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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA DE PARATUBERCULOSIS
EN BOVINOS ENTRE 12 Y 24 MESES DE EDAD EN ECUADOR”
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de
Médico Veterinario y Zootecnista
AUTOR:
Rogers Lenin Guamán Tixi
TUTORA:
Dra. María Inés Baquero Cárdenas MSc.
Quito, Marzo 2017
ii
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a los pilares fundamentales en mi vida, mis
padres, Mercedes y César, quienes con su amor y sacrificio guiaron mis
pasos para lograr cada objetivo en mi vida, y por los cuales me levanto
cada día para lograr ser una mejor persona.
A mi hermano Mauricio por ser una gran ayuda en momentos duros; a mi
hermana Gabriela, de quien viviré agradecido por haber sido la persona
que me cuidó y aconsejó en todo momento y a la cual tengo como un
gran ejemplo a seguir.
A mis mejores amigos, Paúl y Estefanía, aquellas personas que se
convirtieron en hermanos y con los cuales he compartido las mejores
locuras de mi vida.
Rogers
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios y la Virgencita de la Inmaculada, por todas las
bendiciones recibidas en todo momento.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central
del Ecuador y a la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del
Agro - Agrocalidad, por su ayuda con la realización de este trabajo, por lo
que estaré eternamente agradecido.
A mi familia, que me conoce con mis defectos y virtudes, porque han
demostrado su confianza en mí y en todas las decisiones que he tomado,
y sé que nunca me van a dar la espalda.
A mi tutora, Dra. María Inés Baquero, por ser una excelente docente
durante la carrera, quien aceptó trabajar conmigo desde el inicio confiando
en mí y por brindarme su tiempo para la asesoría durante la realización de
este gran proyecto.
Al personal de los laboratorios de Serología y Virología de Agrocalidad,
quienes me brindaron su ayuda de manera desinteresada con la realización
de mi proyecto de investigación, así mismo por darme la oportunidad de
crecer personal y profesionalmente.
Al personal de Medican Veterinaria, por ser un apoyo en mi crecimiento
profesional, que me han demostrado ser excelentes profesionales y
grandes personas.
A mis amigas y amigos, aquellos que compartieron conmigo toda mi vida
estudiantil, y que pese a la distancia en estos momentos los llevo siempre
en mi corazón.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, ROGERS LENIN GUAMÁN TIXI, en calidad de autor del trabajo de investigación “DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA DE PARATUBERCULOSIS EN BOVINOS ENTRE 12 Y 24 MESES DE EDAD EN ECUADOR”, por la presente autorizo a la Universidad Central del Ecuador, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de
Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice
la digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el
repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley
Orgánica de Educación Superior.
En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de marzo del 2017
Firma
______________________
Rogers Lenin Guamán Tixi
C.I.172687603-8
Email: [email protected]
v
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor:
ROGERS LENIN GUAMÁN TIXI, para optar por el Título o Grado de Médico
Veterinario y Zootecnista, cuyo título es: “DETERMINACIÓN DE LA
PREVALENCIA DE PARATUBERCULOSIS EN BOVINOS ENTRE 12 Y 24
MESES DE EDAD EN ECUADOR”. Considero que dicho trabajo reúne
todos los requisitos y méritos para ser sometido a la presentación pública y
evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de marzo del 2017
Firma
_____________________
Dra. María Inés Baquero Cárdenas MSc.
C.I. 170663393-8
vi
vii
viii
ix
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ........................................................................................... ii
AGRADECIMIENTO .................................................................................. iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL .................................. iv
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR .............................................. v
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL ................................................................ vi
ÍNDICE GENERAL ..................................................................................... ix
LISTA DE TABLAS .................................................................................... xi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................. xii
LISTA DE ANEXOS ................................................................................. xiii
RESUMEN ............................................................................................... xiv
ABSTRACT ............................................................................................... xv
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
OBJETIVOS ............................................................................................... 5
GENERAL .............................................................................................. 5
ESPECÍFICOS ....................................................................................... 5
CAPÍTULO I............................................................................................... 6
REVISIÓN DE LITERATURA..................................................................... 6
Antecedentes de la investigación ........................................................... 6
Generalidades ........................................................................................ 7
Etiología .................................................................................................. 7
Especies afectadas................................................................................. 9
Transmisión ............................................................................................ 9
Patogenia y respuesta inmune del hospedador .................................... 10
Signos clínicos ...................................................................................... 11
Diagnóstico ........................................................................................... 11
Identificación a través de técnicas directas .......................................... 12
Identificación a través de técnica indirectas ......................................... 12
Tratamiento .......................................................................................... 13
Control .................................................................................................. 14
Implicaciones en salud pública ............................................................. 15
CAPÍTULO II ............................................................................................ 16
x
METODOLOGÍA ...................................................................................... 16
Tipo de investigación ............................................................................ 16
Diseño de la investigación .................................................................... 16
Descripción de la zona de estudio ........................................................ 16
Población objeto de estudio .................................................................. 16
Muestra ................................................................................................. 16
Procedimiento de la investigación ........................................................ 18
1.- Selección de muestras .................................................................... 19
2.- Procesamiento de muestras a través de ELISA indirecto ................ 19
Descripción del método ........................................................................ 19
Materiales ............................................................................................. 20
Protocolo de ELISA indirecto ................................................................ 20
Validación ............................................................................................. 22
Interpretación de resultados ................................................................. 22
3.- Análisis de datos ............................................................................. 23
Relación entre variables ....................................................................... 23
Georreferenciación ............................................................................... 23
CAPÍTULO III ........................................................................................... 24
RESULTADOS ......................................................................................... 24
Determinación de la prevalencia .......................................................... 24
Resultados por variables de estudio ..................................................... 25
Región ............................................................................................... 25
Edad .................................................................................................. 27
Sexo .................................................................................................. 27
Georreferenciación ............................................................................... 29
DISCUSIÓN .......................................................................................... 30
CAPÍTULO IV .......................................................................................... 36
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................... 36
CONCLUSIONES ................................................................................. 36
RECOMENDACIONES ......................................................................... 37
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 38
ANEXOS .................................................................................................. 45
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Población y muestra analizadas para la determinación de
prevalencia de Paratuberculosis ...................................................................... 17
Tabla 2. Materiales para el diagnóstico serológico a través de ELISA ..... 20
Tabla 3. Número total de muestras procesadas ........................................... 24
Tabla 4. Distribución de resultados obtenidos por animal y hatos a nivel
nacional ................................................................................................................ 25
Tabla 5. Distribución de resultados obtenidos por región ........................... 26
Tabla 6. Distribución de resultados obtenidos por sexo .............................. 28
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribución espacial de hatos muestreados a nivel nacional ... 18
Figura 2. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis a nivel nacional
............................................................................................................................... 25
Figura 3. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis por región ........ 26
Figura 4. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis por edad .......... 27
Figura 5. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis por sexo ........... 28
Figura 6. Distribución espacial de hatos positivos y sospechosos a nivel
nacional ................................................................................................................ 29
xiii
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Selección aleatoria de sueros sanguíneos ............................... 45
Anexo 2. Preincubación de muestras ...................................................... 45
Anexo 3. Adición del conjugado .............................................................. 45
Anexo 4. Lavado de placa ....................................................................... 46
Anexo 5. Lectura de placa en el lector ELISA ......................................... 46
Anexo 6. Procesamiento de muestras por el estudiante ......................... 46
Anexo 7. Ejemplo de hoja protocolo de ELISA utilizado ......................... 47
Anexo 8. Ejemplo de resultado de obtenido a través del software IDSoft™
................................................................................................................. 48
Anexo 9. Abstract certificado................................................................... 50
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“Determinación de la prevalencia de paratuberculosis en bovinos entre 12 y 24 meses de edad en Ecuador”
Autor: Rogers Lenin Guamán Tixi
Tutora: Dra. María Inés Baquero MSc.
Fecha: Marzo, 2017
RESUMEN
La paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enfermedad crónica que afecta a rumiantes principalmente bovinos, ovinos y caprinos. El agente etiológico es el Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, el cual produce una enteritis granulomatosa ocasionando diarrea profusa y caquexia que termina con la muerte del animal. La enfermedad se encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial, teniendo un alto impacto económico. Sin embargo, debido a que la mayoría de los casos de la enfermedad son subclínicos, ha sido complicado establecer datos sobre prevalencia de la enfermedad para individuos, hatos o país.
Este es un estudio transversal que se realizó para determinar la prevalencia de paratuberculosis subclínica en bovinos entre 12 y 24 meses en Ecuador. En total se analizaron 5047 (n=5047) sueros sanguíneos distribuidos en 716 hatos en las 4 regiones de Ecuador. El análisis serológico fue realizado a través de la prueba ELISA indirecto (ID-Vet); de la misma manera se realizó una relación entre las variables región, edad y sexo con los resultados obtenidos.
