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UNIVERSIDAD DE PANAMÁ
VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSTGRADO
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS CON ÉNFASIS EN
PROTECCIÓN VEGETAL
IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE FUSARIUM, AISLADOS
DEL CULTIVO DE LA PIÑA DE LA PROVINCIA DE PANAMÁ OESTE
MARCOS CECILIO BUITRAGO ESPINOSA
TESIS PRESENTADA COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL
GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS CON ÉNFASIS EN
PROTECCIÓN VEGETAL
PANAMÁ, REPÚBLICA DE PANAMÁ
2018
ii
HOJA DE APROBACIÓN
ABBY S. GUERRA Ph. D.
_____________________ DIRECTOR
LUIS MEJIA Ph. D.
_____________________ ASESOR
JUAN M. OSORIO Ph. D.
_____________________ ASESOR
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios, por haberme permitido llegar a punto y haberme dado salud
para lograr mis objetivos, superando las innumerables limitaciones.
A mis padres Ruth y Marcos, por haberme apoyado en todo momento, por sus
consejos, por la motivación constante que me ha permitido ser una persona
persistente.
A mis hermanas Mabel y Yicell, mis sobrinos Jonathan, Alejandro y Angie y mis
cuñados Secundino y Nicolás, que alzaron muchas veces mi ánimo.
A mi amada Dayanis, por su ayuda incondicional, aportando sus conocimientos en
técnicas de laboratorio y alentándome en los momentos difíciles para culminar de
manera satisfactoria la tesis.
Al director Darío Gordon, por haberme permitido realizar esta investigación en
las instalaciones del DCSTDDF de la DNSV del MIDA.
Al Ing. Rogelio Mogoruza por ayudarme durante la colecta de muestras, así como
a los productores de las diferentes regiones del cultivo de piña, por permitirme
entrar en sus fincas para realizar los muestreos.
A mis amigas, la Dra. Ana Montenegro y la Dra. Gesabel Navarro, por su gran
apoyo en la parte morfológica y molecular.
A los doctores Abby Guerra, Luis Mejía y Juan Miguel Osorio por aceptar
incondicionalmente el asesoramiento de esta investigación.
iv
Gracias a mis demás familiares, amigos y compañeros de trabajo por su constante
apoyo y a todas aquellas personas que colaboraron de manera directa o
indirectamente aportando su tiempo y conocimientos para la realización de esta
tesis.
MUCHAS GRACIAS A TODOS
v
ÍNDICE GENERAL
Pág.
AGRADECIMIENTO iii
ÍNDICE GENERAL v
ÍNDICE DE CUADROS vii
ÍNDICE DE FIGURAS viii
ABREVIATURAS UTILIZADAS x
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN 4
2. REVISIÓN DE LITERATURA 7
2.1 Las enfermedades en la piña y su importancia 7
2.2 Fusariosis en la piña 8
3. ASPECTOS METODOLÓGICOS 9
3.1 Muestreo 9
3.2 Identificación morfológica 12
3.2.1 Medios de cultivos para Fusarium spp. 12
3.2.2 Procesamiento 14
3.3 Identificación microbiológica 15
3.3.1 Caracteres utilizados para la identificación de las especies en plato
Petri
16
vi
3.4 Identificación molecular 17
3.5 Análisis filogenético 19
4. RESULTADOS 20
4.1 Síntomas a nivel de campo 20
4.2 Determinación morfológica 22
4.3 Reacción de cadena de polimerasa 29
4.4 Amplificación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños 30
4.5 Análisis por secuenciación 32
5. DISCUSIÓN 35
6. CONCLUSIÓN 44
7. RECOMENDACIONES 47
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 48
vii
ÍNDICE DE CUADROS
Pág.
Cuadro 1. Distribución de las muestras colectadas 10
Cuadro 2. Oligos usados para la amplificación de la región conservada de
ITS (generales) y Calmodulin (específicos)
18
Cuadro 3. Características morfológicas de los aislados de Fusarium
colectados en piña de las áreas productoras de Panamá Oeste -
Parte A
37
Cuadro 4. Características morfológicas de los aislados de Fusarium
colectados en piña de las áreas productoras de Panamá Oeste -
Parte B
38
Cuadro 5. Características morfológicas de los aislados de Fusarium
colectados en piña de las áreas productoras de Panamá Oeste -
Parte C
39
Cuadro 6. Comparación de los resultados obtenidos en morfología,
amplificación y secuencias del gen ITS, genbank y Fusarium ID /
MLST
42
Cuadro 7. Comparación de los resultados obtenidos en morfología,
amplificación y secuencias del gen Calmodulin, genbank y
Fusarium ID / MLST
43
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Mapa de localización geográfica de Empacadora Las Yayas
(Finca N°3)
11
Figura 2. Mapa de localización geográfica de Finca Castulo (Finca N°4) 11
Figura 3. Imagen A: Placa izquierda y derecha con medio CLA, imagen B:
Placa izquierda con medio PDA y placa derecha con medio SA
14
Figura 4. Plantación de piña afectada por fusariosis 20
Figura 5. Daño causado por fusariosis en el tallo de la planta 21
Figura 6. Coloración de los diferentes aislamientos en el medio Potato
Dextrose Broth
22
Figura 7. Clamidosporas: A y B - F. solani, C y D - F. oxysporum 24
Figura 8. Macroconidias: A - F. fujikuroi, B - F. chlamydosporum, C - F.
oxysporum, D - F. subglutinans
25
Figura 9. Microconidias: A - F. oxysporum, B - F. subglutinans, C - F.
solani, D - F. Fujikuroi
26
Figura 10. Fialides: A -F. fujikuroi, B - F. solani, C - F. oxysporum, D - F.
subglutinans
27
Figura 11. Esporoquío: A - F. oxysporum, B - F. chlamydosporum, C - F.
solani, D - F. fujikuroi
28
Figura 12. Representación esquemática de la región de ADNr del gen 29
ix
espaciador transcrito interno con oligos ITS4 e ITS5. Las
posiciones aproximadas utilizadas para la amplificación y
secuenciación del ADN están indicadas por flechas
Figura 13. Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos
ITS4 / ITS5
30
Figura 14. Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos
SUB1 / SUB2
31
Figura 15. Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos
CLOX1 / CLOX2
31
Figura 16. Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos
PRO1 / PRO2
32
Figura 17. Análisis filogenético usando método de máxima verosimilitud
(¨maximum likelihood¨) de secuencias del locus ITS para
especies del complejo Fusarium.
33
Figura 18. Análisis filogenético usando método de máxima verosimilitud
(¨maximum likelihood¨) de secuencias del locus Calmodulin
para especies del complejo Fusarium.
34
Figura 19. Especies de Fusarium encontrados en el estudio 44
Figura 20. Especies de Fusarium encontrados por finca 45
x
ABREVIATURAS UTILIZADAS
PDA: Potato dextrose agar = Agar de dextrosa de papa
PDB: Ptato dextrose broth = Caldo de dextrosa de papa
CLA: Carnation leaf-piece agar = Agar de pedazos de hojas de clavel
SA: Soil agar = Agar suelo
µm: micrometro
CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide = Bromuro de cetiltrimetilamonio
ITS: Internal transcribed spacer = Espaciador transcrito interno
pb: pares de bases
SSU: Small subunit = Subunidad pequeña
LSU: Large subunit = subunidad grande
ADN: Acido desoxirribonucleico
NCBI: National Center for Biotechnology Information = Centro Nacional de
Información Biotecnológica
MLST: Fungal Biodiversity Center = Centro de Biodiversidad Fúngica
1
RESUMEN
Las enfermedades fúngicas constituyen uno de los principales factores
limitantes para aumentar la producción de piña en las zonas tropicales. La
fusariosis causada por Fusarium spp., es considerada una de las principales
enfermedades en este cultivo en la provincia de Panamá Oeste, en la República
de Panamá. Este estudio se basó en el género Fusarium para registrar una base
de datos de cepas nativas de 54 muestras de plantas infectadas recolectadas en
áreas de producción de piña. Las muestras de tejido de piña con síntomas
similares a la enfermedad de fusiarosis, se colocaron en agar dextrosa de papa
(PDA), caldo de dextrosa de papa (PDB), agar de hoja de clavel (CLA) y agar
de suelo (SA) para obtener aislados de Fusarium. Estos aislados fueron
incubados a +22˚C y se observaron en estereoscopio y microscopio, donde se
registraron datos como el cambio de color en el medio de cultivo, la forma de
las conidias, entre otros aspectos. Los métodos moleculares consistieron en la
amplificación, secuenciación, y análisis filogenético de dos loci ampliamente
utilizados en estudios similares: el ITS completo y una región del gen
Calmodulin. La amplificación por PCR se realizó utilizando oligos de regiones
conservadas: gen ITS (ITS4/ITS5) y gen Calmodulin (CLOX1/CLOX2,
SUB1/SUB2, PRO1/PRO2). Se identificaron especies como F. oxysporum, F.
subglutinans, F. fujikuroi, F. solani y F. chlamydosporum mediante el uso de
estudios morfológicos y claves taxonómicas; y de igual manera se confirmaron
mediante PCR y análisis de secuencias. Se realizó un árbol de máxima
verosimilitud, comparándolas con las secuencias de los aislados seleccionados
en la base de datos de secuencias de Fusarium. El objetivo de este trabajo fue
generar información de los hongos del género Fusarium presentes en la piña,
alimentando la base de datos de los departamentos gubernamentales encargadas
de la vigilancia, realizando una actualización en cuanto a plagas presentes y no
presentes, con miras a diseñar un manejo integrado del patogeno y la
enfermedad.
