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UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL
“LISANDRO ALVARADO”
EFECTO NEUROPROTECTIVO DEL ÁCIDO VALPROICO EN LA
ISQUEMIA-REPERFUSIÓN
MARÍA M. HERNANDEZ DE GONZÁLEZ
Barquisimeto, 2007
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
DECANATO DE MEDICINA
MAESTRIA EN FISIOLOGIA
“EFECTO NEUROPROTECTIVO DEL ÁCIDO VALPROICO EN LA
ISQUEMIA-REPERFUSIÓN”
Trabajo presentado para optar al grado de Magíster Scientiarum
Por: MARÍA M. HERNÁNDEZ DE GONZÁLEZ
Barquisimeto, 2007
APROBACION DEL TUTOR
En mi carácter de tutor del trabajo titulado: “EFECTO NEUROPROTECTIVO DEL
ÁCIDO VALPROICO EN LA ISQUEMIA-REPERFUSION”, presentado por la
ciudadana MARIA MAGDALENA HERNÁNDEZ DE GONZÁLEZ para optar al
grado de MAGÍSTER SCIENTIARUM EN FISIOLOGÍA, considero que dicho
trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación
pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En Barquisimeto, a los 19 días del mes de Enero de 2007.
____________________________ Prof. Nelson Loureiro, PhD
“EFECTO NEUROPROTECTIVO DEL ÁCIDO VALPROICO EN LA
ISQUEMIA-REPERFUSIÓN”
Por: MARÍA MAGDALENA HERNÁNDEZ DE GONZÁLEZ
Trabajo de grado aprobado
___________________________ ________________________________ Dr. Nelson Enrique Loureiro D.S. Dr. Gregório Tiskow D.
________________________________ Dr. José Lorenzo Garay F.
Barquisimeto, ____ de ____________ de 2007
AGRADECIMIENTO
A Dios Padre creador de todas las cosas visibles e invisibles, quién me ha motivado a descubrir y defender el misterio más hermoso de su creación: La Vida.
A mi esposo Genaro, quien gracias a su amor, apoyo y compañía se hace
posible hoy éste logro.
A mis hijos: Mariena, Esther, Israel y María Gabriela; quienes con su cariño y comprensión supieron donarme el tiempo que les pertenecía, en la realización de este trabajo y el logro de ésta meta.
Al Dr. Nelson Loureiro, por su labor como Tutor y guía, quien supo tener paciencia y comprensión durante mi proceso de aprendizaje, sin lo cual no hubiese sido posible la realización de éste trabajo de investigación.
A todo el personal que labora en el Laboratorio de Fisiología Celular del Decanato de Medicina de la UCLA, especialmente a los estudiantes Anaís Pereira y Daniela Petruchi y los TSU Elis Mosquera, William López y Gladys Pastran quienes me ayudaron y acompañaron en la elaboración de ésta investigación.
A la Dra. Martha Silva: por su amistad incondicional y su apoyo en los
momentos más cruciales en la elaboración de éste trabajo. A mi cuñado y hermano Dr. Luís Enrique González R. quien desde el exterior
me brindó su apoyo durante este tiempo de estudios. A todos los profesores, empleados y técnicos del Departamento de Fisiología de
la Universidad “Lisandro Alvarado” por acogerme en sus áreas y brindarme su apoyo y amistad.
A la Universidad “Lisandro Alvarado”, por brindarme la oportunidad de formarme y culminar éste trabajo.
A la Universidad “Rómulo Gallegos” por su confianza y apoyo económico, sin la cual no hubiese sido posible el logro de ésta meta. María
INDICE
PAG
INDICE DE ILUSTRACIONES vi
RESUMEN vii CAPÍTULO I INTRODUCCION 1 II ANTECEDENTES 6 Isquemia Cerebral 6 El Ion Calcio en los procesos excitotóxicos 12 Formación de Radicales Libres en la Isquemia Reperfusión cerebral y su rol en los procesos excitotóxicos 17
Muerte Celular en la isquemia Cerebral: Necrosis – Apoptosis 24
Ácido Valproico 32 III MATERIALES Y MÉTODOS 38 Diseño Experimental 41 Análisis Estadístico de los Datos 51 IV RESULTADOS 52 V DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN 66 BIBLIOGRAFÍA 78 ANEXOS 86
INDICE DE ILUSTRACIONES
ILUSTRACIONES PAG Figura 1 Mecanismos de daños inducidos por la isquemia 11
Figura 2 Homeostasis del Ion Calcio 16
Figura 3 Intervención de la mitocondria en la isquemia 16 Figura 4 Diagrama de eventos claves de la Apotósis 30 Figura 5 Estructura Química del Ácido Valproico 33 Imagen 1 Efecto del VPA sobre expresión de Bcl-2 59 Imagen 2 Efecto del VPA sobre expresión Caspasa-3 Activada 60 Gráfico1 Evaluación Neurológica según García 53 Gráfico 2 Evaluación Neurológica según Bederson 54 Gráfico 3 Niveles de Peroxidación Lipídica en la Isquemia-Reperfusión 56
Gráfico 4 Niveles de Proteínas Carboniladas en la Isquemia-Reperfusión 58
Gráfico 5 Niveles de Peroxidación Lipídica en el estrés oxidativo 62 Gráfico 6 Niveles de Proteínas Carboniladas en el estrés oxidativo 65
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
DECANATO DE MEDICINA MAESTRIA EN FISIOLOGIA
“EFECTO NEUROPROTECTIVO DEL ÁCIDO VALPROICO EN LA
ISQUEMIA-REPERFUSIÓN”
Autor: María M. Hernández. de González Tutor: Nelson Enrique Loureiro D.S.
RESÚMEN
El cerebro es altamente vulnerable a la isquemia por depender casi exclusivamente de la fosforilación oxidativa para su funcionamiento. La interrupción del flujo sanguíneo cerebral desencadena una serie de eventos producto de la falla energética tales como: alteración de los gradientes iónicos, acumulación de neurotransmisores excitatorios extracelulares, aumento del calcio intracelular; generando una cascada enzimática con la consiguiente depleción de la poca energía almacenada, sobrecarga mitocondrial, estrés oxidativo, activación de enzimas catabólicas, daños en la membrana plasmática, inflamación y muerte celular por necrosis (muerte que ocurre rápidamente) y o apoptósis (tipo de muerte tardía) en tejidos afectados. La reperfusión y oxigenación después de la isquemia pueden exacerbar significativamente la lesión cerebral. En la isquemia inducida por la oclusión de la arteria cerebral media en roedores, se identifican dos zonas: una central isquémica donde las células mueren por necrosis, y otra que circunda la zona central llamada penumbra donde las células mueren por apoptósis. Estudios anteriores demuestran que el Ácido Valproico (VPA) protege las células cerebrales de la muerte celular por apoptósis in vitro e in vivo y tiene un efecto neuroprotector antioxidante in vitro. Considerando el estrés oxidativo como uno de los mecanismos fisiopatológicos involucrados en la isquemia-reperfusión, en este trabajo se demuestra que el VPA redujo el daño neurológico, la oxidación a lípidos y proteínas; aumentó la expresión de Bcl-2 y disminuyó la expresión de Caspasa-3 Activada en el cerebro de ratas sanas sometidas a isquemia-reperfusión, inducida por la oclusión transitoria de la arteria cerebral media derecha. Se demuestra además que el VPA ejerce un efecto antioxidante parecido a la Vitamina E en el cerebro de ratas sanas sometidas a estrés oxidativo agudo por la aplicación intracraneal de FeSO4 en el hemisferio cerebral derecho; mientras que el Diazepam (droga que comparte efectos similares al VPA) no tuvo efecto antioxidante. Palabras Claves: Isquemia-reperfusión, acido valproico, estrés oxidativo, excitotoxicidad, apoptósis, necrosis.
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
El cerebro humano es un órgano que consume una gran cantidad de energía para
mantener sus funciones, con un elevado costo energético para el organismo, que
representa el 2,5% del peso corporal, con una tasa metabólica que está alrededor del
25% del metabolismo basal total, lo que explica la elevada vulnerabilidad de éste noble
órgano a la isquemia. La interrupción del flujo sanguíneo sólo durante cinco minutos,
provoca la muerte masiva de neuronas en diversas áreas del cerebro, mientras que otros
tejidos requieren mayor tiempo de exposición a la isquemia para producirse daño y
muerte celular.
Las células neuronales tienen un consumo elevado de oxígeno y glucosa,
dependiendo casi exclusivamente de la glucosa como sustrato de energía; y el
almacenamiento de glucosa o glucógeno en el órgano es limitado. Sin embargo la causa
de la vulnerabilidad del cerebro a la isquemia no es únicamente responsabilidad de la
falta de glucosa, al parecer, los mecanismos de señalización que intervienen
normalmente en el proceso de información intracelular e intercelular, se vuelven
dañinas para las propias células cerebrales ante un proceso de isquemia. Como
consecuencia de la interrupción del flujo sanguíneo cerebral, se produce la formación de
radicales libres, activación de enzimas catabólicas, daños en la membrana plasmática,
inflamación y muerte celular por necrosis y por apoptósis en los tejidos afectados.
La isquemia cerebral puede ser causada por la oclusión de una arteria cerebral, o
alguna de sus ramas por una embolia, por trombosis local o por traumas; desde el
punto de vista temporal esta puede ser transitoria con posterior reperfusión, o
permanente y en cuanto a su extensión puede ser global, involucrando todo el tejido
cerebral, o focal al afectar sólo una limitada área irrigada por una arteria ocluida.
Ante la isquemia, la falla de energía produce la interrupción de la homeostasis iónica
con la consecuente alteración de los gradientes iónicos y la acumulación de
neurotransmisores excitatorios extracelulares, sobre todo el Glutamato, el cual,
desencadena una serie de reacciones intracelulares, con la consiguiente depleción de la
poca energía almacenada llevando finalmente a la muerte celular.
El Glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en el sistema nervioso
central y se libera masivamente desde los terminales nerviosos glutamatérgicos bajo
condiciones isquémicas, aumentando su concentración en el espacio extracelular. Esta
elevada concentración del Glutamato extracelular bajo condiciones de isquemia,
sobreestimula sus receptores: NMDA, AMPA, y los receptores de Glutamato tipo
Kainato, promoviendo la salida del potasio y la entrada de sodio y calcio a la célula. Los
receptores del NMDA son canales de calcio dependientes de ligando y voltaje-
dependientes el cual, además de permitir la entrada de calcio, también junto a éste entra
el sodio, la sobreestimulación de éste receptor por parte de una acumulación
extracelular exagerada del Glutamato, genera la entrada masiva de calcio a la célula,
causando la muerte celular por necrosis o por apoptósis (muerte celular programada).
La reperfusión y oxigenación después de un episodio isquémico puede exacerbar de
forma significativa la lesión al cerebro, lo cual ha sido demostrado experimentalmente
en roedores. Los efectos de la isquemia reperfusión dependerán entre otras cosas, de la
duración de la interrupción del flujo sanguíneo, y de la extensión de la reperfusión. Al
producirse una isquemia inducida por la oclusión de la arteria cerebral media en los
roedores, la lesión se va dividir en dos zonas: una central isquémica y una periférica
llamada de penumbra. En la región central se produce muerte celular por necrosis, que
ocurre rápidamente, mientras que en la penumbra región hipoperfundida, la muerte
celular sucede más lentamente, a través de un mecanismo diferente conocido como
apoptósis.
La muerte por necrosis en la región central de la isquemia, se debe a la depleción de
ATP, NAD y Oxígeno para las necesidades metabólicas de la célula, produciendo
ruptura de las organelas citoplasmáticas, liberación masiva de proteasas y otras enzimas
e inflamación.
En la penumbra la hipoperfusión dificulta a la célula mantener los gradientes
ionicos. Las células localizadas en ésta región (penumbra), se ven afectadas por
sustancias detonantes producidas por células vecinas, como la liberación de Glutamato y
Aspartato por parte de neuronas de la región isquémica central donde se produce
exitotoxicidad, entre los que se encuentran: liberación de especies reactivas de oxígeno
y óxido nítrico (NO) que causan estrés Oxidativo y Nitrosativo, citoquinas
inflamatorias, y metaloproteinasas, endotelinas, que incrementan la vasoconstricción y
como consecuencia una mayor hipoperfusión suplementaria. Aún cuando muchos
factores involucrados en la necrosis central actúen en la zona de penumbra periférica,
las cascadas de señalización en ambas zonas son diferentes.
La apoptósis llamada también muerte celular programada, es un conjunto de señales
intracelulares que están fuertemente controlados por la expresión genética que ocurre
normalmente durante el desarrollo del cerebro y de todos los tejidos. En la vida de un
individuo existe un equilibrio entre la proliferación celular y apoptósis. Este es un
mecanismo de autodestrucción celular que han desarrollado los organismos
multicelulares para eliminar células dañadas o potencialmente malignas, caracterizado
por una fragmentación del DNA cromosómico, seguido de una desorganización
estructural de los orgánulos celulares y pérdida de la morfología normal de la célula
volviéndose esféricas, para luego descomponerse en pequeños fragmentos llamados
cuerpos apoptóticos, que posteriormente son fagocitados por los macrófagos.
La apoptósis parece estar involucrada además, en una gran diversidad de
enfermedades degenerativas tales como enfermedad de Parkinson, Alzheimer, en
enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo I, encefalomielitis entre otras. Las
moléculas directamente responsables de la autodestrucción, son una serie de enzimas
con actividad proteasa, denominadas Caspasas. Las Caspasas son proteínas ricas en
cisteinas, que al activarse, cortan en determinados residuos de aspartato de las proteínas
dianas. Estas enzimas se encuentran en un estado enzimáticamente inactivo llamado
Zimógeno; esta es la forma precursora inactiva de la enzima. Existen dos tipos de
caspasas: iniciadoras y ejecutoras, sin embargo aún se desconoce exactamente como se
organizan estas funciones para producir la cascada proteolítica.
Existen otras proteínas llamadas de Bcl-2 las cuales están asociadas a membrana y
se localizan en múltiples sitios sub-celulares incluyendo mitocondrias, membrana
nuclear y retículo endoplásmico y son capaces de inhibir la apoptosis. El gen que
expresa Bcl-2 es un potente supresor de muerte celular programada ya que diferentes
estímulos que activan éste gen, sobre-expresan ésta proteína que previene la apoptósis.
Otras por el contrario, de la misma familia de Bcl-2, tienen efectos proapoptóticos, tal
como la proteína BAX que induce muerte celular.
Los radicales libres juegan un papel fundamental en la citotoxicidad durante la
isquemia reperfusión, éstos están involucrados dentro de los factores desencadenantes
de necrosis y apoptósis. Las caspasas pueden ser activadas ante situaciones de estrés
Oxidativo o Nitrositivo (NO·). Durante el proceso de isquemia-reperfusión aumentan las
concentraciones de especies altamente reactivas, tanto de oxígeno como de nitrógeno,
inducidas por la entrada masiva de calcio (debido a la depleción transitoria de energía) y
conducen a daño celular tanto por necrosis como por apoptósis. Por otro lado, la acción
de los radicales libres sobre las proteínas (oxidación de las proteínas), parece influir
sobre la activación de señales que llevan a apoptósis.
En base a estudios que demuestran la acción neuroprotectora del ácido Valproico
(medicamento ampliamente utilizado como anticonvulsivante y en los desordenes
afectivos bipolares), el presente trabajo a través, de un protocolo experimental en el que
se produce isquemia reperfusión mediante la oclusión transitoria de la arteria cerebral
media (OTACM), estudia los efectos de esta droga sobre la protección neuronal,
demostrándose que reduce los niveles de radicales libres y disminuye la apoptósis. Por
otro lado se compara éste efecto neuroprotector con otras drogas tales como la Vitamina
E (potente antioxidante), y el Diazepam (droga anticonvulsivante) en ratas sometidas a
estrés oxidativo, a través, de la inyección intracraneal de un agente productor de
radicales libres. Se evaluó el estado neurológico de los animales que fueron sometidos a
isquemia-reperfusión, 24 y 48 horas posterior a las lesiones producidas y desde el punto
de vista bioquímico, se cuantificaron postmorten inmediato, los niveles de peroxidación
lipídica, proteínas carboniladas, así como también se comprobó los niveles de
activación del proceso de apoptósis, a través de la expresión de Caspasa-3 activada y
Bcl-2.
CAPÍTULO II
ANTECEDENTES
Isquemia Cerebral
La hipoxia es la reducción de la presión parcial de oxígeno (PaO2) a nivel de la
sangre arterial limitando la formación de ATP mitocondrial en las células afectadas,
mientras que la Isquemia es una condición patológica en la cual existe un daño tisular,
cuando éste es privado de su irrigación sanguínea. Comprende principalmente los
fenómenos que ocurren como consecuencia del aporte inadecuado tanto de oxígeno
como de nutrientes. El daño por Reperfusión, se refiere a la injuria a nivel del tejido,
una vez que el flujo sanguíneo es restaurado después de un período de isquemia (Ferez,
S.; Lupi, H. 2004). La isquemia cerebral es el resultado de la reducción del flujo
sanguíneo cerebral, permanente o transitorio, en éste último caso acompañado de
reperfusión. El tejido cerebral tiene relativamente un elevado consumo de oxígeno y
glucosa, y depende casi exclusivamente de la fosforilación oxidativa para la producción
de energía, además posee un almacenamiento limitado de energía, aspectos estos que lo
hacen mas vulnerable al daño isquémico que otros tejidos. Una disminución o bloqueo
del flujo sanguíneo cerebral focal, restringe o suprime la obtención de sustratos,
particularmente oxígeno y glucosa, disminuyendo o depletando la energía necesaria
para mantener los gradientes iónicos, desencadenando una serie de eventos
fisiopatológicos que comprometen seriamente las funciones y la vida de las células
cerebrales. La isquemia es el evento más catastrófico que lleva a la muerte celular a las
áreas afectadas y el tejido cerebral, que es particularmente muy vulnerable a la
isquemia, ante una interrupción total del flujo sanguíneo de tan sólo 5 minutos, trae
como consecuencia la muerte neuronal de las áreas comprometidas (Jin-Moon Lee y
cols. 2000).
Philip A y cols. (2003) sostienen que durante la isquemia cerebral severa o
moderada, se reduce el flujo sanguíneo cerebral y se deteriora su autorregulación. Estos
investigadores relacionan diferentes umbrales en los niveles de reducción del flujo con
el grado de daño al tejido cerebral afectado; cuando los niveles del flujo sanguíneo están
alrededor de 20ml/100g/min, la fracción de oxígeno se torna máxima, la tasa
metabólica cerebral comienza a fallar, se altera o afecta la función de las neuronas de la
corteza cerebral y la actividad electroencefalográfica cortical cesa. Este grado de
isquemia constituye un umbral para la pérdida de la función eléctrica neuronal. Una
disminución aún mayor del flujo sanguíneo a niveles de alrededor de 10ml/100g/min.
produce un daño mucho mas severo a las membranas y su función. En estas condiciones
de flujo sanguíneo tan disminuido, hay carencia de oxígeno, se produce una caída de la
PO2 lo cual inhibe el metabolismo aeróbico mitocondrial, y se activa el metabolismo
anaeróbico de glucosa, causando un aumento en la producción de ácido láctico y una
caída del pH provocando una acidosis intra y extracelular. Todas las funciones
dependientes de energía para mantener la homeostasis se ven severamente deterioradas,
los iones de potasio salen masivamente de la célula hacia el espacio extracelular, y hacia
el interior de la célula entran el sodio, agua y calcio, trayendo como consecuencia un
edema citotóxico. Estos investigadores sostienen que la extensión del daño cerebral
isquémico va a depender del umbral crítico de reducción del flujo sanguíneo, de la
duración de la isquemia, de la temperatura de los tejidos, de los niveles de glucosa en la
sangre y de otras variables fisiológicas. Afirman, además, que algunas neuronas parecen
ser más vulnerables a la hipoxia y a la reducción del flujo sanguíneo que otras,
llamando a este fenómeno “Vulnerabilidad Selectiva”.