Un total de 87 animales resultaron positivos (n=87/5047), determinando una prevalencia nacional de 1,72%. Por regiones, la prevalencia fue de 2,05% para la Costa, 1,64% para la Sierra, 1,00% para el Oriente y 1,32% en la región Insular. La mayor prevalencia se concentró en las regiones de mayor población bovina en el país, y donde las condiciones ambientales de la región permiten la resistencia del agente e infección a los animales. La edad de los animales entre los 12 y 24 meses, no fue un factor determinante en la presencia de la enfermedad. Con respecto al sexo, la mayor parte de animales positivos fueron hembras (n=60/87) en relación a machos (n=27/87); sin embargo, éste no fue un factor predisponente en la epidemiología de la infección. Por esta razón, se deberían realizar más estudios, con respecto a las variables que influyen en la prevalencia de la enfermedad en el país.
Palabras clave Paratuberculosis, subclínica, bovinos, prevalencia, ELISA
xv
CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR FACULTY OF VETERINARY MEDICINE SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE
"Determination of the prevalence of paratuberculosis in cattle
between 12 and 24 months of age in Ecuador" Author: Rogers Lenin Guamán Tixi.
Tutor: Dra. María Inés Baquero MSc.
Date: Mars, 2017
ABSTRACT Paratuberculosis or Johne’s disease, is chronic disease affecting ruminants,
mostly bovines, ovines and goats. The etiologic agent is Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis, which causes glaucomatous enteritis, with profuse
diarrea and cachexia, which ends-up with the death of the animal. The disease is
widely spread worldwide, with a high economic impact. However, due to the fact
most of cases of disease are subclínical, establishing data on disease prevalence
for individual animals, herds or country.
A transversal study was conducted in order to determine prevalence of subclinical
paratuberculosis in bovines aged from 12 and 24 months in Ecuador. 5047
(n=5047) sera samples were obtained from 716 herds in 4 regions of Ecuador. A
serologic analysis was conducted, by using indirect ELISA test (ID-Vet). With
results obtained, a relation was also established between variables región, age
and sex.
A total of 87 animals were found positive (n=87/5047), with a nationwide
prevalence of 1,72%. Prevalence per regions was 2,05% for the Coast, 1,64% for
the Sierra, 1,00% for Oriente and 1,32% for Galápagos. The highest prevalence
was found in regions with the highest bovine population of the country, and where
environmental conditions of the region allow resistance to the agent and infection
to animals. Animals´ age (12 to 24 months) was not a determining factor for the
prevalence of the disease. In respect to sex, most of positive animals were female
(n=60/87), in relation to male animals (n=27/87). However, it was not a
predisposing factor in the infection epidemiology. For this reason, further studies
should be conducted on variables influencing on the prevalence of the disease in
the country.
KEYWORDS: PARATUBERCULOSIS, SUBCLINIC, BOVINES, PREVALENCE,
ELISA
1
INTRODUCCIÓN
En Ecuador, en el año 2015 la población bovina fue de aproximadamente
4,12 millones de cabezas, concentrándose el 47,18% del ganado en la
Sierra, el 43,01% en la Costa y el 9,51 en la Amazonía (ESPAC, 2015).
Según la Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua
(ESPAC), la población bovina en el 2015 ha disminuido en relación al año
2014, al pasar de 4,58 millones de cabezas a 4,12 millones de cabezas
(ESPAC, 2015). Esto puede ser debido a las condiciones climáticas y
problemas relacionados a enfermedades, que incrementaron la mortalidad
en el ganado, causando una disminución de su población. Por ello, es
importante el diagnóstico oportuno de enfermedades, a fin de ayudar a los
productores a mantener sus hatos sanos y evitar pérdidas económicas (El
Universo, 2015). Actualmente, el 20% de las pérdidas de producción están
asociadas a las enfermedades de alto impacto económico que afectan al
ganado bovino (OIE, 2015).
La paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enfermedad infecciosa
que produce una enteritis granulomatosa de tipo crónica (Tobergte & Curtis,
2013). El agente etiológico es el Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (MAP), el cual es un bacilo gram negativo, aerobio y ácido
resistente, que afecta la lámina propia del intestino (Mundaca, 2012). Es un
patógeno obligado, que requiere de los macrófagos para multiplicarse, y es
resistente, puesto que sobrevive en el medio ambiente y en las heces de
los animales hasta por un año (Collins & Manning, 2010). Esta enfermedad
es de distribución mundial, que afecta a rumiantes domésticos de
importancia productiva como bovinos, ovinos y caprinos, considerados
como los reservorios naturales principales de la infección (Tobergte &
Curtis, 2013); sin embargo, la enfermedad también ha sido descrita en otras
especies tales como caballos, cerdos, primates, humanos y, de forma
experimental, en conejos y liebres (Collins & Manning, 2010).
2
La trasmisión se da principalmente por vía fecal-oral, mediante la ingesta
de alimento y agua contaminados con heces de animales infectados. Sin
embargo, también puede haber infección intrauterina, a través del semen
de toros infectados y a través de fomites e insectos que actúan como
vectores mecánicos (Coromoto, de Rolo, Clavijo, & Valle, 2006). La
infección en los bovinos generalmente se da a edad temprana, entre los
primeros 35 días de edad, al amamantarse de ubres contaminadas con
heces que contienen el patógeno (Coromoto et al., 2006). Una vez que el
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ingresa al organismo,
atraviesa las células M en las placas de Peyer de la mucosa intestinal
(Collins & Manning, 2010), donde es fagocitado por macrófagos localizados
en el epitelio del íleon, logrando sobrevivir en el interior de éstos (Sevilla,
2007). La infección se disemina mediante la migración de los macrófagos
infectados hacia los nódulos linfáticos regionales, iniciando de esta manera
la respuesta inmune adquirida frente al patógeno, en la cual pueden
intervenir factores genéticos o inmunológicos del hospedador (Sevilla,
2007). Generalmente, la inmunidad humoral en el animal se desarrolla
entre 10 a 17 meses post-infección (Cfsph, 2010).
El periodo de incubación de la enfermedad es variable pudiendo ir de 4
meses hasta 15 años (Cfsph, 2010); sin embargo, los signos clínicos se
manifiestan en la etapa productiva del animal (Coromoto et al., 2006). Es
importante recalcar que en animales provenientes de ambientes muy
contaminados o de madres infectadas, los signos clínicos se presentarían
entre los 12 y 18 meses de edad (Coromoto et al., 2006). La enfermedad
presenta una etapa subclínica y otra clínica progresiva. La infección clínica
se desarrolla provocando debilidad y diarrea intermitente, que
posteriormente se convierte en profusa y persistente, causando la muerte
de los animales por deshidratación y caquexia severa (Mundaca, 2012). En
las heces de los animales se excreta una gran cantidad de bacterias al
medio ambiente diseminando la infección dentro del rebaño (Mundaca,
2012). En especies no rumiantes tales como caballos, cerdos, o conejos,
no se produce la eliminación de Mycobacterium avium subsp.
3
paratuberculosis en heces o en leche, representando un riesgo mínimo de
transmisión hacia otros animales (Collins & Manning, 2010).
No existe un tratamiento específico contra esta enfermedad, por ello es
indispensable realizar un monitoreo constante de los animales a fin de
ayudar al manejo y control de la enfermedad (Sevilla, 2007). La vacunación
es limitada debido a su escaza efectividad e interferencia en programas de
detección y erradicación de tuberculosis bovina (Tobergte & Curtis, 2013).
El diagnóstico de la enfermedad se realiza mediante la detección del agente
en caso de infección clínica, o mediante la medición de la respuesta inmune
en casos de infección subclínica (Gurung, Begg, Purdie, Eamens, &
Whittington, 2015). En caso de infección clínica la microscopía, cultivo
microbiológico y PCR son las más utilizadas; mientras que en infecciones
subclínicas se realiza la detección serológica de anticuerpos en sangre o
leche. A nivel de campo se pueden realizar pruebas de DHT
(Hipersensibilidad Retardada), sin embargo, otras infecciones causadas
por micobaterias podrían sensibilizar al bovino provocando reacciones
falsas positivas (Tobergte & Curtis, 2013).
La técnica de ELISA permite analizar varios animales a bajo costo (Gurung
et al., 2015); esta prueba es la más sensible (41.5%) y específica (99.42%),
en comparación a otras técnicas serológicas para la detección de
anticuerpos séricos, permitiendo una rápida identificación de la enfermedad
(Fry, Kruze, & Collins, 2008). De esta manera, la OIE ha determinado al
método de ELISA como una prueba alternativa para el diagnóstico de
paratuberculosis y como una técnica recomendada para la determinación
de la prevalencia de la enfermedad (Tobergte & Curtis, 2013).
