturales en cuanto a su
color y contorno ya que están reemplazando al hueso cubierto por la mucosa (Rahn, Ivanhoe,
& Plummer, 2009).
Las bases protésicas generalmente están hechas de polímeros o de metal, siendo el
polímero el material más seleccionado por su baja densidad y su fácil manipulación (Rahn,
Ivanhoe, & Plummer, 2009), la composición química básica de la mayoría de los materiales
para bases de prótesis están constituidos por polvo y líquido; estando el polvo compuesto
por esferas de polimetilmetacrilato y en menor cantidad peróxido de benzoílo, considerado
como iniciador, el mismo que es responsable del proceso de polimerización, mientras que el
líquido más utilizado es el metilmetacrilato no polarizado con cantidades pequeñas de
hidroquinona que es un inhibidor encargado de impedir la polimerización no deseada, al
líquido también se puede añadir el dimetacrilato de glicol, que es un agente de
entrecruzamiento, que proporciona una gran resistencia a la deformación. (Anusavice K. J.,
2008). Estos componentes pueden ser acabados por la energía térmica suministrada por
diferentes métodos, como son: la inmersión en baño de agua caliente, irradiación de
microondas, y la técnica de moldeo por inyección, estos métodos de procesamiento pueden
afectar a la resina en sus propiedades físicas relacionadas principalmente con el grado de
conversión de monómero y la porosidad, que a su vez puede afectar las características de la
superficie, logrando mejores resultados con el método mecánico (Preti, 2008), siendo por
esto las resinas termopolimerizables las más utilizadas en forma general para la fabricación
de bases protésicas (Cacciacane, 2013).
10
2.2.1 Resinas Acrílicas
Son polímeros de gran importancia en odontología ya que desempeñan un papel
importante en la fabricación de dentaduras completas y parciales, así como en la
construcción de prótesis maxilofaciales (Dixon, 2012).
Anusavice K. J. (2008) manifiesta que las resinas acrílicas son derivados del etileno
encontrándose en su estructura un grupo vinilo, considerándose en odontología las resinas
acrílicas más importantes y utilizadas: el ácido metacrílico y el ácido acrílico.
8
Figura 1 Estructura de los ácidos acrílicos tomado de (Anusavice K. J., 2008)
Toledano, Osorio, Sanchez, & Osorio (2009) señalan que la esterificación de estos
poliácidos se puede dar con cualquier radical orgánico o inorgánico ayudando así a la
formación de miles de resinas acrílicas diferentes, por este motivo Cova (2010) argumentan
que la unión de los ésteres provenientes de estos ácidos con diferentes radicales como el
metilo, etilo, fenilo dan como resultado los monómeros de dichas resinas: acrilato de metilo
y metacrilato de metilo.
La polimerización de las resinas acrílicas es por adición, son de consistencia dura y
transparente y poseen la capacidad de absorber agua por su polaridad relacionada con su
grupo carboxílico. Ayudando la absorción de agua en el ablandamiento y en la perdida de
resistencia del material (Toledano, Osorio, Sanchez, & Osorio, 2009).
11
2.2.2 Clasificación
Según Cova (2010) las resinas acrílicas se pueden clasificar según diferentes puntos de
vista:
2.2.2.1.1 De acuerdo con el tiempo de curado:
Resinas de autocurado
Resinas de termocurado
Resinas de fotocurado (Cova, 2010, pág. 335)
2.2.2.1.2 De acuerdo con el método de procesado:
Resinas procesadas en muflas con yeso o silicona
Resinas procesadas en microondas
Resinas procesadas con lámparas de luz visible
Resinas Fluidas (Cova, 2010, pág. 335)
2.2.3 Composición de resinas de termocurado
Las resinas acrílicas se forman cuando se “mezcla un monómero liquido con un polvo
que contiene pequeñas partículas de polímero, y esta mezcla es sometida a polimerización,
a la resina polimerizada se le denomina polimetilmetacrilato, que está compuesto a su vez
por numerosas unidades monoméricas de metilmetacrilato que se unen para formar largas
cadenas de polímeros” (Dixon, 2012, pág. 219).
Composición polvo-líquido:
Polvo:
Polímero: el más utilizado es el Polimetacrilato de metilo, que puede ser modificado
con metacrilato de etilo, butilo o alquilo, para hacerlos más resistentes.
Iniciador: el más utilizado es el Peróxido de benzoilo o disobutilasonitrilo, este
inicia su reacción al mezclar el líquido con el polvo.
12
Plastificante: el más utilizado es Ftalato de dibutilo, puede estar en el polvo o en el
líquido, siendo su objetivo aumentar la solubilidad.
Pigmentos: los más utilizados son: Sulfuro de mercurio que da una pigmentación
roja; Sulfuro de cadmio pigmentación amarilla; Óxido férrico pigmentación marrón
y Carbón pigmentación negro.
Opacadores: dióxido de titanio utilizado para reducir la translucidez.
Fibras sintéticas teñidas: simulan los pequeños vasos sanguíneos.
Partículas de relleno: las más utilizadas son las esferas de vidrio, fibra de vidrio,
silicato de circonio y alúmina, tienen la función de mejorar la unión entre el plástico
y las partículas (Cova, 2010) (Dixon, 2012).
Líquido
Monómero: formado principalmente por metacrilato de metilo que se modifica al
unirse con otros monómeros acrílicos.
Inhibidor: hidroquinona, agregada al líquido evita durante el almacenamiento su
polimerización.
Opacificadores: Dióxido de titanio.
Activador: en las resinas autopolimerizables de autocurado o curado en frío el
activador es ácido sulfínico o aminas terciarias, siendo el más utilizado el
dimetilparatoluidina, mientras que en los fotocurables es la luz y en los termocurables
el calor.
Plastificantes: sustancias que ayudan al polímero a ser resiste y más blando, entre
ellos tenemos el ftalato de dibutilo.
13
Agentes de entrecruzamiento: Para aumentar el entrecruzamiento de las cadenas
aquí se encuentra el dimetacrilato de glicol o el alil metacrilato (Cova, 2010) (Dixon,
2012).
2.2.4 Características de las resinas acrílicas de termocurado para bases
Cacciacane (2013) señala ciertos requerimientos que deben poseer las bases protésicas,
las mismas que citamos a continuación:
Estabilidad química y dimensional.
No debe ser tóxica y tiene que ser compatible con los tejidos orales.
Aceptabilidad por los sentidos del tacto, gusto, olfato y vista del paciente.
De consistencia resistente, debe ser fuerte y dura, pero no frágil e higiénica.
De fácil manipulación, adaptables a los problemas clínicos.
Costo razonable y asequible para los pacientes. (Cacciacane, 2013)
(Anusavice K. J., 2008).
2.3 Género Cándida
Los hongos del género Cándida se encuentran con frecuencia en la cavidad bucal de
individuos sanos y como tales se pueden considerar como residentes normales de la
microflora oral (Marsh P, 2011) (Jawetz, 2005). Por lo general crecen como levaduras
redondeadas, ovales o con forma de yema, con un tamaño que oscila de 4 a 6 µm (Nafees A,
2011), con un metabolismo principalmente aerobio, son formadoras de hifas. La
identificación de este género de hongo se basa en la combinación de características
morfológicas, enzimáticas y bioquímicas.
El Género Cándida comprende más de 150 especies, menos de 10 causan enfermedad en
humanos siendo las más frecuentes C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. kefir
(pseudotropicalis), C. krusei, C. guilliermondii, C. parakrusei, C. zeylanvides, C. stellatoidea
y C. brumptii.
Sobre medio de agar o en las primeras 24 horas a 37°C las especies de Cándida producen
colonias blandas de color cremoso con olor a levadura (Jawetz, 2005).
14
2.3.1 Cándida Albicans
La Cándida albicans es el principal miembro patógeno del género, causando el 90% de
infecciones en el ser humano, puede presentarse en forma de levadura, levadura con
seudohifas, o en forma de largas hifas tabicadas ramificada (Sapp, 2005).
2.3.1.1 Características generales de la Cándida Albicans
Cándida albicans pertenece a la familia Crytococcaceae, forma parte de la microbiota
oral accesoria o complementaria. Son células globosas, ovoides o ligeramente alargadas, su
tamaño oscila entre 3 a 5µm por 6 a 12 µm. (Negrroni, 2014). Cándida albicans es dimórfica
lo que quiere decir que además de formar levaduras y seudohifas es capaz de formar hifas
verdaderas, tanto en vivo como in vitro (Jawetz, 2005).
“La pared de C. albicans está formada por polisacáridos de manano, glucanos y quintina
sola o en complejos con proteínas. Una capa externa fibrilar se extiende desde la superficie
y contiene varias glucoproteínas y complejos de manano con proteínas denominadas mano
proteínas” (Jawetz, 2005).
A través de dos pruebas se puede diferenciar a C. albicans del resto de las especies:
La primera en cultivos con poca cantidad de suero (0,5ml) y no más de 37°C, durante casi
90 minutos se observa que las células brotantes producen hifas verdaderas o tubos
germinales (Negrroni, 2014, pág. 399), estas características le diferencian de otras especies
de Cándida debido a que se forman rápidamente y no demuestra estrangulación en el lugar
de salida de la hifa (Negrroni, 2014).
La segunda a través de un de un “medio nutrimentalmente C. albicans produce
clamidosporas grandes y esféricas” (Jawetz, 2005, pág. 641), que crecen al final de hifas,
es el rasgo de identidad y rara vez es producido por otra especie de Cándida (Saunders,
2006).
Se pueden utilizar métodos auxiliares menos específicos para la identificación de C.
albicans como pruebas de fermentación de carbohidratos y asimilación (Nafees A, 2011).
15
2.3.1.2 Factores de Virulencia
Además de su facilidad para crecer y multiplicarse, se considera que el factor de
virulencia más importante de la cándida albicans es la capacidad de adherirse a las células
del hospedador, a otros microorganismos y materiales inertes como son los biomateriales de
las prótesis dentales que se encuentran en boca (Negroni, 2014).
Existe la probabilidad que el efecto combinado del huésped y los factores de virulencia
de la Cándida sean los que ayudan a que se de la candidiasis oral (Marsh, 2011).
Varios son los factores del hongo responsables de su virulencia, entre los más importantes
tenemos:
Adherencia: está dada por sus características químicas, ya que poseen una
manoproteína que permite su unión y por la estructura de su pared celular
puesto que poseen una capa fibrilar que recubre a la misma (Negroni, 2014).
Las adhesinas son moléculas presentes en la superficie de las células de
Cándida y son las responsables de su adherencia a las superficies orales,
perteneciendo a este grupo las manoproteínas antes mencionadas, “las
adhesinas fibrilares encargadas de unirse a los receptores y las proteínas de
fucosil que se unen a los receptores del complemento en las células del
huésped” (Marsh, 2011, pág. 168).