Mecanismos de daño después de la isquemia.
Interrupción de la Homeostasis iónica de la membrana y liberación de aminoácidos
excitatorios, primera consecuencia de la falla de energía: Jin-Moon Lee y cols. (2000)
reportan que, a escasos segundos de haber comenzado la isquemia cerebral, cesa la
actividad electroencefalográfica cortical; cuando la isquemia es global, rápidamente
sobreviene pérdida de la conciencia. El cese masivo de la actividad neuronal es inducida
por la salida del potasio desde las neuronas, mediado inicialmente por la apertura de los
canales de potasio dependientes de voltaje y mas tarde por los canales de potasio
dependientes de ATP, provocando a nivel de la membrana una hiperpolarización.
El desbalance iónico producido por la isquemia o hipoxia, se traduce como una
respuesta a la demanda de energía no satisfecha de los tejidos afectados, que llevan a la
reducción de los niveles de ATP y a la falla de las bombas iónicas de la membranas,
sobre todo de la bomba Na+/K+ ATPasa, encargadas de mantener el gradiente iónico
transmembrana. La hiperpolarización inicial que se produce a pocos segundos después
del comienzo de la isquemia es la respuesta de los canales de K+ a los cambios agudos
en las concentraciones locales de ATP, H+ o Ca2+ (Siegel G. 2006).
Seguidamente después de la hiperpolarización, se produce una despolarización
anóxica, debida a una rápida redistribución iónica a través de la membrana, esta
despolarización masiva se conoce como un estado de depresión extendida que puede
propagarse a los tejidos cerebrales vecinos. Todos estos eventos desembocan en una
liberación masiva de aminoácidos excitatorios como el Glutamato y Aspartato desde las
terminaciones nerviosas, llevando a la neurodegeneración excitotóxica de neuronas y
glias (Jin-Moon Lee y cols 2000).
Excitotoxicidad en el daño cerebral isquémico.
Philip A. y cols. (2003), en cuanto a los mecanismos que producen la muerte celular
isquémica explican que ésta ocurre vía tres grandes mediadores a saber: (a) incremento
de las concentraciones intracelulares de calcio (relacionado con la excitotoxicidad del
glutamato), (b) acidosis del tejido y (c) la producción de radicales libres (Óxido Nítrico
y especies de Oxígeno reactivas).
La excitotoxicidad del glutamato, como mediador clave en la muerte neuronal
inducida por la isquemia.
Lucas y Newhouse en 1957 reportan por primera vez que la hiperfuncionalidad del
Sistema glutamatérgico podía producir daño neuronal, al demostrar que la exposición
prolongada de las neuronas de la retina al glutamato, producía la destrucción o muerte
de las mismas. Posteriormente Olney y colaboradores demostraron que este efecto
neurodegenerativo era una característica común de todos los aminoácidos excitatorios a
nivel de todo el SNC (citado por Moreno Yanes 2004).
El Glutamato (ácido glutámico) es el principal neurotransmisor excitatorio del SNC,
éste junto con otros aminoácidos excitatorios en el SNC se encuentran involucrados en
un sistema de sinapsis excitatorias llamado glutamatérgico que, en condiciones
fisiológicas, es regulado además de otros factores, por un sistema inhibitorio llamado
gabaérgico, donde el principal aminoácido inhibidor es el ácido ganmaminobutírico o
GABA (Moreno Yanes J.A. 2004). La materia gris cerebral contiene concentraciones de
glutamato en un promedio de 10mmol/l, muchos de los cuales se encuentra almacenado
en vesículas sinápticas para ser liberados como un neurotransmisor. Las
concentraciones extracelulares del glutamato se mantienen normalmente en el rango de
≈1µmol/l, gracias al transportador acoplado al eflujo de Na+ que se encarga de
recaptarlo desde los espacios extracelulares cuando éste es liberado y la glutamina
sintasa que forma glutamina a partir del glutamato utilizando como cofactor el ATP.
Bajo condiciones isquémicas debido a que las reservas de energía y el gradiente de Na+
fallan, se produce un aumento en la liberación y una caída en la recaptación del
glutamato, aumentando su concentración a nivel extracelular, que lleva a una
sobreactivación de sus receptores N-Metil-D-Aspartato (NMDA), Ácido alfa-amino-3-
hidroxi-5-metil-4-izoxaprolepropiónico (AMPA), y los receptores de Glutamato tipo
Kainato, promoviendo la salida del potasio y la entrada de sodio y calcio a la célula,
principalmente los receptores de NMDA que son canales de calcio activados por
ligando y dependientes de voltaje, estos receptores tienen una alta permeabilidad al
calcio, aumentando su concentración intracelular a niveles sumamente citotóxicos, con
la consecuente sobrecarga de las mitocondrias, generación de radicales libres y la
activación de enzimas entre las cuales está la sintasa de óxido nítrico (NOS) llevando a
las células a morir ya sea por necrosis o por apoptósis (Siegel G. 2006).
La importancia del receptor NMDA en el proceso de muerte celular quedó
demostrada por Choi (1988) quien observó que el bloqueo en forma selectiva de los
receptores NMDA en células cultivadas, se prevenía el influjo de calcio y la muerte
celular, inducida por una exposición breve e intensa al Glutamato. Dirnagi U. y cols.
(1999) también reportan que los antagonistas de los receptores de NMDA demostraron
fuerte neuroprotección, al ser administrados antes o durante la oclusión de la arteria
cerebral media, en modelos de isquemia transitoria o permanente en roedores.
Moreno Yanes (2004) describe dos fases en la neurotoxicidad inducida por la
exposición a altas concentraciones de glutamato; la primera fase ocurre a los pocos
minutos de exposición al glutamato y va a depender de la presencia de sodio y cloruro
en el medio extracelular, donde la neurona aumenta su volumen (engrosamiento
neuronal) debido a la entrada del sodio acompañado de agua y cloruro a la célula, esta
fase es reversible, la neurona puede recuperarse y sobrevivir. La segunda fase es
irreversible y aparece horas después de haberse iniciado la exposición al glutamato
(aparición retardada), esta fase es totalmente dependiente de la presencia de calcio
extracelular y se caracteriza por la ruptura de todos los procesos homeostáticos, falla
energética grave, inflamación celular, daño e la membrana plasmática y la activación de
diferentes procesos catalíticos, que condenan a la muerte celular inminente. De acuerdo
al tiempo e intensidad de exposición al glutamato, ésta muerte puede ser por apoptósis o
por necrosis.
Despolarización
Inflamación celular
(edema)
Daño Mitocondrial
Apoptósis
Mediadores inflamatorio
Ca 2+
Inducción de
enzimas
Radicales Libres
NODegradación de la membrana
Na +
K +
K +
DespolarizaciónPeri -infarto
Infiltración de leucocitos
ActivaciónMicroglial
GG
G
G
Liberación de Glutamato
Na +
Ca 2+
FALLA DE ENERGÍA
ISQUEMIA
Daño al DNA
Despolarización
Inflamación celular
(edema)
Daño Mitocondrial
Apoptosis
Mediadores Inflamatorio
Ca 2+
Inducción de
Radicales Libres
NODegradación de la membrana
Na +
K +
K +
DespolarizaciónPeri -infarto
Infiltración de leucocitos
ActivaciónMicroglial
GGGG
GG
GG
Liberación de Glutamato
Na +
2+
FALLA DE ENERGÍA
ISQUEMIA
Daño al DNA
Despolarización
Inflamación celular
(edema)
Daño Mitocondrial
Apoptósis
Mediadores inflamatorio
Ca 2+
Inducción de
enzimas
Radicales Libres
NODegradación de la membrana
Na +
K +
K +
DespolarizaciónPeri -infarto
Infiltración de leucocitos
ActivaciónMicroglial
GGGG
GG
GG
Liberación de Glutamato
Na +
Ca 2+
FALLA DE ENERGÍA
ISQUEMIA
Daño al DNA
Despolarización
Inflamación celular
(edema)
Daño Mitocondrial
Apoptosis
Mediadores Inflamatorio
Ca 2+
Inducción de
Radicales Libres
NODegradación de la membrana
Na +
K +
K +
DespolarizaciónPeri -infarto
Infiltración de leucocitos
ActivaciónMicroglial
GGGG
GG
GG
Liberación de Glutamato
Na +
2+
FALLA DE ENERGÍA
ISQUEMIA
Daño al DNA
Figura 1: Mecanismos de daños inducidos por la isquemia
El ión Calcio en los procesos excitotóxicos
La concentración del calcio libre intracelular es diez mil a veinte mil veces menor
que la concentración extracelular, lo cual se mantiene gracias a los mecanismos
regulatorios de las células que son muy estrictos. A nivel extracelular la concentración
del calcio es de aproximadamente 5mmol/L, mientras que la concentración de éste ión
libre a nivel del citosol es de 0.1 a 10 µmol/L. El calcio se almacena en las mitocondrias
y el retículo endoplásmico donde su concentración oscila entre 1 a 20µmol/L. Sin
embargo a pesar de éste gradiente eléctrico transmembrana a favor del calcio, su entrada
a la célula está restringida (Murray R.K y cols. 1998). El calcio a altas concentraciones
dentro de la célula es potencialmente citotóxico. La entrada del calcio a la célula, está
ligada directa o indirectamente a la utilización de energía. En primer lugar está la
bomba de Calcio dependiente de ATP y en segundo lugar está el intercambiador
Ca2+/Na+, éste último utiliza energía almacenada en el gradiente electroquímico de
sodio. El intercambiador puede operar en dirección contraria cuando el gradiente de
Na+ falla, importando más calcio que exportando sodio. La liberación del calcio desde
las mitocondrias requiere energía dependiente o independiente de Na+ y su
almacenamiento en el retículo endoplásmico requiere energía y es mediado por la
bomba consumidora de ATP (Philip A.B. y cols. 2003).
Al declinar el flujo sanguíneo cerebral con la consecuente depleción del suministro
de oxígeno, se altera el metabolismo energético y disminuyen los niveles de ATP, se
pierde el potencial de membrana y tanto las neuronas y las glias se despolarizan. Budd
S.L. (1998) explica que todos estos eventos disparan o activan el influjo o entrada del
calcio a través de los canales de calcio sensibles a voltaje, reforzando aun más la
despolarización de la membrana y provocando la liberación masiva de los aminoácidos
excitatorios desde las terminaciones nerviosas hacia el espacio extracelular,
especialmente el glutamato; y como todos los procesos dependiente de energía tal como
la recaptación del glutamato están comprometidos, sus niveles extracelulares se
incrementan, trayendo como consecuencia una prolongada activación de los receptores
de glutamato en la membrana, que lleva a un mayor influjo de calcio. Es decir que la
entrada de calcio a la célula durante la isquemia comienza con la despolarización inicial
de la membrana y promueve la liberación del glutamato que aumenta aún mas su
entrada, estableciendo un círculo vicioso, donde el influjo de calcio a la célula está
sobrerregulado.
El aumento de la concentración de calcio intraneuronal en los procesos de
neuroexitotoxicidad se establecen en tres periodos o fases: la primera fase se presenta en
los primeros minutos, donde se observa un aumento transitorio del calcio, que luego
decae hasta un nivel que es mayor a la concentración inicial. En la segunda fase se
presenta un periodo de latencia o de recuperación, cuya duración puede oscilar entre 30
a 60 minutos, luego se produce un nuevo aumento de la concentración de calcio
intracelular el cual, es irreversible y se acompaña de muerte celular. Tanto el periodo de
latencia como la última fase (irreversible), son independientes del glutamato y se deben
a la pérdida de la homeostasis del ión calcio intraneuronal (Moreno Y. 2004). Esta
tercera fase irreversible del incremento del calcio intracelular, es llamada por algunos
investigadores como “desregulación del calcio retardada” (DCR) (Chipoulos C. y Vera
A. 2006).
El calcio juega un papel fundamental en los procesos de excitotoxicidad isquémica,
por que muchos eventos enzimáticos involucrados en la fosforilación de proteínas son
dependientes de calcio. Una alteración en la actividad de las fosfatasas y las proteínas
kinasas durante la isquemia-reperfusión, provocan cambios en la actividad de los
receptores iónicos de membrana y también afectan la trascripción y transducción de
genes. Estos efectos pueden por lo tanto explicar los efectos a largo plazo de la isquemia
sobre la función e integridad de la membrana, facilitando la peroxidación lipídica por
parte de los radicales libres y el desencadenamiento de la muerte celular (Lipton, S. y
Nicotera, P. 1998).
Otras reacciones mediadas por calcio que son aceleradas durante el proceso
isquémico, son la proteólisis y el ensamblaje y reensamblaje de los microtúbulos. Las
proteínas del citoesqueleto son degradadas al aumentar los niveles de calcio intracelular
(Baudry M. y cols. 1981). El calcio activa varias enzimas que desencadenan reacciones
que producen especies de oxígeno reactivas y nitrosativas.
Todos estos eventos que suceden durante la isquemia son acelerados si se restituye
el flujo es decir, si hay reperfusión. Entre las reacciones enzimáticas que promueven la
formación de radicales libres de oxígeno están la oxidación del ácido araquidónico (por
la cicloxigenasa y la lipoxigenasa) la oxidación de la xantina e hipoxantina (vía xantina
oxidasa) y estos llevan a la formación de NO. (por la óxido nítrico sintasa). Sin embargo
la mayor parte de las especies de oxígeno reactivas que se producen durante la isquemia
son a través de la cadena respiratoria mitocondrial, tomando en cuenta que la
mitocondria contiene superóxido dismutasa con la resultante formación de O2. y H2O2 ,
de allí la importancia de la mitocondria en los procesos fisiopatológicos del daño
isquémico (Philip A.B. y cols. 2003).
La mitocondria contribuye a la homeostasis del calcio intracelular a través de su
captación y liberación por parte del intercambiador uniporte de Na+/Ca2+, los poros de
permeabilidad transitoria (PTP. tanto los de alta y baja conductancia) y otras vías menos
caracterizadas tal como la vía independiente de Na+ para el eflujo de Ca2+ y un antiporte
H+/Ca2+.
El aumento del calcio intracelular, aumenta el influjo del mismo a la mitocondria,
esto produce una sobrecarga de calcio intramitocondrial, generando la producción de
especies de oxígeno reactivas (ROS). Schild L. y Reiser G. (2005) reportan que la
generación de ROS y la permeabilidad mitocondrial se activaron ante la deprivación
transitoria de oxígeno y la elevación de calcio citosólico en mitocondrias cerebrales
aisladas sometidas a isquemia temporal. Por otro lado Chipoulos C. y Vera A. (2006)
sostienen que el secuestro del calcio por parte de la mitocondria es un prerrequisito
esencial para la producción de ROS, debido a que la sobrecarga del calcio a la
mitocondria activa la formación de poros de permeabilidad transitoria (PPT); los poros
de permeabilidad transitoria son canales con una gran conductancia, formado por
proteínas que residen en la membrana interna y externa mitocondrial y son activadas por
la sobrecarga de calcio mitocondrial.
También se asocia a ROS con la formación de los PPT, con una segunda fase de
despolarización irreversible de la membrana, por un aumento tardío de la concentración
de calcio intracelular (DCR), y la muerte celular. Durante la isquemia, además de
producirse un influjo de calcio masivo por parte de la sobreestimulación del glutamato
sobre los receptores de NMDA. Smith M.A.y cols. (2003) han reportado un mecanismo
alternativo que involucra un incremento de la conductancia intracelular del calcio y un
aumento retardado de la concentración del calcio intracelular (DCR), relacionado con
un proceso de despolarización irreversible en la segunda fase que resulta de una
sobrecarga de calcio, el cual actúa independientemente de los cambios en la transmisión
sináptica y liberación del neurotransmisor excitatorio, pero es dependiente de las
presencia de calcio extracelular. Este evento se atribuye a la apertura prolongada de un
canal de cationes no selectivo, el cual es activado por el peróxido de hidrógeno,
produciendo la muerte de neuronas estriatales de rata. Este canal es permeable a los
iones de sodio, potasio y calcio. Herson y cols. (1997) reportan que este canal se
caracteriza por tener un perfil biofísico único con una gran conductancia para los
cationes monovalentes y una permeabilidad a los cationes divalentes con una cinética
extremadamente lenta, que demanda la presencia de β-NAD+ en el citoplasma para
activarse. Sin embargo Smith M.A. y cols. (2003) afirman, que la conductancia de éste
canal en las neuronas de la espina estriatal, muestra una conductancia similar para los
tres iones (Na+, K+ y Ca2+).
Ca2+
Ca2+
CANAL DE Ca2+
DEPENDIENTE DE
VOLTAJE
BOMBA DE Ca2+
Ca2+
Ca2+
ATP
AT
P
Na+
Na+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
R.NMDA
INTERCAMBIADOR DE Na+- Ca2+
PROT. DE UNIÓN AL Ca2+
[Ca2+]i 0.1-10µmol/l
10-20µmol/l
[Ca2+]e5mmol/l
PiCa2+-Pi
∆Ψ=180
Ca2+
Ca2+
CANAL DE Ca2+
DEPENDIENTE DE
VOLTAJE
BOMBA DE Ca2+
Ca2+
Ca2+
ATP
AT
P
Na+
Na+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
R.NMDA
INTERCAMBIADOR DE Na+- Ca2+
PROT. DE UNIÓN AL Ca2+
[Ca2+]i 0.1-10µmol/l
10-20µmol/l
[Ca2+]e5mmol/l
PiCa2+-Pi
∆Ψ=180
Figura 2: Homeostasis del Ion Calcio
Na
Ca
Ca 2+
Ca 2+ - Pi
Na+
Ca2
+
Ca2+
Ca2
+
PiCa2+ - Pi
∆Ψ =180
Ca2+ROS
CITOCROMO “C”FACTOR APAF-1
CANAL DE Ca2+
INTERCAMBIADOR DE Ca2+
Na
Ca
Ca 2+
Ca 2+ - Pi
Na+
Ca2
+
Ca2+
Ca2
+
PiCa2+ - Pi
∆Ψ =180
Ca2+ROS
CITOCROMO “C”FACTOR APAF-1
CANAL DE Ca2+
INTERCAMBIADOR DE Ca2+
Figura 3: Intervención de la Mitocondria en los procesos excitotóxicos inducidos por la isquemia. Activación de la permeabilidad mitocondrial (Formación de poros de permeabilidad transitoria) ante la falta de O2 y aumento del Ca2+ intracelular.
Las neuronas del SNC sometidas a isquemia-reperfusión, demuestran una estrecha
relación entre la muerte celular mediada por Ca2+ y la producción de radicales libres.
