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UNIVERSIDAD ESTATAL
PENÍNSULA DE SANTA ELENA
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
ESCUELA DE BIOLOGÍA MARINA
FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN
DE LA TESIS DE GRADO
2004
UNIVERSIDAD ESTATAL
PENÍNSULA DE SANTA ELENA
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
ESCUELA DE BIOLOGÍA MARINA
“Caracterización de la insulina en el camarón Penaeusvannamei”
TESIS DE GRADO
Previa a la obtención del Título de:
BIÓLOGO MARINO
FRANCISCO HERNAN POZO MIRANDA
LA LIBERTAD – ECUADOR
2004
UNIVERSIDAD ESTATAL
PENINSULA DE SANTA ELENA
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
ESCUELA DE BIOLOGÌA MARINA
“Caracterización de la insulina en el camarón Penaeusvannamei”
INFORME DE TESIS DE GRADO
Previa a la obtención del Título de:
BIÒLOGO MARINO
FRANCISCO HERNAN POZO MIRANDA
LA LIBERTAD – ECUADOR
2004
DECLARACIÓN EXPRESA
La responsabilidad para los hechos, ideas y doctrinas expuestos en esta tesis, me
corresponden exclusivamente y patrimonio intelectual de la misma, al Centro Nacional
de Acuicultura e Investigaciones Marinas, CENAIM .
Francisco Pozo M.
DEDICATORIA
Dedico este trabajo de tesis de grado a mis padres: Sr. Francisco Pozo Borbor y Sra.
Cleotilde Bertha Miranda Mateo por que me supieron darme de muchas formas, el
amor, afecto, estimulo y apoyo en las horas mas difíciles de mi vida, me dieron el
animo necesario para no rendirme y sesar el impetud de mi ideal, por eso de manera en
particular y afectuoso les agradezco de verdad.
Seria injusto de mi parte, olvidarme de mis hermanos: Wilmer, Selenita, Haidee, Angel,
Sandra Pozo Miranda, por brindarme su apoyo en los momentos que lo necesite.
AGRADECIMIENTO
En primer lugar, debo agradecer al Dios del cielo, Jehová, por haberme brindado fuerzas
para poder lograr cada una de mis metas, y a mis Padres por siempre darme sus sabios
consejos y apoyo incondicional.
A las autoridades, Rector Ab. Xavier Tómala M., Vice-rector Ec. George Clemente, al
Director de la unidad Academica Ing Gonzalo Tamayo y personal Académico de la
Universidad Estatal Península de Santa Elena por liderar el proceso de formación
profesional.
Al director del Cenaim Jorge Calderón Ph. D. por haberme brindado la oportunidad de
realizar mi tesis en el centro de investigación.
Agradecer en particular a Ana Gutiérrez Ph. D(c) Tutor de tesis del CENAIM porque
con sus ideas científicas profesionales orientó el trabajo, cumpliendo de manera eficaz.
En lo personal, gracias por ayudarme en el desarrollo de la tesis.
A Julia Nieto Ph. D. por haber tenido siempre confianza en mí y por haberme apoyado
desde el primer día de mi tesis, demostrándome con su dedicación por su trabajo, que
todo en la vida exige dedicación y esmero.
A Enrique Blacio Ms. C. encargado de asuntos estudiantiles, por ayudarnos en todo
momento que necesitábamos de él.
A José Melena Ph. D(c) por tus explicaciones, tus ideas ingeniosas, tu buen humor y tu
enorme paciencia; ayudándome en más de una ocasión.
A Blgo. Fabrizzio Echevería, por la paciencia y confianza que tuvo al permitirme
trabajar en el laboratorio de Inmunología durante las pruebas de ELISA.
Gracias a todos mis compañeros de Pre-grado, por todos esos buenos momentos que
hemos pasado juntos, por vuestra ayuda en el trabajo y vuestro apoyo moral en los
momentos difíciles: Jorge Malave, Marcelo Suarez, Yomara de la Cruz, Yessenia Pozo
y Martha Borbor.
Gracias a mis amigos que están lejos, tan diferentes entre ellos, pero me apoyaron
incondicionalmente, que me aconsejaron de manera sincera y honesta, que a pesar de la
distancia los tengo siempre presente: Winsor Aguirre Ph. D., Tecnol Anastacia Yela
Montes. Candy Suastegui (Samy), Tatiana Torres.
Agradecer a todas las personas que me han apoyado durante todo este tiempo, esa gente
que ha hecho que mi día a día haya sido mucho más llevadero.
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO Págs.
ABREVIATURAS
TABLA DE CONTENIDO
INDICE DE TABLAS
INDICE DE FIGURAS
INTRODUCCIÓN
1. ANTECEDENTES 4
1.1 GENERALIDADES DE LA ENDOCRINOLOGÍA 4
1.2 SISTEMA ENDOCRINO 5
1.2.1 Tipos de Transmisión Química 6
1.2.2 Transmisión Neurocrina 6
1.2.3 Transmisión Endocrina 6
1.2.4 Transmisión Neuroendocrina 6
1.2.5 Transmisión paracrina 7
1.2.6 Transmisión autocrina 7
1.3 SISTEMA ENDOCRINO DE DECÁPODOS 7
1.4 MUDA Y CRECIMIENTO EN DECAPODOS 8
1.4.1 Control de la muda 9
1.4.2 La Hormona Inhibidora de la muda (HIM) 10
1.4.3 Órgano Y 11
1.5 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS EN CRUSTÁCEOS 12
1.5.1 Control hormonal de la Glucosa 16
1.6 PÉPTIDOS TIPO INSULINA 17
1.6.1 Insulina 17
1.6.2 Factor de crecimiento tipo insulina (IGF) 19
1.7 PÉPTIDOS TIPO INSULINA EN ARTROPODOS 20
1.8 ENSAYO DE INMUNOABSORBANCIA DE ENZIMA LIGADA
(ELISA) 22
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 ANIMALES 25
2.2 EFECTO DE INSULINA / IGF SOBRE ÓRGANOS Y 25
2.2.1 Diseño experimental 25
2.2.2 Dilución de Hormonas 26
2.2.2.1 Insulina 26
2.2.2.2 Factor de Crecimiento Tipo Insulina (IGF) 26
2.2.3 Determinación de Estadío de Muda 27
2.2.4 Disección del Órgano Y 28
2.2.5 Cultivo de órganos "Y" in vitro 29
2.2.6 ENSAYO DE INMUNOABSORVANCIA DE ENZIMA LIGADA
(ELISA) 31
2.2.6.1 Curva estándar 31
2.2.6.2 Protocolo De La Técnica Elisa 32
2.3 EFECTO DE INYECCIÓN DE INSULINA/IGF SOBRE METABOLISMO DE LA
GLUCOSA 35
2.3.1 Diseño experimental 35
2.3.2 Extracción de hemolinfa 35
2.3.3 Extracción de tejidos 36
2.3.4 Extracción de hepatopáncreas 36
2.3.5 Extracción del músculo 36
2.3.6 Extracción de branquias 37
2.3.7 Análisis de Glucosa 37
2.3.7.1 Curva estándar de glucosa(Kit Sigma) 37
2.3.7.2 Protocolo de análisis de glucosa(Kit Sigma) 38
2.3.8 Determinación de glucógeno 38
2.3.8.1 Preparación de suero enzimático 38
2.3.8.2 Preparación Curva de calibración (5-40 ug) 39
2.3.8.3 Análisis de la muestra 40
3. RESULTADOS.
3.1 EFECTO DE PEPTIDOS TIPO INSULINA EN LA PRODUCCIÓN DE
ECDIESTEROIDES 41
3.1.1 Interacción de los estadíos de muda con insulina bovina en
cultivos in vitro 41
3.1.2 Interacción de los estadios de muda con IGF-I en cultivos in vitro 42
3.2. EFECTO INYECCIÓN PEPTIDOS TIPO INSULINA SOBRE NIVELES
DE GLUCOSA 43
3.2.1 Niveles de Glucosa en hemolinfa 43
3.2.2. Niveles de Glucógeno en tejidos 46
3.2.2.1. Hepatopancreas 46
3.2.2.2. Músculo 48
3.2.2.5. Branquias 50
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ABREVIATURAS y SIMBOLOGIA
ANOVA Análisis de varianza
AS4919 Anticuerpo 4919
B 0 Absorbancia del control
B Absorvancia del blanco
BSA Bovine serum albumene( suero de albumina de bovino)
c/u Cada uno.