2
Palabras claves: Fusarium, piña, morfología, molecular, ITS, Calmodulin
ABSTRACT
Fungal diseases are one of the main limiting factors to increase pineapple
production in tropical areas. Fusariosis disease caused by Fusarium, is
considered one of the main diseases in this crop in the province of Panama
Oeste, in the Republic of Panama. This study focused on the genus Fusarium to
register a database of native isolates from 54 samples of infected plants
collected in pineapple production areas. Pineapple tissue samples with
symptoms-like of the fusariosis disease were mounted on potato dextrose agar
(PDA), potato dextrose broth (PDB), carnation leaf agar (CLA) and soil agar
(SA) to obtain isolates of Fusarium. These isolates were incubated at +22˚ C
and were observed under a stereoscope and microscope, where data was
recorded such as color changes in the culture medium, the shape of the conidia,
among other aspects. The molecular methods consisted in the amplification of
DNA sequences, sequencing, and phylogenetic analysis of two widely used
loci: the complete ITS region and one section of the Calmodulin gene. PCR
amplification was performed using oligos from conserved regions: ITS gene
(ITS4/ITS5) and gene Calmodulin (CLOX1/CLOX2, SUB1/SUB2,
PRO1/PRO2). We identified F. oxysporum, F. subglutinans, F. fujikuroi, F.
solani and F. chlamydosporum through the use of morphological studies and
taxonomic keys; and they were also confirmed by PCR and sequence analysis.
A maximum likelihood tree was made, comparing them with the sequences of
the selected isolates in the Fusarium sequence database. The aim of this work
was to generate information about the fungi of the genus Fusarium present in
the pineapple production area, feeding the database of the government
departments in charge of the surveillance, making an update regarding present
3
and not present pests, and design a better management of the pathogens and the
disease.
Keywords: Fusarium, pineapple, morphology, molecular, ITS, Calmodulin
4
1. INTRODUCCIÓN
La piña (Ananas comosus L. Merr), es nativa del sur de Brasil y Paraguay
(California Rare Fruit Growers, 1996). Al iniciar la conquista española en
América, encontraron la piña ya domesticada y ampliamente cultivada por los
aborígenes, los cuales sembraban varios tipos y por su forma le recordaba la fruta
del árbol de pino, y la nombraron piña. Aunque, su verdadero nombre de origen
Guaraní, es Ananá, donde proviene su nombre científico (Bartholomew et al.,
2002). En 1535, fue introducida a España y a fines del siglo XVII ya era conocida
en la mayoría de las regiones tropicales del mundo. En Europa se le cultivaba en
invernaderos hasta que comenzaron a llegar los frutos importados. Hoy en día se
cultiva en todas las regiones tropicales del mundo (Bartholomew et al., 2002).
Es el cultivo mayormente producido en la provincia de Panamá Oeste,
ocupando el 56% de la producción nacional. La producción de las otras provincias
es la siguientes: Chiriquí el 28%, Bocas del Toro el 10%, Coclé el 3%, Los Santos
y Veraguas el 1% (Cepeda, 2012). Anualmente, se destinan alrededor de 3,000
hectáreas para la producción de piña, pero en el 2010 la actividad registró un leve
revés por las inclemencias del clima, bajos rendimientos por Fusarium spp. y el
alce de los insumos Agropecuarios (Cepeda, 2012).
El 90% del producto, de las 3,000 hectáreas sembradas a nivel nacional, se
exporta y solo el 10% restante, es vendido en el mercado nacional. El éxito que ha
tenido la piña panameña fue marcado a nivel mundial, luego de que el país
participara por primera vez en la feria internacional Fruit Logistic 2011, un evento
de frutas frescas y exóticas en la ciudad de Berlín, Alemania (Cepeda, 2012). La
exportación de piña representa un factor importante para la economía del país,
alcanzando ingresos por la suma de 37.5 millones de balboas, generando un
significativo número de empleos directos e indirectos (Cepeda, 2012).
5
A pesar de las bondades del cultivo, su alto valor de exportación y su alto valor
nutritivo, la producción de piña es afectada por múltiples factores bióticos y
abióticos (Ploetz, 2006). Entre los factores bióticos, las enfermedades causadas
por hongos, causan gran merma en la producción de este cultivo. Esta planta
perenne es susceptible a un número de enfermedades fungosas, de la cual, la
fusariosis es las más severa (Ploetz, 2006). La enfermedad afecta a todas las
partes de la planta, dañando particularmente a los frutos y el tallo. El agente
causante de la fusariosis, son varias especies de hongos pertenecientes al género
Fusarium (Ploetz, 2006).
Geiser et al., 2008, indicaron que las especies de hongos filamentosos tales
como Fusarium, colectivamente representan el grupo más importante de
patógenos de plantas. Este investigador coincide con Summerell et al., 2003, en
los esfuerzos para comunicar con precisión, que varias especies de Fusarium son
responsables de enfermedades de las plantas y la contaminación de los alimentos
por toxinas; pero estas afectaciones se han visto obstaculizadas, porque la mayoría
de las especies son difíciles de diferenciar por su misma morfología, haciendo
necesario un estudio de estos organismos a nivel genómico para complementar los
estudios de morfología.
Las especies de este hongo se pueden distinguir unas de otras, basándose en
características morfológicas y las comparaciones sistemáticas de secuencias de
ADN (Harrow et al., 2010). Las características morfológicas utilizadas para
distinguir entre especies en este grupo, incluyen disposición del conidióforo en el
micelio aéreo, el número de aberturas en las conidiógenas como las monofiálides
y polifiálides (Aoki et al., 2001). La identificación tradicional de las especies de
Fusarium se hace comúnmente basándose en sus características micro y
macroscópicas. Sin embargo, estas características son en su mayoría inestables y
requieren de otro método de comparación (Nelson et al., 1983).
6
La caracterización de la población de hongos patógenos es importante para
entender su biología y para el desarrollo de estrategias efectivas para el control de
patógenos (Malvick y Percich, 1998), y para los estudios moleculares entre los
individuos, siendo este uno de los componentes de la estructura de la población
(Leung et al., 1993).
7
2. REVISIÓN DE LITERATURA
La piña es una planta monocotiledónea perteneciente a la familia de las
Bromeliáceas, de los cuales existe cerca de 50 géneros y alrededor de 2,000
especies, de la mayoría son xerofitas epífitas, por lo que pueden vivir sobre otras
plantas. Todos los tipos cultivados de la piña pertenecen al género Ananas y en
particular a la especie comestible comosus (Rebolledo et al., 1998).
2.1 Las enfermedades en la piña y su importancia.
Las enfermedades en plantas de piña pueden ser causadas por distintos
organismos y constituyen uno de los elementos limitantes dentro de la producción
de cualquier cultivo, de aquí que el control de los patógenos, sea un factor a tener
presente desde la producción de hijuelos y plantación, hasta la cosecha y post
cosecha (Sandoval, 2004). Si se señalan los patógenos más importantes, en orden
decreciente, en cuanto a daño económico que puedan causar estos serían: hongos,
bacterias y virus. Adicionalmente existen otros patógenos de importancia
secundaria como son los fitoplasmas y los viroides (Sandoval, 2004).
En el mundo se tienen identificadas 467 especies de organismos nocivos y
asociadas a las plantas de piñas, de las cuales, 213 son plagas insectiles y 254
fitopatógenos. Si se agregan 187 especies de malezas reportadas en el cultivo,
suman un total de 654 los posibles organismos dañinos que pueden afectar de
alguna manera la producción y comercialización de esta fruta (Montilla, 1995).
8
2.2 Fusariosis en la piña
Fusarium es un género amplio y diverso de hongos con diversas características
ecológicas, desde saprofitos, productores de micotoxinas, controladores
biológicos, fitopatógenos e incluso patógenos de humanos (Summerell et al.,
2010). La fusariosis es una enfermedad considerada por los expertos como la
mayor amenaza para el cultivo de la piña en el ámbito mundial, debido a la
susceptibilidad que presentan a este patógeno las principales variedades
comerciales de piña para exportación (OIRSA, 2018). Esta enfermedad afecta la
fruta, rebrotes, coronas y la planta en general, permaneciendo largo tiempo en los
residuos vegetales. Durante el desarrollo del cultivo, todas las partes de la planta
pueden mostrar exudación de goma de los tejidos infectados. Este patógeno
sobrevive en los retoños o hijos. Si se presenta en etapas tempranas del cultivo, el
hongo destruye la planta completamente (OIRSA, 2018).