Formación de Radicales libres en la isquemia reperfusión y su rol en los procesos
excitotóxicos
Los radicales libres son átomos o moléculas que tienen en su orbital mas externo
uno o mas electrones desapareados, razón por la cual, son altamente reactivos capaces
de extraer un electrón de moléculas vecinas, cambiando así las propiedades
fisicoquímicas de éstas. En condiciones normales en las células, se producen pequeñas
cantidades de radicales libres a nivel de las mitocondrias como producto del
metabolismo del oxígeno molecular, donde éste sufre un proceso de reducción hasta
agua, durante el transcurso de la fosforilación oxidativa, lo cual lleva a la producción de
especies de oxígeno reactivas o radicales libres derivados del oxígeno molecular (ROS),
siendo éstos, los radicales de anión superóxido (O2·-), moléculas de peróxido de
hidrógeno(H2O2), y radicales hidroxilos (OH·), éste último es un agente oxidante muy
reactivo que tiene la particularidad de ser muy liposoluble, y provocar daños
irreversibles a las membranas celulares (Gutteridge J. y Halliwell B.1990). Los sistemas
antioxidantes de la células como los barredores de radicales libres tal como; el tocoferol
(Vitamina E), la Vitamina C y las enzimas que metabolizan los radicales libres
(Superóxido Dismutasa, Catalasa) y Glutatión mantienen el balance fisiológico u
homeostasis REDOX. La falla de estos antioxidantes, o la producción excesiva de
oxidantes por encima de la capacidad antioxidante de la célula, produce estrés oxidativo
que trae como consecuencia la destrucción y muerte celular.
Numerosos estudios reportan la producción de radicales libres y estrés oxidativo
durante la isquemia, sin embargo, mientras que durante la isquemia se producen
pequeñas cantidades de radicales libres, una gran producción de intermediarios de ROS
se produce durante la reperfusión. Existen diversos factores que favorecen la producción
de radicales libres durante la isquemia reperfusión cerebral:
(a) La Cantidad de O2 disponible que pasa a través de la cadena respiratoria
mitocondrial es insuficiente durante la isquemia: La ubiquinona molécula
transportadora de electrones (Q9, Q10) es el sitio donde mayormente se escapan
radicales libres desde la mitocondria, vía ciclo de la ubiquinona, ésta sufre una
reducción de dos electrones, primero a semiquinona, luego a un diol en el Complejo I
(NADH deshidrogenasa, NADH-ubiquinona oxidoreductasa) o Complejo II (Succinato
deshidrogenasa), posteriormente entrega los dos electrones al centro hierro-sulfuro
(ferrosulfoproteína) del Complejo III. Ante la disminución del Oxígeno disponible
durante la isquemia, se inhibe o se paraliza el proceso de fosforilación oxidativa,
alterando la transferencia de electrones. Al producirse la reperfusión, aumenta la entrada
de oxígeno a la mitocondria, que interactúa con la ubiquinona generando una gran
cantidad de anión superóxido, el estrés oxidativo resultante a su vez, agrava la
inhibición de la cadena respiratoria aumentando aún mas la producción de radicales
libres, estableciéndose así un circulo vicioso (Siegel G. J. 2006).
(b) El aumento de la concentración de Ca2+ y Na+ intracelular, como consecuencia
de la falla de energía y la neurotoxicidad del glutamato, altera las propiedades físicas de
los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, induciendo la sobreproducción
de radicales libres (Chipoulos C. y Vera A. 2006).
(c) La depleción de ATP durante la isquemia y la hipoxantina derivada de su
degradación, durante la reperfusión genera anión superóxido por acción de la xantina
oxidasa, que transfiere electrones directamente al oxígeno (Facchinetti F. y cols.1998).
O`Regon M.H. y cols. (1994) reportan que los inhibidores de la Xantina Oxidasa
suprimen la generación de radicales libres detectado por resonancia del espín del
electrón durante la isquemia cerebral en ratas.
(d) Durante la isquemia cae la degradación oxidativa de los ácidos grasos libres
aumentando su concentración, los cuales, junto con el calcio citosólico elevado, activan
a la fosfolipasa A2, que aumenta la liberación del ácido araquidónico desde los
fosfolípidos de la membrana. El ácido araquidónico es metabolizado por la
lipoxigenasa, la cicloxigenasa y citocromo oxigenasa P-450, para formar
prostaglandinas, leucotrienos y eucosanoides respectivamente. Estas reacciones
involucran la producción de radicales libres (Facchinetti F. y cols. 1998).
(e) La Neurotoxicidad del glutamato, el aumento del calcio citosólico que ocurre
durante la isquemia, activan la isoforma de la sintasa de óxido nítrico dependiente de
calcio (NOS) generando la producción de óxido nítrico (NO·), el cual al reaccionar con
el anión superóxido da lugar a la formación del radical peroxinitrito (ONOO-) que es un
potente oxidante capaz de producir daños a lípidos, proteínas y DNA. Durante la
primera fase de la isquemia cerebral la acción vasodilatadora del NO· parece beneficiar
a los tejidos que rodean a la zona central de la isquemia, sin embargo la producción
sostenida de éste radical puede participar en el daño neuronal que ocurre en la última
fase de la isquemia cerebral (Facchinetti F. y cols. 1998).
(f) La disminución de la PO2 durante la isquemia y la caída de los niveles de ATP,
promueve la glicólisis anaeróbica en la célula, produciendo una acidosis. Phillip A.B y
cols. (2003) proponen que la acidosis aumenta la producción de radicales libres y
activan el daño al DNA.
(g) Los radicales libres también se generan durante la isquemia por la liberación de
hierro desde los almacenes de las neuronas isquémicas. Como el liquido cefalorraquídeo
tiene baja concentración de proteínas que se unan al hierro, gran cantidad del hierro
liberado reacciona con el peróxido de hidrógeno (H2O2) a través de la reacción de
Fenton o con el O·2 y el H2O2 a través de la reacción de Haber-Weiss, produciendo gran
cantidad de radical Hidroxilo (OH·), el cual se considera como el oxidante mas potente
de los sistemas biológicos por ser altamente reactivo (Phillip A.B y cols. 2003). El OH·
producto de estas reacciones, es el principal responsable de la peroxidación lipídica
inducida por hierro.
El cerebro presenta diversas condiciones que lo hacen muy vulnerable a la acción
dañina de los radicales libres, entre las que se pueden mencionar: a) elevado consumo
de oxígeno y una alta actividad metabólica oxidativa, b) posee gran cantidad de ácidos
grasos polinsaturados que son fácilmente oxidados por ser los sustratos fundamentales
para la peroxidación lipídica, (Facchinetti F y cols. 1998), c) tiene baja concentración de
enzimas antioxidantes al compararlo con otros órganos (Dringer R. y cols. 2000), d)
posee un alto contenido de hierro y cobre en ciertas áreas del SNC que al reaccionar con
ROS llevan a la formación de OH· (Aust S.D. y cols. 1985). Además el líquido
cefalorraquídeo presenta muy pocas proteínas que unan al hierro como la ferritina, en
orden a mantener el hierro en una forma menos reactiva (Auroma y Halliwell 1987).
Todas estas condiciones llevan a afirmar el rol fundamental que juegan los radicales
libres en los procesos de excitotoxicidad inducida por la isquemia –reperfusión cerebral,
de allí su importancia.
Se ha demostrado en diversos estudios que entre los blancos de los radicales libres
están: los lípidos los cuales sufren un proceso de oxidación llamado peroxidación
lipídica, las proteínas que son oxidadas por los radicales libres y por los productos de la
peroxidación lipídica y el DNA que sufre un proceso de fragmentación por parte de los
radicales libres. Todos estos eventos llevan a daños en las membranas celulares, daños
en las enzimas y proteínas estructurales e incluso muerte celular.
La peroxidación lipídica de las membranas iniciada por los radicales libres, más
específicamente por el radical hidroxilo (OH·), se produce por abstracción de un átomo
de hidrógeno de un lado de la cadena de un ácido graso polinsaturado, quedando un
radical carbono centrado que puede reaccionar con el anión superóxido (O2·) y producir
radicales peróxilos que a su vez, abstraen un átomo de hidrógeno de otro ácido graso
polinsaturado adyacente originando hidroperóxilos lipídicos. Esta reacción en cadena
produce muchos hidroperóxilos lipídicos, que compromete seriamente la integridad y
fluidez de las membranas y por último, la pérdida de iones a través de las mismas. Para
que se inicie la peroxidación lipídica es necesaria la presencia del hierro en forma
reducida (Fe2+) (Gutteridge J. y Halliwell B. 1990).
Los productos finales de la peroxidación lipídica son aldehídos, entre ellos el
Malonaldehido o MDA, de allí que uno de los métodos más utilizado hoy en día para
detectar peroxidación Lipídica es la cuantificación de Malonaldehido o MDA por
diversos métodos bioquímicos (Gutteridge J. y Halliwell B. 1990).
A nivel de las proteínas, los radicales libres y los productos de la peroxidación
lipídica, pueden producir la formación de enlaces cruzados, denaturación de las
proteínas y formación de grupos carbonilos (Sieguel G.J. 2006). La cuantificación de
grupos carbonilos (o Proteínas Carboniladas) se utiliza para diagnosticar la intensidad
del estrés oxidativo y el daño ocasionado a proteínas.
Los radicales libres al oxidar las proteínas, lo pueden hacer directamente sobre los
aminoácidos unidos o libres, causando la inactivación de enzimas, proteínas
estructurales y receptores (Facchinetti F. y cols. 1998). Oliver C.N. y cols. (1990)
reportan un incremento de la oxidación de las proteínas durante la fase de reperfusión en
cerebros sometidos a isquemia reperfusión.
Además de producir daño a nivel de las proteínas y lípidos, los radicales libres
producen graves daños al DNA. El ataque de los radicales libres al DNA produce la
ruptura de la cadena única o la doble cadena de DNA y la modificación de sus bases.
Una primera consecuencia del daño al DNA es la activación de varios procesos de
reparación incluyendo a la Poly (ADP-Ribosa) Polimerasa (PARP-1) (Facchinetti F. y
cols.1998), la cual forma parte importante en la cascada que lleva a la muerte celular, ya
sea por necrosis o por apoptósis.
Muerte Celular en la Isquemia Cerebral: Necrosis - Apoptósis
Un gran número de investigaciones hasta ahora realizadas afirman que durante la
isquemia se producen dos tipos de muerte celular: necrosis y apoptósis, sin embargo, la
decisión o el destino de las células a morir por uno u otro tipo de muerte, va a depender
entre otras cosas de los siguientes aspectos descritos por Moreno Yánes. (2004):
(a) Extensión del daño isquémico o intensidad y naturaleza del estímulo
excitotóxico. Es decir, que ante un estímulo excitotóxico pequeño, las neuronas están
predispuestas a morir por apoptósis (por ejemplo en la isquemia moderada transitoria);
mientras que al estar expuestas ante un estímulo excitotóxico mayor, morirán por
necrosis.
(b) La alteración de los factores de supervivencia neuronal pueden determinar el tipo
de muerte neuronal ya sea por necrosis o apoptósis. Tal como se observa en los tejidos
vecinos mas cercanos que rodean a la zona isquémica, donde los factores de
supervivencia son alterados y disminuidos, produciendo en esta zona una muerte tardía
por apoptósis, mientras que en la zona central de la isquemia, la muerte se da por
necrosis.
(c) El tipo de neurona y su grado de madurez. Existen neuronas más susceptibles o
más vulnerables que otras a morir por necrosis ante la sobreactivación de los receptores
de NMDA, sobre todo las más maduras exhiben mayor susceptibilidad.
(d) La concentración de calcio intraneuronal es el factor condicionante quizás mas
importante, donde una alta concentración de calcio intraneuronal que acompaña a
grandes daños isquémicos, produce muerte por necrosis, mientras que pequeñas
concentraciones de calcio intraneuronal (siempre por encima de los niveles normales y
potencialmente citotóxicos) y pequeños daños isquémicos, promueve la muerte por
apoptósis.
Por otro lado y en el mismo orden de ideas, Ferrer I y Planas A. (2003) sostienen,
que al producirse una isquemia cerebral focal, se van a distinguir dos zonas claramente
identificadas: una zona central del infarto donde se produce muerte por necrosis, la cual
se caracteriza por el fracaso fulminante de la energía celular e inflamación y ruptura de
las organelas intracelulares, siendo la muerte por necrosis un tipo de muerte celular
pasiva por falla de energía (privación de oxígeno y depleción de ATP y NAD). Esta
zona central es la zona que recibe el mayor impacto del daño isquémico, es el sitio
donde el estímulo excitotóxico es mayor, lo que explica como ya se ha dicho, el
predominio de la muerte por necrosis. Además de la zona central, se identifica una zona
circundante a la zona central llamada penumbra, donde se produce muerte celular por
apoptósis, que es considerada un tipo de muerte celular activa por que requiere energía
para producirse. La apoptósis en ésta zona, se produce mas tarde como consecuencia de
la hipoperfusión que es insuficiente para mantener la actividad eléctrica de las neuronas,
pero que es capaz de preservar los canales iónicos.
Ante tal situación se podría plantear que probablemente si se restituye la perfusión,
se recuperaría y se salvaría el tejido de la penumbra, no obstante las neuronas de ésta
zona “recuperada”, corren el riesgo de sufrir daños a largo plazo, por la muerte neuronal
retardada o tardía (Apoptósis), por que da tiempo de activar estas vías de señalización
que destinan a las células a morir. Para sustentar esta afirmación, Phan T. y cols. (2002)
reportan que las neuronas que han sufrido una isquemia breve (no severa), en un plazo
insuficiente para progresar a necrosis, pueden presentar ruptura de DNA y expresar
inmediatamente los primeros genes para la muerte celular programada, dado que el
metabolismo residual puede permitir la producción de proteínas que llevan a la
ejecución de éstas vías. Por lo tanto, mejorar la perfusión a estos tejidos por la
aplicación de agentes tombolíticos, puede prevenir la muerte celular por necrosis, pero
no pueden prevenir la apoptósis a las neuronas que han sufrido isquemia transitoria. De
allí la importancia de buscar nuevas estrategias terapéuticas que limiten la necrosis en la
zona central isquémica y además eviten o bloqueen las vías de señalización hacia la
apoptósis en la penumbra.
Apoptósis
Un tipo distinto de muerte celular por necrosis fue descrita por primera vez en 1842
por Carl Vogt, luego en 1972 John Kerr es el primero en dar el nombre de Apoptósis a
este fenómeno de muerte celular. La palabra Apoptósis deriva del griego antiguo y
significa “caída de los pétalos de las flores” o “desprendimiento de las hojas de los
árboles” (Lawen, 2003). La Apoptósis es un mecanismo de autodestrucción celular
llamada también muerte celular programada que se diferencia de la muerte celular
por necrosis tanto en su naturaleza como en su significado biológico. La apoptósis se
caracteriza por presentar cambios morfológicos a nivel celular tales como encogimiento
de la célula, agregación de la cromatina con fragmentación del DNA y picnosis nuclear
in vivo.
La Apoptósis es un proceso activo de autodestrucción celular que se caracteriza por
estar dirigida genéticamente, es un fenómeno que tiene una gran importancia en el
mantenimiento de la homeostasis dado que se encarga de eliminar las células
“indeseables”, dañadas o potencialmente dañinas para los tejidos (Griffiths A y cols.
2002).
Durante el desarrollo del cerebro un gran número de células inmaduras son
eliminadas mediante el mecanismo de Apoptósis, quedando sólo las neuronas maduras.
Las neuronas al igual que todas las células requieren de sustentos tróficos o nutrientes
para sobrevivir. Hamburger y Levi-Montalcini en 1979(citado por Yuan y Yankner,
2000), propusieron que la sobrevida de las neuronas desarrolladas, estaba directamente
relacionada a sus blancos de inervación, de esta manera surge la hipótesis de las
neurotrofinas, que sugiere la existencia de una competencia por parte de las neuronas
inmaduras por los factores tróficos derivados de sus tejidos blancos, los cuales son
limitados en abastecimiento, y solo aquellas neuronas que logran establecer una
conexión sináptica correcta, obtendrían el soporte nutritivo trófico y así permitir su
sobrevida.
Hasta hace poco se asumió que las neuronas simplemente morían por inanición
pasiva al estar expuestas a la deficiencia de factores tróficos, en 1988 Jhonson y
colaboradores (citado por Yuan y Yankner, 2000), demostraron que ante la inhibición
de RNA y síntesis de proteínas, se bloqueaba la muerte celular inducida por la
deprivación del factor de crecimiento nervioso (NGF) en neuronas simpáticas
cultivadas. Esta fue la primera evidencia de que las neuronas podrían promover su
propia muerte (Yuan y Yankner, 2000).
Hervitz y colaboradores en la década de los noventa estudiaron los genes que
controlan la muerte celular programada sobre la lombriz intestinal C. elegans e
identificaron un gran número de genes denominados Ceds ; tres de los cuales
constituyen el control, el paso clave hacia la muerte celular neuronal; estos son el Ced-
3, Ced-4 y Ced-9. Posteriormente en 1994 Hengartner y Horvitz identificaron algunos
de los genes mamíferos equivalentes a los genes Ced. El primero en ser identificado es
el homólogo del gen Ced-9 el Bcl-2. La proteína codificada por éste gen está asociada a
membranas y es un potente supresor de la muerte celular. Otros genes homólogos de
Ced identificados son las llamadas Caspasas entre las cuales una de las primeras en ser
identificadas es la Caspasa 1 que comparte una homología extensiva con el Ced-3 y es
un gen promotor de muerte celular crítica. Después de estas innovaciones, se han
descubierto más de 14 tipos de Caspasas las cuales de acuerdo a su función en la
Apoptósis han sido clasificadas en tres grupos: Grupo I: Caspasas 1, 4, 5, 11, 12, 13 y
14 que intervienen principalmente en procesos citoquímicos; Grupo II: Caspasas 3, 6 y
7 llamadas caspasas efectoras; y el Grupo III: Caspasas 2, 8, 9 y 10 llamadas caspasas
iniciadoras de muerte celular (citados por Graham y Chen, 2000).
El descubrimiento de estos genes programadores de la muerte celular abrió
ampliamente un sinfín de oportunidades para comprender los mecanismos de muerte
celular neuronal a nivel molecular. Esto supone que la muerte neuronal en los
vertebrados inducidos por la depleción de factores tróficos, requiere de la intervención
de las Caspasas (Yuan y Yankner, 2000).
Las Caspasas son sintetizadas como pro- enzimas que se activan al sufrir la
proteólisis por otras caspasas en la cascada de señalización. Las caspasas han sido
agrupadas en diferentes grupos; las caspasas iniciadoras presentan un prodominio
largo, de mas de 90 aminoácidos, que contiene los dominios DED (Caspasa 8 y
Caspasa10) o dominio reclutado (CARD) /Caspasa 2 y Caspasa 9; Ced-2) , las Caspasas
efectoras contienen cortos pro- dominios. Durante la activación los predominios sufren
clivaje y se separan de las caspasas activas. El sitio activo está formado por la interfase
de de 2 subunidades por 1 arginina, 1histidina, 1 cisteina de la subunidad larga, y 1
arginina de la subunidad corta. La caspasa 3 es una caspasa efectora que cuando está
activada es capaz de segmentar una gran cantidad de sustratos celulares activándolos,
incluyendo al ICAD (inhibidor de DNAsa activada por caspasa), la Poly (ADP-Ribosa)
Polimerasa (PARP-1), entre otras (Graham y Chen, 2000).