CDNA Acido Desoxiribonucleico copia.
E Ecdysone
ELISA Enzyme Linked Inmunoorbent Assay (Anlisis Inmunoabsorvancia con
Enzima Ligada)
Fig Figura
GAR Goat anti-rabitt (anticonejo)
h Horas
IGF I Insulin-like Growth Factor I (Factor de Crecimiento tipo insulina I)
IGF II Insulin-like Growth Factor I (Factor de Crecimiento tipo insulina II)
L Litro
M Molar
M199 Medio de Cultivo 199
mg Miligramo
ml Mililitro
mm Milimetros
mM Milimolar
ng Nanogramo
nm Nanometro
OY Órgano Y
pH Potencial de hidrogeno
r.p.m. Revoluciones por minuto.
t Tiempo
v/v Volumen / Volumen
20-E 20-hidroxyecdisone
0 C Grados Celsius.
µg Microgramo
M Micromolar
l Microlitro
INDICE DE CUADROS
Contenido. Pag.
Tabla # 1. Niveles de Glucosa en Hemolinfa 44
ÍNDICE DE GRAFICOS
Figura 1. Ubicación del órgano Y, en Penaeidos 11
Figura 2. Estructura de ecdiesteroides en crustáceos 12
Figura 3. Diagrama de la vía de glucolisis y fosfato
pentosa, en el metabolismo de la glucosa 14
Figura 4. Estructura química de; (a) Glucosa, (b) piruvato. 16
Figura 5. Diagrama de la estructura de la insulina. 19
Figura 6. Estructura biológica del IGF 20
Figura 7. Esquema del protocolo del análisis de inmunoabsorvancia
de enzima ligada para la determinación de ecdiesteroides 24
Figura 8. Caracterización de estadios de muda mediante observación
microscópica directa 27
Figura 9. Curva Standard de glucosa 38
Figura 10. Efectos de concentraciones de insulina sobre ecdiesteroides 42
Figura 11. Efectos de concentraciones de IGF-I sobre ecdiesteroides 43
Figura 12. Efectos de Insulina/IGF-I sobre el nivel de Glucosa en hemolinfa 45
Figura 13. Efectos de insulina/IGF-I sobre el nivel de glucógeno
Hepatopancreas 48
Figura 14. Efectos de concentraciones de insulina/IGF-I sobre el nivel de
glucógeno en músculo. 49
Figura 15. Efectos de concentraciones de insulina/IGF-I sobre el nivel de
glucógeno en branquias. 51
INTRODUCCIÓN
La acuicultura se expandió rápidamente en varios países de Latinoamérica en vías de
desarrollo con el afán de incrementar la producción del camarón, pero el año 2000, ha
sido el mas difícil en la historia de la industria camaronera en el Ecuador debido al
impacto sufrido por la enfermedad de la Mancha Blanca(WSSV), el cual rebaso
cualquier expectativa negativa.
Actualmente la industria camaronera en el Ecuador, producto del ataque agresivo de este
virus, aun enfrenta problemas relacionados al bajo crecimiento y altas mortalidades lo
cual ha reducido el nivel de producción. Estos problemas pueden deberse a una inadecuada
practica de manejo.
Esta situación evidencia que es necesario estudios fisiológicos para desarrollar
estrategias de manejos adecuadas a la capacidad del animal y así incrementar la
producción. Sin embrago, estudios relacionados a los factores (ambientales, nutricional,
hormonales) que controlan el crecimiento en camarón son escasos.
Recientes estudios muestran a la insulina como potencial factor de crecimiento en
invertebrados. En la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el nemátodo C.
elegans, ha sido demostrado la presencia de receptores de insulina cuya mutación causa
defectos en el crecimiento y desarrollo (Chen et al., 1996: Kimura et al., 1997).
Resultados similares fueron obtenidos en moluscos(Smit et al., 1991). Así, se considera
el estudios con Insulina, como la opción mas clara para controlar el crecimiento.
Paralelamente, péptidos tipo insulina han sido relacionados con el proceso de muda en
artrópodos. La muda o eliminación de la cutícula es la culminación del periodo del
crecimiento. Este proceso esta regulado por las hormonas ecdiesteroides producidas
por el órgano Y de crustáceos (Jegla et al., 1990) y la glándula prototoracica en
insectos (Nagasawa et al., 1984).
La producción de ecdiesteroides es inhibida por la MIH presente en el pedúnculo
ocular (Chang et al., 1989) o estimulada por la PTTH (Hormona Prototoracicotropica)
en el cerebro (Masura et al., 2000). En insectos ha sido identificado un neuropéptido
con función prototoracicotropica (Ishizaki et al., 1994) y una alta homologia con la
insulina en su secuencia de aminoácidos (Nagasawa et al., 1984). Recientemente, se
tiene evidencia de que péptidos presentes en sistema nervioso estimulan la muda y
crecimiento en camarón(Nieto, 2000; Hatt et al., 1997).
En crustáceos, diversos estudios han demostrado la presencia de un péptido tipo
insulina, que regula el metabolismo de la glucosa en algunos tejidos. Dosis de insulina y
IGF ocasionaron un incremento en el contenido de la glucosa en el hepatopáncreas y el
músculo de Crayfish (Richardson et al., 1996), así como en branquias de cangrejos (
Kucharski et al., 1997).
Indicios sobre la existencia de péptidos tipo insulina en camarones penaeidos han
surgido a partir de estudios inmunohistoquímicos de post larva (Gutiérrez,
comunicación personal).
Diversas funciones son atribuidas a la insulina en artrópodos. Debido a la homologia
entre crustáceos e insectos junto con la información existente sobre la insulina , fue
nuestro objetivo determinar la función que desempeña la insulina en la secreción de
ecdiesteroides y el metabolismo de carbohidratos en camarones juveniles L. vannamei.
1. ANTECEDENTES
1.1 GENERALIDADES DE LA ENDOCRINOLOGÍA
La endocrinología es un campo de la ciencia que se encarga del estudio de la síntesis,
secreción, función hormonal, y de los mecanismos de regulación de la secreción
hormonal. El sistema endocrino tiene un rol importante pues regula los mecanismos
necesarios en los procesos de adaptación de las especies a los cambios ambientales. La
adaptación es un proceso que se desarrolla entre muchas generaciones y en el cual
interviene fundamentalmente el sistema endocrino. Este sistema está sujeto a una serie
de cambios que apuntan a mantener la homeostasis del organismo y la capacidad
reproductiva. El mantenimiento de la homeostasis implica desarrollar mecanismos
adecuados para regular la energía del metabolismo.