Capacidad de resistir a los mecanismos de defensa del huésped: esto se
debe al dimorfismo fenotípico de alta frecuencia, que es la capacidad que
tienen las células de la Cándida de realizar cambios reversibles en la
morfología de la colonia cuando es expuesta a estímulos externos, ya que al
momento que se une al huésped cambia su morfología de levadura a forma
filamentosa, logrando con esto promover la penetración del epitelio y
aumentar la resistencia celular a los mecanismos defensivos del hospedador
(Marsh, 2011). “La formación de seudohifas y la rapidez con la que pueden
variar su morfología son características de agresividad” (Negroni, 2014, pág.
402).
Enzimas hidrolíticas: el hongo de cándida albicans tiene la capacidad de
secretar enzimas en el ambiente local, entre ellas tenemos la aspartil proteasa
16
(SAP) que provocan un daño en las células del huésped y a la matriz
extracelular y las fosfolipasas (FP) que causan un daño a nivel celular, o
tejidos del huésped (Marsh, 2011).
Tabla 1 Factores de Virulencia de C. Albicans Mecanismos Factores Moleculares
Adherencia Enzimas extracelulares:
Proteasas
Lipasas
Evasión de las defensas del huésped Toxinas
Interferencia con:
Fagocitosis
Defensas inmunes
Complementos
Nitrosaminas
Sinergismo con bacterias y otras levaduras Metabolitos
Fuente : (Roque, 2011, pág. 8)
Elaborado: por Elizabeth Proaño
Es estimada por ello un perjudicial oportunista. Las relaciones con su hospedero,
representadas en la Imagen 2, juegan un importante rol en este tipo de contaminación. El
estado fisiológico del hospedador es el primer factor que gobierna la causa de las candidiasis,
diferenciaciones de este estado pueden provocar que las levaduras comensales se conviertan
en patógenas, causando infecciones, como lo señala (Laforet, 2010).
Figura 2 Esquema de las relaciones entre C. Albicans y su hospedador (Laforet, 2010, pág. 13)
2.3.1.3 Candidiasis orales
La Candidiasis oral es una infección micótica, muy frecuente en la mucosa bucal causada
por la especie Cándida principalmente por Cándida albicans (85%- 95%) constituyéndose
como una enfermedad oportunista debido a que en la población general forma parte entre el
40% y 60% de la flora saprófita bucal (Bascones M. A., 2004).
17
Se ha demostrado que la incidencia de la infección por Cándida aumenta de forma
progresiva en relación con una respuesta deficiente del sistema inmunológico del huésped
(Neuman, 2014).
Existe mayor predisposición en personas con
Diabetes Mellitus
Hipoparatiroidismo
Tratamiento antibiótico
Quimioterapia antineoplásica
Tratamiento con corticoides
Uso de prótesis
Lactantes ( Recién nacidos )
Deficiencia primaria de linfocitos T
Xerostomía
Infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana (Balarezo, 2014).
2.3.1.3.1 Clasificación
La candidiasis oral por lo general tiene una de estas cuatro presentaciones:
Candidiasis seudomembranosa
La candidiasis seudomembranosa o también conocida como algodoncillo se identifica
más comúnmente en neonatos (De Long, 2015), la infección probablemente se la adquiere
en el canal vaginal durante el parto (Cawson, 2009), en pacientes adultos mayores está
asociada a fatiga, anemia, diabetes mellitus (Bascones M. A., 2004), pero se debe pensar
como primera causa la infección por Virus de Inmunodeficiencia Humana.
Se presenta como múltiples placas elevadas indoloras o muy poco sensibles, de color
amarillento blancuzco, de aspecto grumosos, que al raspar se separan con facilidad de la
superficie de la mucosa bucal dejando una superficie eritematosa (Neuman, 2014), también
18
se puede acompañar de sensación de quemazón y apreciar un sabor metálico (Balarezo,
2014).
Las placas son numerosas y no se localizan en zonas amplias de la mucosa oral (De Long,
2015). Su localización más frecuente es en el paladar duro y blando pero se puede dar en
cualquier lugar de la cavidad oral.
Al realizar una tinción de Gram de un frotis se encuentran grandes masas de hifas
enredadas, células epiteliales y leucocitos, la biopsia de la mucosa oral muestra un epitelio
hiperplásico infiltrado por un edema y células inflamatorias (Cawson, 2009).
El tratamiento tópico es con nistatina o anfotericina por 5 a 7 días, sino existe remisión
de los síntomas con antifúngicos tópicos sugiere la presencia de una inmunodeficiencia
(Cawson, 2009).
Candidiasis atrófica eritematosa
La candidiasis atrófica eritematosa se presenta en personas con afectación del sistema
inmunológico, teniendo mayor predominio en personas afectadas por VIH (Cawson, 2009),
en pacientes no inmunocomprometidos se presenta con significativa frecuencia en
portadores de prótesis removibles mal ajustadas o en quienes utilizan siempre la dentadura
inclusive durante la noche, con mala higiene de la misma (Sapp, 2005).
En etapas iniciales se puede observar petequias y áreas de erosión superficial, pero el
signo característico es una mucosa eritematosa y dolorosa que se localiza en una sola región
sea vestibular, palatina o como una superficie roja generalizada de tejido atrófico
principalmente debajo de las prótesis superiores en adultos mayores (Sapp, 2005).
La candidiasis eritematosa puede afectar a la lengua notándose con frecuencia zonas
irregulares y parchadas, esta apariencia se debe a la ausencia de papilas filiformes, por un
reducción extensa del epitelio y a inflamación excesiva del tejido conjuntivo (Balarezo,
2014).
Los pacientes refieren sensibilidad intensa y dolor frente al consumo de líquidos
calientes, fríos, alimentos picantes y bebidas alcohólicas (Sapp, 2005). El diagnóstico es
19
clínico sin embargo los cultivos pueden ser útiles para confirmar la presencia de Cándida,
mientras que los frotis citológicos por lo general fracasan en la demostración de formas
micelares de hongos (Ceccotti E. S., 2007).
Se confirma el diagnostico con la resolución del cuadro entre una a 2 semanas, con signos
clínicos previamente mencionados se puede iniciar tratamiento empírico con antifúngicos
tópicos aplicados sobre la superficie tisular. Sin embargo es necesario identificar y actuar
sobre los factores de riesgo para evitar la recurrencia de la enfermedad (Sapp, 2005).
Queilitis angular
La queilitis angular llamada de igual forma estomatitis angular se encuentra asociado a
una candidiasis hiperplásica crónica siendo más prevalente en la población geriátricos
portadores de prótesis, como consecuencia de la disminución de la dimensión vertical que
produce la salida y acumulación de saliva infectada por cándida hasta la comisuras labiales
(Bascones M. A., 2004) (Balarezo, 2014) (Cawson, 2009).
Clínicamente se evidencia eritema en las comisuras labiales con costras y fisuras en la
superficie, en pacientes ancianos suele extenderse por los surcos de la piel desde la
comisura, se debe a la maduración de los tejidos por la edad (Balarezo, 2014).
El tratamiento se lo realiza con antifúngicos intraorales, si coexistiera infección causada
por S. aureus es necesario el uso tópico de ácido fusídico (Cawson, 2009).
La prevalencia de Estomatitis Subprotésica en los pacientes que usan prótesis ha sido
reportada entre un 25% a 65%. Esta patología es más común en pacientes con edades
comprendidas entre 25 y 90 años y de preferencia mujeres.
También conocida como: Mucosa Inflamada Subprotésica, Palatitis Subprotésica
Crónica, Estomatitis Subprotésica, Estomatitis Venenata, Candidiasis Atrófica Crónica,
Estomatitis con relación a prótesis, Estomatitis Protésica. Según citan otros autores en la
bibliografía revisada (Thorén & Gunn, 2013).
2.3.1.3.2 Etiopatogenia
20
Se considera que el origen de Estomatitis Subprotésica es multifactorial, se señala como
factores etiológicos: mala higiene de la dentadura que permite que se acumule placa dental
en la superficie interna de la prótesis, considerándose de importancia crítica para el
desarrollo y mantenimiento de la estomatitis protésica (Thorén & Gunn, 2013).
El uso de prótesis removibles en el día y la noche, prótesis totales superiores ajustadas
que impiden la acción protectora de la saliva sobre la mucosa oral, traumatismos ocasionados
por prótesis desajustadas, contaminación bacteriana y de levadura de la superficie de
la prótesis forma un ambiente adecuado para el desarrollo de infección (Balarezo, 2014).
Otros factores predisponentes son la reacción alérgica a la resina (monómero), dieta rica
en carbohidratos, deficiencia de hierro y fólicos, las terapias antibióticas prolongadas e
inmunosupresivas y las inmunodeficiencias (Preti, 2008).Todos estos factores parecen
aumentar la capacidad de Cándida albicans para colonizar tanto la prótesis y las superficies
de la mucosa oral, donde actúa como un patógeno oportunista (Gendreau, 2011).
Siendo la Cándida albicans el factor etiológico principal, junto con la biopelícula
protésica, se considera la posibilidad que sean las proteasas extracelulares de la Cándida las
que mantienen el proceso inflamatorio y su adherencia al material protésico este dado por la
hidrofobicidad del organismo (Preti, 2008).
Tabla 2. Desarrollo de Estomatitis Protésica asociada con Cándida
Factores Etiológicos Factores
Predisponentes
Factores de Origen
Trauma
Infección
Alergías
Saliva (Xerostomía)
Dieta (Ingesta de
carbohidratos)
Higiene oral
Hábito tabáquico
Placa en la prótesis
Uso de la prótesis
Material de la base
Protésica
Textura superficial de
la prótesis
Enfermedades
generales(diabetes
mellitus,
malignidades)
Deficiencias
nutricionales
Defectos
inmunológicos
Vejez
Tratamiento médico
Fuente : (Thorén & Gunn, 2013) Elaborado: por Elizabeth Proaño
21
2.3.1.3.3 Clasificación
De acuerdo con la gravedad, la última modificación de esta la clasificación fue realizada
por Moreira y Bernal en 1989, de esta manera teniendo en cuenta las características clínicas
pueden diferenciarse tres variedades (Preti, 2008, pág. 376).
Grado I: Puntos hiperémicos: Lesión inflamatoria de aspecto rojo brillante,
generalmente asintomática, donde pueden aparecer puntos hiperémicos. La
mucosa puede presentarse fina, lisa y brillante. Es la lesión mínima visible a la
inspección. Está lesión se asoia con el traumatismo producido por las prótesis
(Thorén & Gunn, 2013).