Otras proteínas involucradas en la aspoptósis son las llamadas Bcl-2, éstas se
encuentran agrupadas dentro de una familia de proteínas Bcl-2 en la cual se van a
distinguir tres grupos: Las proteínas antiapoptóticas, donde la Bcl-2 y la Bcl-xl son los
dos miembros antiapoptóticos mas importantes, y las proteínas proapoptóticas entre las
que se encuentran el Bax y Bak, además están la familia BH-3 que son todas
proapoptóticas (Bad, Bik, Bid, Bin) (Lawen, 2003).
La apoptósis puede ser desencadenada por factores diversos, sin embargo los
mecanismos moleculares intrínsecos son siempre los mismos. Se han identificado tres
vías generales para activar la apoptósis: la vía intrínseca, la vía extrínseca (ambas
activan a la caspasa-3) y la vía independiente de Caspasa (AIF).
(a) La vía extrínseca es desencadenada desde la membrana plasmática a través de
receptores de membrana, estos receptores de la muerte son el FAS (llamado Apo-1) y el
factor alfa necrótico tumoral (TNF-R). Estos receptores pueden ser activados por
ligandos extracelulares. La activación de los receptores de la superficie celular FAS
(que al unirse al ligando se convierte en FAS-ligando activado), y el factor alfa
necrótico tumoral (TNF-R), van a desencadenar la activación de la caspasa 8, la
caspasa 8 activada a su vez, puede activar la vía intrínseca, al clivar la proteína BID
(familia de las proteínas de Bcl-2 pro-apoptótica), la cual se traslada a la mitocondria
provocando la liberación del Citocromo c, el cual, forma junto con el factor Apaf 1 un
complejo Citocromo c citosólico también llamado Apoptosoma, que activa a la caspasa
9, que a su vez activa a la caspasa 3. La caspasa 3 activada es capaz de clivar muchos
sustratos incluyendo al inhibidor de DNAsa activado por caspasa (ICAD), la
polimerasa poli(ADP-Ribosa) (PARP-1, una enzima reparadora de DNA), actina,
laminina y fodrina, todo lo cual lleva a fragmentación de DNA internucleosomal,
produciendo muerte celular. Las endonucleasas supuestamente son las responsable de la
fragmentación del DNA nucleosomal, esta vía pasa por la mitocondria. La caspasa 8
activada puede también activar directamente la caspasa 3, esta vía es aún desconocida.
Esta vía de señalización para apoptósis activada por receptores de la membrana
plasmática es la llamada vía extrínseca. (Lawen, 2003).
Ferrer y planas (2003) reportan que durante la isquemia, la expresión de éstos
receptores de membrana FAS y FAS-ligando aumenta y la isquemia focal es
ampliamente reducida en ratones que expresan FAS mutado no funcional.
(b) La vía intrínseca involucra desde su inicio la mitocondria. Esta vía es activada
por diversas formas de estrés intracelular y extracelular, incluyendo el oxidativo,
tratamiento con drogas citotóxicas y concentraciones elevadas de calcio intracelular.
Está señal promueve la liberación del citocromo “C” desde la mitocondria hacia el
citosol donde se une al factor activador de proteasas apoptóticas (Apaf-1) formando el
complejo del citocromo C citosólico (Apoptosoma); siguiendo de aquí en adelante con
la cascada ya descrita (Lawen, 2003).
En relación a esta vía intrínseca algunos investigadores afirman, que durante la
isquemia, se produce un aumento sostenido de la permeabilidad de la membrana interna
de la mitocondria, esta es la llamada permeabilidad transitoria mitocondrial (PTM)
causada por la formación de los poros de permeabilidad transitoria (PPT) ya expuesta
anteriormente, estos poros de permeabilidad mitocondrial transitoria (PPTM), son
activados por las elevadas concentraciones de calcio mitocondrial, por los procesos
oxidativos y por las despolarizaciones de la membrana inducida por la isquemia
reperfusión. La PPTM conduce a una despolarización de la membrana mitocondrial, a
un desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, liberación de iones
intramitocondriales e inflamación. Todos estos eventos llevan a la ruptura de la
membrana mitocondrial externa (cuya superficie es menor que la membrana interna),
liberando macromoléculas hacia el citoplasma. Entre las sustancias liberadas hacia el
citoplasma está el citocromo C que tal como se ha señalado, actúa como un activador de
la cascada apoptótica. Las proteínas familias de Bcl-2 están también involucradas en la
liberación de las moléculas asesinas. Sin embargo, ante una fuerte depleción de ATP
debido a la falla de energía, estos eventos podrían obligar a la célula a morir por
necrosis (Philip A.B. y cols. 2003).
Ferrer y Planas (2003) sostienen que la activación de la vía mitocondrial o
intrínseca, seguida de la isquemia focal es activada por la translocación de BAX , que
compite con Bcl-2 y otros miembros de la familia de Bcl-2 en la membrana
mitocondrial, llevando a la liberación del citocromo C al citosol. De hecho Martinou JC
y cols (1994) han demostrado que la sobrexpresión de Bcl-2 reduce el tamaño del
infarto en ratones transgénicos sometidos a isquemia cerebral.
(c) La vía independiente de caspasa involucra una proteína clave llamada factor
independiente de Apoptósis (AIF). Esta proteína contiene en su estructura una secuencia
amino terminal que la limita a estar localizada exclusivamente en la mitocondria en las
células sanas. Ante cualquier estímulo proapoptótico ésta es liberada de la mitocondria
perdiendo la secuencia del dominio de localización mitocondrial, ésta va directamente al
núcleo desencadenando la fragmentación internucleosomal del DNA (Graham y Chen
2000).
Muchos investigadores sugieren que los mecanismos de la Apoptósis cerebral tanto
la fisiológica como la relacionada a diversas patologías, comparten mecanismos
análogos, la diferencia radica en los factores desencadenantes de la misma. Así,
mientras en la apoptósis fisiológica que se produce normalmente durante el desarrollo
embrionario del cerebro la falta de factores neurotróficos juega un papel fundamental,
existen pocas evidencias de que esté implicada en los mecanismos patogénicos
primarios de las enfermedades neurodegenerativas del adulto. Mas bien las alteraciones
genéticas o bioquímicas como resultado de insultos tóxicos podrían desencadenarse
enfermedades neurodegenerativas que optarian por las vías de señalización de la
apoptósis. Sin embargo, un factor que puede promover la apoptósis después del daño
isquémico, es la deprivación del soporte del factor de crecimiento, que puede ser el
resultado del daño neuronal o glial, que son los responsables de proveer este soporte
(Siegel G.J. 2006).
La apoptósis como ya se ha señalado anteriormente, es una consecuencia de la
isquemia reperfusión cerebral, la cual desencadena una serie de eventos catastróficos
que llevan a muerte celular neuronal en las áreas afectadas, tanto por necrosis en la
región central de la isquemia, como por apoptósis en la zona circundante de la isquemia
llamada penumbra. Sin embargo en la isquemia aplicada a modelos de ratas a través de
la oclusión de la arteria cerebral media, según Ferrer y Planas (2003), el daño que se
produce a nivel de la zona afectada, va a depender entre otras cosas del tiempo que dure
la oclusión de la arteria cerebral media y de la extensión de la reperfusión.
dATP
AIF
Caspasa-3
CITOSOL
NÚCLEO
AIF
Fragmentación de alto peso
Molecular
Fragmentación internucleosomal
PROTEÓLISIS
DNA-PKPARP
REPARACIÓN DE DNA
DESTRUCCIÓN CITOSÓLICA
Vía ExtrínsecaVía intrínseca
VíaIndependiente
de Caspasa
dATP
AIF
Caspasa-3
dATP
AIF
Caspasa-3
CITOSOL
NÚCLEO
AIF
Fragmentación de alto peso
Molecular
Fragmentación internucleosomal
PROTEÓLISIS
DNA-PKPARP
REPARACIÓN DE DNA
DESTRUCCIÓN CITOSÓLICA
Vía ExtrínsecaVía intrínseca
VíaIndependiente
de Caspasa
Figura 4: Diagrama Esquemático que ilustra los eventos claves moleculares en la muerte celular programada o Apoptosis en células de mamíferos.
Moo Lee y cols. (2000) y otros investigadores relacionan la apoptósis de la
penumbra con la liberación de Glutamato y otros aminoácidos excitatorios desde las
terminaciones nerviosas afectadas, como una respuesta a la isquemia; trayendo como
consecuencia entre otros, la sobreactivación de los receptores glutamatérgicos
ionotrópicos de calcio (sobretodo los receptores de NMDA), aumentando el influjo de
éste catión a la célula, acrecentando su concentración intracelular, con sobrecarga de las
mitocondrias, generación de radicales libres y activación de varias enzimas incluyendo
fosfolipasas, proteasas y oxido nítrico sintasa (NOS).
Es bien conocido que tanto ROS como los radicales NO·, juegan un rol importante
en la patogénesis de varios desórdenes neurológico tal como la isquemia, trauma y
enfermedades neurodegenerativas. Estos están estrechamente involucrados en el
proceso de inducción de muerte celular por necrosis o apoptósis. Lipton S. A. y cols.
(1998) citan las siguientes investigaciones al respecto: Behl C y Davis JB en 1994
reportaron que las neuronas y otras células morían por acción del péptido amyloideo β
mediante mecanismos mediados por el peróxido de hidrógeno. Troy y Shelanski en
1994 y 1996 demostraron que la supresión de la actividad de la Superóxido Dismutasa
cobre/zinc (SOD-Cu/Zn) indujo a apoptósis en células PC12 cultivadas. Buttke TM y
Sandstrom P en 1994 reportaron que los antioxidantes podían proteger las células de
morir por apoptósis, de tal manera que la actividad de los antioxidantes enzimáticos
tales como la superóxido Dismutasa, la Catalasa y la Glutatión Peroxidasas y los no
enzimáticos como la Vitamina E (Tocoferol), la vitamina C (ácido ascórbico) entre
otros, podrían jugar un rol muy importante como agentes antiapoptóticos.
De acuerdo a la intensidad del estrés oxidativo la muerte celular puede producirse
por apoptósis o por necrosis, así lo reportan Dypbukt J.M. y cols. (1994), quienes
observaron, que bajas concentraciones de pro-oxidantes, inducía a muerte celular por
apoptosis en células β pancreáticas RINm5F, mientras que las altas concentraciones
promovían la necrosis.
En modelos de roedores sometidos a isquemia cerebral global y transitoria focal, se
ha reportado que la isquemia-reperfusión, provee mayor daño a los tejidos isquémicos
que la isquemia cerebral permanente (Ferrer y Planas 2003). La reperfusión después de
la isquemia causa una sobreproducción de ROS en las mitocondrias que depleta los
antioxidantes endógenos, produciendo un estrés oxidativo. Recientes estudios reportan
la evidencia que la vías de señalización mediadas por ROS, pueden causar daño y
muerte celular en la isquemia reperfusión cerebral. La glutatión peroxidasa (una enzima
antioxidante) es muy importante para detoxificar el peróxido de hidrógeno después de la
isquemia reperfusión cerebral, como se ha observado en ratones transgénicos después de
la isquemia focal (Saito A. y cols. 2005).
Los radicales libres están también involucrados en un tipo de muerte celular distinto
a la apoptósis, pero semejante a necrosis, mediada por calpaina. Así lo demuestran las
investigaciones realizadas por Sée Violaine y Philippe Loeffer. (2001). La calpaina es
activada en varias condiciones de necrosis y apoptósis, mientras que las caspasas solo
son activadas en la apoptósis.
Estos mismos autores reportaron que las especies de oxígeno reactivas (ROS), en
este caso el peróxido de hidrógeno, inducian un proceso activo de muerte neuronal
distinto a la apoptósis pero semejante a la muerte por necrosis. En estos experimentos el
estrés oxidativo activó un proceso de muerte celular activa independiente de caspasa,
pero dependiente de calpaina. Todo lo anteriormente dicho hace pensar que coexiste
otro tipo de muerte neuronal activo distinto de apoptósis pero semejante a la necrosis,
que podría ser activada en los procesos excitotóxicos isquémicos, donde están
involucrados el calcio y los radicales libres.
Ácido Valproico
En base a lo anteriormente expuesto, se puede inferir que el daño ocasionado a los
tejidos afectados por la isquemia-reperfusión, obedece a la interacción de procesos
fisiopatológicos complejos tales como la despolarización peri-infarto, inflamación, la
exitotoxicidad, necrosis y apoptosis. En vista que los cinco procesos involucrados
podrían ser blancos terapéuticos con miras a disminuir los daños provocados por la
isquemia, las investigaciones se han orientado a estudiar el posible efecto
neuroprotector de algunas drogas incluyendo el litio y el ácido Valproico (VPA). La
presente investigación se enfoca en el estudio del efecto neuroprotector del VPA en la
isquemia reperfusión y estrés oxidativo agudo.
Estructura Química: El ácido Valproico (VPA) es un ácido carboxílico de cadena
ramificada simple (ácido graso de cadena ramificada corta) llamado también ácido n-
dipropil-acético, cuya estructura química se esquematiza a continuación:
Uso Farmacológico: El VPA, es la droga antiepiléptica más comúnmente usada hoy en
CH3CH2CH2
CH3CH2CH2
CHCOOH
Figura 5: estructura química del ácido Valproico
día en el tratamiento de la epilepsia generalizada y en la epilepsia parcial, sin embargo
su mecanismo de acción aun no está del todo claro. La acción antiepiléptica del ácido
Valproico posiblemente se debe a una combinación de varios efectos en el SNC debido
a su amplio espectro de acción contra diferentes tipos de ataques y estatus epilépticos
(Goodman Gilman A. 2003).
El VPA aumenta selectivamente la inhibición GABA-érgica en la corteza cerebral,
disminuyendo las convulsiones (el GABA: ácido gagmaminobutírico es el principal
neurotransmisor inhibitorio del SNC). Se han encontrado cambios en los niveles de
GABA en corteza cerebral, hipocampo, cuerpo estriado y cerebelo de roedores, después
del tratamiento con VPA. El efecto del VPA sobre los niveles de GABA es muy rápido,
y es probablemente debido a su rápida recaptación en los tejidos y terminales nerviosos,
a través de un transportador de ácidos grasos de cadena mediana y porque, a su vez,
disminuye el catabolismo de GABA. Asimismo disminuye los niveles de Aspartato y
otros aminoácidos excitatorios. Sin embargo los efectos sobre los niveles de Glutamato
se ven poco afectados por el VAP. Esta droga inhibe la alta frecuencia de disparos de
los potenciales de acción a nivel neuronal, por que bloquea la entrada de sodio voltaje
dependiente y aumenta la conductancia de los canales de potasio; estas habilidades del
VPA pueden ciertamente contribuir a su eficacia como droga antiepiléptica. El ácido
Valproico también es ampliamente utilizado en los desordenes bipolares,
fundamentalmente la psicosis maniaco depresiva junto con el Litio. El mecanismo de
acción de ambos parece ser diferente, a pesar de tener efectos similares y ser dos drogas
estructuralmente distintas (Johannessen C. 2000).
Efecto neuroprotector del Ácido Valproico: El Litio y el VPA se han estudiado en
forma conjunta y separada, tratando de dilucidar su mecanismo de acción como
neuroprotectores en diversos procesos patológicos. Mora A. y colaboradores (1999)
reportaron que el tratamiento agudo con VPA protegía contra la apoptosis inducida por
baja concentración de K+ en células granulares cerebelosas cultivadas. D`Mello S.R. y
cols. (1994) ya habían demostrado este mismo efecto para el litio, mediante un
mecanismo en el cual está implicada la activación de la tirosin kinasa.
Acción Antiapoptótica del Ácido Valpróico a través de la Expresión Genética:
Diferentes Estudios certifican que tanto el Litio como el VPA regulan la expresión
genética en experimentos in vitro e in vivo bajo distintas condiciones, hecho que podría
explicar en parte su acción antiapoptotica al tomar en cuenta que este tipo de muerte
celular es regulada por la expresión genética. La acción reguladora del VPA y el Litio
sobre la expresión genética, está sustentada por los estudios de Chen y Chuang (a 1999),
quienes demostraron que el VAP inhibía la actividad de la Glicógeno Sintasa Kinasa-3
en células cultivadas de neuroblastoma humano. Previamente a este estudio se había
demostrado que el VAP y el Litio aumentaban la actividad de la unión al DNA del
activador de proteína (AP-1), y se sabe que la fosforilación de C-Jun por la Glicógeno
Sintasa (GSK)- 3 beta inhibe la actividad de unión al DNA de AP-1 (factor de
transcripción). Esto sugiere que tanto el Litio como el VAP regulan la glicógeno sintasa,
aumentando así la actividad de la unión al DNA de AP-1. La Glicógeno sintasa 3-beta
juega un papel muy importante en los eventos de regulación a largo plazo en el SNC,
modula varios procesos del Citoesqueleto y regulando a su vez las sinapsinas y los
neurofilamentos. La Glucógeno sintasa está involucrada en las vías de señalización pro
apoptóticas a través de la proteín Kinasa Beta. En el mismo año, estudios posteriores
realizados por Chen y Chuang (b 1999) reportaron, que el tratamiento a largo plazo,
pero no agudo, con litio disminuyó la expresión de p53 y Bax mientras que aumentó la
expresión de Bcl-2, protegiendo a las células granulares cerebelosas cultivadas, contra
la exitotoxicidad del glutamato. Mostraron además un aumento en los niveles de Bcl-2,
en el tratamiento crónico con litio y VPA.
Efecto Antiapoptótico del Ácido Valproico a través de la sobreexpresión de la Proteína
Antiapoptótica: Bcl-2. La acción del VPA sobre el aumento en la expresión del Bcl-2,
encierra una gran importancia en su rol neuroprotector, al considerar que la misma es
una proteína que protege la célula contra la muerte celular por apoptósis, tal como ya se
ha expuesto. En base a este efecto del VPA sobre la expresión de Bcl-2, es importante
resaltar las siguientes investigaciones: Hockenbery y cols. (1993) demostraron que el
Bcl-2 in vitro actúa por vía antioxidante protegiendo las células de la muerte oxidativa
inducida por menadiona y peróxido de hidrógeno, mientras que la sobrexpresión de Bcl-
2 actuó suprimiendo completamente la peroxidación lipídica. Reforzando tales
evidencias, Tyurina Y. y cols. (1997), en sus investigaciones transfectaron células PC12
de Feocromocitoma de rata con genes de Bcl-2 y las sometieron a estrés oxidativo
demostrando una disminución sorprendente de la tasa de oxidación a nivel de los
fosfolípidos de la membrana de las células PC12 transfectadas con Bcl-2, con respecto a
las no transfectadas, sugiriendo una protección antioxidante análoga a la acción
antioxidante de la Vitamina E. Bogdanov M.y cols. (1999) demostraron que el Bcl-2
disminuyó significativamente la generación de especies de oxígeno reactivas en ratones
con sobrexpresión de Bcl-2 sometidos a la administración de una toxina mitocondrial,
el ácido 3-nitropropionico.
En cuanto a estudios experimentales en la isquemia cerebral, Grahan y Chen (2000)
sostienen que la sobrexpresión genética de Bcl-2 en ratones transgénicos reduce en
forma significativa el daño cerebral inducido por la isquemia. Apoyando ésta afirmación
se puede mencionar a Philip A.B. y cols. (2003) quienes afirman que las drogas que
bloquean las caspasas y aumentan la acción de la Bcl-2, protegen las neuronas contra el
daño isquémico.