La diversidad genética dentro de este género es alta, y hay especies que han
demostrado tener subespecies complejas (O'Donnell et al., 2013). Las especies de
Fusarium del suelo, por ejemplo, las diferentes formae speciales de F. oxysporum,
son responsables de marchitez vascular severa o pudrición en las raíces en una
amplia gama de cultivos de importancia económica (Alabouvette et al., 2009).
Fusarium guttiforme ha sido frecuentemente asociado con la fusariosis de la piña
en Brasil (Ploetz, 2006), mientras que Fusarium subglutinans emerge como la
principal causa asociada a la putrefacción núcleo inicial de la fruta en Hawai
(Rohrbach y Pfeiffer, 1976). En los últimos años, estudios de secuenciación han
proporcionado nuevas oportunidades para estudiar las comunidades de hongos en
diferentes ambientes (Nicolaisen et al., 2014). Sin embargo, la región ITS, que es
ampliamente utilizado en estudios de comunidades de hongos (Lindahl et al.,
9
2013), no proporciona una resolución profunda y marcada a nivel de especie para
todas las especies de Fusarium (Nicolaisen et al., 2014; O'Donnell et al., 1998).
En el estudio de Mulè et al., 2004, desarrollaron oligos específicos de
Fusarium, para profundizar en la diversidad de Fusarium. Se dirige al gen
Calmodulin, y es usado desde entonces en la filogenética para detección de
muchos hongos. Como método de control, López et al., 2005, evaluó el
tiabendazol en Fusarium sp., que inhibió por completo el crecimiento micelial.
Además de este fungicida, el prochloraz presentó una inhibición total del
crecimiento de F. oxysporum f.sp. cubense agente causal del marchitamiento o
mal de panamá en bananas evaluado in vitro; del mismo modo, se encontró que
fue el mejor fungicida para el control de la enfermedad in vivo (Nel et al., 2007).
3. ASPECTOS METODOLÓGICOS
3.1 Muestreo
Las muestras colectadas en este estudio proceden de plantas de piña, Ananas
comosus (L.) Merr, localizados en las principales regiones productoras de la
Provincia de Panamá Oeste, Corregimiento de la Chorrera, en los poblados de Las
Yayas, La Arenosa y Las Zanguengas en los meses de mayo, octubre del 2015 y
enero de 2016. Se visitaron seis fincas productoras de piña, cada parcela se
referenció geográficamente con un sistema de posicionamiento global, GPS,
Bushnell Back Track D-Tour, Kansas, United States (cuadro Nº1). Las
coordenadas se mapearon con el programa Google Maps, 2018. (Figura Nº1 y
Figura Nº2).
10
Se colectaron muestras con síntomas característicos de la enfermedad
fusariosis, en las tres localidades citadas anteriormente en la Provincia de Panamá
Oeste. En total se colectaron 54 plantas de piña divididas en 6 fincas (Empacadora
Las Yayas, Finca Piña del Oeste, Empacadora de Piñas, Panamá S.A., Finca
Cástulo, y dos fincas de Cabozarzo S.A.; Cuadro Nº1); que posteriormente se
trasladaron a los Laboratorios del Departamento de la Coordinación de Servicios
Técnicos de Detección y Diagnósticos Fitosanitarios (DCSTDDF), del Ministerio
de Desarrollo Agropecuario (MIDA), localizado en la Provincia de Panamá,
Corregimiento de Tocumen, Rio Tapia, donde se realizaron los análisis
morfológicos y moleculares.
Cuadro N°1 Distribución de las muestras colectadas.
Nº de
Finca Poblado
Nombre de
la finca Coordenadas
Altitud
(m.s.n.m.)
Superficie
(HAS)
Numero
de
muestras
tomadas
1 Las Yayas Empacadora
Las Yayas
8°55'31.52"N
79°50'40.08"W 132 13.5 8
2 Las Yayas Finca Piña del
Oeste
8°56'04.91"N
79°51'24.50"W 123 8 5
3 La Arenosa
Empacadora de
Piña, Panamá
S.A.
9°02'40.64"N
79°55'55.38"W 94 14 8
4 La Arenosa Finca Cástulo 9°02'57.92"N
79°55'35.80"W 95 30 14
5 Las
Zanguengas Cabozarzo S.A.
8°58'38.37"N
79°53'15.60"W 117 9.5 9
6 Las
Zanguengas Cabozarzo S.A.
8°58'45.41"N
79°53'31.46"W 127 11.29 10
11
Figura Nº1 Mapa de localización geográfica de Empacadora Las Yayas (Finca Nº3).
Figura Nº2 Mapa de localización geográfica de Finca Castulo (Finca Nº4).
12
3.2 Identificación morfológica
3.2.1 Medios de cultivos para Fusarium spp.
Agar de Dextrosa de Papa (Potato dextrose agar - PDA).
Es un medio rico en carbohidratos que contiene 20 g dextrosa, 20 g de agar, el
caldo de 250 g de papas; luego se afora hasta un litro con agua destilada (Fisher et
al., 1983; Leslie y Summerell, 2006).
Caldo de dextrosa de papa (Potato dextrose broth - PDB)
Para preparar este medio líquido, se hirvió 200 g de papas peladas en un litro
de agua durante 60 minutos. Transcurrido este tiempo, se filtró, se añadió 20 g de
glucosa y aforó con agua destilada hasta un volumen de un litro.
Agar de pedazos de hojas de clavel (Carnation leaf-piece agar - CLA)
Las hojas de clavel fresco, se cortaron en 5-8 mm² por pieza, se secaron en un
horno microondas durante 3 a 4 minutos. Los trozos de hojas secas se cubrieron
en papel aluminio y se esterilizaron por irradiación con luz ultravioleta durante
una hora. Para la preparación del agar, se colocó de 8 a 10 trozos de hojas de
clavel estéril en una placa de Petri y se adicionó el agar recién extraído del
autoclave (20 g de agar en un litro de H2Od) (Fisher et al., 1982).
13
Agar suelo (Soil agar - SA)
Se preparó mediante la colocación de 250 g de suelo de arcilla negra seca, se
tamizó y se llevó el volumen total a un litro con agua destilada y se esterilizó por
15 min a 121°C y 15 PSI. Luego, se añadió 15 g de agar y se sometió a
esterilización nuevamente (Klotz et al., 1988).
14
3.2.2 Procesamiento
Las muestras fueron lavadas con agua del grifo para quitar el exceso de tierra y
luego con agua destilada, seguido se partieron a la mitad de la planta con un
cuchillo previamente esterilizado. Con escalpelos estériles se procedió hacer
cortes de 1 cm x 1 cm, se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio
(clorox comercial), al 1% durante 1 min y finalmente, se enjuagaron tres veces
con agua destilada estéril. Posteriormente se colocó en platos conteniendo agar de
papa dextrosa (PDA), agar suelo (SA) y agar de hojas de clavel (CLA) para
caracteres microscópicos (Fisher et al., 1982; Fisher et al., 1983; Klotz et al.,
1988; Tuite, 1969). Se incubaron las muestras en un ambiente controlado, a
+23°C con 12 horas luz/oscuridad, durante 8 días para los medios PDA y 20-25
días para los medios SA y CLA (Salleh y Sulaiman, 1984).
Figura Nº3 Imagen A: Placa izquierda y derecha con medio CLA, imagen B: Placa izquierda con
medio PDA y placa derecha con medio SA.
15
3.3 Identificación microbiológica
Para características microscópicas, de las muestras obtenidas de los
aislamientos cultivados en PDA durante 8 días, se seleccionaron 50 esporas y
fueron medidos en cuanto a longitud, anchura y cantidad de septas. Las muestras
obtenidas de los aislamientos cultivados en CLA, y AS, durante 20-25 días,
fueron observados en el estereoscopio y microscopio para detectar presencia de
estructuras de sobrevivencia. Para la manifestación del color, se transfirió una
pequeña masa de esporas a un medio de caldo de dextrosa de papa (PDB), se
colocó 50 ml en un tubo de Erlenmeyer, luego se agitó a 170 RPM a una
temperatura de incubación de 26°C. Tras dos días después de la agitación, se
presentó cambio de coloración. La identificación morfológica en platos petri, se
basó en los caracteres descritos por Nelson et al., 1983, Burgess et al., 1994 y
Leslie y Summerell, 2006. La longitud de las estructuras, fueron medidos
utilizando el programa Motic Images Plus 2.0. Para la observación microscópica,
se ejecutaron con el objetivo de 40x en un microscopio Motic BA 410E; mientras
que la observación estereoscópica, se ejecutaron en un estereoscopio Motic SMZ-
161.