De lo anteriormente expuesto podemos decir que la endocrinología puede ser dividida
en dos grandes áreas de estudio:
a.- El metabólico.
b.- El reproductivo
Otras funciones del sistema endocrino son aquellas referidas a los procesos de
diferenciación celular, y en el control del sistema inmunológico.
1.2 SISTEMA ENDOCRINO
El sistema endocrino se fundamenta anatómicamente en las glándulas de secreción
interna o glándulas endocrinas. En la definición clásica, las glándulas endocrinas típicas
están conformadas por células acinares en contacto con una red de vasos sanguíneos.
Esta descripción anatómica se ha modificado en los últimos años para dar paso a una
clasificación funcional (Gonzalez, 1997(a)), de tal manera que ahora se considera como
célula endocrina a toda aquella que secreta una hormona.
La actividad del sistema endocrino es ejecutada por las hormonas mientras que la del sistema
nervioso central es ejecutada por los neurotransmisores. El lugar de acción de un
neurotransmisor o de una hormona se denomina órgano blanco o diana. La forma de acción
sobre el órgano blanco en el sistema nervioso es directa a través del espacio intersináptico, e
indirecta en el sistema endocrino a través de la vía sanguínea(Gonzalez, 1997(b)).
1.2.1 Tipos de Transmisión Química
Las células interactúan unas con otras y modifican su actividad metabólica por acción
de sustancias químicas denominadas transmisores. Existen diferentes tipos de
transmisión química: neurocrina, neuroendocrina, endocrina, paracrina y autocrina
(Rosenfeld, 1994).
1.2.2 Transmisión Neurocrina
Es la que ocurre en el sistema nervioso a través de sustancias químicas denominadas
neurotransmisores, las cuales son liberadas al espacio intersináptico y se unen a un
receptor post-sináptico modificando la actividad metabólica de la célula post-sináptica.
1.2.3 Transmisión Endocrina
Es la que ocurre en el sistema endocrino a través de la liberación de sustancias químicas
denominadas hormonas, que actúan a distancia sobre una célula efectora.
1.2.4 Transmisión Neuroendocrina.
Es la que ocurre por la liberación de sustancias químicas (neurohormonas) en los
terminales nerviosos hacia la circulación, y actúan a distancia sobre una célula efectora.
1.2.5 Transmisión paracrina.
Es la transmisión que ocurre entre dos células adyacentes, donde una de las células
secreta la sustancia (parahormona) que actúa por difusión sobre la célula vecina
modificando su función. Se le conoce también como control local. Bajo este sistema de
transmisión se puede regular la acción de una hormona aumentando o disminuyendo su
acción.
1.2.6 Transmisión autocrina
Es cuando una sustancia química actúa sobre la misma célula que la produce para regular su
secreción.
1.3 SISTEMA ENDOCRINO DE
DECÁPODOS
La endocrinología de crustáceos decápodos está regulada por cuatro tipos de moléculas,
clasificadas como hormonas y como neurorreguladores: péptidos, esteroides, aminas, y
terpenoides. Estos son sintetizados por el sistema endocrino constituido por:
a) neurorreguladoresay órganos neurohémicos y,
b) glándulas endócrinas epiteliales de tipo clásico.
Los principales órganos endócrino son los siguientes:
El complejo órgano X-glándula sinusal del pedúnculo ocular.
El órgano postcomisural, que secreta cromatoforinas .
Los órganos pericárdicos que secretan la hormona cardioaceleradora.
Los órganos Y ( epitelial ) que secreta ecdiesteroides.
La glándula androgenica, propia de los machos, que secreta la hormona
androgénica.
El órgano mandibular que secreta el farnesoato de metilo (equivalente a la
hormona juvenil).
Cada uno de estos órganos que comprenden el sistema endocrino secretan diferentes
tipos de hormonas para regular procesos fisiológicos.
1.4 MUDA Y CRECIMIENTO EN DECAPODOS
El crecimiento se manifiesta como el aumento en longitud, volumen o peso.
Una de las particularidades de la presencia de un exoesqueleto rígido en los crustáceos
es entre otros factores, la restricción del crecimiento a períodos bien definidos. Esta
característica lleva a la eliminación del antiguo exoesqueleto y la formación de uno
nuevo y generalmente de mayor tamaño, siendo el conjunto de estos sucesos conocido
como muda. Este fenómeno es cíclico, alternándose fases de relativo reposo externo con
otras de intensa actividad (Vega et al., 2000).
Luego de los estudios realizados con los cangrejos Cancer pagurus y Maia squinado se
introdujo el concepto de intermuda, como la secuencia de transformaciones
comprendidas entre dos mudas, en cuyo período se cumple un ciclo completo de
modificaciones morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, responsables del crecimiento
(Drach, 1939).
Generalmente, el intervalo entre dos mudas sucesivas puede ser dividido en tres etapas:
postmuda, intermuda y premuda (Drach, 1939), reconociendo cuatro estadíos A, B, C,
D (Robertson et al., 1987). Los estadíos A y B corresponden a la postmuda; el estadío
C a la intermuda; el estadío D a la premuda.
La caracterización de esos estadíos puede resumirse del modo siguiente(Robertson et
al., 1987):
Estadío A: el animal acaba de abandonar la exuvia, continuando la secreción de
la nueva cutícula.
Estadío B: comienzan a endurecerse las diferentes capas de la nueva cutícula.
Estadío C: todo el exoesqueleto se engrosa y endurece. Hay crecimiento de
tejidos y acumulación de reservas.
Estadío D: se reabsorben los minerales y materiales orgánicos del exoesqueleto
y se deposita parcialmente el nuevo exoesqueleto, debajo del viejo.
Cada uno de estos períodos puede reconocerse, y a su vez dividirse en subestadíos, por
cambios tegumentarios externos (grado de rigidez, pigmentación) o internos, como la
formación de las nuevas setas o setogénesis, que permite seguir el ciclo por observación
microscópica directa (Aiken,1973; Reaka,1975; Dexter, 1981; Robertson et al., 1987).
1.4.1 Control de la muda
La exuviación, es la manifestación de un complejo proceso. Esencialmente todos los
tejidos están involucrados en la preparación de la siguiente muda: hay movilización de
reservas, aumento de la división celular y modificación del comportamiento. Como en
el resto de los animales, la coordinación de la serie de eventos necesarios para la ecdisis
a través del tiempo de la intermuda, se efectúa mediante un sistema hormonal (Chang,
1991). El control de la muda de los crustáceos, se debe a la siguiente interacción:
1.4.2 La Hormona Inhibidora de la muda (HIM),que se origina en el complejo
órgano X-glándula sinusal localizado en los pedúnculos oculares (Chang, 1989). La
HIM promueve la formación de nuevos tejidos e inhibe la actividad secretora del
órgano Y (Fig.1)
1.4.3 Órgano Y,es un par de glándulas epiteliales endocrinas localizadas cerca del
músculo aduptor mandíbular, en la cámara prebranquial. Fue descrito como homólogo a
la glándula prototorácica en insectos, como fuente de la hormonas de la muda o
ecdiesteroides : ecdisona, 20-OH-ecdisona, 3-
Dehidroxiecdisona (Chang, 1989) entre otros(Fig.2).
Fig.1. Ubicación del organo Y, en Penaeidos (Sefiani, 1996).
La ecdisona, es transformada en tejidos periféricos, a su forma activa, la
20-hidroxiecdisona (Skinner, 1985) que desencadena la preparación del
organismo para una nueva ecdisis (Skinner, 1985).