Las funciones de las Proteínas pertenecientes a la familia de Bcl-2 (pro-apoptóticas
y antiapoptóticas), son altamente reguladas por modificaciones postranslacional, tal
como el caso de la fosforilación de la Bcl-2; ésta se caracteriza por poseer en su cadena
polipeptídica, posibles sitios de fosforilación de serina, uno de los cuales es la serina 70
ubicada en el “loop domain” (dominio en asa) (Ruvolo y cols. 1998). La serina 24, un
residuo situado en el N-terminal del dominio BH4 del Bcl-2, se encuentra únicamente
en los miembros de la familia de Bcl-2 con función antiapoptotica, con la excepción de
las proteínas pro-apoptóticas Bcl-Xs y Boo que también poseen éste dominio. Los
estudios sobre éste dominio realizados por diferentes investigadores revelan que el BH4
es necesario para la traslocación local de Bcl-2. Además, la pérdida o deleción de éste
dominio suprime la acción antiapoptotica de ésta familia de proteínas, es decir, que su
habilidad antiapoptotica depende de éste dominio (Hallin U y cols. 2005). Confirman
éstas afirmaciones, la reciente descripción de como la fosforilación de Bcl-2 en la
serina-24 o dominio BH4 de su estructura polipeptídica, coincide con la liberación del
citocromo C después de la isquemia hipóxica en el cerebro de ratas neonatales, y
precede además la activación de la caspasa-3 y la muerte celular. Todos estos
descubrimientos refuerzan la importancia del Bcl-2 en la estabilidad de la membrana
mitocondrial, afectada durante la isquemia y el estrés oxidativo.
Efecto del Ácido Valpróico sobre el Estrés Oxidativo y procesos de Isquemia-
reperfusión: Se han reportado algunas evidencias sobre la acción del VPA sobre el
estrés oxidativo. Wang J. F.y cols. (2003) demostraron en estudios in vitro, que el
tratamiento crónico con ácido Valproico inhibe el daño oxidativo a lípidos y proteínas
en cultivos primarios de células cerebrocorticales de ratas, las cuales fueron sometidas
a estrés oxidativo con cloruro férrico (FeCl3), observandose un claro efecto antioxidante
in vitro. Hasta el presente aún no se había estudiado este efecto del VPA in vivo en la
isquemia-reperfusión.
Recientemente se ha reportado que el tratamiento pos- insulto del VPA, protege al
cerebro contra el daño inducido por la isquemia reperfusión en ratas sometidas a
OTACM (Ren M. y cols. 2004), un efecto similar al litio, demostrado por los mismos
investigadores un año antes (Ren M. y cols. 2003). Además reportaron que el VPA
inhibió la activación, inducida por la isquemia, de la Caspasa-3 y aumentó los niveles
de la H3 histona acetilada, por inhibir la histona deacetilasa (HDAC). Igualmente
aumentó los niveles de las proteínas de shock térmico 70(HSP70).
No obstante, a pesar de las evidencias presentadas acerca de la acción del VPA sobre
el daño neuronal, tanto in vitro como in vivo, y más concretamente sobre los daños
inducidos por la isquemia y el estrés oxidativo, inferir los acontecimientos que
ocurrirían in vivo durante un evento de isquemia reperfusión o de estrés oxidativo agudo
no es posible sin un margen de error inaceptable. De hecho hasta ahora no se ha
estudiado el efecto del VPA sobre la acción de los radicales libres en la isquemia
reperfusión y estrés oxidativo in vivo. El objetivo de la presente investigación es por lo
tanto verificar, comprobando detalladamente cada uno de los mecanismos involucrados,
el rol neuroprotectivo del VPA en la isquemia reperfusión y estrés oxidativo agudo.
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales.
Se utilizaron un total de 65 ratas hembras de la raza Sprague-Dawley de un peso
aproximado de 200–300 gramos. Las ratas fueron suministradas por el Instituto
Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Los Teques-Miranda, y por el
Bioterio del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centrooccidental
“Lisandro Alvarado”. Las ratas fueron colocadas en jaulas con comida y agua ad
libitum, a una temperatura de 25º, con periodos alternos de luz y oscuridad de 12 horas.
Materiales y Reactivos
• Tabla de Disección.
• Equipo de Cirugía Menor.
• Jeringa de insulina para la colocación de los anestésicos por vía intraperitoneal
• Jeringa de Hamilton de 5µL para administrar el sulfato ferroso por via
intracraneal.
• Sutura quirúrgica Monofilamento de Nylon 3-0 (ETHILONR).
• Sutura quirúrgica de Seda 2-0.
• Trepanador
• Guillotina
• Tubos de ensayo de baquelita. (Kimax USA)
• Viales plásticos
• Tubos de eppendorf
• Homogenizador de Potter Elvhjem de 15ml (WHEATON USA)
• Centrifuga para tubos de eppendorf (Centrífuga 5415c)
• Centrífuga para tubos de baquelita (ECCO)
• Espectrofotómetro (Spectronic 21D- Milton Roy)
• Baño de Maria (GEMMY INDUSTRIAL CORP)
• Balanza analítica (SARTORIUSR ).
• Homogeneizador Politrón (Arthur H. Thomas CO Scientific Apparatus.
Philadelphia. USA).
• Microprocessor pHmetro (HANNA Innstruments. HI 9321).
• Vortex (Genie 2).
• Plancha de agitación (Corning. Laboratory Stirrer/Hot Plate. Model PC-320).
• Ketamina (KetasetcIII Fort DodgeR)
• Xilacina (Rompúm R , Bayer)
• Ácido Valproico (Sigma).
• Vitamina E (α- Tocoferol , Vivax Pharmaceuticals).
• Diazepam (TalemaR de Biotech).
• Sulfato ferroso (FeSO4) (Merck).
• Sucrosa (Merck), Tris HCl (Sigma).
• Dodecyl Sulfato de sodio (SDS) (Sigma).
• Acido Acético al 20% (Merck).
• Acido Tiobarbitúrico (TBA) (Sigma).
• n-Butanol (Sigma).
• 1,1,3,3-Tetrametoxipropano (TMP) (Sigma).
• 2,4- dinitrofenilhidrazina (Merck).
• Ácido tricloroacético (Sigma).
• Guanidina (Sigma).
• Fosfato de potasio (M&B).
• Etanol (Riedel-de Haën).
• Acetato de etilo (Merck).
• Borohidruro de sodio (NaBH4) (Laboratory reagents BDH Chemicals
Inglaterra).
• CuSO4 (RH).
• Tartarato de Na/K (RH).
• Na2CO3 (Sigma)
• Folin-Ciocalteau ( QEEL. Sao Pablo. Brasil).
• Albúmina sérica bovina (BSA), Santa Cruz.
• Anticuerpo primario Anti- Bcl-2 de rata obtenido en conejo.Santa Cruz.
• Anticuerpo primario Anti- Caspasa -3 de rata activada obtenido en conejo
(Sigma).
• Anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, obtenido en cabra, Chemicon.
• Acrilamida, Promega.
• Aprotinina, Sigma.
• Azul de Bromofenol, USB.
• Bisacrilamida, Sigma.
• Bradford (Solución), BioRad.
• Dimetilformamida, Sigma.
• DTT, Sigma.
• HC-110, Kodak.
• Leupeptina, Sigma.
• Luminol, Sigma.
• Metanol, Merck.
• Película MIN-R, Kodak.
• Peróxido de hidrógeno, IQE.
• Persulfato de Amonio, Promega.
• TEMED, USB.
• Tween 20, Riedel – De Haen
• 4-Bifenilfenol, Merck.
Diseño Experimental
Se trabajó con dos modelos experimentales: un modelo de Isquemia-Reperfusión y
otro para Estrés Oxidativo, organizados de la siguiente manera:
Modelo Isquemia Reperfusión:
Este modelo estuvo conformado por 25 ratas, las cuales fueron divididas en dos
grupos: un grupo experimental (n=13), y un grupo control (n=12). El grupo
experimental recibió ácido Valproico a una dosis de 300mg/Kgp intraperitoneal,
dividida en dos dosis, administradas cada 12 horas. Es importante acotar que para
alcanzar concentraciones séricas relevantes, es necesario utilizar altas dosis de ácido
valproico, por que el metabolismo del mismo en las ratas es muy activo (Hassel B. y
cols. 2001). El grupo control fue tratado con vehículo (Solución fisiológica al 0,9%). El
tratamiento se administró 24 horas antes de ser sometidas a la oclusión transitoria de la
arteria cerebral media derecha (OTACMD), hasta 48 horas después de la OTACMD.
Oclusión Transitoria de la Arteria Cerebral Media.
La oclusión de la arteria cerebral media se realizó sin craneotomía, según el modelo
propuesto de Lonza E. Z. y cols. (1989). Las ratas fueron anestesiadas con Ketamina a
una dosis de 70 mg/Kg de peso y Xylacina a una dosis de 10 mg/Kg de peso por vía
intraperitoneal. Posteriormente se procedió a realizar una incisión en la región cervical
lateral derecha, se disecó el tejido celular subcutáneo, se separaron los músculos
esternocleidomástoideo y digástrico, se identificó la arteria carótida común derecha con
su bifurcación, se aisló la arteria, y luego se procedió a ligar la arteria carótida externa y
la arteria carótida común. Seguidamente se realizó una pequeña incisión en la arteria
carótida común inmediatamente por debajo de la bifurcación, y se introdujo un
monofilamento de nylon 3-0 siliconado a través de la misma, dirigiendo el nylon hacia
la arteria carótida interna, hasta aproximadamente 17mm desde la bifurcación para
ocluir la arteria cerebral media derecha. Cuidadosamente se fijó el nylon a la arteria
carótida común con hilo de sutura de seda y se dejó ocluida durante 45 minutos. Luego
se procedió a retirar el nylon para reperfundir, así como las ligaduras de la arteria
carótida externa y común y se suturó la herida, dejándose la rata en recuperación.
Evaluación Neurológica:
24 horas y 48 horas después de la OACMT se procedió a realizar la evaluación
neurológica. Se emplearon dos parámetros de evaluación neurológica: la propuesta por
García y cols. (1995), modificada, donde además de evaluar la marcha, la simetría en la
extensión de los cuatro miembros delanteros y traseros, el trepamiento y la sensibilidad
corporal del lado contralateral del hemisferio isquémico, se sumó la ptosis palpebral del
lado de la lesión. Esta escala de evaluación ascendente va del 0 al 24, considerando que
a mayor puntaje menor daño neurológico y viceversa (Ver ANEXO B). La otra es la
propuesta por Bederson y cols. (1986), que evalúa la fuerza muscular de la pata
delantera del lado contrario a la lesión, simetría de las patas delanteras y marcha. La
escala de evaluación es descendente y va del 0 al 3 (Ver ANEXO C), en este caso a
mayor puntaje mayor daño neurológico y viceversa. Las ratas que no mostraron ningún
signo de daño neurológico fueron descartadas.
Modelo Estrés Oxidativo
Para éste modelo se asignaron 40 ratas, las cuales fueron divididas en cuatro grupos
(n=10 para cada grupo): tres grupos experimentales y un grupo control. Los tres grupos
experimentales fueron organizados de la siguiente manera: Un primer grupo
experimental a las que se les administró Acido Valproico por vía intraperitoneal (i.p) a
una dosis de 300 mg x Kg de peso repartidas en dos dosis cada 12 horas, un segundo
grupo que recibió tratamiento con Vitamina E a una dosis de 100mg/Kg de peso cada 12
horas (i.p), y un tercer grupo que fue tratado con Diazepam ( a una dosis de 8mg/Kg de
peso cada 12 horas (i.p). Al grupo control se le administró por vía i.p un vehículo
(Solución Fisiológica al 0,9%). El tratamiento para todos los grupos fue administrado
durante 24h.
Aplicación del Agente Oxidante
Después de la última dosis de cada tratamiento, se procedió a anestesiar las ratas con
Ketamina a una dosis de 70mg/Kg de peso y Xylacina a una dosis de 10mg/Kg de peso
por vía intraperitoneal y luego se indujo estrés oxidativo agudo a nivel del hemisferio
derecho cerebral, mediante la administración intracraneal de 2µg de Sulfato Ferroso
(FeSO4). Al hemisferio cerebral izquierdo no se le aplicó el oxidante por lo que sirvió
como control por cada animal. Dos horas después de la administración del sulfato
ferroso intracraneal, fueron sacrificadas y se procedió a disecar el cerebro sobre hielo.
Obtención de la muestra del cerebro.
Las ratas del modelo de isquemia-reperfusión, 48 horas después de la OTACM y de
la última dosis del tratamiento, fueron sacrificadas. Mientras que las ratas del modelo de
estrés oxidativo, fueron sacrificadas 2 horas después de la aplicación del FeSO4
intracraneal. Una vez sacrificadas las ratas, se procedió a abrir el cráneo con un
trepanador, se disecó el cerebro y se extrajo de la bóveda craneal, se separaron el
hemisferio cerebral derecho del izquierdo, y se guardaron por separados en unos viales
plásticos previamente identificados con fecha. Posteriormente se conservaron a -20° C
hasta su uso.
Obtención del homogeneizado del cerebro de las ratas.
Previamente se preparó una solución tampón de sucrosa 250 mM Tris-HCl 100 mM
pH=7,4. Se pesó el hemisferio cerebral (derecho e izquierdo por separado, previamente
descongelado), para calcular la cantidad de tampón necesario para homogeneizarlo. Por
cada 100 mg de tejido se le agregó 1 mL de tampón. Se colocó el tampón y el cerebro
(hemisferio) en un homogeneizador Potter Elvhjem y se homogeneizó 4 veces por 60
segundos con descansos de 5 minutos en cada vez. Los hemisferios derecho e izquierdo
del cerebro de cada una de las ratas se homogenizaron y se procesaron por separado.
Al finalizar el proceso de homogenización, 15µL de la muestra se colocaron en un
tubo de ensayo con 1185 µL de Hidróxido de sodio 0,1M, dejándose en reposos durante
24h a temperatura ambiente para determinar las proteínas totales mediante el método de
Lowry y cols. (1951). El resto del homogenizado se colocó en viales plásticos y fue
almacenado para determinar la peroxidación lipídica y las proteínas carboniladas.
Cuantificación de los niveles radicales libres por el método de Peroxidación
Lipídica.
Se empló el método de Ohkawa y cols. (1997) modificado: reduciendo las
cantidades de reactivos y muestra a la cuarta parte proporcionalmente
Principio del método:
Consiste en medir mediante método colorimétrico, la concentración de
Malonaldehido (MDA) en los homogeneizados de tejidos y en plasma sanguíneo. El
Malonaldehido es un producto secundario generado en la peroxidación lipídica que al
reaccionar con el ácido Tiobarbitúrico produce un pigmento rosado que aumenta de
intensidad al incrementar la concentración de esa sustancia. La formación de éste en el
ensayo se debe a la formación de peróxidos cíclicos y endoperóxidos que sufren un
proceso de fragmentación (Ohkawa y cols. 1997).
Método:
Se tomaron 25 µl de la muestra (hemisferio cerebral derecho y hemisferio cerebral
izquierdo por separado) y se colocaron en un tubo de ensayo. Se les agregó luego, en el
siguiente orden:
• 175µL de H2O destilada
• 50µL de Dodecyl Sulfato de sodio al 0.8% (SDS).
• 375µL de ácido acético al 20%.
• 375µL de ácido tiobarbitúrico (TBA) al 0.8%
Luego se colocaron los tubos en baño de María a 100ºC durante 60 minutos.
Sucesivamente, y previo enfriamiento de los tubos, se agregaron a cada tubo los
siguientes reactivos:
• 250µL de H2O destilada
• 1,25µL de n-Butanol (agitándose fuertemente) para un volumen final de 2,5µL.
• Se centrifugó los tubos a 4000rpm durante 10 minutos.
• Luego se tomó el sobrenadante y se leyó la absorbancia (a 532nm) en el
espectrofotómetro
La curva Patrón se raealizó empleando 1,1,3,3-Tetrametoxipropano (TMP) en vez de
la muestra.
La concentración de MDA se expresó en nmol / mg Proteína. Para esto se procedió
a cuantificar las proteínas totales en la muestra.
Cuantificación de Proteínas totales (Método de Lowry y cols. 1951).
Método:
Al homogenizar cada hemisferio cerebral, se colocaron 15µL de la muestra en un
tubo de ensayo con 1185 µL de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1M, para un volumen
final de 1200 µL dejándose en reposo durante 24h a temperatura ambiente, con el fin de
digerir las proteínas antes de realizar la cuantificación de las proteínas totales.
La curva patrón se realizó empleando albúmina sérica bovina (BSA) como estándar.
Las lecturas en el espectrofotómetro se hicieron a 750 nm. La concentración de
proteínas se expresó en mg/mL.
Cuantificación de Proteínas Carboniladas (Método de Levine R. y cols. 1990):
Principio del Método:
En éste método se cuantifican grupos carbonilos (aldehidos y acetonas) utilizando el
reactivo 2,4 –dinitrofenilhidracina (2,4-DNP), éste derivatiza las proteínas y las
precipita. Posteriormente son diluidas en tampón guanidina HCL y luego se lee en un
espectrofotómetro a 370nm.
Método:
En primer lugar se preparó el blanco tomando una cantidad equivalente a 1mg de
proteínas de una de una de las muestra, se colocó en un tubo de eppendorf y se le
agregó 30µL de Borohidruro de sodio a 200mM (NaBH4), se completó con buffer
sucrosa hasta un volumen final de 300µL. Se dejó reposar por 30 minutos. Los tubos de
las muestras experimentales se les agregaron la cantidad del homogenizado de cerebro
equivalente a 1 mg de proteínas (determinadas previamente por el método de Lowry), y
se les añadió buffer sucrosa hasta completar un volumen final de 300µL.
Luego se procedió a precipitar las proteínas con ácido tricloroacético al 20% para
una concentración final de 10% de éste. Se centrifugaron las muestras a 12000rpm
durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. A continuación se describen en orden
el resto de los procedimientos:
- Se adicionó a cada tubo 500µL de 2,4-DNP y se dejó incubar a temperatura ambiente
durante 1 hora en oscuridad, agitando los tubos cada 10-15 minutos.
- Al finalizar el tiempo de incubación, se precipitaron nuevamente las proteínas con
500µL de ácido tricloroacético al 20%, se agitó fuertemente y se sometió a
centrifugación a 12000rpm por 5 minutos.
- Se descartó el sobrenadante y se lavaron los precipitados con 1ml de una mezcla de
etanol-acetato de etilo (1:1), se agitó fuertemente y se dejó reposar por 10 minutos, para
luego centrifugar y descartar el sobrenadante, este procedimiento se repitió por tres
veces.
- Al precipitado resultante del último lavado, se le agregó 600µL de Guanidina 6M en
fosfato de potasio a 20mM.
- Se procedió a leer en el espectrofotómetro a 370nm.
Los cálculos se realizaron mediante la siguiente fórmula:
Moles de grupos carbonilos =
∆A370: es la diferencia entre la absorbancia de la muestra y la absorbancia del blanco.
ε: es el coeficiente de extinción molar (22000 M-1 cm-1).
ε ∆A370
El hemisferio cerebral derecho e izquierdo en todos los casos se procesaron por
separado. El hemisferio cerebral izquierdo sirvió como control en cada rata, dado que
éste hemisferio no fue sometido a isquemia, ni se le aplicó el oxidante (FeSO4).
Los valores obtenidos de proteína carboniladas o grupos carbonilos se expresan en
Moles de grupos carbonilos por miligramo de proteínas totales.