Grado II: Eritema difuso: Área eritematosa bien definida, que dibuja el
contorno de la prótesis; puede estar constituida por un fondo finamente
granuloso y, a veces, aparece cubierta por un exudado blanco grisáceo.
Grado III: Inflamación granular: Lesión más definida, compuesta por una
mucosa gruesa con gránulos irregulares que se elevan superficialmente,
semejando formas papilar.que cubre principalmente la parte central del
paladar (Thorén & Gunn, 2013).
Figura 3 Estomatitis protésica: a) Grado 1, b) Grado 2, c) Grado 3 tomado de (Preti, 2008)
2.3.1.3.4 Clínica
Las manifestaciones clínicas se presentan generalmente por debajo de la prótesis se
observa un eritema claramente definido al área de la mucosa que se encuentra oculta por la
prótesis sin que exista una inflamación similar en la mucosa inferior. También se puede
observar puntos blancos diseminados que se desprenden fácilmente (Cawson, 2009), por lo
general es asintomática y las complicaciones que presenta son la aparición de fisuras en las
comisuras relacionada con queilitis angular, siendo este el síntoma más evidente y el
agravamiento de la hiperplasia papilar (Scully, Bagán, Carrozzo, Flaitz, & Gandolfo, 2014).
22
Un síntoma acompañante de la estomatitis subprotésica puede ser el ardor de la mucosa
y por este motivo debe de ser incluida en el diagnóstico diferencial de la boca urente (Grunert
& Crepaz, 2008).
El diagnostico se lo realiza mediante tinción de Gram en un frotis tomado de la mucosa
inflamada o de la superficie interna de la prótesis que muestra hifas de Cándida que
proliferan entre la base de la prótesis y la mucosa (Cawson, 2009).
La cuantificación de cándida en saliva no tiene mayor valor, ya que forma parte de la
flora saprófita de la cavidad oral y más en portadores de prótesis.
2.3.1.3.5 Tratamiento y mantenimiento
La inadecuada higiene de los pacientes portadores de prótesis dentales, su uso prolongado
y la mala adaptación de las mismas aumenta el riesgo de la acumulación de placa
dentobacteriana en la base de las prótesis y favorece la proliferación de microorganismos
oportunistas como lo es la cándida albicans (García, Benet, & Castillo, 2010).
Por estas razones una limpieza adecuada de las prótesis dentales y de la mucosa de soporte
permite el mantenimiento del color de la base y la salud general del paciente, evitando la
halitosis, la irritación de tejidos, hiperplasia papilar y principalmente infecciones micóticas
(Rahn, Ivanhoe, & Plummer, 2009). Se recomienda retirar las prótesis después de cada
comida para realizar la limpieza de la mucosa de soporte y la lengua con agua, mientras que
la de la prótesis es con un cepillo común de cerdas blandas y un jabón suave, no se debe
utilizar pasta dental en la limpieza ya que estas poseen elementos abrasivos que pueden dañar
la estructura de la prótesis (Thorén & Gunn, 2013) (Balarezo, 2014).
El portador de prótesis debe evitar su uso durante la noche y puede conservarla
extraoralmente en agua o con un limpiador de prótesis durante la noche, previamente
realizada su limpieza y en el caso de pacientes con infecciones recurrentes esto es
contraindicado ya que para evitar la proliferación bacteriana debe mantenerse la prótesis
seca después de la limpieza (Thorén & Gunn, 2013).
23
El tratamiento está enfocado a contrarrestar los factores causantes de la infección para
evitar la recurrencia (Gendreau, 2011). Los poros en el metilmetacrilato de la prótesis
sirven como reservorio de Cándida por esta razón se debe realizar una limpieza extrema con
hipoclorito sódico al 0,1%, clorhexidina o nistatina una hora al día y cremas de anfotericina
B o ketoconazol debajo de las prótesis durante la noche. También se puede aplicar un barniz
o gel de miconazol en la superficie interna de la prótesis mientras se lleva puesta con la
indicación que debe de quitar y limpiar 3 veces al día. El tratamiento dura entre una y dos
semanas (Preti, 2008) (Cawson, 2009).
En la hiperplasia epitelial del paladar o estomatitis subprotésica (grado 3) la inflamación
de la mucosa puede desaparecer después de las medidas de higiene y tratamiento
prostodóntico, cuando esto no sucede se debe realizar la extirpación quirúrgica del tejido
papilar (Thorén & Gunn, 2013) (Preti, 2008).
2.4 Propóleo
2.4.1 Definición
El propóleo es una sustancia adherente de origen natural, no tóxico resinosa producida
por las abejas a través de la mezcla de las secreciones de sus glándulas hipofaríngeas con el
producto digerido de resinas recogidas de hojas, flores de las plantas, árboles y cortezas, que
sirve como un sellador y tiene el propósito de proteger y aislar al panal de microrganismos
patógenos (Vagish, 2014).
Una de las propiedades más importantes del propóleo es la actividad antimicrobiana que
posee, la cual es atribuida por los flavonoides (Farre R, 2004), siendo este un compuesto eficiente
en tratamientos antisépticos, herpes, amigdalitis, posee propiedades cicatrizantes,
antinflamatorio, anticariógeno, en los último siglo se lo ha implementado en el campo de la
odontología con buenos resultados en Periodoncia, Cirugía Oral, Endodoncia y Patología Oral
entre otras (Premoli, 2010).
24
2.4.2 Características organolépticas del propóleo
La estructura del propóleo es sumamente compleja y múltiple por cuanto depende de la
flora, las condiciones geográficas y climáticas de la zona donde se elabora el producto. Se
ha demostrado que Apis mellífera es selectiva en la utilización de las especies vegetales
(Hernández, Lazo, & Junod, 2005).
Para Premoli (2010), la capacidad apícola de una determinada zona o región dependerá
de la vegetación circundante y de la preferencia de las abejas por un determinado tipo de
flores, según color, aroma, forma y floración.
Según Hernández (2005) un mismo panal producirá propóleos en diferentes cantidades
en distintas épocas del año y aún puede haber diferencias en las cantidades producidas en
ese mismo período, pues las abejas trabajan según sus necesidades y posibilidades. Además,
en una misma colmena la apariencia externa de los propóleos puede variar de una familia a
otra (Vagish, 2014).
Por su gran contenido en aceites esenciales es un componente aromático, la fracción que
se relaciona con los polifenoles de ácidos aromáticos, constituye las 2/3 partes de esta
cantidad, a las cuales se les atribuye la acción farmacológica (Noriega, 2014).
Su color varía de amarillo claro hasta marrón oscuro al igual que su sabor puede
presentarse amargo, ligeramente picante o insípido esto se debe al origen herbario de la
resina, época de recolección, zona geográfica.
A temperaturas menores de 15 °C tiene una consistencia dura y quebradiza, de 45 a 250°C
el propóleo es una sustancia suave, flexible y muy pegajosa, entre 60 y 70°C se vuelve
líquido (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013).
La calidad de los propóleos está directamente relacionada con los métodos de recolección,
almacenamiento y conservación. En el Ecuador la producción es de carácter artesanal, y no
se tiene registro actualizado que permita establecer el número de establecimientos o
laboratorios que se dediquen a su extracción y comercialización lo cual ha dificultado la
posibilidad de conseguirlo para la elaboración de las diferentes pruebas de laboratorio
25
requeridas en la presente investigación, ya que su producción depende de la época y no se
encuentran a los productores y distribuidores con facilidad.
2.4.3 Características Físicas
Las características químicas del propóleo son muy variables y complejas debido que
depende de la estación y área geográfica, por esta razón es importante conocer los estándares
de calidad con que cuenta la muestra recolectada. (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013).
Lacalle (2010) refiere que el contenido de agua de un propóleo de buena calidad no debe
ser mayor al 5%, para que no causen reacciones que a su vez formen productos no deseados
como fermentaciones y crecimiento de levaduras.
El propóleo tiene una baja solubilidad en agua pero puede ser disuelto en solventes como
alcohol etílico, acetona, benceno y soda cáustica; siendo el alcohol etílico el solvente más
favorecido ya que permite extraer con más eficiencia los principios activos y a bajas
concentraciones de cera (Farre R, 2004).
La presencia de ceras resta pureza al propóleo. Se consideran propóleos de buena calidad
aquellos en los cuales el porcentaje de ceras no supere el 25%. El punto de fusión esta desde
59°C hasta 80°C (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013).
2.4.4 Características Químicas
El propóleo es una mezcla compleja de diferentes constituyentes de origen natural con
más de 300 componentes investigados hasta el momento. Entre los principales componentes
están las resinas y bálsamos (50-55%), ceras (25-35%), aceites volátiles (10%), polen (5%),
minerales y sustancias orgánicas (5%), que incluye ácido fenólico, terpenos, ácido cinámico,
ácido cafeico, aldehídos aromáticos, alcoholes, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas (A,
B1, B2, B3, y B7), varios ésteres, minerales, aceites esenciales y flavonoides (flavonas,
flavonoles y flavanonas) también contiene elementos, como el hierro y el zinc que son
importantes para la síntesis de colágeno (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013; Vagish, 2014).
26
Muchas de las sustancias que determinan la actividad biológica del propóleo, se asocian
a la presencia de núcleos fenólicos como los flavonoides (Premoli, 2010). Los flavonoides
y ácidos fenólicos, junto con sus ésteres, se consideran los principales compuestos bioáctivos
del propóleo.
Principales flavonoides presentes en el propóleo, miel y jalea real.
Tabla 3: Flavonoides presentes en el propóleo
GRUPO COMPUESTO
Flavonoles: Quercetina, Kaempferol galangina, fisetina
Flavononas: Pinocembrina, naringenina, hesperidina.
Flavonas: Apigenina, acacetina, crisina, luteolin
Fuente: (Viuda-Martos, 2008, pág. 118)
2.4.5 Mecanismo de acción
Por los cuantiosos componentes del propóleo no se conoce completamente el mecanismo
de acción, por lo que se ha realizado múltiples estudios.
Vargas (2013) en su artículo cita a Mirzoeva et al. (1997) quienes demostraron que
“algunos de los constituyentes comúnmente encontrados en los propóleos, principalmente
quercetina y naringenina, provocan un incremento en la permeabilidad y una reducción en
el potencial de la membrana bacteriana, lo que contribuye a disminuirla resistencia de las
bacterias a agentes antibacterianos” (pág. 710).
Los flavonoides son el componente bioáctivo principal del propóleo ayudan a inhibir la
motilidad bacteriana, factor importante en la virulencia de estos microorganismos, los
flavonoides (quercetina, apigenina, galangina, etc) y los ácidos fenólicos (cafeico,
isoferúlico, cinámico y benzoico), además de ser tóxicos para las levaduras, inhiben la
actividad enzimática de la hialuronidasa y el ácido cafeico y la actividad de la dihidrofolato
reductasa, podrían explicar la similitud entre algunos de sus efectos antiinflamatorios (Farré,
2004).