Fig.2. Estructura de ecdiesteroides en crustáceos: (a) ecdisona, (b) 20-OH-ecdisona, (c) 3-Dehidroxiecdisona. (tomado de Chang, 1997).
La concentración de ecdiesteroides en la hemolinfa varía drásticamente durante el
transcurso del ciclo de muda. En la postmuda, inmediatamente después de la ecdisis, su
concentración es mínima; luego hay un súbito incremento, alcanzando la máxima
concentración durante la premuda, para luego disminuir en forma abrupta, poco antes de
la muda (De Reggi et al 1975: Dorothy, 1985: Chan, 2000: Nieto, 2000).
Las alteraciones de la concentración ecdiesteroides podrían ser reguladas tanto por los
cambios en la tasa de síntesis y/o liberación de la hormona como por la tasa de
hidroxilación de ecdisona a 20-hidroxiecdisona y su degradación en la hemolinfa
(Skinner et al., 1985; Lachaise et al., 1993).
1.5 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS EN CRUSTÁCEOS
El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que ocurre en el interior de las
células para obtener energía y síntesis de macromoléculas a partir de compuestos
sencillos mediante procesos
metabólico
s.
Varias revisiones han resumido evidencias sobre la existencia de 2 vías para el desdoblamiento
de la glucosa en la obtención de energía en crustáceos, como son la glicólisis y la ruta Fosfato
pentosa (Chang et al., 1983) (Fig.3).
GLUCOSAATPADP
Glucosa-6-fosfatoGLICOLISIS PENTOSA FOSFATO
NADP+
NADPH+H+
Fructosa9-fosfato 6-Fosfoglucono--lactatoATP H2O
H+ADP
Fructosa 1,6-difosfato 6-Fosfogluconato
Dihidroxiacetona GliceraldehidoFosfato 3-fosfato NADP
NAD++PNADPH+H+CO2
Ribulosa-5-fosfatoNAD+H+
1,3-DifosfogliceratoADP
ATP
3-Fosfoglicerato
2-Fosfoglicerato
H2O
FosfenolpiruvatoADP
ATPPiruvato
Figura 3. Diagrama de la vía de glucolisis y fosfato pentosa, en el metabolismo de la glucosa.
Así como los productos finales de la glicólisis son bien conocidos, la producción de NADPH a
través del metabolismo de la glucosa-6-fosfato y la síntesis de ribosa por medio de la ruta
fosfato pentosa, son igual de importantes en la economía energética de los crustáceos. Los
nucleotidos reducidos son cofactores requeridos en la biosíntesis de lípidos, mientras que la
ribosa en un sustrato en el metabolismo de ácidos nucléicos.
Diversos estudios demuestran que las vías para el metabolismo de la glucosa son diferentes por
tejido y por estadio de muda. En el crayfish Oroconectes virilis, la glucosa es metabolizada por
la vía fosfato pentosa durante la intermuda y en premuda esta actividad se reduce por la
activación de la glicólisis (Chang et al.,1983). En contraste con esta informacion, en el crayfish
Pacifastacus leniusculus, el metabolismo de la glucosa ocurrió vía glicólisis durante la
intermuda (Chang et al.,1983) (Fig.3).
Debido a que la literatura existente describe el metabolismo de carbohidratos en diferentes
tejidos, de una multiplicidad de especies de crustáceos, es difícil establecer una sola ruta de
metabolismo de la glucosa (Fig.4). Sin embargo, la información sugiere algunas
generalizaciones:
1. La glicólisis (formación de ácido láctico a partir de glucosa) es la ruta catabólica
principal de la glucosa en el músculo de crustáceos.
2. La relación de catabolismo glicolítico y no glicolítico es más baja en las branquias
y hepatopáncreas que en otros tejidos.
3. La síntesis y degradación del glicógeno varía de manera definida a través del ciclo
de muda y son reguladas por hormonas.
La naturaleza y los niveles de los carbohidratos circulantes en la hemolinfa son afectados por
ciertos parámetros como: el estadio de muda, estrés (Sanders. 1983), temperatura, salinidad
(Ranferi. 2002) y la hormona hiperglicémica (Chung et al., 2003)
a b
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Fig:4. Estructura química de; (a) Glucosa, (b) piruvato. ( tomado de Lehninger, 1982 ).
1.5.1 Control hormonal de la Glucosa
En crustáceos la variación de glucosa a lo largo de un ciclo de muda, se debe a un péptido
estimulador llamado hormona hiperglicemica de crustáceos (CHH). Esta hormona posee en su
estructura: una secuencia de 72 aminoácidos, un piroglutamato unido al terminal amino y una
amino valina al terminal carboxilo.
Las CHHs (CHH-A y CHH-B) son los neuropéptidos más abundantes en la glándula Sinusal
(SG) (Cuzon et al., 2000). Esta neurohormona desempeña un rol importante en la regulación de
la glicemia, incrementa los niveles de D-glucosa en la hemolinfa vía movilización de D-glucosa
almacenada en hepatopáncreas y músculo. El decrecimiento del nivel glicémico se debe a la
reversión del proceso en la producción de D-glucosa en tejidos objetivos , hepatopáncreas y
músculo (Verry et al 2001).
1.6 PÉPTIDOS TIPO INSULINA
1.6.1 Insulina
La insulina (Fig.5) es una proteína dimérica unida por puentes disulfuro, la cual es
sintetizada como un precursor de cadena simple que primero pierde el péptido señal, y
posteriormente pierde un segmento conocido como péptido C, antes de llegar a ser la
molécula hormonal madura (Froesch et al., 1985).
En vertebrados la insulina es producida por un grupo de células endócrinas
pancreáticas (células ß), y su función es mantener los niveles normales de glucosa en la
sangre (Froesch et al., 1985). Los efectos de la insulina sobre sus tejidos blanco, son
metabólicos, promueven la captación de glucosa (Ullrich et al.,1997).
El descubrimiento de la insulina representó un gran paso en la medicina clínica, y
contribuyó sustancialmente al progreso en el campo molecular y endocrinología
comparativa. La importancia del uso de insulina para tratamiento de diabetes trajo gran
interés en esta hormona y consecuentemente se convirtió en un recurso disponible para
estudios de caracterización estructural y funcional (Steiner et al., 1967).
La proinsulina e insulina fueron las primeras hormonas protéicas cuya secuencia de
aminoácidos fue determinada (Ryle et al., 1955; Steiner et al., 1967; Adam et al.,
1996). El cDNA de la insulina fue uno de las primeros en ser clonados por la técnica de
ADN recombinate (Chan et al., 2000). A la vez, con el avance en la endocrinología
molecular se logró determinar la filogenia y el origen evolutivo de la insulina.
Fig.5. Diagrama de la estructura de la insulina, constituida por 51 aminoácidos. La síntesis deinsulina atraviesa diferentes etapas: se fabrica como preproinsulina que luego se transforma enproinsulina al cortarse sus extremos. La mayoría de la proinsulina se separa en dos partes: el“péptido C" (conector) y la insulina, que está constituida por dos cadenas polipeptídicas, una de21 aminoácidos y otra de 30, unidas por dos puentes disulfuro. (Fuente:www.porquebiotecnologia.com.ar)
1.6.2 Factor de crecimiento tipo insulina (IGF)
Posteriormente al descubrimiento de la insulina, se identificaron a los factores de
crecimiento tipo insulina IGF-I y IGF-II, que juntos forman un solo grupo de
polipéptidos, debido un alto grado de homología en la secuencia de aminoácidos y en la
estructura terciaria (Fig .6).