Actualmente, la enfermedad se encuentra a nivel mundial; pero se ha
demostrado su ausencia en Suecia y algunos estados de Australia (Cfsph,
2010). Según datos del Sistema de Vigilancia de Sanidad Animal de
Estados Unidos, se estima la presencia de la enfermedad en el 70% del
ganado lechero y el 10% del ganado de carne del país (Sweeney, Collins,
Koets, Mcguirk, & Roussel, 2012). En Ecuador, la Paratuberculosis se
4
encuentra presente (WAHIS, 2016); sin embargo, no se conocen datos
acerca del número de animales infectados, dado el carácter subclínico de
la enfermedad, la falta de disponibilidad de pruebas diagnósticas, la
ausencia de programas de control de la enfermedad y la escasa
presentación de informes por parte de ganaderos y veterinarios (Mundaca,
2012). A nivel nacional, estudios realizados en el año de 1997 en Azuay,
en 2012 en Pichincha y en 2017 en la región sur del país, se determinó que
existiría una prevalencia de la enfermedad de 5,24, 7,29 y 6%
respectivamente (Oña & Cajilema, 2012).
La importancia de la enfermedad en bovinos jóvenes, es porque estos son
más susceptibles a la infección dado por la extensa superficie de las placas
de Peyer intestinales, las que constituyen el sitio primario de infección del
patógeno, presentándose enfermedad subclínica; así mismo, estos
animales excretan el agente en bajas cantidades, presentando una baja
respuesta celular con una alta respuesta humoral (Sevilla, 2007). En este
sentido, el objetivo principal de este estudio será el de determinar la
prevalencia de la enfermedad subclínica en bovinos entre 12 y 24 meses
de edad, a nivel nacional.
La presencia de anticuerpos séricos contra la infección será determinada
mediante la técnica de ELISA Indirecto (ID Screen® Paratuberculosis
Indirect), señalando que las muestras de suero a analizar forman parte del
Muestreo Nacional de Fiebre Aftosa realizado en el 2014 por la Agencia
Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro. Los datos obtenidos
en esta investigación permitirán determinar el estatus actual de la
enfermedad en el país, tomando en cuenta que existen pocos estudios e
información a nivel de país referente a detección y prevalencia de
paratuberculosis bovina.
5
OBJETIVOS
GENERAL
Determinar la prevalencia de paratuberculosis subclínica en bovinos entre
12 a 24 meses de edad en Ecuador.
ESPECÍFICOS
Detectar la presencia de anticuerpos contra Mycobacterium avium
subspp. paratuberculosis en muestras de suero sanguíneo de
bovinos entre 12 y 24 meses, mediante ELISA indirecto.
Realizar una relación entre las variables: región, edad y sexo con los
resultados obtenidos.
Elaborar un mapa de georreferenciación de los hatos positivos de
paratuberculosis bovina a nivel nacional.
6
CAPÍTULO I
REVISIÓN DE LITERATURA
Antecedentes de la investigación
Los estudios de prevalencia de paratuberculosis bovina, realizados a nivel
mundial, han determinado diferentes resultados dependiendo de la región
geográfica, técnica de diagnóstico utilizada y número de animales en
estudio (Muñoz, 2014). La prevalencia en Europa, se encuentra entre el 7
y 55% (Sánchez et al., 2009). En este sentido, estudios realizados en
España, estimaron en el 2010, una prevalencia nacional del 8% (Delgado,
2010), mientras que en País Vasco, Asturias y Galicia, determinaron una
prevalencia mediante ELISA, del 8,3%, 10% y 2,78% respectivamente
(Muñoz, 2014). Estudios serológicos en Australia identificaron una
prevalencia en hatos lecheros entre un 9 y 22% (Paolicchi, 2009). En
Turquía el diagnostico serológico de 147 bovinos de 2 años determinó una
prevalencia de 12,24% (GÜMÜŞSOY, İÇA, ABAY, AYDIN, & HIZLISOY,
2015). En Asia, un estudio en China analizó 1400 animales mediante
ELISA, determinando una prevalencia de 17,64% (Meng et al., 2015).
En Estados Unidos en el año 2009, se determinó una prevalencia del 40%
de los rebaños (Sánchez et al., 2009). En América del Sur, en Chile, el
diagnóstico mediante la prueba ELISA en 136 bovinos, determinó una
positividad del 83,8% (Thiermann, 2007), mientras que el análisis de 596
bovinos en la VIII región de Chile, determinó una positividad del 6,4%
(Mundaca, 2012). En Venezuela se determinó una positividad de 1,45%, al
analizar 217 animales mediante ELISA (Sánchez et al., 2009). En Lima
mediante la técnica de ELISA, se analizaron 60 bovinos, lo que determinó
7
una positividad del 36,7% (Bustamante, Aguilar, & Ortiz, 2011). En
Colombia existió una positividad del 8% al analizar 958 animales a través
de diagnóstico serológico (Benavides, Arteaga, & Montezuma, 2016).
En Ecuador, un análisis de 496 animales de 30 fincas realizado en 2
parroquias de la Provincia de Azuay, determinó una positividad del 5,24%
(Sánchez, 1991). El análisis serológico de 384 vacas en lactancia realizado
en parroquias del cantón Mejía, determinó una prevalencia en esta zona de
7,29% (Cajilema, Oña, Paredes, & Mosquera, 2015). Así mismo, el análisis
de hatos lecheros en la zona sur de Ecuador, determinó una prevalencia
de 6% (Cárdenas & Peñaloza, 2017). Sin embargo no existen estudios
sobre prevalencia de la enfermedad en hatos bovinos a nivel nacional.
Generalidades
La paratuberculosis, conocida también como enfermedad de Johne, es una
enfermedad crónica, contagiosa, progresiva y debilitante que produce una
enteritis y linfadenitis granulomatosa (Muñoz, 2014). En el ganado bovino
fue reportada por primera vez en 1895 en Europa, mientras que en Estados
Unidos en 1905 (Sweeney et al., 2012). Es considerada como una de las
enfermedades bacterianas crónicas más graves y extendidas de los
rumiantes a nivel mundial (Hasonova & Pavlik, 2006). Tiene un elevado
impacto económico dentro del sector ganadero, debido a la excesiva
pérdida de peso de los animales y la disminución de la producción láctea
(Leão, Amaro, Santos-Sanches, Inácio, & Botelho, 2015). Las pérdidas
representan un costo incuantificable para los ganaderos, dado el carácter
subclínico en que se encuentra la enfermedad en la mayoría de los
animales (Delgado, 2010).
Etiología
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), antiguamente
denominado como Mycobacterium Jonhei, se encuentra dentro de la familia
Mycobacteriaceae, género Mycobacterium, orden Actinomycetales, phylum
Actinobacteria, el cual es el agente etiológico de la paratuberculosis (Quinn
8
et al., 2011). El agente forma parte del Complejo Mycobacterium avium
intracellulari (MAC), un grupo de micobacterias que presentan crecimiento
lento de sus colonias, siendo mayor a 7 días, y por ser consideradas
clínicamente patógenas para los animales y el hombre (Nákid, 2014). Este
agente se diferencia de otros miembros del complejo Mycobacterium avium
por la presencia de genes únicos tales como IS900 y hspX (Lavers, 2013).
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis es un bacilo gram positivo
recto de 1-2 μm de longitud por 5 μm de ancho, aerobio, inmóvil, (Mon,
2015). Son bacterias ácido resistentes por la gran cantidad de ácidos
micólicos en su pared, lo que permite su tinción con fucsina y la resistencia
a la decoloración con alcohol ácido (Fernández, 2016). Su pared celular
contiene alto contenido lipídico y un 60-70% de citosina y guanina en su
ADN (Delgado, 2010). Se caracteriza por tener un crecimiento lento en
medios de cultivo, de entre 12 semanas hasta 6 meses y la formación de
colonias rugosas no pigmentadas (Castellanos, 2010). El agente no
produce micobactina, por lo que se considera exigente en cultivo al tener
dependencia de ésta para su crecimiento en medios a base de huevo
(Lavers, 2013).
Existen 2 tipo de cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,
que se distinguen por los hospedadores a los que infectan. El tipo I o cepa
S (sheep) afecta a ovejas, y el tipo II o cepa C (cattle) afecta a bovinos,
afectando esta última, a una gran variedad de especies rumiantes y no
rumiantes (Delgado, 2010). Esta clasificación se da en base a la
identificación del gen IS900 y la enzima de restricción IS1311 (Fernández,
2016). Puede existir transmisión cruzada de cepas S y C entre especies
rumiantes, sin embargo es muy poco común (CFSPH, 2010).
Los factores de virulencia que permiten identificar la respuesta inmune
humoral y celular del animal no están muy definidos, puesto que la bacteria
comparte la mayoría de sus antígenos con otras micobacterias; sin
embargo, el lipoarabinomanano (LAM), la Johnina, el antígeno
protoplasmático purificado (PPA-3) y proteínas de choque térmico son
9
consideradas como factores de virulencia (Delgado, 2010).
El Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, es un patógeno
intracelular obligado, el cual no se puede replicar fuera del hospedador; sin
embargo sobrevive en el medio ambiente y en las heces hasta un año si se
encuentra protegido de los rayos ultravioleta; es resistente al calor,
congelación, desecación y compuestos químicos ácidos o alcalinos
(Lavers, 2013).
Especies afectadas
La enfermedad afecta comúnmente a bovinos y ovinos, sin embargo sus
efectos también se han observado en diferentes rumiantes domésticos y
salvajes (Gurung et al., 2015). Dentro de los rumiantes domésticos
susceptibles se encuentran caprinos, camellos, alpacas, y animales
salvajes como gatos, zorros, aves, osos, mapaches, armadillos y
zarigüeyas (Leão et al., 2015). Se pueden infectar de forma experimental
conejos, caballos y perros (CFSPH, 2010).
Transmisión
La principal vía de transmisión de la bacteria es por vía fecal-oral a través
de la ingesta de alimento y agua que se encuentren contaminados con
heces de animales infectados (Fernández, Jolly, Colavecchia, Fernández,
& Mundo, 2011). El aislamiento de la bacteria de tejidos fetales y maternos
ha determinado el riesgo de infección vertical a través del semen de toros
infectados (Nákid, 2014), por vectores mecánicos como fomites e insectos
(CFSPH, 2010). La depredación es considerada como otra vía de contagio,
debido al aislamiento del patógeno tanto en depredadores como en presas
(Castellanos, 2010) y la transmisión a través del medio ambiente debido a
la resistencia del patógeno (Nielsen, Weber, Kudahl, Marce, & Toft, 2011).
La infección se da durante los primeros 6 y 12 meses de vida del ternero,
considerados los recién nacidos como los más susceptibles al ingerir leche
o calostro a través de ubres sucias de sus madres (Leão et al., 2015),
10
teniendo un alto riesgo de infección dentro de explotaciones intensivas, al
haber contacto entre los recién nacidos y animales enfermos (Sevilla,
2007). Sin embargo, los animales adultos también son susceptibles de
infección cuando son expuestos a la bacteria (Lavers, 2013).
Patogenia y respuesta inmune del hospedador
En el desarrollo de la enfermedad influyen factores genéticos y factores
inmunológicos del hospedador (Sevilla, 2007). Después de la ingestión de
la bacteria al organismo, es absorbida por las células M localizadas sobre
las placas de Peyer intestinales; éstas son fagocitados por los macrófagos
donde sobreviven a la degradación y se replican dentro de ellos, ocurriendo
la propagación de la enfermedad mediante la migración de los macrófagos
hacia los nódulos linfáticos regionales (Quinn et al., 2011). El agente inhibe
la apoptosis de los macrófagos retrasando al sistema inmune para el
reconocimiento de la bacteria (Lavers, 2013). Se inicia el desarrollo de
granulomas en nódulos linfáticos e intestino, con atrofia de las vellosidades
y engrosamiento de la pared intestinal, presentando 2 tipos de lesiones:
multibacilar y paucibacilar. Los dos casos provocan pérdidas de proteínas
plasmáticas y alteraciones en la absorción de nutrientes (Quinn et al.,
2011).
Al inicio de la infección se da una respuesta inmune mediada por células,
ayudado por el INF-gama producido por linfocitos Th (Lavers, 2013). Una
respuesta Th1 se da en infecciones subclínicas, mientras que en
infecciones clínicas existe una respuesta Th2 (Mon, 2015). Esta respuesta
es importante para el control inicial de la enfermedad, sin embargo no es
suficiente para la eliminación de la bacteria del organismo (Nielsen et al.,
2011). Cuando la inmunidad celular disminuye, se inicia la inmunidad
humoral con producción de anticuerpos e interleucinas 4 y 10; en bovinos
el anticuerpo producido en la infección es la inmunoglobulina G (IgG) (Koets
& Gröhn, 2015). La inmunidad humoral se desarrolla entre 10 a 17 meses
post-infección (CFSPH, 2010).
11
Signos clínicos
El periodo de la enfermedad es variable, puede ir desde los 4 meses hasta
15 años (Tobergte & Curtis, 2013), significando un desafío clínico la
detección de animales infectados (Nielsen et al., 2011).
La enfermedad se ha dividido en 4 etapas (Gilardoni, Paolicchi, & Mundo,
2012), la primera o etapa silenciosa con ausencia de signos clínicos; la
segunda etapa o subclínica sin signos visibles de la enfermedad, pero se
puede identificar la bacteria en heces o presencia de anticuerpos
circulantes; la tercera etapa con signos clínicos visibles tales como diarrea
intermitente, baja de producción lechera y pérdida de peso, pudiendo
detectar animales infectados mediantes cultivo de heces o serología; y la
cuarta etapa caracterizada por ser la etapa clínica avanzada, donde se
presenta diarrea profusa, deshidratación y debilitamiento extremo, donde
finalmente los animales mueren por caquexia severa (Mon, 2015).
Los signos clínicos suelen presentarse en bovinos entre los 2 a 6 años de
edad, pudiendo durar de 3 a 6 meses (Ramírez, Rodríguez, & Fernández,
2011); en rumiantes menores la diarrea es poco marcada, incluso ausente,
mientras que en especies no rumiantes tales como conejos, equinos o
primates se ha observado lesiones intestinales leves (CFSPH, 2010). El
cuadro clínico de la enfermedad en bovinos incluye diarrea intermitente que
se vuelve constante, seguido de caquexia grave, edema ventral y
submandibular a causa de la hipoproteinemia y finalmente la muerte
(Martínez et al., 2012),
Diagnóstico
El diagnóstico de la enfermedad suele ser complicada dado el largo periodo
de incubación y la progresión lenta de la enfermedad (Ramírez et al., 2011).
Para la detección se pueden utilizar métodos directos, los cuales están
basados en la detección de la bacteria, sea este cultivo fecal o detección
de genes mediante PCR (Lavers, 2013). Los métodos indirectos son
utilizados para la detección de la respuesta inmune del hospedador (IgG o
12
INF-γ) (Lavers, 2013), variando la sensibilidad y especificidad de las
pruebas según el estado de la enfermedad en que se encuentren los
animales (Mon, 2015).
Identificación a través de técnicas directas
El diagnóstico post-mortem se utiliza para la identificación de las lesiones
características de la enfermedad (Mon, 2015). A la necropsia se observa
inflamación de la mucosa del íleon, con aumento y engrosamiento de
nódulos y vasos linfáticos mesentéricos (Mon, 2015).
Dentro de las técnicas ante-mortem, está la observación microscópica de
las micobacterias a partir de heces fecales o tejidos, mediante la coloración
Ziehl-Neelsen; esta es una técnica rápida, pero con baja especificidad,
debido a que no puede determinar la especie de micobacteria (Tobergte &
Curtis, 2013).
El cultivo bacteriológico es considerado como una técnica directa gold
standard (100% especificidad), utilizada para el diagnóstico de la infección
en estados avanzados de la enfermedad (Tobergte & Curtis, 2013); sin
embargo el procedimiento es lento, costoso y se pueden presentar falsos
positivos por la contaminación de las muestras enviadas, disminuyendo la
especificidad de la prueba (Mon, 2015).
Se han desarrollado métodos moleculares para la detección y tipificación
del agente a través de la identificación de la secuencia IS900 presente en
el genoma del ADN (GÜMÜŞSOY et al., 2015). Esta técnica permite
rapidez en la identificación del agente pero con una sensibilidad y
especificidad moderada (GÜMÜŞSOY et al., 2015).
Identificación a través de técnica indirectas
Estas técnicas van a detectar la respuesta inmune de la infección, sea ésta
la respuesta celular in vivo o la respuesta humoral in vitro (Lavers, 2013).
13
La evaluación de la respuesta inmunológica in vivo se realiza mediante la
prueba de intradermoreacción, la cual se basa en una respuesta local de
hipersensibilidad retardada, a las 48 horas de inocular el derivado proteico
purificado (PPD) aviar o johnina intradérmicamente en las tablas del cuello
del bovino (Mon, 2015). Esta técnica posee una baja sensibilidad y baja
especificidad debido a que produce reacciones cruzadas con otras
micobacterias, dando resultados falsos positivos (Mon, 2015).
Dentro de las técnicas para detección humoral in vitro, se encuentran la
fijación de complemento (CF), Ensayo por Inmunoadsorción ligado a
enzimas (ELISA) e inmunodifusión en gel agar (AGID) (Tobergte & Curtis,
2013).
La técnica de ELISA es la más utilizada para establecer la prevalencia de
la enfermedad dentro de los hatos, siendo ésta la más sensible y específica
para detectar anticuerpos contra Map, en relación a otras técnicas
serológicas (Tobergte & Curtis, 2013). La sensibilidad del ELISA en bovinos
puede variar entre 34 y 41% y la especificidad entre 94,8 y 99,5% (Gurung
et al., 2015). Esta es una técnica rápida y de bajo costo que consiste en la
medición de IgG ya sea en suero o leche, midiendo un nivel de densidad
óptica relacionado con la presencia de anticuerpos (Lavers, 2013).