Determinación de Bcl-2 y Caspasa 3 activada
Para determinar la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y la proteína
proapoptótica Caspasa-3 Activada en las muestras de cerebro de las ratas sometidas a
isquemia-repefusión, se procedió a realizar la Electroforesis y Western Blot. Para ello se
prepararon las muestras tal como se describe mas adelante y se cuantificó la
concentración de proteínas de la muestra a través del método de Bradford. Este método
es ideal para determinar proteínas a ser leídas en un medio reductor, para lo cual el
método de Lowry es una limitante, ya que en éste último se utilizan sustancias
reductoras de proteínas como el sulfato cúprico (CuSO4) que interfieren con los
reactivos (detergentes: SDS, Triton X-100 entre otros) que son utilizados en la
electroforesis y Western Blot.
Preparación de las Muestras
Se prepararon las muestras de los hemisferios cerebrales derecho e izquierdo por
separado de las ratas Sprague-Dawley pertenecientes al Modelo Isquemia-Reperfusión.
Las muestras se prepararon en Buffer de homogenización (Buffer de Homogenización:
Tris base 20 mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 0,6 mM, EGTA 0,5 mM, DTT 1 mM, PMSF 1
mM, aprotinina 5 µg/mL, leupeptina 2 µg/mL y Triton X-100 al 0,05 %; pH 7,4) y se
procedió a la determinación de proteínas según el método de Bradford (Bradford M.M.,
1976).
Determinación de Proteínas por el Método de Bradford (1976).
Principio del Método.
El método se basa en el cambio de la absorción máxima de la solución ácida del
colorante Coomasie® Brillant Blue-250 de 465 nm a 595 nm de longitud de ondas (de
color rojo vino a azul), cuando éste se une a las proteínas. El colorante Coomasie se une
principalmente a residuos de aminoácidos básicos y aminoácidos aromáticos. La curva
patrón se hizo empleando BSA como estándar.
A los tubos identificados para las muestras, se les agregó 2 µL de las muestras.
Posteriormente se adicionó a todos los tubos, incluyendo al blanco, 3 mL de la solución
Bradford seguido de agitación, dejándose en reposo durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Transcurrido los 10 minutos se procedió a leer en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 590 a 595 nm. La concentración de proteínas se expresó en mg/mL.
Electroforesis y Western Blot.
Para identificar la presencia o no de alguna de las proteínas involucradas en el
proceso de daño neuronal y que son objeto de estudio en este trabajo, se realizó la
técnica de electroforesis en gel seguido de inmunodeteccción de esas sustancias usando
la técnica de inmunoblot.
Preparación de las muestras:
El homogenizado de las muestras se diluyó en Buffer SDS 3X (Buffer SDS 3X: para
10 mL= Glicerol 3 mL, Dodecil Sulfato de Sodio –SDS- 0,9 g, Tris 0,5 M –pH 6,8- 3,75
mL, Azul de Bromofenol 0,1% 0,3 mL y agua pentadestilada hasta completar el
volumen final) hasta alcanzar una concentración final de proteínas de 5 µg/mL.
Las muestras fueron sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8 y 12%,
(minigeles de 12 x 8 cm) de 1,5 mm de espesor. Se colocaron las muestras tanto de
hemisferio cerebral derecho e izquierdo en la cantidad de 100 µg aproximadamente de
proteína por pozo. Paralelamente se colocó el marcador de peso molecular en cada uno
de los geles. La electroforesis se llevó a cabo en un tanque (MiniProtean II, BioRad)
lleno de Buffer de Corrida (14,4 g de Glicina, 3 g Tris base, SDS 1 g para 1 L en agua
pentadestilada) a 80 V y a temperatura ambiente, con una duración promedio de 130
minutos.
Western Blot.
Realizada la electroforesis, el gel obtenido se colocó en contacto directo con una
membrana de nitrocelulosa (Amersham) y se procedió a la transferencia a 80 V por
cuatro horas dentro de refrigerador, en un tanque (BioRad) lleno de Buffer de
Transferencia (14,4 g de Glicina, 3 g Tris base, 1 mL de SDS 10 % y 200 mL de
Metanol para 1 L en agua pentadestilada) frío. Las membranas fueron mantenidas en
Buffer de Transferencia por 30 minutos antes de ser usadas.
Culminada la transferencia, se descartaron los geles y las membranas fueron teñidas
con rojo de Ponceau con la finalidad de confirmar que las proteínas de las muestras
fueron transferidas, así como los marcadores de peso molecular. Sucesivamente se
lavaron con TTBS (Solución Buffer Tris Tween 20: 50 mM Tris base, 150 mM NaCl, 1
mM MgCl2 y Tween 20 al 0,05 %) hasta remover el colorante y se procedió al bloqueo
de las membranas con TTBS más 5 % de leche descremada por 5 horas en agitación
leve. Se procedió a lavar las membranas con TTBS y sucesivamente se colocó el
anticuerpo primario según cada caso (Anti-Bcl-2, Anti-Caspasa-3 Activada). Se diluyó
el anticuerpo primario 1:500 para Bcl-2 y 1: 2000 para Caspasa-3 activada, en TTBS +
BSA 1 % y se dejaron las membranas en incubación durante dos horas en agitación
constante y a temperatura ambiente. Tras lavar las membranas con TTBS por 3 veces, se
procedió a incubarlas con Anticuerpo secundario (Chemicon) anti-IgG de conejo
conjugado con peroxidasa de rábano (obtenido en cabra) en una dilución 1:4000 en
TTBS + BSA 1% + Leche descremada 1 % por una hora, a temperatura ambiente y en
agitación constante. Se lavaron las membranas con TTBS por 3 veces y se procedió a
detectar la unión del anticuerpo mediante quimioluminiscencia en película Kodak y
revelado con HC-110 (Kodak).
Análisis Estadistico de los Datos
Todos los datos obtenidos se expresan como el promedio + DE indicando el número
de animales utilizados por grupos experimentales. En algunos casos se presentan como
porcentajes respecto al control. El análisis estadístico se realizó empleando un análisis
de varianza (ANOVA), y como test post – hoc la prueba t de Bonferroni. Se usó el
software estadístico (GraphPad Software, San Diego, CA). Un valor de p< 0,05 fue
considerado como significativo.
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Evaluación Neurológica
El Ácido Valproico redujo significativamente el déficit neurológico con respecto a
los controles tal como se puede observar en el gráfico 1 y 2, sin embargo no hubo
diferencias significativas entre la evaluación a las 24 horas con respecto a la de las 48
horas dentro del mismo grupo. No obstante las ratas tratadas con VPA (evaluación
neurológica a las 24 y 48 horas después de la OTACM según Benderson: 0,43+ 0,63 y
0,44+ 0,88 . según García 18,80+ 6,47 y 20,80+ 6,98. ), mostraron una ligera
recuperación a las 48 horas, mientras que las ratas controles (evaluación neurológica a
las 24 y 48 horas después de la OTACM según Benderson:2,20+ 078 y 2,45+076. según
García: 6,77+4,78 y 4,21+4,75) mostraron un empeoramiento de sus condiciones
clínicas neurológicas. Estos resultados se repiten tanto en la evaluación neurológica
realizada con la escala propuesta por García y colaboradores (1995), como en la
propuesta por Bederson y cols. (1986).
Evaluación Neurológica(García,1995 modificada)
ratas tratadas con VPA sometidasa isquemia reperfusión
CONTROL 24
H
VPA 24
H
CONTROL 48
H
VPA 48
H
0
5
10
15
20
25
**
GR
AD
OS
Gráfico 1: Efecto del VPA sobre el daño Neurológico inducido por la Isquemia Transitoria. Escala de evaluación Neurológica según García y cols. (1995) modificada: a menor grado mayor daño neurológico y viceversa. Cada columna representa el promedio + DE de 12 animales para el grupo control y 13 animales para el grupo experimental, evaluados a las 24 y 48 horas después de la OTACM. El tratamiento se administró desde las 24 horas antes de la OTACMD, hasta 48 horas después de la misma: Dosis de VPA: 150mg/Kgp i.p., cada 12 horas (300mg/Kgp diario) y vehículo (solución Fisiológica 0,9%). La significancia indicada con (*) tuvo una p < 0,001 al comparar con sus respectivos controles.
Evaluación Neurológica según Bedersonratas tratadas con VPA sometidas
a isquemia reperfusión
CONTROL 24
H
VPA 24
H
CONTROL 48
H
VPA 48
H
0
1
2
3
* *
GR
AD
OS
Gráfico 2: Efecto del VPA sobre el daño Neurológico inducido por la Isquemia Transitoria. Escala de evaluación Neurológica según Bederson y cols. (1986). A menor grado menor daño neurológico y viceversa. Cada columna representa el promedio + DE de una n=12 animales para el grupo control y una n=13 animales para el grupo experimental, evaluados a las 24 y 48 horas después de la OTACM. Dosis de VPA: 150mg/Kgp i.p., cada 12 horas (300mg/Kgp diario) y vehículo (solución Fisiológica 0,9%). El tratamiento se administró desde las 24 horas antes de la OTACMD hasta 48 horas después de la misma. La significancia indicada con (*) tuvo una p < 0,001 al comparar con sus respectivos controles.
Niveles de Peroxidación Lipídica
En el hemisferio cerebral derecho del grupo control, los niveles de MDA se mostraron
aumentados con respecto al hemisferio cerebral izquierdo del mismo grupo: Al observar
los niveles de MDA del HCD (isquémico) de las ratas del grupo control (48,28 + 11,24
nmol/mg proteínas), con respecto a los niveles obtenidos en el hemisferio cerebral
izquierdo (HCI) o contralateral (18,96 + 5,49nmol/mg proteína), se aprecia una
disminución significativa del MDA en el HCI de un 60,73% con respecto al hemisferio
cerebral derecho (2,5 veces menos que el HCD), lo cual significa que el HCI no
presentó estrés oxidativo, sirviendo así como control (Gráfico 3).
El VPA redujo significativamente la peroxidación lipídica al compararla con el grupo
control: En el Gráfico 3 se observa, que el tratamiento con VPA, redujo los niveles de
MDA en un 42,9% en el hemisferio cerebral derecho (27,57 + 2,35 nmol/mg proteína)
con respecto al hemisferio cerebral derecho del grupo control (48,28 + 11,24 nmol/mg
proteínas). Demostrándose así, que el VPA si fue capaz de disminuir la peroxidación
lipídica (1,7 veces menos que los controles) inducida por el estrés oxidativo producido
en la isquemia transitoria.
No hubo diferencias significativas entre los niveles de MDA del HD del grupo que
recibió VPA (17,14+1,75nmol/mg proteína) y el HI no isquémico del grupo control
(18,96+ 5,49 nmol/mg proteína).
Peroxidación Lipídica de cerebro de ratastratadas con Vehículo y VPA
sometidas a Isquemia-Reperfusión
CONTROL OACM
D HD
VPA OACM
D HD
CONTROL OACM
D HI
VPA OACM
D HI
0
10
20
30
40
50
60
*
MD
A n
m/m
g P
rot
Gráfico 3: Efecto del VPA sobre el daño oxidativo a los lípidos (Peroxidación Lipídica) inducido por la Isquemia Transitoria. Peroxidación Lipídica en cerebro de ratas tratadas con VPA (150mg/Kg de peso ip C/12h) o vehículo (solución Fisiológica 0,9%)desde 24 horas antes de la OTACMD hasta 48 horas después de la misma, cuando fueron sacrificadas. Cada columna representa el promedio + DE de los hemisferios derecho e izquierdo de cada grupo por separado de 9 animales para el grupo control y 9 animales para el grupo experimental. La significancia indicada con (*) tuvo una p < 0,001 al comparar con sus respectivos controles.
Niveles de Proteínas Carboniladas:
En el hemisferio cerebral derecho del grupo control los niveles de Proteínas
Carboniladas se mostraron aumentados con respecto al hemisferio cerebral izquierdo:
Al observar los niveles de Proteínas Carboniladas del HCD (isquémico) de las ratas del
grupo control (0,027+ 0,002 Moles de grupos carbonilos/mg proteína), con respecto a
los niveles obtenidos en el hemisferio cerebral izquierdo (HCI) o contralateral (0,011+
0,005 Moles de grupos carbonilos/mg proteína) se aprecia una disminución significativa
de la cantidad de Proteínas Carboniladas en el HCI de un 59,26% con respecto al
hemisferio cerebral derecho (2,4 veces menos que el HCD), lo cual corrobora
nuevamente lo antes dicho con respecto a los resultados de la peroxidación lipídica, que
en el HCI no tuvo estrés oxidativo, sirviendo así como control (Gráfico 4).
El VPA redujo significativamente la oxidación de las proteínas al compararla con el
grupo control: En el Gráfico 4 se puede observar, que el tratamiento con VPA,
disminuyó los niveles de Proteínas Carboniladas en un 66,67% en el hemisferio
cerebral derecho (0,009+ 0,003 Moles de grupos carbonilos/mg proteína) con respecto
al hemisferio cerebral derecho del grupo control (0,027+ 0,002 Moles de grupos
carbonilos/mg proteína). Esto indica que el VPA fue capaz de inhibir la oxidación de las
proteínas, inducida por el estrés oxidativo, producido por la isquemia transitoria en el
HCD de las ratas (3 veces menos que el grupo control).
Los niveles de Proteínas carboniladas en el HD (isquémico) de las ratas tratadas con
VPA (0,009+ 0,003 Moles de grupos carbonilos/mg proteína) arroja resultados
similares al HI (no isquémico) de las ratas Controles (0,011 + 0,005 Moles de grupos
carbonilos/mg proteína). Además es importante señalar que el VPA disminuyó la
oxidación de proteínas en el hemisferio contralateral (0,006 + 0,002 moles de grupos
carbonilos/mg proteína) en un 45,46% con respecto al HIC (1,8 veces menos).
Proteínas Carboniladas de cerebro de ratastratadas con VPA y Vehículo sometidas
a Isquemia-Reperfusión
CONTROL OACM
D HD
VPA OACM
D HD
CONTROL OACM
D HI
VPA OACM
D HI
0.00
0.01
0.02
0.03
*
Mo
les
de
gru
po
s C
arb
on
ílo
s/m
g P
rot.
Gráfico 4: Efecto del VPA sobre el daño oxidativo a las Proteínas (Proteínas Carboniladas) inducido por la Isquemia Transitoria. Proteínas carboniladas en cerebro de ratas tratadas con VPA (150mg/Kg de peso ip c/12h) y vehículo (solución Fisiológica 0,9%), 24 horas antes de la OTACMD hasta 48 horas después de la misma. Cada columna representa el promedio + DE de los hemisferios derecho e izquierdo de cada grupo por separado de 9 animales para el grupo control y 9 animales para el grupo experimental. (*) Se observó una diferencia significativa entre los valores del HD de los controles y las tratadas (p < 0,001). La significancia indicada con (*) tuvo una p < 0,001 al comparar con sus respectivos controles
Efecto del ácido Valproico sobre la muerte celular en el cerebro de ratas con
isquemia transitoria.
Expresión de Bcl-2: Al observar la imagen 1 se puede apreciar que el ácido Valproico
aumentó la expresión de la proteína Bcl-2 en el cerebro con isquemia transitoria con
relación a los controles. De esta manera proveyó mayor protección contra la muerte
celular por apoptosis inducida por la isquemia – reperfusión que los controles, las cuales
sólo fueron tratadas con solución fisiológica.
Imagen 1: Efecto del ácido Valproico sobre la Expresión de la Proteína Antiapoptótica Bcl-2 en
cerebro de ratas sometidas a isquemia transitoria.
Caspasa -3 Activada: En la imagen 2 se observa que el ácido valproico disminuyó
significativamente la activación de la Caspasa -3 al compararla con el control. Al tomar
en cuenta que la activación de esta proteína representa el último eslabón río abajo,
irreversible, en la cascada de señalización para la apoptosis dependiente de caspasa, se
puede deducir que el VPA inhibió o disminuyó la muerte celular por apoptosis en el
cerebro de las ratas tratadas y sometidas a isquemia transitoria.
Bcl-2 24KD
CONTROL VPA
Imagen 2: Efecto del ácido Valproico sobre la proteína proapoptótica Caspasa -3 en cerebro de ratas sometidas a isquemia transitoria.
MODELO ESTRÉS OXIDATIVO AGUDO
Con la finalidad de dilucidar mejor el mecanismo mediante el cual el VPA ejerce su
efecto antioxidante, ya observado en la isquemia transitoria, tomando en cuenta que el
estrés oxidativo es una consecuencia de la misma, se comparó los efectos del VPA con
la Vitamina E (potente antioxidante), con el Diazepam (potenciador del efecto
gabaérgico), a través de un modelo de estrés oxidativo agudo, inducido por la aplicación
de un generador de radicales libres (FeSO4), inyectado en el hemisferio derecho de las
ratas tratadas con VPA, Diazepam y Vitamina E durante 24 horas. Se determinó
peroxidación lipídica, niveles de Proteínas Carboniladas.
Niveles de Peroxidación Lipídica
En el hemisferio cerebral derecho del grupo control, los niveles de MDA se mostraron
aumentados con respecto al hemisferio cerebral izquierdo del mismo grupo: Al observar
los niveles de MDA del HCD (donde se aplicó el FeSO4) de las
CONTROL VPA
CASPASA-3 ACTIVADA 17KD
ratas del grupo control (78,22+ 22,12 nmol/mg proteína), con respecto a los niveles
obtenidos en el hemisferio cerebral izquierdo (HCI) o contralateral (36,55 + 18,02
nmol/mg proteína) se aprecia una disminución significativa del MDA en el HCI de un
53,28% con respecto al hemisferio cerebral derecho (2,1 veces menos que el HCD), lo
cual significa que el HCI no presentó estrés oxidativo, sirviendo así como control
(Gráfico 5).
El VPA redujo significativamente la peroxidación lipídica al compararla con el grupo
control: En el Gráfico 5 se observa, que el tratamiento por sólo 24 horas con VPA,
redujo los niveles de MDA en un 56,87% en el hemisferio cerebral derecho (33,74 +
12,10 nmol/mg proteína) con respecto al hemisferio cerebral derecho del grupo control
(78,22+ 22,12 nmol/mg proteína). Demostrándose así, que el VPA si fue capaz de
disminuir la peroxidación lipídica inducida por el sulfato ferroso administrado por vía
intracraneal en el HCD de las ratas (2,3 veces menos que los controles).
La Vitamina E redujo los niveles de MDA al compararla con el grupo control: De
manera similar en las ratas tratadas con Vitamina E, se redujeron notablemente los
niveles de MDA en un 73,86% a nivel del HCD (20,45 + 6,28 nmol/mg proteína) con
respecto al HCD del grupo control (78,22+ 22,12 nmol/mg proteína) es decir, 3,8 veces
menos que los controles (Gráfico 5)
El Diazepam no disminuyó la peroxidación lipídica en el hemisferio cerebral derecho
sometido a estrés oxidativo: En el Gráfico 5 se puede observar que las ratas tratadas
con diazepam, no presentan diferencia significativa en los niveles de MDA en el HCD
(72,81 + 13,10 nmol/mg proteína), con respecto al hemisferio cerebral derecho del
grupo control tratada con vehículo (78,22+ 22,12 nmol/mg proteína). El diazepam no
inhibió la peroxidación lipídica en el cerebro afectado por el agente oxidante, mientras
que el VPA y la Vitamina E si lo hicieron.