Vagish (2014) manifiesta que el propóleo puede inhibir la síntesis de prostaglandinas,
activar la glándula del timo, apoyar al sistema inmune mediante la promoción de la actividad
27
fagocítica, estimular la inmunidad celular, y aumentar los efectos sobre los tejidos epiteliales
de curación.
Premoli (2010) refiere que la importancia del propóleo reside en que este es transportado
indistintamente por la sangre y por la linfa a todos los órganos, donde es metabolizado. Su
sitio de acción se considera que son los núcleos hipotalámicos de autorregulación, su acción
es la de estabilizar el sistema homeostático, homeotáxico, mejorando la capacidad de
defensa, funcionamiento y adaptación del organismo, así como los modelos anatomo-
funcionales normales.
2.4.6 Propiedades biológicas del propóleo
Las diferentes propiedades terapéuticas del propóleo han sido comprobadas por trabajos
científicos en diversas partes del mundo, coincidiendo casi siempre los resultados,
independientemente del sitio geográfico de procedencia de los productos estudiados
(Premoli, 2010).
Al estudiar la actividad antibacteriana y antiviral del propóleo de diferente origen
geográfico, se comprueba que todos son activos frente a hongos y cepas bacterianas Gram
(+) y muchas de ellas; también frente al virus de la influenza, como lo establece (Eguizábal,
2007)
Los compuestos fenólicos en sus variadas formas son los principales responsables de las
propiedades funcionales del propóleo: capacidad antioxidante (Almaraz, 2007), capacidad
antibacteriana (Huang, 2006), capacidad antivirales (Evers y otros 2005), la capacidad
antiinflamatoria (Harris y otros 2006) entre otras.
Actividad Antifúngica
El propóleo con predominio de ácido trans-p-cumárico, muestra mayor actividad
frente a Cándida albicans que los que contienen flavonoides, ésteres del ácido cafeico
y ácidos ferúlicos, muestran menor actividad antifúngica (Farre R, 2004). Se observó
mayor inhibición (50%) a una concentración de propóleo del 4% siendo los
microorganismos más afectados el género Cándida, Trichophyton metagrophytes, El
28
diluyente del propóleo, aceite, etanol, propilenglicol o glicerina también influye en
su actividad antifúngica (Vagish, 2014).
Actividad Antibacteriana
Al estudiar la actividad antibacteriana y antiviral del propóleo de diferente origen
geográfico, se comprueba que todos son activos frente a hongos y cepas bacterianas
Gram (+) y limitada actividad sobre Gram (-), también se evidencia actividad frente
al virus de la influenza (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013) (Farre R, 2004).
El propóleo tiene una actividad antibacteriana, ya que a través de los flavonoides
(quercetina, galangina, y pinocembrina), ácido cafeico, ácido benzoico, y ácido
cinámico actúan sobre la pared o membrana celular causando daño estructural y
funcional de la bacteriana al inhibír la ARN-polimerasa. (Vagish, 2014).
En las muestras procedentes de zonas templadas esta actividad se atribuye a sus
contenidos en ésteres y ácidos fenólicos, componentes de los que carecen los
propóleos de origen tropical sin embargo, muestran una actividad similar por su
contenido en derivados carbono prenilados del ácido p-cumárico (Premoli, 2010).
Acción cicatrizante
El propóleo provoca la estimulación de los procesos de regeneración tisular y de
cicatrización. (Premoli, 2010). Esta propiedad se debe a la presencia de ácidos
aminados, como la arginina y la prolina, cuyo papel es conocido en el proceso de
regeneración de la piel debido a la capacidad de secuestrar o inhibir la formación de
radicales libres, aumentando la síntesis del colágeno acelerando así la reparación
tisular (Farre R, 2004).
Acción antioxidante
Esta propiedad está vinculada a los polifenoles y los flavonoides respecto a los cuales
se ha demostrado que son capaces de romper reacciones en cadenas sobre los lípidos,
inhibir las reacciones de quimioluminiscencia por su capacidad de secuestrar o
29
inhibir la formación de radicales libres, la donación de hidrogeno, la quelación de
iones metálicos o de su actuación como sustrato como sustrato para los radicales
como superóxido e hidroxilo (Viuda-Martos, 2008).
Acción antiinflamatoria
El Propóleo impide de forma dosis dependiente la acción de las ciclooxigenasas
(COX), enzimas que actúan en la formación de las prostaglandinas comprometidas
en la inflamación, actuando a través de un flavonoide galangin y un éster de fenetilo
ácido cafeico que presentan una inhibición de las COX 1 y COX 2 (Viuda-Martos,
2008).
2.4.7 Reacciones Adversas
A pesar de las variadas aplicaciones favorables del propóleo en el campo de la salud, un
pequeño porcentaje de la población es alérgica a este compuesto natural y a los demás
productos apícolas (polen, jalea real, miel, veneno). Se considera que debido a esta situación
es necesario realizar a los pacientes, pruebas de sensibilidad antes de comenzar cualquier
procedimiento con propóleo (Lee, 2006).
2.4.8 Usos del propóleo en odontología
Efecto sobre la caries dental:
Existe evidencia de las acciones protectoras anticaries del propóleo principalmente rico
en pinocembrina y galangina, inhibe la actividad glucosiltransferasa y el crecimiento del
Streptococcus mutans causante de caries dentales. Las flavanonas, algunos
dihidroflavonoles y el sesquiterpeno tt-farnesol, que es el agente antibacteriano más activo,
inhiben el crecimiento del St mutans y del St sobrinus en la cavidad oral (Farre R, 2004).
30
Herpes Simple
Se utiliza como como un antiviral, retrasa el crecimiento y la progresión de cambios en
la mucosa en una etapa temprana de la infección con Herpes simple y no causa efecto
citotóxico (Vagish, 2014).
Protección contra la Radiación:
El propóleos puede reducir a la mitad el daño causado a los cromosomas por la radiación
ionizante. Su anti-oxidante, la propiedad de los propóleos permite la defensa contra la
radiación gamma podría atribuirse a su capacidad de eliminación de radicales que es mejor
que propiedad antioxidante de la vitamina C (Farre R, 2004).
Enfermedades gingivales y periodontales
El propóleo ayuda a la inhibición de la placa y tiene una actividad anti-inflamatoria, usado
como componente de dentífrico para controlar la microbiota oral, también se usa como un
medio de transporte eficaz para aumentar la viabilidad periodontal de las células de dientes
avulsionados, en el recubrimiento pulpar directo y como analgésico (Vagish, 2014) (Premoli,
2010).
Estomatitis Aftosa Recurrente
Varios estudios han evaluado el efecto de propóleos de abeja en la estomatitis aftosa
recurrente, 500 mg de propóleo cápsula tomada diariamente redujo significativamente de las
úlceras. La calidad de vida de estos pacientes mejora de forma significativa pero no hubo
disminución en el número de recurrencia de estas úlceras.
Material de obturación del conducto radicular:
Según (Premoli, 2010) se ha sugerido por Kosenko et al que la añadidura de alcohol en
un 4% a propóleos se puede utilizar como un canal de raíz material de obturación. Este
material ha demostrado tener una alta eficacia en las formas agudas, crónicas exacerbadas y
31
de la periodontitis apical. Tiene un efecto anestésico, no mancha la corona y también
promueve regeneración de la estructura circundante del hueso.
Curación de heridas dentales y Heridas de la Piel:
Para observar el patrón de cicatrización del epitelio por vía oral y heridas cutáneas, se
pudo establecer que el 10% de solución hidro-alcohólica de propóleos, acelera la
cicatrización de la herida de extracción curativo, pero no tiene ningún efecto sobre la
cicatrización “sitio zócalo” así lo analiza (Premoli, 2010).
Enjuague bucal y pasta dental
El propóleo se ha utilizado para hacer un enjuague bucal que inhibe la formación de placa
supra-gingival, a través del lavado de boca en base de alcohol etílico. Soluciones de
propóleos también se pueden utilizar en forma de enjuague bucal o gel para aplicación local
en pacientes con candidiasis oral usando las prótesis dentales removibles (Vagish, 2014).
Estomatitis Protésica
Por la creciente resistencia al fluconazol y la toxicidad de algunos fármacos antifúngicos,
se buscaron nuevas alternativas en el tratamiento de la estomatitis protésica. Propóleo que
contiene propilenglicol ha demostrado tener una actividad antifúngica, que es similar al
miconazol en el C. albicans disminuye las colonias y en el eritema de los pacientes con
Candidiasis subprotésica (Vagish, 2014).
32
CAPÍTULO III
3 Metodología
3.1 Lugar de la Investigación
La obtención del extracto etanólico de propóleo se realizó en la Facultad de Ingeniería
Química de la Universidad Central del Ecuador y la parte Microbiológica en el Laboratorio
de Microbiología de la USDQ, aproximadamente en el mes de Marzo del 2016.
3.2 Tipo y diseño de la investigación
Estudio Experimental de Tipo Microbiológico: es un estudio in vitro, que se lo
realizó en un laboratorio microbiológico bajo estrictas normas de control.
Prospectivo: Es un estudio en el cual el registro de los datos será orientado al futuro.
Longitudinal: ya que los datos fueron registrados de acuerdo a la evolución de los
hechos durante un periodo de tiempo determinado y observados en varios momentos.
3.3 Población y muestra
3.3.1 Población
En este tipo de análisis no se conoce con exactitud el tamaño de la población, por ello se
estima con fórmulas que no incluyen este parámetro; además, se toman en cuenta las
recomendaciones del microbiólogo que lleva a cabo la metodología y la recopilación de
información científica como artículos base.
3.3.2 Muestra
Para el cálculo de la muestra se aplicó la siguiente fórmula:
33
Fórmula:
Donde:
n = tamaño de la muestra
Z: valores correspondientes al riesgo deseado (nivel de Confianza)
s2: varianza de la variable cuantitativa (grupo de control observado), s = 9
d = valor mínimo de la diferencia que se desea detectar (datos cuantitativos),d = 12.1
α = es el nivel de confianza = 0,50 que se traduce en: 1,645
β = es un valor estimado = 0,075 que se traduce en: 0,96
n = 2*144 (1,960 + 1,282)2
249,64
n = 3027,042
249,64
n = 12 por cada concentración
Al ser tres concentraciones y dos grupos control se requiere analizar un total de 60 bloques
de resina contaminados con Cándida albicans.
3.4 Criterio de inclusión y exclusión
3.4.1 Criterio de Inclusión
Bloques de resina acrílica de termocurado, color rosado.