Tratamiento
El tratamiento antibiótico en animales infectados no es recomendable,
debido a que no existen medicamentos específicos y eficaces, los costos
de los medicamentos son elevados, el periodo de administración es largo y
existe posibilidad de recurrencia de la enfermedad una vez finalizado el
tratamiento (Muñoz, 2014).
Antibióticos como la estreptomicina, viomicina, diamino difenil sulfona o
hidracida, administrados al ganado mejora su condición clínica, pero los
animales continúan con eliminación de micobacterias a través de las heces
(Muñoz, 2014). En bovinos que poseen un alto valor genético se puede
justificar y es recomendable la terapia antibiótica, la cual es efectiva al
14
desaparecer de manera temporal el cuadro clínico, pero la excreción de
bacterias continúa incluso luego del tratamiento, siendo estos animales
diseminadores de la enfermedad dentro del hato (Muñoz, 2014).
Control
La paratuberculosis es una enfermedad que debe ser notificada a la
Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (Tobergte & Curtis, 2013).
Por ello se debe instaurar medidas de control indispensables para reducir
la tasa de infección de los animales que, a su vez, se debe complementar
con pruebas de diagnóstico para lograr éxito en el control (Muñoz, 2014).
Se debe realizar el aislamiento de los animales sospechosos y la
eliminación rápida de animales positivos, considerados como reservorios
dentro del rebaño al contaminar instalaciones y pastos con heces (Quinn et
al., 2011). Además, se debe controlar animales silvestres como roedores,
debido a la influencia de éstos en la persistencia de la enfermedad en el
ambiente y el riesgo de infección y diseminación de la enfermedad a los
bovinos (Delgado, 2010). Se debe realizar el control del ingreso de nuevos
animales al rebaño, los cuales deben provenir de haciendas libres de la
enfermedad (Muñoz, 2014).
Es importante instaurar medidas sanitarias y de cría dentro de la granja, a
fin de disminuir el riesgo de contagio en terneros; se debe prestar atención
a la limpieza de heces, separación de terneros de sus madres y animales
adultos, y la alimentación con leche pasteurizada o sustitutos lácteos
(Quinn et al., 2011).
La inmunización de los animales con vacunas vivas o atenuadas es
utilizada para el control de la enfermedad, siendo su principal ventaja la
prevención de casos clínicos (Tobergte & Curtis, 2013). Sin embargo, es
importante tomar en cuenta que ésta no previene la infección de los
animales, si no que disminuye la excreción de bacterias a través de las
heces, disminuye las lesiones intestinales en animales infectados y reduce
15
la mortalidad, lo cual tiene un impacto económico positivo al disminuir las
pérdidas que causa la enfermedad (Muñoz, 2014).
Sin embargo, la vacunación presenta ciertas desventajas como la
interferencia en programas de erradicación de tuberculosis bovina, la
detección de falsos positivos a través de la técnica de ELISA, y reacción
positiva de tuberculina aviar en bovinos adultos (Muñoz, 2014), interfiriendo
en la diferenciación de animales vacunados con los infectados con cepas
de campo (Quinn et al., 2011).
Implicaciones en salud pública
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, ha sido asociado con la
enfermedad de Crohn en los seres humanos (Leão et al., 2015). Existen
similitudes entre la enfermedad de Johne en animales y la enfermedad de
Crohn en humanos, puesto que en ambas se produce una inflamación
intestinal crónica granulomatosa difusa principalmente a nivel del íleon
(Sweeney et al., 2012).
La transmisión se puede dar principalmente a través del consumo de leche
o productos lácteos contaminados, dado que la pasteurización de la leche
no es suficiente para eliminar a la bacteria, y ésta ha sido aislada a partir
de leche pasteurizada y quesos (GÜMÜŞSOY et al., 2015). Los síntomas
que presentan los pacientes enfermos son similares a los causados en
animales, entre ellos están diarrea, linfadenitis, inmunosupresión, pérdida
de peso, obstrucción con sangrado intestinal y úlceras (Paolicchi, 2009).
Sin embargo la enfermedad de Crohn es una enfermedad multifactorial con
susceptibilidad genética, que muchos autores indican que los antígenos del
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, no serían capaces de
causar la enfermedad en humanos (Sweeney et al., 2012)
16
CAPÍTULO II
METODOLOGÍA
Tipo de investigación Es un estudio observacional de tipo descriptivo.
Diseño de la investigación
Es un estudio transversal en el que se obtuvieron datos para determinar la
presencia y calcular prevalencia de paratuberculosis, utilizando la técnica
de ELISA.
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de laboratorio para el diagnóstico serológico se realizó en el
laboratorio de Serología de los laboratorios de Diagnóstico Animal de
Agrocalidad, localizado en el Valle de Tumbaco, ubicado a 2355 msnm y
con T° promedio entre 12 a 26°C (GAD Tumbaco, 2016).
Población objeto de estudio
Los animales analizados son aquellos que provienen del Muestreo Nacional
de Fiebre Aftosa del año 2014; éstos son machos y hembras, que se
encuentran entre 12 y 24 meses de edad, distribuidos en las 4 regiones del
Ecuador. Un total de 796 hatos fueron muestreados, del que se obtuvieron
un total de 6532 animales, los que se detallan en la Tabla 1.
Muestra
En base a la población total, la muestra a ser analizada fue calculada a
través del software ProMESA (Programme for Statistical Sampling in
17
Animal Population) mediante la fórmula para estimar proporciones de una
población finita, tomando en cuenta el 95% de nivel de confianza, 5% de
error y 50% de prevalencia. De esta manera, se determinó un total de 716
hatos y 5047 animales a nivel nacional, donde la selección de los sueros
sanguíneos por provincia será completamente al azar. El número de
muestras totales se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1. Población y muestra analizadas para la determinación de prevalencia de
Paratuberculosis
Región Provincia N (a) N (# hatos) n (a) n(# hatos)
COSTA
Esmeraldas 653 58 459 49
Manabí 1278 115 698 78
Santo Domingo de los Tsáchilas
506 51 381 46
Los Ríos 78 7 75 7
Guayas 397 33 316 31
Santa Elena 45 3 44 3
El Oro 574 57 418 48
TOTAL REGIÓN COSTA
3531 324 2391 262
SIERRA
Carchi 69 10 67 10
Imbabura 87 9 83 9
Pichincha 347 34 284 32
Cotopaxi 117 15 109 15
Tungurahua 164 42 149 38
Bolívar 100 17 94 16
Chimborazo 289 79 244 77
Cañar 229 23 200 23
Azuay 241 31 209 29
Loja 318 43 264 42
TOTAL REGIÓN SIERRA
1961 303 1703 291
ORIENTE
Sucumbíos 130 23 120 23
Napo 248 21 214 20
Orellana 155 26 141 25
Pastaza 93 10 88 10
Morona Santiago 102 22 96 21
Zamora Chinchipe 156 28 142 25
TOTAL REGIÓN ORIENTE
884 130 801 124
INSULAR
Santa Cruz 76 13 73 13
San Cristóbal 36 12 36 12
Isabela 44 14 43 14
TOTAL REGIÓN INSULAR
156 39 152 39
TOTAL A NIVEL NACIONAL 6532 796 5047 716
N(a): número de animales muestreados; n(a): número de animales seleccionados
Fuente: AGROCALIDAD (2014)
Elaboración: El autor
18
Figura 1. Distribución espacial de hatos muestreados a nivel nacional
Fuente: AGROCALIDAD
Elaboración: PANAFTOSA – WGS84
19
Procedimiento de la investigación
El trabajo de investigación se llevó a cabo en 3 etapas: selección de
muestras, procesamiento de muestras en el laboratorio y análisis de datos.
1.- Selección de muestras
Los sueros sanguíneos utilizados para el estudio se encontraban
almacenados a -20°C dentro del banco de sueros del Laboratorio de
Diagnóstico Animal; los sueros a esta temperatura se conservan hasta por
5 a 10 años (OIE, 2016). La selección de sueros se realizó de manera
aleatoria con ayuda de la base de datos proporcionado por Agrocalidad y
se clasificó de acuerdo a sexo, edad, provincia y región.
2.- Procesamiento de muestras a través de ELISA indirecto
Esta etapa consistió en el procesamiento de muestras de suero sanguíneo
con una duración de 2 meses, el cual contó con supervisión del personal
que labora en Serología de los laboratorios de Sanidad Animal en
Agrocalidad.