El VPA y la Vitamina E mostraron resultados similares: Al comparar los niveles de
MDA de los HCD de las ratas tratadas con VPA (33,74 + 12,10 nmol/mg proteína) con
respecto a los HCD de las ratas tratadas con Vitamina E (20,45 + 6,28 nmol/mg
proteína), se puede apreciar que ambos grupos arrojan resultados similares. Es decir que
el VPA exhibió una disminución de la peroxidación lipídica similar a la que presentó la
vitamina E, no existen diferencias significativas entre los resultados mostrados por
ambos grupos (Gráfico 5).
Peroxidación Lipídica de cerebro de ratastratadas con vehículo, diazepam, Vit. E, y VPA
sometidas a estres oxidativo agudo
CONTROL HD
DIAZEPAM
HD
VIT E
HD
VPA HD
CONTROL HI
DIAZEPAM
HI
VIT E
HI
VPA HI
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
*
*
nm
MD
A/m
gP
rot
Gráfico 5: Efecto del VPA sobre el daño oxidativo a los lípidos (Peroxidación Lipídica) inducido por estrés oxidativo agudo. Peroxidación Lipídica en cerebro de ratas tratadas durante 24 horas con VPA (150mg/Kg de peso ip c/12h), Vitamina E (100mg/Kg de peso ip), Diazepam (8mg/Kg de peso ip) y vehículo (solución Fisiológica 0,9%), Después de la última dosis de tratamiento se sometieron a estrés oxidativo agudo mediante la administración de FeSO4 intracraneal directamente en el hemisferio derecho, dos horas después fueron sacrificadas. Cada columna representa el promedio + DE de los hemisferios derecho e izquierdo de cada grupo por separado de 8 animales por grupo. La significancia indicada con (*) tuvo una p < 0,001 al comparar con sus respectivos controles.
Niveles de Proteínas Carboniladas:
En el hemisferio cerebral derecho del grupo control los niveles de Proteínas
Carboniladas se mostraron aumentados con respecto al hemisferio cerebral izquierdo:
Al observar los niveles de Proteínas Carboniladas del HCD (sometida a la acción del
FeSO4) de las ratas del grupo control (0,034 + 0,003 moles de grupos carbonilos/mg
proteína), con respecto a los niveles obtenidos en el hemisferio cerebral izquierdo (HCI)
o contralateral (0,012 + 0,003 moles de grupos carbonilos/mg. proteína), se aprecia una
disminución significativa de la cantidad de Proteínas Carboniladas en el HCI de un
64,71% con respecto al hemisferio cerebral derecho (2,8 veces menos que el HCD), lo
cual corrobora nuevamente lo antes dicho con respecto a los resultados de la
peroxidación lipídica, que en el HCI no tuvo estrés oxidativo, sirviendo así como
control (Gráfico 6).
El VPA redujo significativamente la oxidación de las proteínas al compararla con el
grupo control: En el Gráfico 6 se puede observar, que el tratamiento por sólo 24 horas
con VPA, disminuyó los niveles de Proteínas Carboniladas en un 64,71% en el
hemisferio cerebral derecho (0,012 + 0,002 moles de grupos carbonilos/mg proteína)
con respecto al hemisferio cerebral derecho del grupo control (0,034 + 0,003 moles de
grupos carbonilos/mg proteína). Esto indica que el VPA fue capaz de inhibir (2,8 veces
menos que el grupo control) la oxidación de las proteínas, inducida por el sulfato
ferroso administrado por vía intracraneal en el HCD de las ratas.
La Vitamina E inhibió significativamente la oxidación de las proteínas, al compararla
con el grupo control: Las ratas tratadas con Vitamina E exhiben una reducción
importante en los niveles de Proteínas Carboniladas en los HCD (0,01 +0,001 moles
de grupos carbonilos/mg proteína) al compararlas con los HCD del grupo control (0,034
+ 0,003 moles de grupos carbonilos/mg proteína), mostrando una disminución de dichas
proteínas en un 70,59% con respecto a los controles (3,4 veces menos que el grupo
control). Estos resultados corroboran la acción antioxidante ya conocida de la Vitamina
E. (Gráfico 6).
El Diazepam no presentó ningún efecto sobre la oxidación de las proteínas en el
hemisferio cerebral derecho sometido a estrés oxidativo: En el Gráfico 6 se observa que
en las ratas tratadas con diazepam no disminuyeron los niveles de proteínas
carboniladas en el HCD (0,033 + 0,003 moles de grupos carbonilos/mg proteína), con
respecto al hemisferio cerebral derecho del grupo control tratada con vehículo (0,034 +
0,003 moles de grupos carbonilos/mg proteína). El diazepam no inhibió la oxidación de
las proteínas en el cerebro afectado por el agente oxidante, mientras que el VPA si lo
hizo. Este resultado es similar a la acción del diazepam con respecto a la peroxidación
lipídica antes mencionado.
El VPA y la Vitamina E mostraron resultados similares sobre la oxidación de las
proteínas: Si se comparan los niveles de Proteínas Carboniladas de los HCD de las ratas
tratadas con VPA (0,012 + 0,002 moles de grupos carbonilos/mg proteína) con respecto
a los HCD de las ratas tratadas con Vitamina E (0,01 +0,001 moles de grupos
carbonilos/mg proteína), se puede apreciar que ambos grupos exhiben resultados
similares. Es decir, el VPA presentó una disminución de la oxidación de las proteínas
similar a la que presentó la vitamina E, sin diferencias significativas entre los resultados
mostrados por ambos grupos. (Gráfico 6).
El VPA y la Vitamina E redujeron la Oxidación de Proteínas en el Hemisferio
contralateral (I) al compararlos con HI de los controles y el Diazepam. Al comparar los
niveles de grupos carbonilos en los HI de las ratas tratadas con VPA (0,004 + 0,002
moles de grupos carbonilos/mg proteína) y Vitamina E (0,004 + 0,002 moles de grupo
carbonilos/mg proteína) con los presentados por los HI de las ratas controles (0,012 +
0,003 moles de grupos carbonilos/mg proteína) y las tratadas con diazepam (0,012 +
0,006 moles de grupos carbonilos/mg proteína), se puede observar que la Vitamina E y
el VPA redujeron significativamente la oxidación de las proteínas en el hemisferio
contralateral.
Proteínas Carboniladas de cerebro de ratastratadas con VPA, Vit. E, Diazepam y vehículo
sometidas a estres oxidativo agudo
CONTROL HD
DIAZEPAM
HD
VIT E
HD
VPA HD
CONTROL HI
DIAZEPAM
HI
VIT E
HI
VPA HI
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
* *
Mo
les
de
gru
poc
arb
on
ilos/
mg
Pro
t.
Gráfico 6: Efecto del VPA sobre el daño oxidativo a las Proteínas (Proteínas Carboniladas) inducido por estrés oxidativo agudo. Proteínas Carboniladas en cerebro de ratas tratadas durante 24 horas con VPA (150mg/Kg de peso ip c/12h), Vitamina E (100mg/Kg de peso ip), Diazepam (8mg/Kg de peso ip) y vehículo (solución Fisiológica 0,9%), Después de la última dosis de tratamiento se sometieron a estrés oxidativo agudo mediante la administración de FeSO4 intracraneal directamente en el hemisferio derecho, dos horas después fueron sacrificadas. Cada columna representa el promedio + DE de los hemisferios derecho e izquierdo de cada grupo por separado de 8 animales por grupo. La significancia indicada con (*) tuvo una p < 0,001 al comparar con sus respectivos controles
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
En la isquemia-reperfusión cerebral ocurren una serie de eventos fisiopatológicos
que llevan finalmente al daño y muerte celular, y que involucra múltiples mecanismos
interrelacionados tales como: el desbalance de los gradientes iónicos, aumento de
glutamato extracelular (excitotoxicidad), sobreactivación de los receptores de NMDA,
aumento en las concentraciones de calcio intracelular, sobrecarga mitocondrial, estrés
oxidativo y nitrosativo, activación de enzimas catabólicas y muerte celular por necrosis
y/o por apoptósis. Los radicales libres juegan un papel fundamental en el mecanismo de
excitotoxicidad dentro del proceso isquémico así como también en distintos procesos
neurodegenerativos.
Considerando los múltiples pasos en la cascada de señalización de los eventos que
llevan a la neurotoxicidad inducida por la isquemia-reperfusión, las investigaciones se
han orientado en la búsqueda de sustancias o drogas que puedan modificar o revertir los
procesos involucrados, a fin de disminuir el daño neuronal resultante. Entre estas
sustancias están el litio y el ácido Valproico o VPA.
En éste trabajo se investigó en primer lugar, si el ácido Valproico protege las células
del daño y muerte neuronal, producto del estrés oxidativo inducido por la isquemia-
reperfusión en el cerebro de ratas sanas sometidas a la oclusión transitoria de la arteria
cerebral media derecha (OTACMD), y en segundo lugar, se comparó su efecto en la
disminución de la oxidación a lípidos y proteínas, con la Vitamina E y el Diazepam, en
el cerebro de ratas sanas sometidas a estrés oxidativo agudo, a través de la inyección
intracraneal de FeSO4 en el hemisferio derecho.
En esta investigación se observó que el VPA disminuyó significativamente el daño
neurológico en las ratas con isquemia-reperfusión al compararlas con las controles. Este
resultado evidencia un efecto neuroprotector del VPA contra el daño neuronal inducido
por la isquemia-reperfusión. Descubrimientos similares fueron obtenidos por Ren M y
cols. (2004) en ratas que fueron sometidas a isquemia-reperfusión a través de la
OTACM y tratadas con VPA (300mg/Kg. peso diario) inmediatamente después del
insulto isquémico durante 48 horas. Estos mismos autores habían obtenido en estudios
anteriores iguales resultados con el Litio, quedando en evidencia que ambas sustancias
ejercen un efecto neuroprotector en la isquemia reperfusión. Sin embargo es posible que
el mecanismo de acción neuroprotector del VPA en la isquemia-reperfusión se realice a
través de diferentes puntos clave de las distintas cascadas de señalización que llevan a la
neurotoxicidad inducida por el proceso de isquemia-reperfusión. Las investigaciones
previas realizadas con litio y VPA reportan distintos mecanismos que podrían estar
relacionados con este efecto.
Un mecanismo probable a través del cual el VPA podría reducir el daño neurológico
inducido por la isquemia reperfusión, es la inhibición de los receptores NMDA de
calcio activado por glutamato, al igual que el presentado por el litio. El litio es un catión
monovalente ampliamente estudiado en los procesos de neurotoxicidad inducida por la
isquemia-reperfusión que ha demostrado tener efectos neuroprotectores tanto in vitro
como in vivo. El VPA y el Litio comparten efectos similares, a pesar de ser dos
sustancias estructuralmente diferentes (Johannessen, 1999). Nonaka y colaboradores
(1998) demostraron que el litio protegía las neuronas del cerebelo, de la corteza cerebral
y del hipocampo (cultivadas) de la excitotoxicidad, inhibiendo el influjo de Ca2+
mediado por el receptor NMDA. En base a los resultados obtenidos en ésta
investigación donde el VPA mostró un efecto neuroprotector en el cerebro de las ratas
sometidas a isquemia-reperfusión, al considerar, que los receptores de NMDA y el
aumento del Ca2+ intracelular forman parte importante en la cascada de señalización de
los eventos citotóxicos inducidos por la isquemia-reperfusión y el estrés oxidativo, se
podría atribuir éste mismo mecanismo para el VPA, sin embargo hasta ahora no hay
evidencias que sugieran o sustenten este mecanismo.
En cuanto a la entrada masiva de calcio a la célula en los procesos excitotóxicos,
Smith M.A y colaboradores (2003) reportan otro mecanismo independiente de la vía del
glutamato, donde el peróxido de hidrógeno indujo toxicidad en neuronas estriatales de
rata, a través de la activación de canales de cationes no selectivos, que permiten la
entrada masiva del Ca2+ y Na+, y al bloquear las sinapsis glutamatérgica obtuvieron el
mismo resultado. Es decir, que el incremento en la entrada del Ca2+ producida por el
peróxido de hidrógeno, era independiente de la actividad sináptica o apertura de los
canales dependientes de voltaje (como el NMDA activado por glutamato). Este
fenómeno está asociado con el aumento intracelular tardío del calcio (DCR) que ocurre
como parte del proceso de excitotoxicidad, el cual es independiente del glutamato y se
caracteriza por ser una fase irreversible. En relación a éste mecanismo, se conoce que el
VPA bloquea los canales de sodio, disminuyendo las corrientes del mismo al interior de
la célula, inhibiendo así la frecuencia de descarga de las neuronas y la respuesta al
glutamato (Brunello, 2004) sugiriendo que el tratamiento a corto plazo con el VPA
realizaría esta misma acción sobre los canales de cationes no selectivo, inhibiendo así la
entrada masiva de calcio y sodio inducida por el estrés oxidativo y por ende por la
isquemia-reperfusión. De ser así el VPA evitaría el aumento intracelular tardío del Ca2+,
con la consiguiente inhibición de la muerte celular por una vía independiente del
glutamato.
En relación a la participación de los radicales libres en el proceso de
neuroexcitotoxicidad inducida por la isquemia-reperfusión y el estrés oxidativo,
creemos que éste es uno de los mecanismos involucrados en la acción neuroprotectora
del VPA, ya que en nuestros resultados el tratamiento con ésta sustancia por 24 horas
antes de la OTACMD, hasta 48 horas después de la misma en el modelo isquemia-
reperfusión y por 24 horas antes de la aplicación intracraneal del FeSO4, en el modelo
de estrés oxidativo agudo, a una dosis de 300mg/Kg pc/12 horas, disminuyó
significativamente la oxidación de lípidos y proteínas. Esto demuestra que el VPA
inhibe la acción de los radicales libres en la isquemia-reperfusión y en el estrés
oxidativo, mostrando un efecto antioxidante. Este resultado es similar a las
investigaciones realizadas por Wang y cols. (2003), quienes demostraron que el VPA
tuvo un efecto neuroprotector contra el estrés oxidativo in vitro, a través de un plan de
tratamiento a largo plazo (7 días), donde el ácido Valproico inhibió en forma
significativa el daño oxidativo a lípidos y proteínas en cultivos primarios de células
cerebrocorticales de ratas, las cuales fueron sometidas a estrés oxidativo con cloruro
férrico (FeCl3) durante 90 minutos. Posteriormente Frey y cols. (2006) reportaron que el
litio y el VPA (dosis: 200mg/Kg pc), disminuyeron la peroxidación lipídica en la
corteza prefrontal e hipocampo del cerebro de ratas a quienes se le reprodujo el
tratamiento de un episodio agudo de manía, y se les indujo estrés oxidativo con d-
anfetamina. Llama poderosamente la atención que estas sustancias no ejercieron ningún
efecto sobre los niveles de proteínas carboniladas. En el contexto del presente modelo
utilizados en nuestra investigación, se observó que el VPA si disminuyó los niveles de
proteínas carboniladas tanto en el modelo de isquemia-reperfusión como en el del estrés
oxidativo agudo, tal como lo reportan Wang y cols (2003) en sus experimentos in vitro.
Estas diferencias probablemente se deban a los distintos diseños y modelos
experimentales utilizados. En este trabajo por primera vez se demuestra la acción
antioxidante del VPA en un modelo de isquemia-reperfusión in vivo, aplicado (a corto
plazo) sólo desde 24 horas antes hasta 48 horas después de la OTACM, y 24 horas antes
de la aplicación intracraneal del sulfato ferroso (FeSO4). Esto refuerza la evidencia de
que el VPA es un efectivo antioxidante in vitro e in vivo, tanto en el tratamiento crónico
(a largo plazo), así como en el aplicado a corto plazo, en el modelo de estrés oxidativo
agudo y en la isquemia-reperfusión, disminuyendo la oxidación de los lípidos y las
proteínas por parte de los radicales libres.
Un resultado adicional que demuestra la participación de las ROS, es el efecto
antioxidante exhibido por el VPA el cual fue igual de significativo al presentado por la
Vitamina E en el modelo de estrés oxidativo, sin embargo, los mecanismos por medio
del cual el VPA ejerce este efecto antioxidante, podrían ser diferentes o iguales al de la
Vitamina E. La Vitamina E ejerce su acción antioxidante a través de su sitio activo que
se localiza en el grupo –OH en la posición 6 del anillo cromano, la cual es capaz de
neutralizar radicales libres sobre todo endoperóxidos y el radical alcóxi al donarle un
electrón, evitando de ésta manera la propagación del proceso de la oxidación a los
lípidos o peroxidación lipídica (Bjornebue A. y cols 1990). El VPA presenta una
estructura química muy diferente a la Vitamina E, sin embargo, también disminuyó los
niveles de Peroxidación Lipídica y Proteínas Carboniladas en el cerebro de ratas
sometido a estrés oxidativo, tanto en la isquemia-reperfusión como en el modelo de
estrés oxidativo agudo. El resultado arrojado por el VPA fue igual de significativo en la
disminución de los niveles de proteínas carboniladas con respecto a la producida por la
Vitamina E. Es posible que el VPA tenga una acción antioxidante directa, para lo cual
debe donar electrones a una especie radical y neutralizarlo. Hasta ahora no se conoce si
el VPA tiene ésta acción antioxidante directa. Se podría sugerir además un mecanismo
de acción antioxidante indirecto, probablemente potenciando la actividad de enzimas
antioxidantes, tal como lo reportan los trabajos de Frey y cols. (2006) quienes
demostraron que el litio y el VPA aumentaron la actividad de la Catalasa (una
importante enzima antioxidante), en la corteza prefrontal del cerebro de ratas sometidas
a estrés oxidativo. Este hallazgo explicaría en parte la acción antioxidante indirecta del
VPA en la isquemia-reperfusión. Sin embargo, para aclarar si el VPA tiene efecto
antioxidante directo, es importante estudiar en futuras investigaciones la estructura
química del VPA como neutralizador o barredor directo de radicales libres. De ser éste
su mecanismo de acción neuroprotectora, esclarecería la protección rápida exhibida por
el VPA tanto a los Lípidos como a las Proteínas.
Siendo el glutamato como ya se ha comentado, un factor importante en la
neurotoxicidad inducida por la isquemia-reperfusión y el estrés oxidativo, y en base a
las investigaciones de Hassel y cols (2001), quienes reportan que el tratamiento crónico
con VPA aumenta la capacidad captadora de glutamato hipocampal a través del
aumento en la expresión del transportador del glutamato EAAT1 en el cerebro de ratas,
se podría plantear que el mecanismo de acción neuroprotectora del VPA, sea por la vía
del glutamato disminuyendo su concentración extracelular a través de éste mecanismo.