16
3.3.1 Caracteres utilizados para la identificación de las especies
en plato petri.
Las características importantes que se tomaron en cuenta en la identificación de
especies de Fusarium fueron (Burgess et al., 1994):
Forma de las macroconidias;
Presencia o ausencia de microconidias;
Forma y modo de formación de microconidios;
Naturaleza de las células conidiógenas (fiálide).
Presencia o ausencia de clamidosporas;
17
3.4 Identificación molecular
Para la extracción de ADN, se utilizó cultivos monospóricos puros (ver cuadro
Nº6 y cuadro Nº7). El micelio se recolectó con una espátula y se transfirió a un
papel filtro Whatman para dejar secar. Una vez seco, se colocó en un papel
aluminio y se guardó una temperatura de -80°C hasta posterior uso.
La extracción de ADN se ejecutó utilizando el protocolo CTAB de acuerdo
con Torres et al., 1993 con ciertas modificaciones, provistas por la Dra. Gesabel
Navarro Velasco. Estas modificaciones consistieron en dejar toda la noche con 1
ml de etanol puro frio a -20ºC, eliminar el sobrenadante por medio de pipeteo en
lugar de tirarlos y adicionar 3 min en el centrifugado durante la precipitación. La
calidad del ADN obtenido se verificó por electroforesis en un gel de agarosa al
0.70% teñido con GelRed, Biotium® y se visualizó en un fotodocumentador Gel
Doc-Ite Imaging System, UVP®. La concentración del ADN, se determinó
midiendo la densidad óptica a una longitud de onda de 260/280 nm, empleando
para ello un espectrofotómetro BioDrop® modelo Touch PC. Para la
amplificación por PCR, se emplearon los oligos mencionados en el cuadro N° 2.
18
Cuadro Nº 2 Oligos usados para la amplificación de la región conservada de ITS (generales) y
Calmodulin (específicos).
Nombre Secuencia del oligo 5´ - 3´
Tamaño del
fragmento de
ADN (pb)
Referencia
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 550
White et al., 1990
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White et al., 1990
CLOX1 CAGCAAAGCATCAGACCACTATAACTC 534
Mulè et al., 2003
CLOX2 CTTGTCAGTAACTGGACGTTGGTACT Mulè et al., 2003
SUB1 CTGTCGCTAACCTCTTTATCCA 631
Mulè et al., 2004
SUB2 CAGTATGGACGTTGGTATTATATCTAA Mulè et al., 2004
PRO1 CAGCAAAGCATCAGACCACTATAACTC 585
Mulè et al., 2004
PRO2 CTTGTCAGTAACTGGACGTTGGTACT Mulè et al., 2004
Cada mezcla de reacción de PCR contenía de 20 a 30ng de ADN genómico,
0.5 µl de cada nucleótido, 2µl de buffer de PCR 10X, 0.6 µl de 50 mM de MgCl2,
0.4 µl de 10 mM de dNTP mix y 2.5 U de Taq ADN polimerasa (Brasil,
Invitrogen®), y se completó con agua ultra pura (Amresco, LLC), hasta completar
un volumen total de 20 µl. El programa de PCR consistió en desnaturalización a
94°C durante 3 min, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 45 s, 64.5°C durante 30
s, 72°C durante 50 s, y una extensión final de 72°C durante 10 min. Para la
amplificación con los oligos específicos, se utilizó el programa de PCR descrito
anteriormente, excepto que la temperatura de anidamiento, fue a 60.8°C para las
especies F. fujikuroi y F. subglutinans; y 64.6°C para F. oxysporum. Los
productos amplificados fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa a
1%, se tiñó con GelRed, Biotium® y se corrió a razón de 100 voltios por una hora
y media. El producto amplificado se visualizó en el fotodocumentador Gel Doc-
Ite Imaging System, UVP®.
19
3.5 Análisis filogenético
Treinta y dos muestras representativas de aislados de Fusarium (ver cuadro
Nº6 y cuadro Nº7) se secuenciaron los amplicones de los loci ITS y Calmodulin
(dieciséis muestras en cada loci) utilizando los mismos oligos que aparecen en el
cuadro Nº2, empleando el servicio de secuenciación de la compañía Macrogen,
Korea, Inc. Las secuencias obtenidas usando los oligos “forward’ y “reverse” para
cada loci, fueron analizadas para control de calidad y ensambladas en una
secuencia final con el programa Sequencher 5.4.6. Las secuencias finales de cada
loci fueron utilizadas para hacer dos alineamientos, uno para ITS y otro para
Calmodulin usando el programa Muscle implementado en el programa MEGA7.0
(Kumar et al., 2015). Se hizo un análisis filogenético para cada loci,
específicamente un análisis de máxima verosimilitud con 1,000 réplicas bootstrap,
manteniendo los parámetros por defecto del programa MEGA 7.0. Adicional, las
secuencias de ADN generadas en este estudio, se obtuvieron secuencias de otras
especies de Fusarium disponibles en la base de datos Genbank para la inferencia
filogenética. Las secuencias ITS con los números de acceso KR071623,
KR071624, MH055398, MH040823, DQ655731,KR071665, HQ625613,
MH141316, EU520242, KM076600, NR_111889, KU604034, KR071671,
KU604035, KU097246, KX951457, KY315572; y las secuencias Calmodulin con
los números de acceso AF158332, KU603998, KU603995, KU603996,
KU604001, KU603983, KC964164, KC964162, EU418438, FR828826,
AF158365 se usaron para alinearlos con las secuencias de este estudio. Además,
las secuencias de ITS, Hypocrea lutea y Hypocrea minutispora (número de
acceso Genbank, HE649471, JN943444); y las secuencias de Calmodulin,
Neonectria candida, Neonectria neomacrospora (número de acceso Genbank,
KM231315, KM231313), se usaron como grupo externo.
20
4. RESULTADOS
4.1 Síntomas a nivel de campo
Se encontraron varios focos de infección en los campos muestreados que van
con plantaciones de cinco a ocho meses de edad. Se observó parches dentro de los
lotes, esto se caracteriza por muerte regresiva en las plantas infectadas, que tienen
una apariencia de secado, amarillamiento en las hojas en la parte superior hacia la
base ocasionando marchitez (Figura Nº4). Muchas hojas tenían una afectación por
arriba del 60 %, por lo que la presencia de la fusariosis estaba extendida en la
planta, tomando en cuenta puede atacar a cualquier edad de la planta.
FiguraNº4 Plantación de piña afectada por fusariosis.
Entre las características que se pudo observar en el tallo de la planta en su
parte terminal, se mostraba oscura y en las secciones transversales, ocasionando
21
una pudrición seca de color marrón, con apariencia de corcho en el centro del área
afectada. Las raíces que están unidas al tallo, tienen poco desarrollo (figuras Nº5).
Mediante el medio de cultivo PDA se obtuvo una producción abundante de
macroconidias y microconidias; además se obtuvo la aparición de esporodoquios
con el medio a base de hojas de clavel. La producción de clamidosporas en las
especies que poseen estas estructuras de sobrevivencia, fue abundante mediante el
uso del medio con suelo SA.
Figura Nº5 Daño causado por fusariosis en el tallo de la planta.
22
4.2 Determinación morfológica
Se identificaron 54 aislados de Fusarium mediante el aspecto morfológico.
Los aislados mostraron diferentes características morfológicas, principalmente
el color en el medio de cultivo. Nelson et al., 1983, realizó una caracterización
morfológica utilizando la coloración en medio de cultivo, mostrando una amplia
gama de colores en su trabajo (figura Nº6). Por lo general, los colores no son
diagnósticos para una especie. El desarrollo del hongo inicio a partir del segundo
día, posteriormente se manifestaron diversos colores en el medio de cultivo.
Figura Nº6. Coloración de los diferentes aislamientos en el medio Potato Dextrose Broth.
Otras características observadas, fueron la forma de la microconidias,
macroconidias (forma de ápice, base, números de septas, tamaño), presencia de
clamidosporas y esporodoquios (cuadro Nº3 al cuadro Nº12). Las características
estructurales de cada especie de Fusarium se presentan en fotos descriptivas
(figuras Nº7 a figura N°11).
23
En F. oxysporum, sus microconidias son abundantes, de forma ovalada, sin
septas, con dimensiones de 6.14 - 15.09 µm x 1.76 - 3.51 µm (figura Nº 9, A;
figura Nº 10, C); y las macroconidias de longitud corta media, en forma recta o
ligeramente curvada, su parte basal con de muescas; a veces, en forma de pie y su
parte apical en forma de gancho, afilado con algo curvatura, con dimensiones de
21.07 - 43.81 µm x 2.7 - 3.55 µm; lo usual fue observar 3 septas y rara veces 4 o 5
septas (figura Nº 8, C). Las clamidosporas están presentes de manera abundante,
con forma redonda, paredes gruesas (Figura Nº7, C - D); y esporodoquios de color
crema (figura Nº 11, A).