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Fig.6. Estructura biologica del IGF, basada en disfracion de cristal de rayos-X.(Tomado CSIRO, 2004).
Los IGFs son sintetizados por varios tipos de células y tienen efectos autócrinos o
parácrinos sobre células objetivo cercanas, así como desempeñar acción endocrina a
través de la circulación, cuando van acompañados por una proteína enlazante (Sara et
al., 1990).
1.7 PEPTIDOS TIPO INSULINA EN ARTROPODOS
La existencia de péptidos tipo insulina en artrópodos se reportó por primera vez en
1984, con la identificación estructural de un péptido aislado del gusano de seda,
Bombyx mori, capaz de estimular la producción de ecdiesteroides en otra especie,
Samia cynthia ricini. Esta hormona denominada bombixin (Smit et al., 1998; Riehle et
al., 1999), posee gran similitud a la insulina, ambas consisten en dos cadenas
conectadas por varios puentes de disulfuro, comparten igual número de residuos de
Cisteinas asi como el espacio entre ellos en cada cadena. (Smit et al., 1998).
Posteriormente, péptidos tipo insulina han sido identificados en el cerebro de otras
especies de insectos como la mariposa, Calliphora vomitaria, la mosca, Drosophila
melanogaste , y el saltamontes Locusta migratoria (Smit et al., 1998) con función
ecdisotropica.
Similar efecto ecdisiotropico se ha observado en cultivos in vitro de ovarios del
mosquito Aedes aegypti con insulina bovina (Graf et al., 1997).
Además de función ecdisiotropica y promotor de crecimiento, estudios han demostrado
que péptidos tipo insulina regulan el metabolismo de la glucosa en algunos tejidos en
insectos(Verry et al 2001).
En contraste a reportes en insectos, estudios en crustáceos demuestran que péptidos
tipo insulina cumplen una función metabólica. Como lo describe Richardson et al.,
(1997) donde dosis de insulina y IGF ocasionaron un incremento en el contenido de la
glucosa en el hepatopáncreas y el músculo de Crayfish, así como en branquias de
cangrejos ( Kucharski et al., 1997), demostrando que la peptidos tipo insulina actúa en
forma antagónica CHH, causando incremento de glucosa en tejidos
1.8 ENSAYO DE INMUNOABSORBANCIA DE ENZIMA LIGADA (ELISA)
El ensayo inmunoenzimático (EIA) consiste en el uso de anticuerpos que pueden
reconocer el antígeno de interés en una mezcla no purificada de antígeno, cuya
reacción puede ser detectada por la presencia de una enzima unida al anticuerpo.
El término ELISA (ensayo de inmunoabsorbancia de enzima ligada) se aplica a un
método heterogéneo, en el cual la actividad de la enzima se mantiene luego de la
reacción entre el anticuerpo y el antígeno.
El método ELISA del tipo competitivo ha sido diseñado para la cualificación de
ecdiesteroides en artrópodos (Porcheron et el., 1989; De Reggi et al 1992), el cual se
resume en el siguiente método de funcionamiento: El primer anticuerpo (IgG) es
adherido a una fase sólida(fig.6.1); posteriormente se adiciona el antígeno que se desea
cuantificar, luego se agrega otro antígeno marcado con una enzima, estos quedan libres
en el medio y se agrega el segundo anticuerpo considerado como
un antisuero que se unirá al primer anticuerpo e identificara a los antígenos de interés.
Este antisuero reconocerá ambos antígenos, la abundancia del antígeno de interés
indicara mayor o menor grado de unión del antígeno marcado(fig.6.2), lo cual se verá
reflejado al agregar un sustrato(fig.6.3) dando un cambio de color por la reacción con
la enzima, es decir que la intensidad de color (grado de reacción) es inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. La intensidad del color es
leída en un espectrofotómetro, obteniendo resultados en absorbancias (unidades
ópticas). Los resultados son interpolados en la curva estándar de 20-hidroxiecdisona,
la cual ha sido sujeta al mismo proceso que las muestras.
21
√
Fig.7. esquema del protocolo del analisis de inmunoabsorvancia de enzima ligada para ladeterminación de ecdiesteroides(Porcheron et al., 1989).
2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 ANIMALES
Se utilizaron camarones juveniles Penaeus vannamei de 10,31±0.17 gramos de peso, de
piscinas camaroneras de LONETGO (Palmar) y la Estación Experimental de la
Fundacion CENAIM-ESPOL (Palmar). Los 2 grupos de animales fueron mantenidos en
43
áreas separadas.
Para el primer Bioensayo, se utilizó un tanque exterior de 8 toneladas y para el
segundo ensayo un tanque de 18 toneladas del departamento de Maduración (
CENAIM-ESPOL). Ambos tanques fueron mantenidos con un recambio de agua de
100%. La alimentación se basó en un 5% de dieta seca comercial (ABA-Empagran).
2.2. EFECTO DE INSULINA / IGF SOBRE ÓRGANOS Y
2.2.1 Diseño experimental.
El diseño experimental se realizó para la determinación del efecto de la insulina/IGF
sobre la síntesis de ecdiesteriodes en cultivos in vitro de Organos Y, en diferentes
estadios de muda, mediante arreglo factorial 24-5 : donde el factor uno (Insulina/IGF)
posee cuatro niveles (10-3 M, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M), mientras que el factor dos (estadio
de muda) tiene cinco niveles (A-B, C, D 0, D1, D2-3).
Se seleccionaron animales en diferentes estadios de muda (Setogenesis), tomados de
manera aleatoria de un tanque exterior de la Fundación CENAIM-ESPOL, para la
disección del órgano objetivo.
2.2.2 Dilución de Hormonas.
2.2.2.1 Insulina.
Se elaboró una solución madre con 57.33 mg de insulina bovina (SIGMA) en 1 ml de
solución de ácido acético al 0.7%, obteniendo una concentración final de 10-2M.
A partir de la solución stock se preparó diluciones 10-3 M, 10-4 M, 10-5 M y 10-6 M, 10-8
M y 10-10 utilizando medio de cultivo.
2.2.2.2 Factor de Crecimiento Tipo Insulina (IGF)
Se preparó una solución madre con 50 ug de hr-IGF I (SIGMA) en 1 ml de PBS
filtrado (0.22 m), obteniéndose una concentración de 1.3x10-5 M. Posteriormente se
realizó una segunda dilución de 1x10-8 M. en 1 ml de PBS, que fue utilizada para
preparar las diluciones 10-9M, 10-10M, 10-11M y10-12M.
2.2.3 Determinación de Estadío de Muda.
Los estadíos de Muda, fueron establecidos según Robertson (1987),
mediante n observación en microscopio de la parte interna del
urópodo(Fig.7).
Fig.8. Caracterización de estadios de muda mediante observación microscópica directa,según Robertson et al., 1987.
Estadío A: inmediatamente después de la Ecdisis, la matriz celular pigmentada
llena completamente las base setales, duración dos días.
Estadío B: la matriz celular retraída de la base setal, fácilmente reconocida por
el espacio presente ocurrido en la base por retracción, ocurre en el tercer día.
Estadío C: matriz ausente de la base setal y aparecen pigmentadas desde la línea
epidermal hasta la base de las mudas setales, se presenta en el quinto día.
Estadío D1: pigmento retraído desde la base de las mudas sobre la vieja cutícula,
octavo día.
Estadíos D2 – D3: El futuro pigmento retraído y el desarrollo de nuevas setas es
observado en el décimo segundo día, luego se produce la Ecdisis (muda) al
siguiente día (24 horas), se observa el estadio A.