Hasta ahora no se ha comprobado ésta acción para el VPA en su efecto neuroprotector
en los procesos de isquemia. Sin embargo se conoce que el glutamato es el principal
neurotransmisor del sistema excitatorio del SNC denominado sistema glutamatérgico, el
cual está regulado directamente por un sistema inhibitorio el sistema gabaérgico; las
investigaciones demuestran que el VPA potencia esta inhibición gabaérgica
(Johannessen, 1999), pudiéndose pensar que el efecto neuroprotector del VPA en la
isquemia-reperfusión y en el estrés oxidativo involucraría ésta acción, inhibiendo así el
efecto excitatorio y citotóxico del glutamato. Para dilucidar si éste es el efecto del VPA
sobre la prevención del daño neuronal inducido por radicales libres, se utilizó en el
modelo de estrés oxidativo agudo, una benzodiazepina (el Diazepam), un sedante que
también potencia la inhibición gabaérgica (Citado por Moreno Yanes J.A. 2002) y se
comparó el efecto de éste con el del VPA y la Vitamina E en el estrés oxidativo. Se
observó que el diazepam no mostró ningún efecto protector contra la acción de los
radicales libres en el cerebro de las ratas tratadas, mientras que el VPA y la Vitamina E
si lo hicieron. Este resultado se correlaciona con el realizado por Madden y Cols. (2003)
quienes reportaron que los potenciadores del gaba (topiramato y vigabatrina) no
ofrecieron neuroprotección a ratones sometidos a isquemia reperfusión, por lo que se
puede sugerir que la acción neuroprotectora del VPA en los procesos de isquemia-
reperfusión, no se produce mediante la potenciación de la inhibición gabaérgica de la
vía excitatoria y citotóxica del glutamato
Hasta ahora es bien conocido que el estrés oxidativo producido por la isquemia-
reperfusión induce al clivaje de la poly (ADP-ribosa) polimerasa, la activación de las
caspasas y fragmentación del DNA en las células neuronales. Se ha demostrado en
particular un aumento en la expresión y activación de proteasas intracelulares, sobretodo
la caspasa-3 activada, la cual ésta muy estrechamente involucrada en la cascada de
señalización de los procesos apoptóticos. Por otro lado, estudios anteriores señalan que
el tratamiento con inhibidores de las caspasas reducen el daño neuronal inducido por la
isquemia (Jihong Xu y cols. 2003). Estos reportes demuestran la intervención de las
caspasas en los procesos que ocurren después del episodio isquémico, sugieriendo
claramente que los mecanismos apoptóticos son activados durante la isquemia, y que al
ser inhibidos o bloqueados, reducen la apoptosis y el daño neuronal isquémico. En base
a lo anteriormente expuesto, en éste trabajo se investigó la acción o el efecto del VPA
sobre la expresión de dos proteínas íntimamente relacionadas con la apoptósis inducida
por la isquemia-reperfusión: la Bcl-2 y la caspasa-3 activada y se observó que el VPA
en primer lugar aumentó la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y en segundo
lugar, disminuyó la expresión de la proteína proapotótica: Caspasa-3 Activada
protegiendo a las células de la muerte celular por apoptósis en el cerebro de ratas sanas
sometidas a isquemia-reperfusión. Estos resultados se correlacionan con las
investigaciones de Chen G. y cols (b-1999) quienes demostraron que el tratamiento
crónico con VPA aumentó los niveles de Bcl-2 en la corteza cerebral de ratas. El Bcl-2
es una proteína antiapoptotica que protege la célula de la muerte celular por apoptósis.
Hockenbery y cols. (1993) ya habían demostrado que la sobreexpresión del Bcl-2
suprimía completamente la peroxidación lipídica en células cultivadas sometidas a
estrés oxidativo, reportando la acción antioxidante del Bcl-2 en la prevención de la
muerte celular por apoptósis inducida por estrés oxidativo. Tyurina Y. y cols. (1997)
reportaron estos mismos efectos del Bcl-2 in vitro, en cultivos celulares de células
PC12 de feocromocitoma de ratas. En relación a la disminución observada en la
expresión de la caspasa-3 activada por parte del VPA, resultados similares obtuvieron
Ren y cols (2004) en ratas sometidas a isquemia-reperfusión cerebral a través de la
OTACM, tratadas con VPA (300mg/Kg.p) inmediatamente después del insulto
isquémico. Todos estos datos refuerzan la hipótesis de que la protección mediada por el
VPA involucra mecanismos antiapoptóticos, protegiendo a las células neuronales de la
muerte por apoptósis inducida por la isquemia-reperfusión
La mitocondria juega un rol importante en la muerte celular inducida por la
isquemia-reperfusión, por que se activan los poros de permeabilidad transitoria
mitocondrial (PPTM), los cuales están intimamente relacionados con las proteínas de la
familia de Bcl-2 (Bax y Bcl-2). Las investigaciones sugieren que Bax induce la salida
de citocromo C a través de poros o canales que ella forma en la membrana mitocondrial
y activa los PPTM, la Bcl-2 impide la inserción de Bax a la membrana mitocondríal por
que podría impedir la formación del poro Bax por no permitir su oligomerización
(citado por Moreno Y. 2004). Hallin U. y cols. (2005) reportan que la fosforilación de
Bcl-2 en la serina-24 o dominio BH4 de su estructura polipeptídica, coincide con la
liberación del citocromo C después de la isquemia hipóxica en el cerebro de ratas
neonatales y precede, además, la activación de la caspasa-3 y la muerte celular. En base
a lo expuesto por éstos investigadores, se puede deducir que el VPA al aumentar los
niveles de Bcl-2 (tal como fue demostrado en este trabajo) impide la acción de Bax, y
en consecuencia impide la liberación del citocromo C, radicales libres y la activación de
la Caspasa-3. Philip A.B. y cols. (2003) afirman que las drogas que bloquean las
caspasas y aumentan la acción de la Bcl-2, protegen las neuronas contra el daño
isquémico. En ésta investigación el VPA aumentó la expresión de Bcl-2 y disminuyó la
caspasa-3 activada en la isquemia reperfusión protegiendo de ésta manera el cerebro de
la muerte celular por apoptósis inducida por la isquemia reperfusión.
Otro mecanismo involucrado en la muerte celular por apoptósis es la intervención de
la proteína reparadora de DNA, la Poly (ADP-ribosa) o PARP-1. El efecto
neuroprotector del VPA, podría estar relacionado con éste mecanismo al tomar en
consideración que la relación demostrada en investigaciones anteriores sobre ésta
enzima en la muerte celular por apoptósis y / necrosis inducida por la isquemia-
reperfusión y el estrés oxidativo. Endres y cols. (1998) reportaron que el daño cerebral
isquémico está mediado por la activación de Poly (ADP- ribosa) Polimerasa o PARP-1,
ellos observaron que esta enzima se activa en minutos después de la reperfusión seguida
de la oclusión de la arteria cerebral media. La PARP-1 es una proteína altamente
conservada de 113KDa, que se encuentra localizada en el núcleo. La PARP-1 interviene
en diversos eventos fisiológicos y patológicos tales como la expresión genética, la
diferenciación celular, la replicación y reparación del DNA, la descondensación de la
cromatina, la transformación malignizante del DNA, la apoptósis y necrosis. A PARP-1
se le ha llamado el “guardián del genoma”, y está reconocida como un “sensor de corte
molecular” porque es susceptible al daño del DNA.
Es importante acotar que PARP-1 es el responsable en un 97% de la ribosilación de
las proteínas en el cerebro (Strosznajder R.P. y cols. 2005). La PARP-1 es activada al
romperse una cadena o la doble cadena de DNA, la cual transfiere de 50 a 200 cadenas
empalmadas de ADP-ribosa a una variedad de proteínas nucleares incluyendo el mismo
PARP-1. En caso de pequeños o moderados daños al DNA, PARP-1 participa en los
procesos de reparación del mismo (Hyo Chol Ha y Zinder S.H. 1999). Para reparar el
DNA, PARP-1 utiliza βNAD como sustrato. Ante un daño del DNA mediado por
isquemia reperfusión, se produce una excesiva activación de PARP-1 que lleva a la
depleción del βNAD, disminuyendo a su vez los niveles de ATP (el cual es usado para
la resíntesis de NAD+ ) y llevando a la muerte de la célula: así, de acuerdo con el grado
de activación de PARP y los niveles de ATP, esta muerte puede ser o por necrosis o por
apoptósis (Sharma S.S. y cols. 2004). Strosznajder R.P.y cols. (2005) refieren que
PARP-1 se considera como el switche molecular entre la vida y la muerte. Un daño
masivo del DNA después del insulto isquémico, activa de forma exagerada a PARP-1
llevando a una caída casi total de los niveles de ATP, este hecho sumado a la falla
energética, llevaría a muerte neuronal por necrosis, que es una muerte independiente de
ATP. Mientras que ante un daño limitado de DNA la activación ligera de PARP-1,
disminuiría en menor grado el NAD y mantendría suficiente ATP para inducir apoptósis
(es una muerte dependiente de ATP). Esto sugiere que la forma de muerte que
prevalecerá, va a depender de los niveles de ATP (Eguchi y cols. 1997). Se ha
demostrado que la inactivación genética de PARP-1 en ratones Knockout, protege las
células contra la muerte evocada por la isquemia-reperfusión (Endres M y cols. 1997).
Además Mandir y cols. en el 2000 (citado por Strosznajder R.P. y cols.. 2005)
investigaron la relación entre la neurotoxicidad mediada por receptores de NMDA y no
NMDA con PARP-1, y hallaron que los ratones carentes de PARP-1 mostraron gran
resistencia a la excitotoxicidad producida por NMDA, pero fueron susceptibles a la
excitotoxicidad por receptores AMPA. Esto sugiere que la neurotoxicidad de NMDA,
requiere de la activación de PARP-1.
En base a lo antes planteado, se podría crear la interrogante, si el efecto
neuroprotector del VPA contra el daño celular ocasionado por la isquemia-reperfusión y
el estrés oxidativo, sería a través de la inhibición o bloqueo de la activación de PARP -1
quedando abierta la posibilidad de confirmar a través de futuras investigaciones éste
efecto con la finalidad de aclarar el mecanismo de acción neuroprotector del VPA en los
procesos isquémicos.
El efecto neuroprotector mostrado por el VPA, es posible que se realice a través de
un mecanismo a corto plazo o a largo plazo. El mecanismo a corto plazo podría darse a
través de las siguientes acciones: una antioxidante directa en la cual ejerce un bloqueo
directo a los agentes oxidante, o un efecto antioxidante indirecto, potenciando la acción
de antioxidantes celulares o elementos que actúen como barredores de radicales libres.
Los mecanismos a largo plazo serían a través de la expresión genética al considerar que
las investigaciones de Post (1992), Hyman y Nestler (1996) sugieren que el tratamiento
con VPA y en su efecto Neuroprotector puede estar involucrada la alteración en la
expresión genética (citados por Wang J.F. y cols. 2003), explicando el efecto aquí
demostrado del VPA en el aumento de la expresión de proteínas antiapoptóticas como el
Bcl-2 y la disminución en la expresión de proteínas proapotóticas como la Caspasa-3
activada protegiendo la penumbra isquémica de la muerte celular por apoptósis inducida
por la isquemia-reperfusión y el estrés oxidativo.
Conclusión
En base a los resultados obtenidos se demostró claramente que:
a- El pre-tratamiento con Ácido Valproico redujo el déficit Neurológico en
ratas sanas sometidas a isquemia-reperfusión, pudiendo ser una alternativa
terapéutica en el tratamiento del shok agudo.
b- El VPA protege la penumbra isquémica a través de la disminución de muerte
por apoptósis inducida por la isquemia-reperfusión, por aumentar la
expresión de Bcl-2 y la disminución de la Caspasa-3- activada.
c- El ácido Valpróico (VPA) tiene efecto neuroprotector contra los radicales
libres en las ratas sanas sometidas a Isquemia Reperfusión cerebral y en el
estrés oxidativo al disminuir la oxidación a los lípidos y a las proteínas. Este
efecto antioxidante del VPA fue similar al mostrado por la Vitamina E. Los
radicales libres y la Apoptósis están involucrados tanto en la isquemia-
reperfusión como en las enfermedades neurodegenerativas, se podría sugerir
el estudio del VPA como antioxidante, pudiendo ser una alternativa
preventiva y terapeutica de éstas patologias.
d- El efecto Neuroprotector y antioxidante demostrado por del VPA no se debe
al potenciamiento de la acción GABAérgica, hecho que permite descartar
ésta via como probable efecto en su acción neuroprotectora, y se propone la
búsqueda de otros mecanismos posibles tal como la inhibición de la
activación de PARP-1 y el estudio de la estructura química de ésta sustancia
como probable barredor directo de radicales libres.
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pp 543-548.
ANEXOS
ANEXO A
CURRÍCULO VITAE
DATOS PERSONALES
Nombre y apellidos: María Magdalena Hernández de González. CI: 4.791.121 Nacionalidad: Venezolana. Lugar y Fecha de nacimiento: Coro- Edo Falcón. 23 – 12 – 1.958. Estado Civil: Casada.
DATOS ACADÉMICOS
EDUCACIÓN MEDIA: Bachiller en Ciencias. EDUCACIÓN SUPERIOR: Universidad de los Andes. Mérida. Estado Mérida. TÍTULO OBTENIDO: Médico Cirujano. PROFESOR ORDINARIO AGREGADO A DEDICACIÓN EXCLUSIVA TIEMPO CONVENCIONAL: UNIVERSIDAD EXPERIMENTAL RÓMULO GALLEGOS. Área de ODONTOLOGÍA. Desde el 15-11-1993 COORDINADORA DE LA ASIGNATURA DE HISTOFISIOLOGÍA. Dependiente del Dpto. de Ciencias Morfológicas y Funcionales del área de ODONTOLOGÍA de la Universidad Rómulo Gallegos. Fecha: Desde el 15 – 11 – 93. DISEÑO DEL PROGRAMA ANALÍTICO DE LA ASIGNATURA DE HISTOFISIOLOGÍA para la carrera de Odontología, de la Universidad Nacional Experimental Rómulo Gallegos. Fecha: Junio 1993. DOLOR: DEFINICIÓN, CLASIFICACIÓN Y TEORÍAS. Trabajo de Ascenso presentado para optar a la categoría de Asistente. Fecha: Marzo 2001. EFECTO ANTIOXIDANTE DEL ÁCIDO VALPROICO EN EL ESTRÉS OXIDATIVO. Presentado para optar a la categoría de Agregado. Fecha: Diciembre, 2005.
ANEXO B
Escala de Evaluación Neurológica según Garcia, JH y cols. Neurological Stroke. 1995. Vol. 26. pp 627 – 635.
ESCALA
Evaluación
Neurológica
Técnica
No afectada
3
Ligeramente
Afectada
2
Severamente
Afectada
1
Totalmente
Afectada
0
Actividad
Espontánea
Se observa el animal durante 5´ en
su ambiente natural, habilidad para
acercarse a las cuatro paredes de la
jaula.
La rata se mueve
alrededor,
explorando el
ambiente y se
aproxima al menos
a tres paredes de la
jaula
La rata se mueve alrededor
en la jaula pero no se
acerca a todos los lados de
la jaula y duda para
moverse aunque
eventualmente alcanza al
menos un borde alto de la
jaula
La rata no se
levanta o
simplemente se
mueve en la
jaula
La rata no
se mueve
Simetría en
Movimiento
de los cuatro
miembros
Se agarra la rata en el aire por la
cola para observar la simetría en el
movimiento de los cuatro
miembros
Los cuatro
miembros se
extienden
simétricamente en
el movimiento
Los miembros del lado
izquierdo se extienden
menos o mas lentamente
que aquellos del lado
derecho
Los miembros
del lado
izquierdo
muestran
mínimo
movimiento
Los
miembros
del lado
izquierdo
no se
mueven
Alargamient
o
De la garra
Delantera
La rata es atraída hasta el borde de
una tabla y se hace caminar sobre
las patas delanteras mientras está
agarrada por la cola, se observa la
simetría en las garras delanteras
mientras la rata alcanza la tabla, los
miembros se mantienen en el aire
Ambos miembros
delanteros se
agarran de la tabla
y la rata camina
simétricamente
sobre sus garras
delanteras
El lado izquierdo se agarra
con menos fuerza que el
derecho y camina sobre sus
garras anteriores en forma
asimétrica
Movimiento
mínimo de
miembros
izquierdos
delanteros.
Los
miembros
delanteros
izquierdos
no se
mueven
Trepamiento
Se coloca la rata sobre la pared de
alambre de la jaula, normalmente la
rata usa sus cuatro miembros para
subirse sobre la pared, al tirarla de
la cola o al sacudirla, ella agarrará
con fuerza el alambre de la jaula
La rata trepa
fácilmente y se
agarra fuertemente
al alambre de la
jaula
El lado izquierdo se
observa asimétrico
mientras trepa, o no se
agarra tan fuerte como en
el lado derecho
La rata falla al
trepar o tiende
a moverse en
círculo en lugar
de trepar.
-------------
--
Propiocepció
n corporal
Se toca la rata con una vara roma
en cada lado del cuerpo, y se
observa la reacción al estímulo
La rata reacciona
girando la cabeza
y se asusta ante los
estímulos en
ambos lados
La rata reacciona
lentamente ante los
estímulos sobre el lado
izquierdo
La rata no
responde a los
estímulos del
lado izquierdo
-------------
--
Respuesta a
la
Palpación
de las
vibrisas
Con una vara roma se cepillan
vibrisas en cada lado, la vara se
mueve hacia atrás del animal para
evitar completamente campo visual
La rata reacciona
girando la cabeza
o se asusta ante los
estímulos en
ambos lados
La rata reacciona
lentamente a los estímulos
sobre el lado izquierdo
La rata no
responde a los
estímulos sobre
el lado
izquierdo
-------------
ANEXO C
Evaluación Neurológica según Benderson, JB y cols. Stroke.1986. Vol. 17. Nº 3. pp 472 – 476.
Después de provocar la oclusión de la arteria cerebral media a las ratas, se realizó evaluación neurológica de la siguiente manera:
• Las ratas fueron elevadas a un metro del piso agarradas por la cola. Se observó la extensión de las patas delanteras:
- Ratas normales extienden sus patas delanteras simétricamente hacia el piso, y si
no tenían otro déficit neurológico, se les designó como grado “o” - Las ratas con infartación consistente, flexionaron la pata delantera contralateral
al hemisferio dañado, la postura varió desde la flexión leve de la muñeca y aducción del hombro (movimiento activo o pasivo que acerca un miembro u otro órgano al plano medio; contrario a la abducción) con extensión del codo, hasta colocarse en varias posturas con una flexión total de la muñeca, codo y aducción con rotación interna de el hombro. Las ratas con alguna cantidad de flexión de miembro delantero sin otro déficit neurológico: grado “1”.
• Se colocaron las ratas sobre una gran lámina suave de plástico cubiertas con
papel que pudo agarrarse firmemente por sus garras, con la cola sostenida por una mano, se aplicó una suave presión detrás del hombro de la rata hasta deslizarse varias pulgadas de la pata delantera, la maniobra se repitió varias veces en cada dirección.
- Normal o medianamente disfuncional: las ratas se resistieron al deslizamiento
igualmente en ambas direcciones. - Severamente disfuncional: las ratas tenían firmemente resistencia reducida para
empujar lateral hacia el lado parético grado “2”. • A las ratas se les permitió moverse libremente y se observó su movimiento:
movimiento circular o en círculos.
- Las ratas que se movieron en círculo hacia el lado parético: grado “3” -La flexión de patas anteriores siempre se observó en las ratas con disminución de la resistencia hacia el empuje lateral y también con movimiento circular.
El examen neurológico se realizó de 3 – 5 minutos.
Escala de evaluación neurológica según Benderson, JB y cols.Stroke.1986. Vol. 17. Nº 3. pp 472 – 476.
(1986)
NORMAL
GRADO 0
NO SE OBSERVÓ
DÉFICIT
MODERADA
GRADO 1
SEVERA
GRADO 2
RESISTENCIA DISMINUIDA PARA EL EMPUJE LATERAL (Y FLEXIÓN DE PATA DELANTERA) SIN MOVIMIENTO CIRCULAR.
GRADO 3
IGUAL COMPORTAMIENTO COMO GRADO 2 CON MOVIMIENTO CIRCULAR.