Descripción del método
La prueba utilizada para esta investigación consistió en un ensayo
inmunoenzimático indirecto, para determinar la presencia de anticuerpos
(Ac) en muestras de suero sanguíneo de bovinos. Las muestras debieron
ser pre-diluidas e incubadas con Mycobacterium phlei a fin de neutralizar
posibles reacciones cruzadas, e incrementar su sensibilidad y
especificidad. Posteriormente las muestras fueron transferidas a las placas
sensibilizadas con el extracto purificado de Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (Ag) (Gilardoni et al., 2012). En presencia de anticuerpos
se forma un complejo Ag-Ac (Sánchez et al., 2009).
Las placas se lavaron, para posteriormente agregar el conjugado anti-
rumiante peroxidasa (HRP), el cual se une al complejo Ag-Ac. Después de
la eliminación del conjugado en exceso mediante un segundo lavado, se
20
adicionó la enzima Substrato (TMB), ésta se oxida generando una
coloración azul, la cual está relacionada con la cantidad de anticuerpos
presentes en la muestra que se convierte en amarillo luego de añadir la
Solución de Parada. En ausencia de anticuerpos no aparece ninguna
coloración. Finalmente la placa se lee a una longitud de onda de 450 nm.
(Gilardoni et al., 2012)
Materiales
Tabla 2. Materiales para el diagnóstico serológico a través de ELISA
Materiales Equipos Reactivos
Canaletas Lavador de placas Agua destilada
Pipeta monocanal de 5-
10 µl
Lector de ELISA Microplacas
sensibilizadas con un
extracto purificados de
Map
Pipeta multicanal 10-200
µl
Computador Conjugado HRP
concentrado (10X)
Probetas de 1000 ml Impresora Control positivo
Puntas de pipetas Vórtex Control negativo
Libreta de apuntes Agitador de placas Diluyente 6
Esferográficos Diluyente 3
Hojas de protocolo Solución de lavado
concentrado (20X)
Resma de papel Solución de revelación
Solución de parada
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
Protocolo de ELISA indirecto
Las muestras de suero fueron analizadas mediante el Kit ID Screen®
Paratuberculosis Indirect de IDvet; ésta es una prueba screening para la
detección de anticuerpos contra Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis, el cual es utilizado en programas de erradicación de la
21
enfermedad. Este método es descrito en las recomendaciones de la OIE
(Manual of Recommended Diagnostic Techniques and Requirements
volumen III – Partuberculosis 5B/009) (Tobergte & Curtis, 2013).
1. Mantener los sueros y reactivos a T° ambiente antes de utilizarlos.
2. Realizar la hoja de protocolo con el número de identificación de cada
suero.
3. Diluir las muestras con el diluyente 6 en una microplaca de pre-
dilución de 96 pocillos.
- 110 µl del Diluyente 6 en todos los pocillos
- 10 µl del Control Negativo en los pocillos A1 y B1
- 10 µl del Control Positivo en los pocillos C1 y D1
- 10 µl de cada muestra a analizar en los pocillos restantes
4. Transferir 100 µl de los controles y las muestras neutralizadas a las
microplacas ELISA sensibilizadas.
5. Incubar 45 minutos a 21°C.
6. Vaciar los pocillos y lavarlos 3 veces con 300 µl de solución de
lavado evitando que los pocillos se sequen entre los lavados.
7. Preparar el conjugado 1X diluyendo el conjugado 10X al 1:10.
8. Distribuir 100 µl de Conjugado 1X a todos los pocillos.
9. Incubar 30 minutos a 21°C.
10. Vaciar los pocillos y lavarlos 3 veces con 300 µl de solución de
lavado.
11. Distribuir 100 µl de Solución de Revelación (TMB) a todos los
pocillos.
12. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
13. Distribuir 100 µl de Solución de Parada a todos los pocillos para
detener la reacción.
14. Leer la densidad óptica de la placa a 450 nm.
15. Guardar las lecturas realizadas con sus respectivas hojas de
protocolo.
22
Validación
De acuerdo al inserto de ID-Vet, el ensayo se considera válido cuando:
La densidad óptica media del control positivo (DOCP) es superior (>)
a 0.350
La proporción entre las densidades ópticas medias de los controles
positivos y negativos (DOCP y DOCN) es superior (>) a 3.
En caso de ensayos no válidos, puede deberse a la técnica y el ensayo
debe repetirse siguiendo una revisión meticulosa del protocolo
Interpretación de resultados
Se realizó mediante el software IDSoft™, el cual es un programa integrado,
que proporciona un análisis rápido de datos; calcula los valores medios y
porcentajes, y es provisto por la empresa IDvet.
Para determinar la presencia de anticuerpos contra Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis presentes en cada muestra, se calculó el
porcentaje de positividad de la muestra (S/P%), mediante la siguiente
fórmula:
𝑺
𝑷% =
𝐃𝐎 𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚 − 𝐃𝐎 (𝐂𝐍)
𝐃𝐎 (𝐂𝐏) − 𝐃𝐎 (𝐂𝐍)× 𝟏𝟎𝟎
DO = densidad óptica
CP = Control Positivo
CN = Control Negativo
De esta manera, de acuerdo al % S/P se obtienen los siguientes resultados:
Resultado Categoría
S/P ≤ 60% Negativo
60% > S/P % < 70% Sospechoso
S/P% ≥ 70% Positivo
Fuente: IDvet Innovate Diagnostics - Francia
23
3.- Análisis de datos
Los resultados obtenidos de cada placa de ELISA, a través del software
IDSoft™, fueron exportadas a Hojas de Excel® 2013 para la elaboración y
análisis de resultados de la investigación mediante tablas de frecuencia e
histogramas.
El cálculo de prevalencia fue calculado a través de fórmula:
𝑷𝑨 =𝐍ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐚𝐧𝐢𝐦𝐚𝐥𝐞𝐬 𝐩𝐨𝐬𝐢𝐭𝐢𝐯𝐨𝐬 𝐚 𝐏𝐚𝐫𝐚𝐭𝐮𝐛𝐞𝐫𝐜𝐮𝐥𝐨𝐬𝐢𝐬
𝐓𝐨𝐭𝐚𝐥 𝐝𝐞 𝐚𝐧𝐢𝐦𝐚𝐥𝐞𝐬 𝐚𝐧𝐚𝐥𝐢𝐳𝐚𝐝𝐨𝐬 𝐚 𝐧𝐢𝐯𝐞𝐥 𝐧𝐚𝐜𝐢𝐨𝐧𝐚𝐥× 𝟏𝟎𝟎
Relación entre variables
A partir de los resultados obtenidos del análisis de sueros sanguíneos
mediante la prueba ELISA indirecto, se efectuó un análisis de relación entre
los resultados y las variables de estudio (región, edad y sexo).
Georreferenciación
Los hatos muestreados y analizados contaron con puntos GPS de
ubicación (X y Y); para realizar la georreferenciación se utilizó el sistema
wgs84 (World Geodesic System 84) el cual permitió la elaboración de
mapas de distribución de hatos positivos a paratuberculosis a nivel
nacional.
24
CAPÍTULO III
RESULTADOS
Determinación de la prevalencia
El presente estudio determinó la prevalencia de paratuberculosis subclínica
a nivel nacional. En total se analizaron 5047 muestras (n=5047)
pertenecientes a 716 hatos (n=716), distribuidas en las 4 regiones del
Ecuador. 2391 muestras pertenecieron a la Costa (n=2391), 1703 a la
Sierra (n=1703), 801 al Oriente (n=801) y 152 a la región Insular (n=152)
(Tabla 3).
Tabla 3. Número total de muestras procesadas
Región Número de muestras Número de hatos
Costa 2391 262
Sierra 1703 291
Oriente 801 124
Insular 152 39
TOTAL 5047 716
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
Un total de 5047 muestras (n=5047) fueron analizadas a través de ELISA
indirecto. De éstas, 87 sueros resultaron positivos (n=87), correspondientes
a 68 hatos; 23 muestras resultaron sospechosas (n= 23) correspondientes
a 22 hatos, y 4937 muestras resultaron negativas (n=4937)
correspondientes a los 626 hatos restantes (Ver tabla 4).
25
Tabla 4. Distribución de resultados obtenidos por animal y hatos a nivel nacional
Resultado Número de
animales
(%) Número de
hatos
(%)
Positivos 87 1,72 68 9,5
Sospechosos 23 0,46 22 3,07
Negativos 4937 97,82 626 87,43
Total 5047 100 716 100
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
A nivel nacional, la prevalencia de la enfermedad por animal fue del 1,72%
(87/5074), y la prevalencia de la enfermedad por hatos del 9,5% (68/716)
(Ver Figura 2).
Figura 2. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis a nivel nacional
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
Resultados por variables de estudio
Región
De las 87 muestras positivas a nivel nacional, 49 muestras positivas (n=49),
pertenecieron a la región Costa, 28 muestras positivas (n=28)
pertenecieron a la región Sierra, 8 muestras positivas (n=8) pertenecieron
POSITIVOS NEGATIVOS
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
87
4937
1,72 97,8268
626
9,5 87,43
Mu
est
ras
anal
izad
as
Número de muestras (%) Número de hatos (%)
26
al Oriente, y 2 muestras positivas pertenecieron a la región Insular (Ver
tabla 5).