Forma cuboide.
2
22*2
d
ZZsn
34
Bordes rectos.
Los bordes y una de las superficies fueron totalmente pulidas, dejando la otra
superficie sin pulir.
Todo el bloque se lo contaminó con cepas de cándida albicans.
El extracto etanólico de propóleo en sus diferentes concentraciones estuvo totalmente
estéril.
3.4.2 Criterio de Exclusión
Bloques de Resina Acrílica de Autocurado de color rosado que presenten porosidades
Bloques de resina acrílica que presenten micro fracturas.
3.4.3 Estandarización
Se realizara la estandarización de la metodología para poder monitorizar la eficiencia de
los procesos analíticos teniendo en cuenta que se ha realizado su montaje con anterioridad
por lo que el personal especializado del laboratorio de microbiología está en la capacidad de
llevar a cabo todos los procedimientos analíticos e instruir y explicar cada proceso que se
realizara, por tal motivo previo a la observación, la microbióloga María Lorena Mejía
Castañeda calibrara a los observadores para de esta manera entender, maniobrar y observar
los mismos valores que la microbióloga observe y así poder llevar a cabo el proceso de
estandarización con éxito, de manera que los resultados sean reproducibles y comparables.
Dentro de la estandarización se debe cumplir con varias etapas como son: montaje,
validación, cálculo de atributos, cartas de Control. La realización de estos procedimientos
requiere la utilización de cepas certificadas con resultados conocidos y cuya procedencia no
sea de origen salvaje, de tal manera que se pueda identificar si nuestra metodología se realizó
en forma correcta. Dentro de los parámetros a estandarizar se encuentran los siguientes:
El tipo de bacterias a estudiar, en este caso Cándida albicans.
Los medios de cultivo para realizar las pruebas: pH, humedad, efecto de la
timina o timidina, cantidad de cationes divalentes.
El tiempo de incubación que es de 24 horas.
La temperatura de incubación.
La medición de halos que se la realiza con pie de rey.
35
3.5 Operacionalización de variables
Tabla 4 Operacionalización de Variables
VARIABLES DEFINICIÓN VARIABLE ESCALA DE
MEDICIÓN INDICADORES
DEPENDIENTE
Efecto
inhibitorio
(Dos Fases)
Capacidad de impedir el
crecimiento de un
microorganismo patógeno
como es el hongo de Cándida
albicans; en la primera fase: la
inhibición producida por los
distintos EEP sobre los bloques
de resina acrílica contaminados
con Cándida Albicans se
evaluará observando el
crecimiento fúngico y
registrándolo posteriormente
como positivo o negativo según
el caso, mientras que
en la segunda fase: se observa y
mide el halo de inhibición con
pie de rey.
Nominal
(Primera Fase)
Cuantitativo
(Segunda Fase)
Nominal
Cuantitativo
(+) = medio de
cultivo gelificado
con presencia de
crecimiento
(-) = medio de
cultivo gelificado
con ausencia de
crecimiento
Mm
INDEPENDIEN
TE
Extracto
etanólico de
propóleo
Es un extracto alcohólico
obtenido por la combinación
del propóleo puro que es un
compuesto resinoso con el
etanol que va actuar como
solvente. Se obtiene el extracto
en diferentes concentraciones al
10%, 20% y 40%.
Ordinal
Ordinal
10%
20%
40%
Tiempo Minutos y horas en los que se
observa el efecto inhibitorio del
extracto etanólico de propóleo
en diferentes concentraciones.
Cuantitativo Cuantitativo 5 minutos
10 minutos
15 minutos
8 horas
Elaborado por: Elizabeth Castro Herrera
3.5.1 Conceptualización de las Variables
3.5.1.1 Variable Independiente
Extracto etanólico de propóleo: se lo conoce también como tintura de propóleo y
es preparado como un extracto alcohólico de propóleo en concentraciones variables
36
entre 10% y 30% (en peso/volumen). Se mezcla la cantidad de propóleo con la
cantidad apropiada de etanol. Se tienen en maceración o fermentación al menos
durante siete días, agitando con frecuencia y filtrando con un filtro con poro fino. El
EEP se envasa en frascos de color marrón, protegidos de la luz y se almacena a
temperatura ambiente, para impedir la oxidación de los componentes del propóleo
(García, Ucar, & Lelis, 2014).
El Tiempo: “es una magnitud física fundamental, el cual puede ser medido utilizando
un proceso periódico, entendiéndose como un proceso que se repite de una manera
idéntica e indefinidamente” (Macias & Yunda, 2015, p. 12).
3.5.1.2 Variable Dependiente:
Efecto inhibitorio: Es la capacidad que tiene una sustancia para impedir el
crecimiento de las cepas de Cándida Albicans, un ejemplo de esto son los extractos
etanólicos del propóleo que poseen actividad antifúngica debido a sus componentes
bioáctivos (Farre R, 2004).
3.6 Procedimiento y Técnica
3.6.1 Unidades de estudio
Se usó el Extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y 40%. Además, se utilizaron como
muestras y para simular las prótesis, bloques de resina acrílica de termocurado de 1.5 x 1.5
mm y de 3mm de grosor previamente fabricadas, los mismos que fueron contaminadas con
Cándida Albicans ATCC® 10231 durante 24 horas a temperatura ambiente.
3.6.2 Características de la unidad experimental
La materia prima que se usó es: 150 gr de propóleo en su estado natural puro y etanol al
96% como alcohol, de lo cual se obtuvo el extracto etanólico de propóleo.
37
Figura 4 Balanza para pesar la muestra de Propóleo Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
3.6.3 Obtención del Extracto Etanólico de propóleo
a.- Recolección de materia prima
La recolección del propóleo se realizó en la Provincia de Pichincha, Cantón Quito. Cada
muestra de propóleo se obtuvo del mayor número de colmenas posibles del apiario “El
Apinal”.
b.- Destilación
Con ayuda de una regla se dibujó un cuadrado de papel filtro de 30 x 30 cm
aproximadamente y se colocó con la espátula 20 gr de propóleo triturado en tamaños
pequeños, luego se selló la muestra con grapas de tal manera que no salga del dedal y se lo
colocó elaborado en el tubo de extracción del soxhlet, una vez situado el empaque en el
soxhlet se midió 200 ml de etanol y se ubicó en el balón. Se procedió a regular el calentador
para que alcance una temperatura aproximada a 78,37ᵒC (temperatura de ebullición del
etanol) y se puso aceite mineral en las uniones del equipo, se dejó circulando este solvente
por 2 horas y se esperó 30 minutos o hasta que se enfríe por completo el balón reservorio.
Se filtró la solución obtenida en un vaso de precipitación de 600 ml y se colocó el balón en
la estufa a 20 ᵒC hasta evaporar completamente el solvente.
38
Figura 5: Filtro para colocar la muestra de propóleo Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 6: Pesaje del propóleo
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 7: Equipo Soxhlet
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
39
Figura 8: Proceso de evaporación
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
La preparación del extracto se la realizó por quintuplicado
El rendimiento de cada muestra de propóleo se calculó de acuerdo a la ecuación:
R (%) = P.100/m (1)
Donde:
R = es el rendimiento en porcentaje,
P = el peso del extracto (g) y
m = el peso de la muestra.
c) Separación
Los sólidos solubles obtenidos se recuperaron empleando etanol ya que es un extracto
alcohólico. A partir de cada extracto de propóleo, se pesaron 10 g y se aforaron a 100 ml de
etanol, obteniendo soluciones de extracto de propóleo con una concentración de 10 %, luego
se pesaron 20 g y se aforaron a 100 ml de etanol, obteniendo soluciones de extracto de
propóleo con una concentración de 20 % y por último se pesaron 40 g y se aforaron a 100
ml de etanol, obteniendo soluciones de extracto de propóleo con una concentración de 40 %.
Figura 9: Muestra pura del extracto etanólico de propóleo
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
40
Figura 10: Balanza analítica con propóleo al a) 10%, b) 20% , c) 40% Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 11: Colocación de etanol sobre las muestras de propóleo Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
d) Envasado
Para esterilizar las soluciones de los extractos se filtraron a través de membranas con
poros de 0.45 µm, y se colocaron en frascos de vidrio oscuros para evitar la penetración de
la luz y se lo mantuvo en un lugar fresco y seco.
e) Almacenamiento
Las soluciones preparadas se almacenaron a 10 °C hasta su uso.
41
Figura 12: Recipientes para el almacenamiento de las muestras
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
3.6.3.1 f) Obtención de las cepas bacterianas y resinas
Cepas de Cándida albicans
La cepa de C. Albicans ATCC® 10231 fue obtenida de la empresa MEDIBAC.
Los Bloques de resina acrílica fueron fabricados en el Laboratorio Dental Mafla.
El extracto etanólico de propóleo al 10%,20% y 40% se obtuvo en los Laboratorios de la
Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.
Muestras de Resina Acrílica de Termocurado
Figura 13: Clasificación de los bloques de Resina acrílica Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
42
Se elaboraron 60 bloques de resina acrílica de termocurado, usando el polímero (O-cryl).
Siendo las dimensiones de las muestras de 1.5 x 1.5 mm y de 3mm de grosor las cuales
fueron almacenadas en agua destilada hasta el momento de la contaminación con Cándida
Albicans ATCC® 10231.
Figura 14: Bloques de resina acrílica antes de ser esterilizados
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
3.6.4 Diseño Experimental
Esterilización: Las 60 muestras de acrílico fueron colocadas en un envase de vidrio y
llevadas a la autoclave a 121 ° C por 15 minutos para su esterilización.
Figura 15: a) Rotulación del frasco con bloques de resina, b) colocación del mismo en el área
del autoclave Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
43
Figura 16: Autoclave a 121°C por 15 minutos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
3.6.4.1 Obtención y preparación de cepas bacterianas
a.- Activación de Cepas
Se siguieron los siguientes pasos para la activación de la cepa:
1. Se dejó que la bolsa sellada que contenía KWIK-STIK, se equilibre a la temperatura
ambiente, luego se rasgó la envoltura para el retiro de la ampolla.
2. Se Arrancó la porción de lengüeta con la etiqueta y se adjuntó a la placa de cultivo
primario o registro de control de calidad. No se desmontó el dispositivo durante la
hidratación.
3. Se Pellizcó (sólo una vez) la ampolla en la parte superior de la KWIK-STIK (justo
debajo del menisco de fluido de la ampolla) encontrando la tapa para liberar el
hidratante.
Figura 17: Liberación del fluido de la ampolla
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
44
4. Se sostuvo verticalmente y se tocó en una superficie dura para facilitar la salida de
fluido a través del eje en la parte inferior de la unidad que contiene la bolita. Se
permitió que el fluido pase a través del mango a la parte inferior de la unidad que
contiene el sedimento.