2.2.4 Disección del Órgano Y.
Se colocó al animal en agua salada con hielo por 5 minutos para desacelerar el
metabolismo. Una vez inmovilizado el animal, se realizó un corte para separa el
cefalotórax del abdomen; luego se realizó un segundo corte longitudinal desde la región
dorsal a la ventral del cefalotórax, que lo dividió en dos mitades iguales. Sobre una
bandeja pequeña de metal con agua de mar estéril a 4ºC, se fijó a una almohadilla de
caucho una de las secciones, colocando la parte del exoesqueleto hacia abajo.
A continuación se separó las branquias y apéndices hacia atrás y se sujetó con agujas a
la almohadilla ambos lados, de manera que quedo expuesta la epidermis que recubre la
región branquial. Se realizó un corte, siguiendo la línea de unión de la epidermis con el
exoesqueleto que cubre la cámara branquial, desde donde nace el bránquiopodito hasta
un nervio que se observa transversalmente. Luego se completó el corte hacia arriba y en
los extremos en forma de un rectángulo. Finalmente se transfirió la fina película de
tejido a un microtubo con agua de mar estéril a 4ºC por diez minutos, para su
estabilización previa a la incubación en medio de cultivo.
2.2.5 Cultivo de órganos "Y" in vitro
Una vez disectados los órganos "Y" y estabilizados en agua de mar estéril, durante 10
minutos a 4 °C, se transfirió cada uno de los tejidos a celdas de microplacas (96 celdas
Nunc-Immuno TM surface) que contenían 200 µl/celda de medio de cultivo M199
(preparación según Blais et al.,1994) y fueron mantenidos por una hora ( T1 ) a
temperatura ambiente. Luego de la primera hora de incubación, un órgano Y
(tratamiento) fue transferido a una celda que contenía medio de cultivo fresco y la
hormona a probar ( Insulina o Factor de crecimiento tipo insulina ), mientras que el
otro órgano Y (control) se depositó en una celda con medio de cultivo fresco sin
hormona. Ambos órganos Y fueron incubados por un lapso de dos horas ( T2 ).
Posteriormente los órganos Y fueron removidos a otra celda con medio de cultivo
fresco por una hora más (T3). Terminado el tercer período de incubación, se desecharon
los órganos Y almacenando las muestras de medio de cultivo a -20 °C.
Para determinar el grado de estimulación de ecdiesteroides se relacionó la
concentración obtenida del T1 y el T3 para el tratamiento y el control del proceso de
incubación (ver ejemplo).
-Primera hora (T1)
Concentración de ecdiesteroides del OY-Tratamiento (0,017 ng/µl).
Concentración de ecdiesteroides del OY-control (0,033 ng/µl).
Tasa de la concentración de ecdiesteroides T1 0.017 / 0.033=0.52
-Tercera hora (T3)
Concentración de ecdiesteroides del OY-Control 0.058 (ng/µl).
Concentración de ecdiesteroides del OY-Tratamiento (0.019 ng/µl).
Promedio de la concentración de ecdiesteroides T3 0.019/0.058 = 0.33
-Relación de la tasa de producción T3/T1.
Tasa del T1: 0.52 ng/ µl.
Tasa del T3: 0.33 ng/ µl.
*Tasa de estimulación: 0.33 /0.52 =0.64
*Si la tasa de estimulación es >1: Hubo estimulación en comparación con el control.
*Si la tasa de estimulación es <1: El tratamiento produjo una inhibición en comparación
con el control.
2.2.6 ENSAYO DE INMUNOABSORVANCIA DE ENZIMA LIGADA (ELISA).
2.2.6.1 Curva estándar.
Se utilizó 20-Hidroxyecdysone (20-E SIGMA) a una concentración 10-6 M., como
solución madre.
La curva estándar consistió en diluciones en un rango de 10-7M. a 10-11M., para lo
cual se preparó 10 microtubos con medio de cultivo, 5 de ellos con 170 µl, los otros 5
con 360 µl y fueron ordenados de forma alternada.
Se agregó 80 µL de solución 10-6 M, al microtubo A (170ul de M119) y 40 µl al
microtubo B ( 360ul de M119 ), luego se homogenizó con vortex, los microtubos C
y D recibieron 80 µl y 40 µl de la solución del microtubo B, respectivamente. Se
repitió el proceso hasta completar las 10 muestras.
2.2.6.2 Protocolo De La Técnica Elisa.
a) Fijación (Coating) de placas ELISA.
Se preparó una solución de recubrimiento para 10 microplacas, con una dilución 1:1000
de anticuerpo ( GAR, Bélgica ) en 10 ml de tampón de Fosfato 1 M., pH 7,4 y 190 ml
de agua miliQ. Se distribuyó 200 µL de la mezcla/celda de las microplacas y se incubó
a temperatura ambiente por 24 horas. Se agregó 100 µL por celda de una solución de
BSA ( 0,300 g en 100 ml de agua de miliQ ), y las microplacas se mantuvieron a 4ºC
por lo menos 12 horas antes de su uso.
b) Lavado de microplaca.
Se eliminó el contenido de la placa previamente incubado, y se lavó 5 veces con 200
µL por celda de solución de lavado (0,01 M de tampón de Fosfato con 0,05% de Tween
20).
c) Solución de anticuerpo y tracer enzimático.
Se empleo el tracer ( rastreador ) enzimático succinyl-20 hidroxyecdysone ligado a la
peroxidasa donado por el Dr. Delbeque ( Universidad Bordoux I, Francia ) y anticuerpo anti
20-E de conejo ( AS 4919 ) donado por el Prof. Patrick Porcheron ( Universidad de
Paris,Francia ).
Se preparó una dilución 1:1000 de anticuerpo y una solución de tracer a una dilución
1:10,000 con tampón de fosfato 0.1M.
Las diluciones fueron realizadas en tubos de vidrio y almacenadas a 4o C para uso en
el momento.
d) Incubación.
Las celdas de la microplaca se llenaron por duplicado en el siguiente orden: con los
estándares: 50 µL cada uno; seguido de las muestras, 50µL, finalmente dos celdas con
50 µL de M119 como control de porcentaje de unión, y dos celdas con 100 µL de
M119 como control o blanco, luego se agregó 50 µL de tracer enzimático y 50 µL por
celda de anticuerpo AS 4919 a todas las celdas excepto a las correspondientes al blanco,
con ayuda de una pipeta multicanal.
Para la reacción inmunológica, la microplaca se incubó por dos horas en agitación continua a 70
rpm en una bandeja de agitación (Stuart Scientific) a temperatura ambiente.
e) Reacción enzimática.
Se lavo la microplaca, como literal b, luego se adicionó 200 µL por celda de la mezcla
de reactivo de coloración, y se dejó en agitación continua, para el desarrollo de la
reacción por 50 minutos.
f) Lectura y análisis.
Finalmente se leyó la microplaca en espectrofotómetro BIOCHRAMITA a 620 nm. La
información obtenida, se transformó utilizando la fórmula:
S-B
x 100
B0
B :Es igual a la observancia del blanco.
S :Es igual a la absorbancia del estándar o muestra.
Bo: Es igual a la observancia del control de 100% de unión.
Se gráfico la curva estándar con los ecdiesteroides (logaritmo base 10) en la abscisa
versus B/Bo en la ordenada. Los datos fueron linearizados y la fórmula resultante fue
utilizada para el procesamiento de los datos de las muestras.