Tabla 5. Distribución de resultados obtenidos por región
Costa % Sierra % Oriente % Insular %
Positivos 49 2,05 28 1,64 8 1,00 2 1,32
Sospechosos 19 0,79 3 0,18 0 0 1 0,66
Negativos 2323 97,16 1672 98,18 793 99,00 149 98,02
Total 2391 100 1703 100 801 100 152 100
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
De esta manera, la prevalencia de paratuberculosis por región, fue mayor
en la Costa, con el 2,05% (49/2391) correspondientes a 37 hatos, seguida
de la Sierra con el 1,64% (28/1703) correspondientes a 23 hatos, la región
Insular con el 1,32% (2/132) correspondientes a 2 hatos y, finalmente, la
región Amazónica con el 1,00% (8/801) correspondientes a 6 hatos (Ver
Figura 3).
Figura 3. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis por región
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
0
500
1000
1500
2000
2500
COSTA % SIERRA % ORIENTE % INSULAR %
49 2,05 28 1,64 8 1 2 1,32
2323
97,16
1672
98,18
793
99 149 98,02
Mu
est
ras
Positivos Negativos
27
Edad
La edad de los animales muestreados en este estudio osciló entre los 12 y
24 meses, siendo el rango de edad más frecuente entre los 12 y 18 meses,
correspondientes a 61 sueros positivos (n=61/87), (70,11%) del total.
Además, 26 sueros positivos (n=26/87) correspondieron a animales entre
los 19 y 24 meses de edad (29,89%). (Ver Figura 4).
Figura 4. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis por edad
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
Sexo
De los 87 animales positivos a paratuberculosis a nivel nacional, 27 fueron
machos (31,03%), y de éstos, 13 corresponden a la región Costa, 13 a la
región Sierra, 1 a la región Oriental y ninguno a la región Insular. Los
restantes 60 animales positivos fueron hembras (68,96%), siendo 36 de la
Costa, 15 de la Sierra, 7 del Oriente y 2 de la región Insular (Ver Tabla 6 y
Figura 5).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
12-18 MESES > 18 MESES
61
26
70,11%
29,89%
An
imal
es
po
siti
vos
segú
n e
dad
Animales %
28
Tabla 6. Distribución de resultados obtenidos por sexo
Machos (+) % Hembras (+) %
Costa 13 48,15 36 60
Sierra 13 48,15 15 25
Oriente 1 3,70 7 11,67
Insular 0 0 2 3,33
Total 27 100 60 100
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
Figura 5. Resultado del diagnóstico de paratuberculosis por sexo
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
0
10
20
30
40
50
60
MACHOS HEMBRAS
27
60
31,03% 68,96%
An
imal
es
po
siti
vos
segú
n s
exo
Número de muestras Porcentaje
29
Georreferenciación
Se realizó la georreferenciación de los hatos positivos y sospechosos a
paratuberculosis, a través de los puntos GPS de localización a nivel
nacional.
Figura 6. Distribución espacial de hatos positivos y sospechosos a nivel nacional
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor (wgs84)
30
DISCUSIÓN
La paratuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa distribuida a nivel
mundial, caracterizada por producir diarrea progresiva, pérdida de peso, y
muerte. Afecta tanto a ganado de leche, como de carne, ocasionando altas
pérdidas económicas (Castellanos, 2010). Los países de América Latina no
cuentan con programas de control y erradicación contra paratuberculosis
bovina, a diferencia de países de Norteamérica, Europa y Asia (Correa,
Fernández, & Ramírez, 2014). Es por esta razón que la prevalencia de
paratuberculosis en la mayoría de países latinoamericanos, no ha sido aún
establecida (Correa et al., 2014).
En Ecuador, la enfermedad está presente pero ésta se encuentra sub
diagnosticada (Cárdenas & Peñaloza, 2017). La falta de programas de
control, baja sensibilidad de técnicas de diagnóstico, largo periodo de
incubación, así como la falta de estudios epidemiológicos de la enfermedad
a nivel nacional, han hecho difícil poder establecer el verdadero impacto
económico de la enfermedad (Cárdenas & Peñaloza, 2017).
El no conocer los datos de animales infectados dentro del hato provocaría
un efecto iceberg, dado que por cada animal infectado en etapa clínica de
la enfermedad, pueden existir 20 animales que se encuentren en etapa
subclínica, diseminando ampliamente el agente dentro del rebaño
(Cárdenas & Peñaloza, 2017). En este sentido, se establece que bovinos
con signos clínicos representarían una pequeña fracción de animales
infectados dentro de un hato (Crossley, Zagmutt-Vergara, Fyock, Whitlock,
& Gardner, 2005).
La técnica de ELISA indirecto es considerada el estándar de oro para la
determinación de la prevalencia de la enfermedad, debido a la sensibilidad
y especificidad para detectar anticuerpos séricos contra el agente (Tobergte
& Curtis, 2013). Esta técnica es ideal para la identificación de animales que
se encuentren en estado subclínico de la enfermedad (Sánchez et al.,
2009), ya que los animales recién nacidos son los más susceptibles a la
31
infección y la inmunidad humoral se presenta entre los 10 y 17 meses post
infección (CFSPH, 2010). De la misma manera, este ensayo es
considerado como una técnica screening, y es útil para el establecimiento
de medidas de vigilancia y control dentro de los hatos afectados (Sánchez
et al., 2009).
En este sentido, este estudio se basó en la determinación de la prevalencia
de paratuberculosis subclínica en bovinos entre los 12 y 24 meses de edad,
los cuales estuvieron distribuidos en 716 hatos pertenecientes a las 4
regiones del Ecuador. Se analizaron un total de 5047 sueros sanguíneos
(n=5047) seleccionados aleatoriamente, y procesados a través de ELISA
indirecto. Se determinó una prevalencia por animal a nivel nacional del
1,72% (n=87/5047), mientras que a nivel de hatos se determinó una
prevalencia del 9,5% (n=68/716).
La paratuberculosis es una enfermedad de distribución mundial con
variabilidad en los datos de prevalencia en ganado bovino (Sevilla, 2007).
En este estudio, el resultado de prevalencia obtenida a nivel nacional
(1,72%) difiere con la investigación de Ocepek et al., (2009) en Eslovenia,
quienes obtuvieron una prevalencia del 0,59%. En esa investigación se
analizaron bovinos entre 6 a 24 meses, a través de la técnica de ELISA
indirecto. Es importante destacar, que cada hato estaba conformado por 5
bovinos, a diferencia de nuestro estudio donde los hatos estuvieron
conformados por un mayor número de animales. De acuerdo a Crossley y
colaboradores, hatos más grandes tendrían una mayor densidad
poblacional y, por tanto, un sistema de manejo que promovería la
exposición al agente en edades tempranas (Crossley et al., 2005).
En Irán, un estudio realizado por Hajikolaei et al., (2006) analizó 140
bovinos menores de 2 años determinando una prevalencia de
paratuberculosis subclínica del 1,43% a través de la técnica de ELISA. En
este sentido se menciona que los bovinos de esta edad presentarían la fase
subclínica de la enfermedad, sin presencia de signos clínicos, pero como
excretores del agente y con buena inmunidad humoral detectable a través
32
de la técnicas serológicas (Hajikolaei, Ghorbanpoor, & Solaymani, 2006).
Estos datos concuerdan con los de nuestro estudio, en el que se analizaron
animales entre 12 y 24 meses de edad y en los que se presentaría una
elevación en el título de anticuerpos en etapa subclínica, detectable
mediante ELISA.
Un estudio en Holanda realizado por Weber et al., (2010), analizó entre los
años de 1996 y 2002, bovinos menores de 2 años, obteniendo una
prevalencia del 1%. Estos datos concuerdan también con nuestro estudio,
siendo que los bovinos más jóvenes presentarían una alta inmunidad
humoral detectable por ELISA y serían considerados importantes en la
transmisión de la enfermedad (Weber, Kogut, de Bree, van Schaik, &
Nielen, 2010).
Crossley y colaboradores en el 2005, en un estudio realizado en
Pennsylvania – EEUU, determinaron una prevalencia de paratuberculosis
del 13.1%, luego de analizar 786 bovinos (Crossley et al., 2005). La
prevalencia obtenida en esta investigación difiere de nuestro estudio
(1,72%), debido a que se determinó el porcentaje de excretores por UFC,
y las muestras de heces analizadas fueron obtenidas en invierno bajo
condiciones climáticas adversas; este parámetro incrementaría el nivel de
estrés en los animales y, por tanto, la excreción de UFC de Map (Crossley
et al., 2005).