5. Se apretó en la parte inferior de la unidad y se presionó el precipitado en el líquido,
hasta que la suspensión este homogénea.
6. Inmediatamente, se saturó el hisopo con los materiales hidratados y se transfirió a un
medio de agar.
Figura 18: Transferencia con hisopo estéril a un medio de agar
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
7. Se inoculó la placa con el cultivo primario rodando suavemente el hisopo sobre una
tercera parte de la placa.
8. El uso de un asa estéril sirvió para rayar y facilitar el aislamiento de colonias.
Figura 19: Uso de asa estéril para aislamiento de colonias
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
45
9. Mediante la eliminación adecuada de riesgo biológico, se desechó el KWIK-Stik.
10. Se incubó inmediatamente la placa de cultivo primario inoculado (s) en la condición
de temperatura adecuada para el microorganismo.
3.6.4.2 Determinación del efecto inhibitorio del propóleo por el método del
Coeficiente fenólico y Difusión en agar
Primera fase: Coeficiente Fenólico Gelificado
a.- Preparación de los medios de cultivo
Tratamiento: Posteriormente se pesó tres porciones de 21gr de Agar Nutritivo TSB el
mismo que se colocó en tres frascos de vidrio cada uno con 700 ml de Agua Destilada, luego
se procedió a pesar y a colocar en cada uno de los frascos 10.5gr de Agar Bacto Agar para
que se gelifique el medio, enseguida se rotuló cada uno de los frascos y se envió al autoclave.
Figura 20: Recipientes con Agar Nutritivo y Agar Bacto Agar
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
46
Figura 21: Colocación de cada Porción de Agar en los recipientes
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 22: Pesaje de porciones de: a) Agar Nutritivo TSB, b) Agar Bacto Agar
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 23: Frascos de vidrio con 700 ml de Agua destilada c/u
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
47
Figura 24: Frascos de vidrio con Agar Nutritivo TSB + Agua destilada + Agar Bacto Agar
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
3.6.4.2.1 b.- Incubación
Mientras tanto se rotularon las 60 cajas Petri con el nombre de la sustancia que contenían,
el número de muestra y el tiempo a tomar en cuenta, al mismo tiempo se colocó los bloques
de resina acrílica en un envase de plástico el mismo que se lo rotulo, una vez realizado esto
y conjuntamente con las 60 cajas Petri se mandó al autoclave a 121°C por 15 minutos.
Figura 25: Cajas Petri rotuladas
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
48
Figura 26: Recipiente con bloques de resina acrílica Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Posteriormente se procedió a colocar 20ml de cada EEP al 10% ,20% y 40%, y de etanol
al 96% (grupo control positivo) y agua destilada (grupo control negativo) en cinco envases
de plástico,
Figura 27: Recipientes con EPP, agua, etanol Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Enseguida se sumergió doce bloques de resina de acrílico termocurado estériles en cada
frasco de plástico; los mismos que se los identifico mediante el nombre y el porcentaje de la
sustancia que contenían de la siguiente manera:
Etanol al 96% (grupo control positivo).
Agua destilada (grupo control negativo).
EEP al 10%
EEP al 20%
EEP al 40%
49
Figura 28: Colocación de los bloques de resina en los frascos con los diferentes EEP
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 29: Recipientes con EPP y Bloques de resina acrílicas
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
En cada uno de los frascos se pipeteó 2µL (microlitros) del cultivo de Cándida albicans
ATCC® 10231 con el fin de contaminar las muestras.
Figura 30: Contaminación de las resinas con C albicans
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
50
Luego con un cronómetro se fue midiendo los tiempos (5min, 10min, 15min, 8h) y al
cumplirse cada lapso de tiempo, se extrajo tres muestras de resina acrílica y se colocaron en
el centro de una cápsula Petri cada una.
Figura 31: Colocación de muestras de resina acrílica en cajas petri.
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Una vez colocados los bloques de resina en las cajas Petri rotuladas con las diferentes
concentraciones de los extractos, el etanol, el agua destilada y el tiempo (5min, 10min,
15min, 8 horas) y el número de muestra (1, 2, 3), se procedió a cubrir las muestras con Agar
nutritivo TSB + Agar Bacto Agar, que se colocó en cada una de las cajas Petri llenándolas
en sus tres cuartas partes.
Figura 32: Colocación del agar sobre las muestras de resina cubriendo sus ¾ partes
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
El agar fue fundido y mantenido a una temperatura entre 40-50°C por 24 h para promover
el crecimiento de la cepa. Las muestras fueron divididas en subgrupos. Cada subgrupo
51
contenía una muestra de resinas acrílicas y se encontraban identificadas con el número de la
muestra y con el tiempo de inmersión de la muestra en los EEP, el etanol y el agua destilada
(5min, 10min, 15min, 8h). Se esperó a que el agar se gelificara y se puso las placas a incubar
a 37°C por 24h y 48h. Se observaron las muestras a las 24 h y 48h de incubación. Los datos
fueron registrados en cuadros.
Figura 33: Cajas Petri con muestras incubadas
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
c.- Resultados
Resultados de la inhibición del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40%, etanol y agua a los 5 min.
Figura 32: Resultado de Inhibición al 20% en 5
min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 31: Resultado de Inhibición al 10% en 5 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
52
Figura 35: Resultado de Inhibición con agua en 5 min
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Resultados de la inhibición del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40%, etanol y agua a los 10 minutos.
Figura 36: Resultado de Inhibición al
10% en 10 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 38: Resultado de Inhibición al
40% en 10 min Fuente: Investigación
Figura 34: Resultado de Inhibición con etanol en 5
min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 37: Resultado de Inhibición al 20% en 10
min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 39: Resultado de Inhibición con etanol en
10 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 33: Resultado de Inhibición al 40% en 5 min
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
53
Figura 40: Resultado de Inhibición con agua en 10 min
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Resultados de la inhibición del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40%, etanol y agua a los 15 minutos.
Figura 45: Resultado de Inhibición con agua en 15 min
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 42: Resultado de Inhibición al 20% en
15 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 44: Resultado de Inhibición con etanol
en 15 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 41: Resultado de Inhibición al 10% en
15 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 43: Resultado de Inhibición al
40% en 15 min Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
54
Resultados de la inhibición del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y
40%, etanol y agua a las 8 horas.
Figura 48: Resultado de Inhibición al 40% en
8 horas Fuente: Investigación
Elabo
Figura 50: Resultado de Inhibición con agua en 8 horas Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 47: Resultado de Inhibición al 20% en
8 horas Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 49: Resultado de Inhibición con
etanol en 8 horas Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 46: Resultado de Inhibición al 10%
en 8 horas Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 48: Resultado de Inhibición con
etanol en 8 horas Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
55
Segunda fase: Difusión en agar
Preparación del inóculo: El inóculo se prepara en solución salina hasta que se observe la
misma turbidez que la solución McFarland, esto se lo realizó colocando entre 4 y 5 ml de
suero fisiológico estéril en un tubo de ensayo.
Figura 51: Solución McFarland
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Se tomó con un asa bacteriológica tres o cuatro colonias morfológicamente similares en
este caso de Cándida Albicans y se suspendió en el tubo hasta alcanzar una turbidez
comparable a la solución de McFarland 0.5.
Figura 52: Comparación de las soluciones con McFarland 0.5.
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
56
Inoculación de las placas: una vez preparado el inóculo bacteriano se introdujo el hisopo
estéril en el inóculo hasta embeberlo completamente y antes de retirarlo se presionó sobre
las paredes del tubo para eliminar el exceso del líquido del mismo.
Figura 53: Introduciendo el hisopo estéril
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Luego se procedió a inocular 5 placas de Agar Mueller-Hinton completamente, sin dejar
ninguna zona libre para obtener un crecimiento confluente, para lo cual se estría con el
hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma cuatro
veces, rotando cada placa unos 90º cada vez y pasándola por último por la periferia del agar
para conseguir una siembra uniforme. Se dejó secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos.
Figura 54: Inoculación de 5 placas de Agar Mueller-Hinton
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Dispensación de los discos: se colocó los discos manualmente con una pinza estéril
asegurándonos que contacten perfectamente con la superficie del agar y realizando una ligera
presión sobre la superficie del agar
57
Figura 55: Colocación de discos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Se realizó la distribución de los discos de forma que no se produzca superposición de los
halos de inhibición colocando así en cada placa tres grupos de un disco en los que se
colocaron 10µL (microlitros) en cada disco, tres grupos de tres discos en los que se colocó
30µL (microlitros) y tres grupos de cinco discos en los que se colocó 50µL (microlitros) ya
que se hizo por triplicado, esto se realizó con cada una de las concentraciones del extracto
etanólico de propóleo 10%, 20% y 40%, etanol al 96% y agua destilada. Las placas se
incubaron 48 horas, y luego se procedió a medir el diámetro de los halos de inhibición desde
un extremo del halo pasando por el centro del mismo hasta el borde opuesto del halo con un
pie de rey. Los datos fueron registrados en cuadros.
Figura 56: Resultados de la prueba de difusión de discos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
58
Resultados del método de disco difusión en agar con los EEP, etanol y agua
Figura 57: Propóleo al 10%, halos de inhibición con uno, dos y tres discos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 58: Propóleo al 20%, halos de inhibición con uno, dos y tres discos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 59: Propóleo al 40%, halos de inhibición con uno, dos y tres discos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
59
Figura 60: Etanol al 96%, halos de inhibición con uno, dos y tres discos
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Figura 61: H2O con ausencia de halos de inhibición con uno, dos y tres discos Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Desecho de las muestras:
En el Laboratorio de Microbiología se identificaran los residuos peligrosos biológicos
infecciosos, cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos generados en el área de
microbiología serán esterilizados en Autoclave: 121 °C y 15 Lb/pulgadas de presión, durante
30 min antes de ser llevados al Almacén Temporal de residuos peligrosos biológicos
infecciosos para ser separados, envasados y posteriormente ser eliminados en fundas de color
rojo, deberán estar siempre bien cerrados para descartar al máximo el daño a la salud
inmediatamente después de su generación, es decir, en el mismo lugar en el que se originan
y por el personal sanitario.
60
3.7 Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos
Primera fase:
Observación de la presencia o ausencia de crecimiento de Cándida Albicans:
Se recopilaron los datos en una tabla previamente elaborada donde se clasificó el efecto
inhibitorio del extracto etanólico del propóleo al 10%, 20% y 40%, mediante un “+” si existe
crecimiento de Cándida albicans y con un “-” si no existe crecimiento.