Para los aislados de F. subglutinans, sus microconidias son abundantes, de
forma oval, no se observó septas, con dimensiones de 6.71 - 13.01 µm x 1.92 -
3.29 µm (figura Nº 9, B; figura Nº 10, D); y las macroconidias de forma esbelta,
su parte basal poco desarrollada y su parte apical algo curvada, con dimensiones
de 29.23 - 44.73 µm x 3.01 - 4.83 µm; contaba con 3 septas (figura Nº 8, D). No
hay clamidosporas y el esporodoquio es de color naranja pálido.
Los aislados de F. fujikuroi, sus microconidias son abundantes, oval,
usualmente sin septas, algunas veces con 1 septa, con dimensiones de 4.71 -
11.01µm x 1.67 - 2.72 µm (figura Nº 9, D; figura Nº 10, A); y las macroconidias
de longitud media, delgada, su parte basal algo redondeada y su parte apical algo
cónico, con dimensiones de 18.27- 44.07 µm x 2.54- 3.93 µm, se observaron 3-5
septas (figura Nº 8, A). No hay clamidosporas y el esporodoquio es de color
naranja pálido (figura Nº 11, D).
Los aislados de F. chlamydosporum, sus microconidias son abundantes,
moderadamente curvada como una pestaña, algunas veces con 1 septa, con
dimensiones de 2.79 x 11.78 µm; y las macroconidias, moderadamente curvadas,
su parte basal termina en una muesca; la parte apical es curva y puntiaguda, con
24
dimensiones de 2.93 x 38.79 µm, se observó de 3 a 4 septas (figura Nº 8, B),
algunas veces 5 septas. Las clamidosporas están presentes; y esporodoquios de
color naranja (figura Nº 11, B).
En los aislados de F. solani ̧ sus microconidias son abundantes, pueden ser
oval, reniforme, con 0 o 1 septa, con dimensiones de 8.61 - 15.09 µm x 2.11 -
4.79 µm (figura Nº 9, C; figura Nº 10, B); y las macroconidias es algo ancha y
robusta, su parte basal termina algunas veces en forma de pie poco desarrollado,
su parte apical es poco papilado y despuntado, con dimensiones de24.88 - 43.81
µm x 3.21- 5.07µm; usualmente con 4 o 5 septas. Las clamidosporas están
presentes (Figura Nº7, A - B) y el esporodoquio es de color crema (figura Nº 11,
C).
Figura Nº7 En la figura A y B se observó clamidosporas emparejadas de paredes gruesas de F.
solani contenida en una masa de micelio, algunas veces había cadenas de cuatro células. En la
figura C y D se observó clamidosporas de F. oxysporum con paredes más delgadas, algunas veces
en cadenas sobre una masa de macroconidias. Escala de magnificación = 40x.
25
Figura Nº8 Macroconidias: A - Esporas de F. fujikuroi relativamente erecta, casi no tiene
curvatura, su parte basal algo redondeada y su parte apical algo cónico. B - Esporas de F.
chlamydosporum moderadamente curvadas, su parte basal termina en una muesca; la parte apical
es curva y puntiaguda C - Esporas de F. oxysporum con longitud corta a mediada con pared
delgada, ápice ligeramente curvado y base en forma de gancho, D - Esporas de F. subglutinans de
forma esbelta, su parte basal poco desarrollada y su parte apical algo curvada. Escala de
magnificación = 40x.
26
Figura Nº9 Microconidias: A - Esporas de F. oxysporum en forma ovoide, algunas veces en forma
arriñonada. B - Esporas de F. subglutinans de forma oval, alargado. C - Esporas de F. solani en
forma oval y reniforme. D - Esporas de F. fujikuroi usualmente ovales y algunas veces en cadenas.
Escala de magnificación = 40x.
27
Figura Nº10 Fiálides: A -F. fujikuroi, B - Largas monofialides de F. solani, C - Cortas
monofialides de F. oxysporum, D - Presencia de mono y polifialides de F. subglutinans. Escala de
magnificación = 40x.
28
Figura Nº11 Esporodoquio: A - Abundante en CLA, color crema F. oxysporum, B - Abundante en
CLA, color naranja F. chlamydosporum, C - Abundante en CLA, color crema F. solani, D -
Abundante en CLA, color naranja pálido F. fujikuroi.
29
4.3 Reacción de cadena de polimerasa
Para la determinación de los aislados de Fusarium, se analizó con oligos
específicos de Calmodulin para detectar F. oxysporum que genera un amplicón de
534 pb, F. subglutinans que amplifica 631 pb y F. proliferatum que amplifica 585
pb; estos oligos fueron desarrollados por Mulè et al., 2004. Este gen es la proteína
codificadora del calcio que está altamente conservada, implicada en la regulación
de una amplia variedad de eventos celulares y metabólicos (Toutenhoofd y
Strehler, 2000). Además, se utilizó un ensayo de PCR usando oligos desarrollados
por White et al., 1990, que amplifican una región de 600 pb, y codifica para el
gen espaciador transcrito interno (ITS), abarcando parte la subunidad menor
(SSU), la subunidad mayor (LSU) y la totalidad de la 5.8S (figura Nº12).
Figura Nº12 Representación esquemática de la región de ADNr del gen espaciador transcrito
interno con oligos ITS4 e ITS5. Las posiciones aproximadas utilizadas para la amplificación y
secuenciación del ADN están indicadas por flechas.
30
4.4 Amplificación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños
Figura Nº13 Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos ITS4/ITS5, amplificó
550 a 660 pb para Fusarium spp. Imagen de arriba = M: Marcador de peso molecular 100pb; cinco
muestras de la investigación; C-: control negativo; C+: control positivo; NT: blanco. Imagen de
abajo = M: Marcador de peso molecular 100pb; siete muestras de la investigación; C-: control
negativo; C+: control positivo; NT: blanco.
31
Figura Nº14 Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos SUB1 / SUB2,
amplificó a 631 pb para F. subglutinans. M: Marcador de peso molecular 100pb, diez muestras de
la investigación, C-: control negativo; NT: Blanco.
Figura Nº15 Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos CLOX1 /CLOX2,
amplificó 534 pb para F. oxysporum. M: Marcador de peso molecular 100pb; doce muestras de la
investigación; C-: control negativo; C-: C+: control positivo; NT: blanco.
32
Figura Nº16 Gel de agarosa al 1% mostrando amplificación con los oligos PRO1 / PRO2,
amplificó 585 pb para F. fujikuroi. M: Marcador de peso molecular 100pb; seis muestras de la
investigación; C-: control negativo; C+: control positivo; NT: blanco.
4.5 Análisis por secuenciación
Con la región ITS, los dieciséis aislados de Fusarium formaron cinco clados
separando las especies. Comparando estos aislados con secuencias tipo, obtenidas
del Genbank, se pudo determinarla presencia de F. subglutinans, F. oxysporum, F.
chlamydosporum, F. fujikuroi y F. solani con un soporte de bootstrap de 1,000
repeticiones, con un valor por arriba de 48% en un análisis de máxima
verosimilitud (figura Nº17). El árbol de la región Calmodulin, los dieciséis
aislados de Fusarium formaron tres clados separando las especies. También se
comparó estos aislados con secuencias tipo, obtenidas del GenBank, y se
determinó la presencia de F. subglutinans, F. oxysporum y F. fujikuroi con un
soporte de bootstrap de 1,000 repeticiones, con un valor por arriba de 27% en un
análisis de máxima verosimilitud (figura Nº18).
33
Figura Nº17 Análisis filogenético usando método de máxima verosimilitud (¨maximum
likelihood¨) de secuencias del locus ITS para especies del complejo Fusarium. Se utilizó
secuencias de Hypocrea lutea e Hypocrea minutispora como grupos externos en el análisis
exogrupo. Las secuencias marcadas en círculo negro son secuencias de Fusarium aislados en
Panamá y generadas en este estudio. Los números debajo de los nodos representan valores de
bootstrap mayores a 70% después de 1000 réplicas.
34
Figura Nº18 Análisis filogenético usando método de máxima verosimilitud (¨maximum
likelihood¨) de secuencias del locus Calmodulin para especies de Fusarium. Se utilizó secuencias
de Neonectria candida e Neonectria neomacrospora como grupos externos en el análisis
exogrupo. Las secuencias marcadas en triangulo negro son secuencias de Fusarium aislados en
Panamá y generadas en este estudio. Los números debajo de los nodos representan valores de
bootstrap mayores a 70% después de 1000 réplicas.