2.3 EFECTO DE INYECCIÓN DE INSULINA/IGF SOBRE METABOLISMO
DE LA GLUCOSA
2.3.1 Diseño experimental.
Se desarrolló un diseño experimentral con el objetivo de observar el efecto post
inyección de insulina/IGF sobre los niveles de glucosa en la hemolinfa y tejidos de
camarones juveniles P vannamei, después de 1, 3, y 5 horas. El diseño consistió en un
arreglo factorial 2X4 completamente aleatorio.
Se seleccionaron animales en estadio C (intermuda) los cuales fueron aclimatados a
temperatura ambiente (26 ˚C) en el set experimental # 21, 3 días antes del ensayo. Los animales
fueron distribuidos de manera aleatoria e individual en recipientes de vidrio (1,5 litros),
asignados previamente en 10 bandejas.
La alimentación consistió en una dieta comercial(ABA-empagran), la cual fue suspendida 24
horas antes del ensayo.
2.3.2 Extracción de hemolinfa
Para extracción de hemolinfa se utilizaron jeringuillas descartables de 1 ml ( Insulin
Syringe 26 G 1/2 ) enjuagadas con anticuagulante ( Citrato de Sodio al 10%) a 4oC . La
hemolinfa fue extraída del primer segmento abdominal, región ventral ( membrana
artropoidal ) del animal. 100 l de hemolinfa fue transferido a microtubos de 1,5 ml
previamente llenados con 300 l de etanol al 95%. Los microtubos fueron
centrifugados a 4.000 r.p.m. por 5 minutos a 4 oC. Se separó el sobrenadante para el
respectivo análisis.
2.3.3 Extracción de tejidos
2.3.4 Extracción de hepatopáncreas.
Los camarones fueron colocados en agua salada, luego se les realizó un corte transversal de la
membrana que une el cefalotorax con el abdomen en la región dorsal, seguido por un segundo
corte desde la parte posterior a la anterior del cefalotórax, quedando. descubierto el
hepatopáncreas, y finalmente se realizó un corto en el sitio de unión del cordón intestinal.
El hepatopáncreas fue transferido a un microtubo de criopreservación (NUNC®). y
almacenado en nitrógeno líquido para su posterior análisis.
2.3.5 Extracción del músculo.
La extracción del músculo se eliminó el exoesqueleto del abdomen, y se cortó
transversalmente en el segundo segmento abdominal. El tejido fue transferido a un
microtubo de criopreservación (NUNC®) y luego almacenado en nitrógeno líquido para
su posterior análisis.
2.3.6 Extracción de branquias.
La extracción de las branquias se realizó eliminando el exoesqueleto que cubre la cámara
branquial, para luego realizar un corte en la parte basal de las branquias. Luego se transfirió las
branquias a un tubo de criopreservación (NUNC®) y almacenado en nitrógeno líquido para su
posterior análisis
2.3.7 Análisis de Glucosa.
Para análisis de glucosa de se utilizó un Kit de análisis de Glucosa (SIGMA), con la
modificación del volumen de la muestra ha cuantificar.
2.3.7.1 Curva estándar de glucosa(Kit Sigma).
Se realizó una curva estándar de glucosa, elaborada en etanol 95% y agua desionizada (
v/v: 3:1 ) para el análisis de la hemolinfa.
A partir de una solucion madre de 0,1ug/ul de glucosa se prepararon diluciones
seriadas de 0-5 ug (10 puntos)para un volumen de 120 ul.( Fig. 8).
Stock de Glucosa.
1,25X10-3 ug/ul
7,5 ul 15 ul 22,5 ul 30 ul 37,5 ul 45 ul 52,5 ul 60 ul 90 ul 120 ul STOCK
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101
112,5 ul 105 ul 97,5 ul 90 ul 82,5 ul 75 ul 67,5 ul 60 ul 30ul 00 ul H2O/Citrato
Fig.9. Curva Standard de glucosa, Elaborada para corregir los datos de lectura realizadas con el kitSigma para glucosa.
2.3.7.2 Protocolo de análisis de glucosa(Kit Sigma).
En microtubos se mezcló 80 ul de reactivo del kit de glucosa sigma y 40 ul de muestra
o estándar. Luego se incubo por 15 min. a temperatura ambiente. Las mezclas fueron
leídas en el espectrofotometro(Thermo spectronic-Genesys 20) a 340nm.
2.3.8 Determinación de glucógeno.
2.3.8.1 Preparación de suero enzimático.
Se utilizo un microhomogenizador de tejido (Ultra Turax T 25) para macerar el
hepatopancreas en 0,5 ml de agua destilada y enrasado hasta 1,5 ml con la misma
calidad de agua.
Se uso tubos de microensayos (eppendorf) para mantener el hepatopancreas
homogenizado y sumergido en hielo picado hasta su inmediata centrifugación a 13000
rpm por 12 minutos a 4 oC en centrifuga (KOKUSAN H200B) y congelados en – 80o C
y luego fueron transferidas a un congelador de – 20oC hasta el momento de su análisis.
2.3.8.2 Preparación Curva de calibración (5-40 ug).
Se disolvió 0,01 g de glucosa en 20 ml de ATC (ácido tricloro acético) al 20 %, como solucion
madre.
Se Tomó 2000 ul de la solucion madre y se diluyo en 10 ml de ATC al 20 % obteniéndose una
concentración de 100 ug/ml como solución de trabajo y se procedió a transferir 100, 200, 300,
400, 500, 600, 700, 800 ul de solucion de trabajo (100 ug/ ml) a tubos de vidrio y se llevo
hasta 2 ml con agua destilada.
El blanco se preparo con 2 ml de agua destilada.
Se Añadir a todos los tubos 0,5 ml de fenol al 80% y 5 ml de ácido sulfúrico
concentrado e inmediatamente se Agito. Después de 30 minutos se tomo 200 ul y se
coloco en una placa de elisa para ser leído en el espectrofotometro a 492 nm.
2.3.8.3 Análisis de la muestra.
Se coloco 0,1 ml de suero enzimático en de centrifuga y se adiciono 2 ml de ATC 20%
seguidamente se agito.
Se centrifugo a 3000 rpm por 20 minutos y el sobrenadante fue transferido a otro tubo de
centrifuga y se adiciono 2 ml de éter de petróleo para seguidamente ser centrifugado a 3000
rpm por 20 minutos, luego se descartar la fase superior que contiene éter y ATC
cuidadosamente con ayuda de una micropipeta pasteur.
Se tomo 2 alicuotas de 0,5 ml de la fase inferior del tubo de centrifuga y se coloco en
tubos de vidrio y se llevo a 2 ml con agua destilada, se adiciono 0,5 ml de fenol al 80
% y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Seguidamente se agito.
Transcurrido 30 minutos tomo 200 ul y se coloco en una placa elisa para medir la
absorvancia en un espectrofotometro a 492 nm.
El resultado se expreso en mg/ glicogeno/g hepatopancreas/ml.
3. RESULTADOS.
3.1 EFECTO DE PEPTIDOS TIPO INSULINA EN LA PRODUCCIÓN DE
ECDIESTEROIDES.
La habilidad de peptidos tipo insulina en estimular la producción de ecdiesteroides fue
probada en órganos Y aislados de juveniles P vannamei en diferentes estadios de muda.
Los órganos Y fueron cultivados in vitro durante tres tiempos diferentes.
3.1.1 Interacción de los estadíos de muda con insulina bovina en cultivos in vitro.
Órganos Y de camarones en diferentes estadios de muda, fueron sometidos a seis tipos
de concentraciones de Insulina bovina (10-3 M, 10-4 M, 10-5 M, 10-6, 10-8M y 10-10M )
Previo al análisis estadístico, los datos fueron asignados en grupos para luego
clasificarlos dentro de cada grupo con respecto al nivel de efecto numerado del 1 al 4,
para luego ser analizados mediante una tabla de contingencia, y posteriormente ver si
existen diferencias significativas mediante la prueba de "Ji" (Chi)Cuadrado.