Interpretación: Se registró el crecimiento fúngico como positivo cuando en el medio de
cultivo gelificado se encontró crecimiento de cándida albicans, y se registró el crecimiento
fúngico como negativo cuando en el medio de cultivo gelificado no se observe crecimiento
de cepas de cándida albicans.
Segunda fase:
Medición de los halos e interpretación de los mismos:
Se recopilaron los datos en una tabla previamente elaborada donde se clasificó el efecto
inhibitorio del extracto etanólico del propóleo al 10%, 20% y 40%, mediante la lectura del
diámetro de las zonas de completa inhibición con un pie de rey o regla.
Figura 62: Pie de rey y resultados de la prueba de disco
Fuente: Investigación
Elaboración: Autor
Interpretación: se compararon los diámetros del halo de inhibición de las diferentes
concentraciones, y estableciendo las correspondientes diferencias de los halos, se determinó
cuál de los extractos es el más efectivo sobre la cepa estudiada.
61
CAPÍTULO IV
4 Análisis Estadístico
4.1 Resultados y Análisis de datos
Al comparar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo sobre el crecimiento
in vitro de cándida albicans entre las diferentes concentraciones al 10%, 20% y 40%. A
través de la técnica del Coeficiente fenólico mediante gelificación, siendo el H20 el grupo
control negativo y el etanol al 96% el grupo control positivo, se obtuvo los siguientes
resultados.
Tabla 5: Fase 1 - 24 horas
N° Porcentaje de
propóleo
LECTURA
5 Min. 10 Min. 15 Min. 8 Hrs.
P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3
1 al 10% - - - - - - - - - - - -
2 al 20% - - - - - - - - - - - -
3 al 40% - - - - - - - - - - - -
4 H2O Propóleo al 0% + + + + + + + + + + + +
5 Etanol 96% - - - - - - - - - - - -
Elaborado por : Elizabeth Castro Herrera
Fuente : Trabajo de laboratorio
A las 24 horas de incubación de los medios de cultivo se pudo observar que los extractos
etanólico de propóleo en sus tres concentraciones al 10%,20% y 40%; así como Etanol al
96%, tienen efecto inhibitorio sobre los bloques de resina acrílica contaminados con cándida
albicans a partir de los 5 minutos; excepto en las del grupo control negativo, como se
demuestra en la tabla 3. Esto indica que las tres concentraciones ensayadas, ejercieron un
efecto esperado en los diferentes tiempos de exposición (5min, 10min, 15min y 8 h).
Tabla 6: Fase 1 - 48 horas N° Porcentaje de
propóleo
LECTURA
5 Min. 10 Min. 15 Min. 8 Hrs.
P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3
1 al 10% - - - - - - - - - - - -
2 al 20% - - - - - - - - - - - -
3 al 40% - - - - - - - - - - - -
4 H2O Propóleo al 0% + + + + + + + + + + + +
5 Etanol 96% - - - - - - - - - - - -
Elaborado por : Elizabeth Castro Herrera
Fuente : Trabajo de laboratorio
62
A las 48 horas se observa que no hay crecimiento de la levadura en los medios de cultivo
por lo que no se modifican los resultados que se observaron a las 24 horas, como se aprecia
en la tabla 4, que es idéntica a la anterior.
Seguidamente utilizamos el software SPSS, y se calcula el índice de correlación de
Pearson para establecer si existe correlación entre las variables o si definitivamente son
independientes lo cual se muestra en el cuadro 5:
Tabla 7: Correlación lineal
Valor Error estándar
asintótico Aprox. S Aprox. Sig.
Intervalo por
intervalo
R de Pearson -,354 ,265 -,655 ,559
Ordinal por
ordinal
Correlación de
Spearman -,354 ,328 -,655 ,559
N de casos válidos 5
Elaboración y fuente: Estadístico SPSS
Al ser R = - 0,354 y p-valor = 0,559 significa que no existe relación lineal entre las
variables es decir que son independientes.
Se supone la hipótesis nula y se basa en aproximación normal
Al observar a que tiempo actúa el extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y 40%
sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans. No establece ninguna
diferencia en los comportamientos de las EEP aplicados en las resinas en los distintos
periodos de tiempo desde el más corto (5 min.) al más extenso (8 h) el resultado es el mismo,
en todos se obtiene un resultado negativo, entonces no se establece un factor que permita
diferenciar, sin embargo, se comprueba unánimemente el efecto inhibitorio del EEP.
Por el método difusión en agar
Se comparó y determino cuál del efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo
(EEP) al 10%, 20% y 40% es más efectivo y se estableció una comparación con el efecto
inhibitorio del etanol al 96% (grupo control positivo) y el agua (grupo control negativo)
sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans mediante el método de
63
difusión en agar. Se obtuvo 45 resultados de halos distribuidos en los tipos de solución,
número de discos y número de pruebas.
Tabla 8: Diámetros de los halos de Inhibición de los extractos etanólicos de propóleo y de los
grupos control SOLUCIÓN N° de
discos
Halo 1 Halo 2 Halo 3 Media
Propóleo al 10% 1 15,94 15,98 15,57 15,83 Propóleo al 10% 3 14,44 13,57 14,87 14,29 Propóleo al 10% 5 15,28 12,84 13,1 13,74 Propóleo al 20% 1 15,7 14,82 14,97 15,16 Propóleo al 20% 3 13,53 13,82 12,99 13,45 Propóleo al 20% 5 13,8 11,54 11,45 12,26 Propóleo al 40% 1 14,1 13,44 11,41 12,98 Propóleo al 40% 3 13,56 14,44 15,71 14,57 Propóleo al 40% 5 12,44 13,22 12,59 12,75 Etanol al 96% 1 13,69 14,19 13,46 13,78 Etanol al 96% 3 12,92 13,83 12,68 13,14 Etanol al 96% 5 11,46 9,4 12,46 11,11 Agua 1 0 0 0 0,00 Agua 3 0 0 0 0,00 Agua 5 0 0 0 0,00
Elaborado por : Elizabeth Castro Herrera
Fuente : Trabajo de laboratorio
Se ha procesado estadísticamente los resultados obtenidos de las pruebas realizadas según
el método de difusión en agar y con la ayuda del software SPSS, se someten a varios análisis;
en primer lugar, se construye un modelo (tabla 6).
En este modelo, que estudia el efecto que produce un solo factor en la variable halo
resultante, la asignación de las unidades experimentales a los distintos niveles del factor se
debe realizar de forma completamente al azar. Este modelo, junto con este procedimiento de
asignación, recibe el nombre de Diseño Completamente Aleatorizado y está basado en el
modelo estadístico de Análisis de la Varianza de un Factor o una Vía.
Esta técnica estadística, Análisis de la Varianza de un factor, se la utiliza porque se tienen
que comparar más de dos grupos y la variable respuesta es una variable numérica, además
porque nuestro estudio cumple con la característica cuando queremos analizar una muestra
que ha estado sometida a diferentes tratamientos o ha estado almacenada en diferentes
condiciones.
64
Nuestro objetivo es estimar el efecto inhibitorio del propóleo y contrastar la hipótesis de
que todos los niveles del factor producen el mismo efecto, frente a la alternativa de que al
menos dos difieren entre sí.
Tabla 9: Informe de comparación de 2 variables con SPSS Solución de Propóleo Media N Desviació
n
estándar
Mínim
o
Máxim
o
Error
estándar de
la media 1 DISCO AL 10% 15,4633 3 ,43981 15,98 16,84 ,25392
3 DISCOS AL 10% 14,2933 3 ,66229 13,57 14,87 ,38238
5 DISCOS AL 10% 13,7400 3 1,34000 12,84 15,28 ,77365
1 DISCO AL 20% 15,1633 3 ,47078 14,82 15,70 ,27180
3 DISCOS AL 20% 13,4467 3 ,42123 12,99 13,82 ,24320
5 DISCOS AL 20% 12,2633 3 1,33155 11,45 13,80 ,76877
1 DISCO AL 40% 12,9833 3 1,40194 11,41 14,10 ,80941
3 DISCOS AL 40% 14,5700 3 1,08088 13,56 15,71 ,62405
5 DISCOS AL 40% 12,7500 3 ,41388 12,44 13,22 ,23896
1 DISCO CON ETANOL 13,7833 3 ,39068 13,69 14,46 ,22556
3 DISCOS CON ETANOL 13,1433 3 1,40643 12,92 15,68 ,81200
5 DISCOS CON ETANOL 11,1067 3 1,56030 9,40 12,46 ,90084
Total 13,7531 36 1,59833 9,40 16,84 ,26639
Elaborado por: Ing. Fernando Guerrero
Fuente : Estadístico SPSS
Como resultado de la prueba SPSS entrega el informe que consta en la tabla 8; dónde se
presentan los doce grupos dispuestos en forma comparativa. A simple vista se puede
observar que el valor medio de estos grupos es numéricamente distinto, lo cual resulta de
utilidad para nuestro análisis.
Tabla 10: Análisis de la Varianza ANOVA con SPSS
Variable dependiente: Halo Resultante Origen Tipo III de
suma de
cuadrados
Gl Cuadrático
promedio
F Sig.
Modelo
corregido
64,474a 11 5,861 5,640 ,000
Interceptación 6809,275 1 6809,275 6552,631 ,000
Solución 64,474 11 5,861 5,640 ,000
Error 24,940 24 1,039
Total 6898,689 36
Total, corregido 89,414 35
a. R al cuadrado = ,721 (R al cuadrado ajustada = ,593)
Elaborado por: Ing. Fernando Guerrero
Fuente : Estadístico SPSS
Los resultados del análisis de la Varianza ANOVA (por sus siglas en ingles Analysis of
Variance) (Boqué & Maroto, 2012). Si el valor de F es mayor que uno (5,64), quiere decir
que hay un efecto positivo del factor Solución de propóleo. Se observa que el P-valor (Sig.)
65
entre grupos combinados y dentro de grupos, tiene un valor de 0.000, que es menor que el
nivel de significación 0.05. Por lo tanto, hemos comprobado estadísticamente que estos doce
grupos son distintos.
En la Tabla 8, el valor del estadístico de contraste de igualdad de medias, F = 5,64 deja a
su derecha un p-valor de 0.000, menor que el nivel de significación del 5%, por lo se puede
decir que existen diferencias significativas en las concentraciones medias de las soluciones
de propóleo entre los 12 tipos de muestras.
La salida de SPSS también nos muestra que R cuadrado vale 0.721, indicándonos que el
modelo explica el 72.1% de la variabilidad de los datos; por lo tanto, esta prueba estadística
permite afirmar que cada una de las muestras de EEP aplicadas en los discos, tiene total
independencia y que cada resultado de la medición de los halos, no necesariamente está
relacionado. Sin embargo, en cada uno de esos resultados se pudo comprobar que no se
observó desarrollo de la cepa dentro del halo de inhibición.