35
5. DISCUSIÓN
Los síntomas de las plantas observadas en campo y afectados por fusariosis,
son muy similares a aquellos descritos por Vásquez y Mata, 2014; por los estratos
marcados de marchitez de las hojas. Igualmente, las raíces presentaron pudrición
seca en la parte basal del tallo causando obstrucción en la xilema, donde Ibrahim
et al., 2015 con las especies F. oxysporum, F. solani y F. chlamydosporum; y
Mùle et al., 2004 con la especie F. subglutinans; Ibrahim et al., 2016 con la
especie F. fujikuroi informaron que estos hongos causan pudrición en la raíz de la
planta de piña. En la base del tallo se encontró orificios necrosados que pueden
ser fuente de apertura de fitopatógenos secundarios, así como menciona Retana et
al., 2018 que en el cultivo de apio causó síntomas similares a lo observado en
piña, sabiendo que fusarium es un hongo cosmopolita. Estos síntomas podrían
confundirse en campo con los ocasionados con la bacteria Ralstonia
solanacearum, que también ocasiona parches de amarillamiento en hojas y
pudrición del tallo, con la diferencia que la mayoría de las veces la lesión es
acuosa y emite olores fétidos.
Mientras tanto Rivera, 1999 y Agrios, 2005 indicaron que F. oxysporum, F.
solani y F. chlamydosporum pueden permanecer en el suelo principalmente por
como clamidosporas. Cuando las plantas comienzan a desarrollarse y crecer, estos
estímulos hacen germinar las clamidosporas, por exudados que secretan
directamente en las puntas de las raíces, a través del área donde la raíz lateral se
forma o finalmente a través de una herida hecha por insectos, nematodos u otro
organismo (incluyendo el hombre).
De igual manera, Mùle et al., 2004 menciona que F. subglutinans pueden estar
en el suelo, siendo fuente de inoculo activo, para ocasionar un considerable daño a
la planta. Una vez ingresen estos fitopatógenos a la planta, se mantienen en los
vasos del xilema, donde germinan y producen muchas esporas que se transportan
36
a toda la planta por medio de la savia, ocasionando obstrucción de los haces
vasculares. Además, la penetración del agente puede verse facilitada por factores
abióticos, como el exceso de humedad en el suelo, que provocan la pudrición de
la raíz por deficiencia de oxígeno.
González-Pérez et al., 2009, informa que estas especies difieren en términos de
color de la colonia y características morfológicas, coincidiendo con los resultados
obtenidos en este trabajo para caracteres de clamidosporas, macroconidia y
microconidia, dichas descripciones también coinciden con Leslie y Summerell,
2006, detallándose en los cuadros Nº3 al cuadro Nº5.
37
Cuadro Nº3 Características morfológicas de los aislados de Fusarium colectados en piña de las áreas productoras de Panamá Oeste - Parte A.
Aislado Color Microconidia
Macroconidia Presencia de
clamidospora
Presencia de
esporodoquio Especie
Ápice base #Septa Tamaño
(µm)
**2170.05f Grisáceo claro Oval, a veces con
base truncada
Gancho a
cónico Redonda 3 37.65x3.02 µm No Si F. fujikuroi
**2171.06 Violeta Oval Curvado Apenas con
muescas 3 23.31x3.36 µm Si Si F. oxysporum
**2173.08t Violeta Oval Cónico
Redondeada a
veces en forma
de pie
3 32.93x2.89 µm No Si F. fujikuroi
**2174.09 Grisáceo Oval con base
truncada. Papilado
Apenas con
muescas 3 21.86x3.21 µm No No F. fujikuroi
2175.10 Naranja pálido Oval, elipsoide
Afilado; en
forma de
gancho
En forma de
pie 3 a 4 29.01x3.51 µm Si Si F. oxysporum
*2177.12t Violeta Oval con base
truncada. Papilado
Apenas con
muescas 3 20.86x3.31 µm No No F. fujikuroi
**2178.13 Grisáceo Oval, algunas en
forma de mazo Algo cónico Redondeada 3 a 5 37.44x2.70 µm No Si F. fujikuroi
2180.15 Naranja pálido Oval, reniforme. Curvado Con muescas 3_ 21.07x3.46 µm Si Poco F. oxysporum
**2181.16 Violeta pálido Oval. Curvado Redondeado 3 38.39x3.60 µm No Si F. subglutinans
*2184.19 Violeta Oval, a veces algo
obovoide Algo curvado
Con pequeñas
muescas 3 a 4 34.36x3.50 µm No Si (poco) F. subglutinans
*2185.20 Marrón oscuro Delgada Algo curvada Con algo de
muesca 3 a 4 18.79x2.93 µm Si Si
F.
chlamydosporum
**2187.22 Violeta Oval con base
truncada. Cónico
Redondeado
con muesca 3 a 5 44.07x3.13 µm No Produjo poco F. fujikuroi
*2195.30 Violeta Oval En forma de
gancho
En forma de
pies 3 a 4 35.38x3.24 µm Si Si F. oxysporum
*33.01 Crema Oval Algo curvada Poco
desarrollado 3 30.16x3.12 µm No Si F. subglutinans
34.02 Violeta Oval, reniforme.
Forma de
gancho, algo
curvo
Forma de pie 3 a 4 38.56x3.25 µm Si Si F. oxysporum
36.04 Violeta pálido Oval, algunas
reniforme
Con algo
curvatura
Con algo de
muesca 3 41.13x3.35 µm No Si F. subglutinans
37.05 Crema Oval, algunas
obovoides Curvado
Poco
desarrollada 3 a 4 36.46x3.62 µm No Si F. subglutinans
38.06 Naranja pálido Oval, a veces con
base truncada.
Forma de
gancho con algo
curvatura
Algo cónico;
forma de pie 3 a 4 37.38x3.34 µm Si Si F. oxysporum
* Muestras que fueron amplificados con gen ITS y enviados a secuenciar.
** Muestras que fueron amplificados con gen Calmodulin y enviados a secuenciar.
38
Cuadro Nº4 Características morfológicas de los aislados de Fusarium colectados en piña de las áreas productoras de Panamá Oeste - Parte B.
Aislado Color Microconidia
Macroconidia Presencia de
clamidospora
Presencia de
esporodoquio Especie
Ápice Base #Septa Tamaño
(µm)
*39.07h1 Violeta oscuro Oval Algo papilado Con algo de
muescas 3 35.26x3.23 µm No Si (Poco) F. subglutinans
**39.07h2 Crema Oval, algunas son
periformes
Con algo de
curvatura
Con algo de
muesca, poco
desarrollada
2 a 3 37.46x3.94 µm No Si F. subglutinans
41.09 Crema Oval, reniforme Algo de muesca En forma de
pie 3 a 4 33.77x3.25 µm Si Si F. oxysporum
42.10 Amarilla Oval Con algo de
curvatura
Con algo de
muescas 3 a 4 44.73x3.12 µm No Si F. subglutinans
43.11 Crema Oval Algo papilado Con algo de
muesca 3 41.38x3.66 µm No Si F. subglutinans
*44.12 Violeta oscuro Oval, algunas
obovoides Curvado
Poco
desarrollada 3 32.51x3.52 µm No Si F. subglutinans
**45.13 Violeta Oval Algo curvado Con algo de
muescas 3 41.22x3.35 µm No Si F. subglutinans
*46.14 Violeta Oval Cónico, algo
curvada
Poco
desarrollada 3 a 4 38.20x3.97 µm No Si F. subglutinans
*47.15 Violeta Oval, algo elipsoide Algo curvada Con algo de
muescas 2 a 3 35.13x3.61 µm No Si (poco) F. subglutinans
48.16 Crema Oval, elipsoide. Forma de
gancho Forma de pie. 3 a 4 35.82x3.21 µm Si Si F. oxysporum
49.17w Crema Reniforme Papilado (forma
de delfín). Forma de pie. 3 42.95x4.47 µm Si Si F. oxysporum
*49.17r Crema Oval, reniforme Redondeado
Delgado, a
veces con
muesca
5 a 6 38.65x3.21 µm Si Si F. solani
*50.18 Crema claro Oval, reniforme Redondeado Delgado 5 32.66x3.21 µm Si Si F. solani
**54.22 Naranja pálido Oval, reniforme Forma de
gancho.
Forma de pie;
con muescas 3 a 4 31.64x3.09 µm Si Si F. oxysporum
**56.24 Grisáceo Oval Algo cónica Un poco en
forma de pie 3 35.13x2.88 µm No Si F. fujikuroi
57.25 Naranja pálido Oval, elipsoide. Cónica Con algo de
muescas 3 20.44x2.73 µm Si Si F. oxysporum
59.27 Grisáceo Oval Cónico, forma
de gancho Forma de pie; 3 42.27x3.45 µm Si Si F. oxysporum
* Muestras que fueron amplificados con gen ITS y enviados a secuenciar.
** Muestras que fueron amplificados con gen Calmodulin y enviados a secuenciar.
39
Cuadro Nº5 Características morfológicas de los aislados de Fusarium colectados en piña de las áreas productoras de Panamá Oeste - Parte C.