En Italia, el estudio realizado por Pozzato et al., (2011), analizó 65608
bovinos, determinando una prevalencia mayor al 50%. Sin embargo, a
diferencia de nuestro estudio, los animales provenían de hatos con historial
de presencia de la enfermedad y fueron analizados durante 2 años
consecutivos (Pozzato et al., 2011). Esta investigación corroboraría la
importancia de determinar la prevalencia de la enfermedad a nivel nacional,
a fin de poder dar seguimiento a la misma en los subsiguientes años.
En Colombia, un estudio realizado por Vélez et al., (2016) analizó bovinos
de 2 años mediante ELISA, determinando una prevalencia del 33,8%. Estos
datos difieren con nuestro estudio, debido a que la investigación se realizó
33
en una granja libre de la enfermedad, donde habían recién ingresado
animales infectados, permitiendo la diseminación del agente (Vélez,
Rendón, Valencia, Ramírez, & Fernández, 2016).
En Ecuador, 2 estudios realizados en la Sierra norte y Sierra sur por
Cajilema et al., (2015) y Cárdenas y Peñaloza (2017) respectivamente,
analizaron bovinos mayores de 3 años a través de la técnica de ELISA,
determinando una prevalencia de 7,29% y 6% respectivamente. Sin
embargo, estos datos solo representarían a una región limitada del país y,
por tanto, no muestran un panorama real de la enfermedad a nivel nacional,
debido al limitado tamaño de la muestra.
En relación de la prevalencia de la enfermedad por regiones, se determinó
que el mayor número de animales positivos se encontraba en la región
Costa con el 2,05% (49/2391), seguido de la región Sierra con el 1,64%
(28/1703), la región Insular con el 1,32% (2/132) y finalmente el Oriente con
el 1,00% (8/801).
En esta investigación, se observa que la enfermedad en la región Costa y
Sierra presentan una mayor prevalencia en relación a la región Amazónica
e Insular. En el estudio realizado en México por Milián et al., (2015) se
menciona que la enfermedad presentó una mayor prevalencia en zonas del
país que abarcaban una mayor densidad poblacional bovina. En Ecuador,
la mayor población bovina se concentra en la región Sierra (47,18%) y
Costa (43,01%) a diferencia de la población bovina que abarca el Oriente y
región Insular (9,37%) (ESPAC, 2015).
Un estudio realizado a nivel nacional en China por Sun et al., (2015)
demostró la amplia distribución de la enfermedad en el país. Los autores
concluyeron que la infección se encontraría presente en zonas donde se
desarrolla la ganadería de leche y carne del país (Sun et al., 2015),
concordando de esta manera con nuestro estudio.
La prevalencia en la región Costa fue mayor (2,05%), lo que concuerda con
un estudio realizado por Vélez et al., (2016) en la zona costera de Colombia.
34
Los investigadores concluyeron que en esta zona se concentraría la mayor
cantidad de ganado de carne, y que la exposición de terneros separados
de sus madres, con heces de animales adultos infectados, incrementarían
las probabilidades de contraer la infección (Vélez et al., 2016). Sin
embargo, en el estudio realizado en Ecuador por Cárdenas y Peñaloza
(2017), determinaron una mayor prevalencia en hatos lecheros,
concluyendo que el confinamiento de los bovinos lecheros, permitiría el
aparecimiento de la enfermedad (Cárdenas & Peñaloza, 2017).
En la región Insular, se determinó la presencia de anticuerpos para la
enfermedad. Con estos datos se ratifica lo indicado por (Cabezas, 2012),
quien menciona la importancia de realizar controles más estrictos en la
movilización de animales entre islas, a fin de evitar la diseminación de
enfermedades dentro de la región Insular.
Sin embargo, en lo referente a la prevalencia en la región Amazónica, y de
acuerdo a lo indicado por Milián et al., (2015) en su estudio realizado en
México, sería importante tomar en cuenta, que la variación en la
prevalencia por región se podría deber a diferencias en el tamaño de la
muestra.
En Venezuela, Sánchez et al., (2009) mencionan que la temperatura
mínima y máxima de la zonas de presencia de animales positivos oscilaban
entre los 19,7°C y 35,2°C. Lavers (2013), además, indica que el agente
presentaría una resistencia frente estas a condiciones ambientales; esta
información coincide con nuestros resultados, puesto que la temperatura
que presentan las regiones de Ecuador donde se detectaron los animales
positivos, fluctúa entre las mencionadas por el estudio (INOCAR, 2012).
En relación al sexo de los animales, se observó una mayor frecuencia de
animales positivos hembras en relación a machos. Estos datos concuerdan
con los estudios realizados por Fadhel et al., (2010) y Vélez et al., (2016),
en los cuales el mayor porcentaje de positividad se obtuvo en hembras. Los
autores indican que la diferencia existente entre hembras y machos, se
35
podría deber a un menor número de machos muestreados (Vélez et al.,
2016) (Fadhel et al., 2010).
En relación a la edad, en nuestro estudio se observó una mayor frecuencia
de positividad en bovinos entre los 12-18 meses (70,11%) en relación a los
bovinos entre 19 y 24 meses (29,89%). Un estudio en Australia, realizado
por Windsor & Whittington (2010), determinó una menor prevalencia de la
enfermedad en bovinos entre los 6 y 18 meses; sin embargo, se concluye
que existiría una mayor posibilidad de infección en bovinos más jóvenes, al
ser expuestos a ambientes altamente contaminados (Windsor &
Whittington, 2010).
En México, la investigación realizada por Zepeda (2012) determinó por
ELISA un 2% de animales infectados entre 8 y 24 meses, similar a nuestro
estudio. En animales jóvenes la enfermedad clínica está ausente, sin
embargo al existir una alta prevalencia dentro del hato, los animales
jóvenes comienzan a excretar el agente a corta edad (Zepeda, 2012).
En Ecuador estudios realizados por Cajilema et al., (2015) y Cárdenas &
Peñaloza (2017), determinaron a través de ELISA un mayor porcentaje de
positividad en bovinos mayores de 24 meses; sin embargo la edad en estos
estudios se limitó a este rango y no se analizó animales menores.
De esta manera se concluiría que la edad estaría más relacionada a la
susceptibilidad que presentan los animales jóvenes a infectarse en relación
a los adultos, así como también al estado físico, inmunológico, medidas de
control y manejo que se tengan con los animales (Cajilema et al., 2015;
Cárdenas & Peñaloza, 2017). Finalmente, se realizó la georreferenciación
de los resultados, determinando, por primera vez, la prevalencia nacional
de paratuberculosis subclínica en bovinos entre los 12 y 24 meses de edad.
En este sentido, esta investigación ayudará a determinar el estatus actual
de la enfermedad en el país, permitiendo a las autoridades competentes
tomar medidas preventivas, a fin de evitar la diseminación. A su vez, estos
datos podrán servir como referencia para estudios posteriores a nivel
regional en el país.
36
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES
Este estudio determinó la presencia de anticuerpos contra
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en bovinos entre 12
y 24 meses a través de la técnica de ELISA. Se estableció una
prevalencia nacional de la enfermedad por animal del 1,72% y por
hato del 9,5%.
La prevalencia de la enfermedad por región del país, fue mayor a
nivel de la Costa con 2,05%, seguido de la región Sierra con 1,64%,
la región Insular con 1,32% y el Oriente el 1,00%, determinando su
distribución a nivel nacional
Se determinó que las variables edad y sexo, no tienen influencia
directa en el aparecimiento de la enfermedad.
Se obtuvo la georreferenciación de hatos positivos a
paratuberculosis a nivel nacional, determinando su amplia
distribución en las 4 regiones del Ecuador.
37
RECOMENDACIONES
Se recomienda establecer programas de control de paratuberculosis
bovina que ayuden a disminuir y controlar la presencia de la
enfermedad, a fin de evitar que los animales positivos se conviertan
en diseminadores de la enfermedad dentro de los hatos.
Es importante realizar un seguimiento de los hatos sospechosos en
este estudio.
Se recomienda la realización de nuevos estudios relacionados con
paratuberculosis, los que ayuden a complementar y profundizar el
conocimiento de la enfermedad.
38
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Municipio de Tecamachalco, Puebla, (Febrero), 0–76.
45
ANEXOS
Anexo 1. Selección aleatoria de sueros sanguíneos
Fuente: El Autor
Anexo 2. Preincubación de muestras
Fuente: El Autor
Anexo 3. Adición del conjugado
Fuente: El Autor
46
Anexo 4. Lavado de placa
Fuente: El Autor
Anexo 5. Lectura de placa en el lector ELISA
Fuente: El Autor
Anexo 6. Procesamiento de muestras por el estudiante
Fuente: El Autor
47
Anexo 7. Ejemplo de hoja protocolo de ELISA utilizado
48
Anexo 8. Ejemplo de resultado de obtenido a través del software IDSoft™
49
(continuación)
Fuente: Software IDSoft™
50
Anexo 9. Abstract certificado
Fuente: Ernesto Andino