Tabla 11: Media de halos de Inhibición para los extractos etanólicos de propóleo
Elaborado por : Ing. Fernando Guerrero
Fuente : Trabajo de laboratorio
Con los resultados obtenidos en el laboratorio se realizó una agrupación de las medias de
los diferentes extractos etanólicos de propóleo junto con análisis estadístico (Tabla 9),
demostrando que hubo diferencia en los halos de inhibición:
66
El extracto de propóleo al 10% es más efectivo sobre la Cándida albicans ya que presenta
una media mayor de 15.83 mm a diferencia de la media más baja que es del extracto etanólico
de propóleo al 40% que se mantiene con un tope de 14,57mm.
Se observa que el extracto de propóleo al 20% alcanza una media de 15.16mm por lo que
no existe una diferencia significativa con el extracto de propóleo al 10%, puesto que los
extractos de propóleo al 10% y 20% tienen similares topes en mediciones de halos.
El etanol que es el grupo control positivo tiene una media de 13.78mm siendo este menor
al de los halos producidos por los extractos. Mientras que en el agua que es el grupo control
negativo no se observó formación de halos de inhibición.
4.2 Discusión
El propósito de este estudio fue determinar y comparar el efecto inhibitorio del extracto
Etanólico de Propóleo al 10%, 20%, 40%, sobre bloques de resina acrílica contaminados con
Cándida albicans. Varios estudios se han realizado para determinar las diferentes
propiedades que poseen los extractos etanólicos de Propóleo entre ellas su capacidad
antimicrobiana entre los que se cita: (Carrillo M, 2011) , (De la Cruz, 2013), (Farre R, 2004),
(Herrera, Alvear, Barrientos, Montenegro, & A, 2010) , (García, Ucar, & Lelis, 2014) ,
(Vagish, 2014), los mismos que concuerda con el hecho de que el propóleo posee una amplia
gama de propiedades como: antioxidantes, antimicrobianas y antifúngicas, entre otras, las
cuales dependen de su origen botánico, composición química, estación climática, método de
extracción, edad y zona geográfica de recolección (Vargas, Urrutia, & Sanchez, 2013).
Romo (2006) en su estudio manifiesta que la fase temprana de colonización de cándida
albicans en prótesis dentales empieza por los factores intrínsecos fisicoquímicos de las
propiedades superficiales de la resina acrílica y los mecanismos activo y pasivo de la
adhesión microbiana, mientras que Farre R (2004) indica que el método con agar es más
efectivo para la evaluación de la inhibición del propóleo sobre Cándida albicans, debido a la
baja solubilidad que presentan los componentes del propóleo en el agar, esta revisión
bibliográfica sustenta la utilización de resina acrílica de termocurado y de la utilización de
agar para la realización de esta investigación.
67
En su investigación García, Ucar, & Lelis (2014) analizaron la “Eliminación de cándida
albicans con extracto etanólico de propóleo comercial de apis mellifera del estado mérida,
en bases de prótesis parciales removibles”, encontrando un efecto antifúngico del extracto
etanólico de propóleo sobre Cándida albicans, siendo los mejores resultados obtenidos por
el extracto etanólico de propóleo al 20% y menor efecto al 40%. Estudio que concuerda con
esta investigación en la que también se encontró un mayor efecto inhibitorio del extracto
etanólico de propóleo al 20% en comparación con el del 40% que posee un menor efecto.
Farre R (2004) manifiesta que el extracto etanólico de propóleo al 20% ante Candida
albicans en mucosa oral, es igual de efectivo que la nistatina y supera a otros antifúngicos
(clotrimazol, econazol y fluconazol) que presentan resistencias. Corcordando de esta manera
con nuestro estudio en donde el extracto etanólico de propóleo al 20% posee una notable
capacidad de inhibición sobre Cándida albicans.
Eguizábal y col (2007), en su estudio analizaron extractos de propóleos a distintas
concentraciones sobre un grupo de bacterias Gram positivas en el que sugieren que el efecto
antimicrobiano de esta sustancia muestra una mayor tendencia de actividad inversamente
proporcional a su concentración (López, 2015), resultados que sustentan con los obtenidos
en este estudio, en donde el extracto de propóleo al 10% presenta una mejor actividad
inhibitoria que el propóleo al 40%.
Drago y cols (2000), Serra y Ventura (2000), sugieren que especialmente la actividad
biosida del propóleo experimentada en varios casos tanto in vitro como in vivo frente a
diversas bacterias tiene un mayor predomino en bacterias Gram positivas y levaduras, que
en las bacterias Gram negativas (López, 2015), argumento que es sustentado por Tolosa y
Cañizares (2002) y Farre R (2004) en cuyos estudios encontraron que el extracto etanólico
de propóleo poseen un mejor efecto bactericida frente a bacterias gram positivas y hongos
especialmente Cándida albicans, de esta manera se puede afianzar con los estudio expuestos
que el extracto etanólico de propóleo tiene una gran efectividad antifúngica frente a la
Cándida Albicans ya que este microorganismo pertenece al grupo de las bacterias Gram
positivas.
Carrillo M (2011) en su estudio reporta que el predominio de la actividad bactericida del
extracto etanólico de propóleo sobre las Gram positivas se debe a la diferencia en la
68
composición de las paredes celulares de cada grupo ya que la pared de las Gram negativas
es más compleja que la de las Gram positivas.
Arslan, Ozbilge, Kaya, & Er (2011) En su estudio comprobaron que el Propóleo posee
actividad antimicrobiana contra E. Faecalis y C. Albicans. Posteriormente Vagish (2014) en
su investigación concluye que el extracto etanólico del propóleo es efectivo en el control de
biofilms orales y poseen fuertes propiedades antifúngicas en relación con Cándida albicans,
demostrando así su acción antifúngica sobre esta levadura y reafirmando de esta manera los
resultados obtenidos en este estudio.
Tolosa (2002) explica que la actividad bactericida del extracto etanólico de propóleo
obedece al tipo de solvente empleado en la extracción, a sus componentes, al lugar de
procedencia y al tipo de microorganismo sobre el que se aplica el extracto.
Los resultados obtenidos en el primer experimento señalan que los EEP son efectivos
para inhibir Cándida albicans de las superficies de las resinas acrílicas, por no observarse
ningún crecimiento de la levadura en el agar, determinándose que mínimo se requieren 5min
de inmersión; este efecto coincide con otros estudios (García, Ucar, & Lelis, 2014) (Farre R,
2004) en los cuales se obtuvieron similares resultados.
En los resultados al 10%, 20% y 40% se observa comportamientos y resultados similares,
es por eso que, al realizar el análisis de correlación lineal de las medias de cada grupo de
datos, se obtuvo como resultado que cada resultado logrado es independiente, es decir no
existe ninguna incidencia de un resultado a otro y esto nos permite tomar aleatoriamente una
muestra y establecer un análisis cuyos resultados serán validados de la misma forma que
cualquier otro. Resultados que concuerdan con la investigación realizada por (Herrera,
Alvear, Barrientos, Montenegro, & A, 2010).
De acuerdo a los resultados de la investigación y considerando además otros estudios
similares, los EEP son una opción para la desinfección de las prótesis dentales, ya que con
esta investigación se evidenció el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo EEP
al 10%, 20% y 40% sobre bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans, al
observar a las 24 h el comportamiento de las cepas y la pérdida de su capacidad de
crecimiento.
69
CAPÍTULO V
5 Conclusiones y Recomendaciones
5.1 Conclusiones
Se ha determinado que los extractos etanólicos de propóleo (EEP) al 10%, 20% y
40% son efectivos en la inhibición de Cándida albicans, con un mínimo de 5min de
inmersión de los bloques de resina acrílica contaminados con las cepas de la
levadura, donde no se observó crecimiento.
Del análisis realizado, y dado que los resultados obtenidos indican que el efecto
inhibitorio se presentó en cada una de las muestras analizadas, y por la diferencia de
los diámetros alcanzados se afirma que, a mayor concentración de etanol, los EEP
serán mucho más efectivos como desinfectantes de prótesis, como se evidencia en
esta investigación por lo que el extracto etanólico de propóleo al 10% posee un mayor
efecto inhibitorio que el extracto etanólico de propóleo al 40%.
Se determinó que, al comparar el efecto inhibitorio de los tres extractos etanólicos
de propóleo al (10%, 20%, 40%) con el etanol al 96%, sobre cepas de Cándida
albicans existe una diferencia significativa, observando que los halos de inhibición
de mayor tamaño son los de los extractos por lo que se puede concluir que el propóleo
potencializa la acción del etanol.
Se estableció que los EEP en sus diferentes presentaciones (10%, 20% y 40%)
presentaron inhibición de Cándida albicans a las 48 h, ya que dentro del halo de
inhibición no se mostró crecimiento de las cepas y los halos fueron definidos.
70
5.2 Recomendaciones
Después de los resultados obtenidos en la presente investigación sobre el efecto inhibidor
del extracto etanólico de propóleo se recomienda lo siguiente:
Realizar un estudio comparativo de los diferentes propóleos provenientes de las
diferentes regiones del Ecuador para determinar el grado de efectividad de los
diferentes extractos sobre las cepas de cándida albicans ya que está comprobado que
su eficacia puede variar por la flora y la estación climática que rodee a la colmena.
Confirmado la gran propiedad antifúngica del extracto etanólico del propóleo sobre
microorganismos Gram positivas se recomienda su empleo en la desinfección de
prótesis dentales como un medio alternativo ya que posee componentes que
benefician la salud oral.
Realizar estudios que demuestren que no produce daños a las diferentes estructuras
de las prótesis (estructura metálica y pigmentación de las bases).
Plantear nuevas investigaciones en las que se utilice saliva artificial o saliva natural
para poder crear un ambiente similar al de la cavidad bucal, ya que desempeña un
papel importante sobre la amplia flora bacteriana oral.
71
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76
ANEXOS
Anexo No. 1 Certificado de consolidación de tutorías
77
Anexo No. 2 Certificado de propiedad intelectual por parte del estadístico
78
Anexo No. 3 Solicitud de conformación de tribunal para la defensa de tesis.
79
Anexo No. 4 Solicitud dirigida a la Facultad de Ingeniería Química para realizar la
extracción del propóleo.
80
Anexo No. 5 Certificado de autorización otorgado por la Facultad de Ingeniería Química.
81
Anexo No. 6 Certificado de aprobación del anteproyecto por el Subcomité De Ética En Seres
Humanos De La Universidad Central Del Ecuador
82
Anexo No. 7 Certificado del Laboratorio de Microbiología de la Universidad San Francisco
de Quito
83
Anexo No. 8 Certificado de traducción