Aislado Color Microconidia
Macroconidia Presencia de
clamidospora
Presencia de
esporodoquio Especie
Ápice Base #Septa Tamaño
(µm)
C03.64 Violeta pálido Oval; algunas obovoide
con base truncada Algo curvada
Con algo de
muesca 2 a 4 31.26x3.07 µm No Si F. subglutinans
C05.66 Amarillo pálido Oval, Algunas globosa Algo curvada,
algunas papilada
Poco
desarrollada 3 28.89x3.56 µm No Si F. subglutinans
C06.67 Bronceado Algunas obovoide, oval Poco papilado;
despuntado
Con algo
muescas 5-7 24.88x5.07 µm Si Si F. solani
**C07.68 Violeta Oval Curvada Poco
desarrollada 3 a 4 40.12x4.83 µm No Si F. subglutinans
*C12.73 Crema pálido Oval, algunas ovoides y
obovoides
Papilada; a veces
algo cónica
Levemente en
forma de pie 5 43.81x3.55 µm Si Si F. solani
**C14.75 Violeta pálido Oval, algunas obovoide Algo curvada Con algo de
muescas 3 29.23x3.26 µm No Si F. subglutinans
*C16.77 Grisáceo Oval con base truncada Despuntado o
cónico
Poco
desarrollado 3 a 5 42.20x3.93 µm No Si F. fujikuroi
C17.78 Bronceado Oval, elipsoide. Papilada Forma de pie 3 a 4 35.72x3.17 µm Si Si F. oxysporum
**C19.80 Rojo vino Oval, reniforme. Cónica, en forma
leve de gancho. Forma de pie 3 35.82x2.70 µm Si Si F. oxysporum
C22.83 Grisáceo Oval.
Papilada; a veces
en forma de
gancho
Forma de pie 3 a 4 35.40x3.03 µm Si Si F. oxysporum
C23.84 Crema Oval Curvada Poco
desarrollada 3-4 61.01x3.19 µm No Si F. subglutinans
*C24.85 Violeta claro Oval Curvada, algunos
papilado
Algunos con
forma de pie 3 42.83x3.01 µm No Si
F.
subglutinans
C25.86 Violeta grisáceo Oval, arriñonada Papilada, a veces
algo cónica Con muescas 3 a 4 31.90x2.76 µm Si Si F. oxysporum
C27.88 Violeta Algo obovoide Curvada, algo
papilada
Poco
desarrollada 3 a 4 34.56x3.63 µm No No F. subglutinans
*C28.89 Crema Oval, elipsoide,
arriñonada. Algo curvada
En forma de
pie 3 32.29x2.99 µm Si No F. oxysporum
C30.91 Violeta Oval Despuntado; forma
de gancho
Forma de pie;
algo de
muescas
3 23.14x3.28 µm Si Si F. oxysporum
***C31.92 Grisáceo Oval, obovoide. En forma cónica Sin desarrollo 3 a 4 43.80x2.90 µm No Si F. fujikuroi
**C32.93 Violeta Oval, obovoide. Cónico; a veces en
forma de gancho
Poco
desarrollo 3 32.45x2.54 µm
No (se observó
células hinchadas) Si F. fujikuroi
C34.95 Violeta pálido Oval, delgada, algunas
obovoide Algo curvada
Poco
desarrollada 3 33.20x3.80 µm No Si
F.
subglutinans
*Muestras que fueron amplificados con gen ITS y enviados a secuenciar.
** Muestras que fueron amplificados con gen Calmodulin y enviados a secuenciar.
40
Todos los aislados de Fusarium spp. mostraron amplificación (vía PCR),
usando el par de oligos ITS4 / ITS5 y coincidiendo con el tamaño esperado. Se
amplificó un fragmento de ADN a un tamaño esperado de 550-600pb (figura
Nº13). Similares resultados fueron descritos en estudios realizados por Rivas et
al., 2015, que detectaron especies de Fusarium en palma aceitera con el uso de los
oligos mencionados anteriormente. El gen ITS identifica la región de la unidad de
subunidad corta, la ITS1, la 5.8S, la ITS2 y la unidad de subunidad larga del
hongo, por lo que tiene la capacidad de detectar otros géneros de hongos, y no son
específicos para este genero, tal cual fue mencionado por White et al., 1990.
Muchas de las secuencias del gen ITS que están suscritas en Genbank, están
identificadas como Fusarium sp., por lo que también tomamos en cuenta la base
de datos de FUSARIUM ID/MLST (cuadro Nº6).
Para la especificidad de los oligos de Calmodulin, se analizó utilizando el par
de oligos CLOX1 / CLOX2, confirmando la presencia de cinco muestras de F.
oxysporum amplificando un fragmento de 534 pb (figura Nº15), resultados
similares a los obtenidos en Mulé et al., 2003; resultados similares aparecen en la
investigación de Irzykowska et al., 2012 que usaron estos oligos para detectar la
hay presencia de hongos productores de micotoxinas, obteniendo resultados
favorables.
Para la especie F. fujikutoi, se utilizó el par de oligos PRO1 / PRO2 que
amplificó un fragmento de 610 pb, resultando positivas diez muestras a esta
especie (figura Nº16), igual sucedió con la investigación de Rahjoo et al., 2008
que también usaron estos oligos para detección de la especie.
También, se usó el par de oligos SUB1 /SUB 2 que amplificó 631 pb,
resultando positivas para F. subglutinans (figura Nº14), resultados similares a los
obtenidos en Mulé et al., 2004. Además, se reporta la presencia de F.
chlamydosporum, que no había sido amplificado por ningún oligonucleótido
41
especifico, pero si amplificó con los oligos ITS4 / ITS5, y que posteriormente
fueron secuenciadas.
Para confirmar la especificidad de los oligos, se secuenciaron los fragmentos
derivados de las especies estudiadas. Se realizaron consultas con las secuencias
ITS en BLASTn de NCBI, pero estos requieren una cuidadosa revisión de los
principales "ident". La búsqueda se hizo más efectiva con los motores de
búsqueda de Fusarium-ID/MLST, ya que la mayoría de las secuencias que se
encuentran registradas aquí, están nombradas hasta género y especies (O'Donnell
et al., 2015).
La comparación de las secuencias obtenidas con secuencias de calmodulina,
confirmó la especificidad de las especies de estos oligos, ya que las secuencias
fueron 99-100% homólogas (cuadro Nº7). En los análisis filogenéticos utilizando
el método de máxima verosimilitud, se muestra que en las secuencias ITS, se
agrupan cinco clados (Figura Nº 17), diferenciándolos por especies y
posteriormente comparadas con secuencias de aislados tipos obtenidos del
Genbank.
También se realizó un análisis filogenético empleando el método de máxima
verosimilitud, usando las secuencias de Calmodulin, se agrupan tres clados
(Figura Nº 18). Por lo que las secuencias de este gen, también han sido
investigados por O'Donnell et al., 2000, donde demostró ser altamente confiable
para el análisis filogenético en el complejo Gibberella fujikuroi y otras especies
relacionadas con Fusarium.
42
Cuadro Nº6 Comparación de los resultados obtenidos en morfología, amplificación y secuencias del gen ITS, genbank y Fusarium ID/ MLST.
Muestra ID GenBank Ident. Número de
acceso
Fusarium ID /
MLST Ident.
Número de
acceso Morfología PCR
2177.12 Fusarium fujikuroi CBS
221.76 100% NR_111889.1
Fusarium fujikuroi, CBS
257.52 100% KU604035 F. fujikuroi F. fujikuroi
2184.19 Fusarium subglutinans
isolate 07038 100% MG274315.1
Fusarium subglutinans
strain CBS 136481 99% KR071625 F. subglutinans F. subglutinans
2185.20
Fusarium
chlamydosporum isolate
Ng30
99% MH141316
Fusarium
chlamydosporum strain
CBS 635.76
98% KR071665 F.
chlamydosporum
F.
chlamydosporum
2195.30 Fusarium oxysporum,
strain: IFM 64210 100% LC317608.1
Fusarium oxysporum,
Isolate CBPPR0037 100% KT211529 F. oxysporum F. oxysporum
33.01 Fusarium subglutinans,
strain CBS 119831 99% KR071624
Fusarium subglutinans
CBS 119831 99% 119831 F. subglutinans F. subglutinans
39.07h1 Fusarium subglutinans,
strain CBS 119831 99% KR071624
Fusarium subglutinans
CBS 119831 99% 119831 F. subglutinans F. subglutinans
44.12 Fusarium subglutinans,
strain CBS 747.97 99% KR071623
Fusarium subglutinans
CBS 747.97 99% 747.97 F. subglutinans F. subglutinans
46.14 Fusarium subglutinans,
strain CBS 119831 99% KR071624
Fusarium subglutinans
CBS 119831 99% 119831 F. subglutinans F. subglutinans
47.15 Fusarium subglutinans
strain CBS 136481 99% KR071625
Fusarium subglutinans
CBS 136481 99% 136481 F. subglutinans F. subglutinans
49.17r Fusarium solani, Isolate
CBPPR0025 100% KT211517
FD_01867 (Fusarium
solani) 98%
http://isolate.fusari
umdb.org/sequenc
e.php?a=dv&id=1
6739
F. solani F. solani
50.18 Fusarium solani, Strain
FRC#s839 98% DQ094719
FD_01867 (Fusarium
solani) 96%
http://isolate.fusari
umdb.org/sequenc
e.php?a=dv&id=1
6739
F. solani F. solani
C12.73 Fusarium solani, Strain
H8 100% JF323002
FD_01867 (Fusarium
solani) 98%
http://isolate.fusari
umdb.org/sequenc
e.php?a=dv&id=1
6739
F. solani F. solani
C16.77 Fusarium fujikuroi,
strain: CBS 221.76 100% AB725607.1
Fusarium fujikuroi, CBS
257.52 100% KU604035 F. fujikuroi F. fujikuroi
C24.85 Fusarium subglutinans
strain CBS 136481 99% KR071625
Fusarium subglutinans
CBS 136481 99% 136481 F. subglutinans F. subglutinans
C28.89 Fusarium cf. oxysporum
33C 100% KF555228.1
Fusarium oxysporum,
UOA/HCPF 14295 100%
UOA/HCPF
14295 F. oxysporum F. oxysporum
C31.92 Fusarium fujikuroi CBS
221.76 100% NR_111889.1
Fusarium fujikuroi,
strain CBS 130402 100% KU604034 F. fujikuroi F. fujikuroi
43
Cuadro Nº7 Comparación de los resultados obtenidos en morfología, amplificación y secuencias del gen Calmodulin, genbank y Fusarium ID / MLST.
Muestra ID GenBank Ident. Número de
acceso Fusarium ID / MLST Ident.
Número de
acceso Morfología PCR
2170.05f Fusarium fujikuroi,
strain 55987 100% LT575188
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusar
iumdb.org/sequen
ce.php?a=dv&id=
13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
2171.06 Fusarium oxysporum,
isolate ITEM 13490 99% FR828826.1
FD_01142 (Fusarium
oxysporum) 99%
http://isolate.fusariumdb.org/sequence.ph
p?a=dv&id=13463 F. oxysporum F. oxysporum
2173.08t Fusarium fujikuroi
strain CBS 221.76 100% KU603995.1
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusariu
mdb.org/sequence.php?a=dv&id=13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
2174.09 Fusarium fujikuroi
strain YT2-4 99% MF356530
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusariumdb.org/sequence.ph
p?a=dv&id=13389 F. fujikuroi F. fujikuroi
2178.13 Fusarium fujikuroi,
strain 55987 100% LT575188
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusar
iumdb.org/sequen
ce.php?a=dv&id=
13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
2181.16 Fusarium subglutinans
strain M20020 99% KC964164
Fusarium subglutinans
strain CBS 119831 99% KU603983.1 F. subglutinans F. subglutinans
2187.22 Fusarium fujikuroi
strain CBS 221.76 100% KU603995.1
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusariu
mdb.org/sequence.php?a=dv&id=13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
39.07h2 Fusarium subglutinans
strain M16084 99% KC964162
Fusarium subglutinans
strain CBS 119831 99% KU603983.1 F. subglutinans F. subglutinans
45.13 Fusarium subglutinans
strain M16084 99% KC964162
Fusarium subglutinans
strain CBS 119831 99% KU603983.1 F. subglutinans F. subglutinans
54.22 Fusarium oxysporum,
ITEM 13490 99% FR828826.1
FD_01142 (Fusarium
oxysporum) 100%
http://isolate.fusariu
mdb.org/sequence.php?a=dv&id=13463
F. oxysporum F. oxysporum
56.24 Fusarium fujikuroi
strain CBS 221.76 100% KU603995.1
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusariu
mdb.org/sequence.php?a=dv&id=13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
C07.68 Fusarium subglutinans
strain M16084 99% KC964162
Fusarium subglutinans
strain CBS 119831 99% KU603983.1 F. subglutinans F. subglutinans
C14.75 Fusarium subglutinans
strain M16084 99% KC964162
Fusarium subglutinans
strain M16084 100% KC964162 F. subglutinans F. subglutinans
C19.80 Fusarium oxysporum,
isolate I13490 99% FR828826.1
FD_01142 (Fusarium
oxysporum) 99%
http://isolate.fusariu
mdb.org/sequence.php?a=dv&id=13463
F. oxysporum F. oxysporum
C31.92 Fusarium fujikuroi
strain CBS 221.76 100% KU603995.1
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusariu
mdb.org/sequence.php?a=dv&id=13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
C32.93 Fusarium fujikuroi,
strain 55987 99% LT575188
FD_01169 (Fusarium
fujikuroi) 100%
http://isolate.fusar
iumdb.org/sequen
ce.php?a=dv&id=
13389
F. fujikuroi F. fujikuroi
44
6. CONCLUSIÓN
En los campos de cultivo de piña establecidos en la Provincia de Panamá
Oeste, se encontró casi en su totalidad la presencia de algún tipo de Fusarium,
mediante los métodos morfológicos, y cuyos porcentajes se mostran en la figura
Nº19.
Figura Nº19 Especies de Fusarium encontrados en este estudio.
De acuerdo con la cantidad de aislados encontrados por finca, se concluye que
en la finca Cabozarzo S. A. se aisló el 35.18% de los aislados totales, Finca
Castulo se aisló el 25.92%, Empacadora de Piña, Panamá. S. A. se aisló el
14.82%, Empacadora Las Yayas se aisló el 14.82% y la Finca Piña del Oeste se
aisló el 9.26%, datos que se observan en la figura Nº20.
38.9%
33.3%
18.5%
7.4%
1.9%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Especies de Fusarium encontrados en el estudio.
F. subglutinans F. oxysporum F. fujikuroi
F. solani F. chlamydosporum
45
Figura Nº20 Especies de Fusarium encontrados por finca.
El ensayo de PCR, permitió la detección confiable de F. oxysporum, F.
fujikuroi y F. subglutinans utilizando los oligos específicos CLOX1 / CLOX2,
PRO1 / PRO2 y SUB1 / SUB2; siendo estas dos últimas especies, nuevos reportes
en la República de Panamá. Adicional se encontró la especie F. chlamydosporum
empleando los oligos ITS4 / ITS5. No se encontró F. guttiforme en este estudio.
Muchas especies de Fusarium están estrechamente relacionadas entre sí,
especies tales como Fusarium proliferatum y Fusarium fujikuroi que tienen
similitudes, ya que descifrar una especie con análisis morfológico se vuelve
difícil. Por lo que es imperante y casi obligatorio el uso de herramientas
moleculares, para confirmar la identidad de estos microorganismos.
[VALOR]%
9.26%
11.11%
14.82%
5.56%
1.85%
5.56%
9.26%
11.11%
9.26%
1.85% 1.85%
5.56%
[VALOR]% [VALOR]%
1.85%
0
2
4
6
8
10
12
14
16
EmpacadoraLas Yayas
Finca Piña delOeste
Empacadorade Piña,
Panamá. S.A.
Finca Castulo CabozarzoS.A.
Especies de Fusarium encontrados por finca.
F. subglutinans F. oxysporum F. fujikuroi
F. solani F. chlamydosporum
46
Los resultados sugieren que el protocolo de PCR generado es eficiente, por lo
que se puede considerar como una nueva herramienta económica para la
identificación de hongos para los laboratorios de DCSTDDF.
El análisis morfológico es un proceso que toma muchos días, pero es mucho
más económico a deferencia de los análisis moleculares que es más costoso, pero
con mayor precisión que el proceso mencionado inicialmente. Los estudios
morfológicos tienen buen aporte debido a los detalles fenotípicos y formas del
organismo en estudio, pero es de vital importancia complementarlo con estudios
moleculares.
Por todo lo anterior, se realiza primer reporte oficial de estas especies
encontradas en piña, aportando información esencial a la Dirección Nacional de
Sanidad Vegetal.
47
7. RECOMENDACIONES
Los resultados obtenidos indican que el gen ITS, pueden utilizarse como un
enfoque alternativo para distinguir entre especies fúngicas, aunque se recomienda
el gen TEF1, RPB1 o RPB2 para estudios con Fusarium porque las secuencias
ITS que están reportadas en Genbank están limitados en especies, ya que la
mayoría están depositadas en la base de datos como Fusarium sp.
Para controlar estos hongos, se recomienda más que todo el uso buenas
prácticas agronómicas, alternándolo con aplicaciones de controladores biológicos,
tal como es el uso de Trichoderma, donde existen reportes que este hongo diezma
el crecimiento de Fusarium (Pérez et al., 2009; Sánchez et al., 2015).
También existen tratamientos químicos muy efectivos como el oxicloruro de
cobre, triazol, zineb, maneb e mancozeb.
Coordinar permanentemente con el Departamento de Vigilancia del Ministerio
de Desarrollo Agropecuario para hacer actualizaciones de los fitopatógenos
presentes en campo, para tener una constante actualización de la base de datos.
48
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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