Los resultados obtenidos después de aplicar el análisis de "Ji" Cuadrado no mostró
efectos significativos (p>0.05) de interacción entre el estadio de muda y las
concentraciones de insulina a los que fueron sometidos, como se muestra en la figura
10.
Fig. 10 Efectos de concentraciones de insulina sobre ecdiesteroides cuantificadoen ratios, barras verticales indican el error estándar de la media.
3.1.2 Interacción de los estadios de muda con IGF-I en cultivos in vitro.
0123456
AB C Do D1 D2-3
Estad’o de muda
Rat
ios
10-10M10-8M10-6M10-5M10-4M10-3M
Previo al análisis estadístico. los datos fueron analizados de igual forma que el ensayo
anteriormente descrito con insulina bovina en cultivos in vitro.
Los resultados obtenidos después de aplicar el análisis de "Ji" Cuadrado no mostró
efectos significativos (p > 0.05) de interacción entre el estadio de muda y las
concentraciones de IGF-I a las que fueron sometidas (Fig 11).
Fig. 11 Efectos de concentraciones de IGF-I sobre ecdiesteroides cuantificadoen ratios, barras verticales indican el error estándar de la media.
3.2. EFECTO INYECCIÓN PEPTIDOS TIPO INSULINA SOBRE NIVELES DE
GLUCOSA.
3.2.1 Niveles de Glucosa en hemolinfa.
0
2
4
6
AB C Do D1 D2Estad’os de muda
Rat
ios
10-12M
10-11M
10-10M
10-9M
Bajo la hipótesis de que peptidos tipo insulina desempeñan una función en el
metabolismo de la glucosa en los crustáceos, se procedió a evaluar el efecto de la
Insulina y IGF-I en juveniles P. vannamei, a través de la cuantificación de niveles de
glucosa en la hemolinfa, luego de una inyección de insulina bovina o factor de
crecimiento tipo insulina.
Los niveles de glucosa fueron expresados en ug glucosa/ml de hemolinfa, comparados
entre tratamientos y tiempos de muestreo post inyección. Se observo diferencias entre
tratamientos y control, como nos muestra la Tabla. I.
Tabla .I. Niveles de Glucosa en Hemolinfa, Mediciones a través del tiempo después deque los animales fueron inyectados con peptidos tipo insulina. Los valores sonexpresado en ug glucosa/ml, ± error estándar, * diferencias significativas (p < 0.05) y** diferencias significativas (p < 0.01)
TIEMPO IGF-I INSULINA CONTROL (PBS-BSA)0 19.72± 1.58 19.72± 1.58 19.72± 1.581 24.57 ±2.55** 18.85± 2.42 15.57± 5.683 16.85 ±5.78 12.81± 1.18 15.24± 5.155 18.78±1.14* 55.42±13.35 45.06± 8.18
En el comportamiento entre la hormona (Insulina/IGF-I) y el nivel de Glucosa en
hemolinfa, se pudo observar que después de una hora post inyección existe un
incremento, siendo IGF-I altamente significativo en un 37% (24.57 ±2.55 ug**) que
insulina con un 16% (18.85±2.42 ug), respecto al control (15.57±5.68 ug), pero
presento una leve disminución de glucosa comparado con el tiempo inicial.
A las tres horas no se ven diferencia significativa de los tratamientos con respecto al control.
Observándose para el IGF-I un incremento de 9,6 % ( 16.85 ±5.78 ug ), mientras que el
tratamiento con Insulina disminuyo en un 19% ( 12.81± 1.18 ug ) referente al Control, pero
ambos disminuyeron el nivel de glucosa respecto al tiempo inicial(T0= 19.72± 1.58).
A las cinco horas de la inyeccion de los tratamientos, se observo un comportamiento inverso al
registrado a las 3 horas de la inyección. El tratamiento con IGF-I disminuyo significativamente
los niveles de glucosa un 58% (18.78± 1.14 ug.*), mientras que el tratamiento con Insulina no
provoco cambios con respecto al control (45.06± 8.18 ug), sin embrago insulina y control
difieren al tiempo inicial, incrementando los niveles de glucosa (Fig.12).
Fig.12. Efectos de Insulina/IGF-I sobre el nivel de Glucosa en hemolinfa, después de 4 intervalos detiempos distintos. barras verticales indican el error estándar. El asterisco representa que el valor essignificativamente diferente que el control * (P< 0.05); ** (P < 0.01).
El tratamiento con IGF-I tuvo un efecto altamente significativo (P < 0.01) comparado al
tratamiento con PBS (control), incrementado los niveles de glucosa despues de 1 hora y luego
disminuyendolos a las cinco horas post inyección, mientras que el tratamiento con insulina
bovina no mostró diferencias significativas en cada uno de los tiempos comparado con el
***
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 3 5
Horas
ug G
luco
sa/m
l IGFInsulinPBS
tratamiento control. Sin embargo, ambos tratamientos (insulina y control ) difieren en el tiempo
cinco respecto al tiempo 1 y 3, incrementando el nivel de glucosa en la hemolinfa, mientras que
IGF se mantiene cerca del nivel del tiempo inicial, durante el tiempo de ensayo.
3.2.2. Niveles de Glucógeno en tejidos.
Los resultados de glucógeno en tejidos son expresados como mg de glucógeno por
gramo de tejido húmedos (mg glucógeno/g tejido),
3.2.2.1. Hepatopancreas.
Los resultados de glucógeno en hepatopancreas después de aplicarse análisis de
varianza de 2 vías mostró diferencias significativas (P < 0,05) entre el tratamiento con
insulina y el control.
En el tiempo 1 no se observo diferencias entre el efecto de las hormonas comparados
con el control, no obstante, el efecto de los tratamientos si difirieron con respecto al
nivel registrado antes de la inyección ( 0.21320.026 mg), observándose una
disminución en el nivel de glucógeno.
A las tres horas de la inyección, el tratamiento con insulina ocasiono un, incremento en
el nivel de glucógeno ( 0.2881.015mg* ) significativamente (P< 0.05) superior con
respecto al control ( 0.1750.017 mg ). El tratamiento de IGF-I no presento diferencias
significativas, observándose un leve incremento en el contenido de glucógeno
(0.1530.017 mg ) con respecto al tiempo 1 (0.1200.016 mg ). Sin embargo, este
incremento no fue mayor al nivel de glucógeno registrado en el tiempo inicial
(T0=0.21320.026 mg ).
Después de 5 horas de la inyección, el tratamiento con insulina presenta diferencias
significativa (0.1690.015 mg*), notándose una disminución en la cantidad de
glucógeno comparado con el control (0.1650.015 mg) y el tiempo cero( 0.21320.026
mg ) (F ig 13).
*
*
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 1 3 5
Horas post Inyección
mg
Glu
coge
no/g
Tej
ido
IGF-IInsulinPBS
Fig. 13. Efectos de insulina/IGF-I sobre el nivel de glucógeno en Hepatopancreas, barrasverticales indican el error estándar, barras verticales indican el error estandar. El asterisco indicaque el valor es significativamente (P< 0.05) diferente del control.
3.2.2.2. Músculo.
Después de aplicar ANOVA de 2 vías y encontrar diferencias (p< 0,05), se observo
una disminución en el contenido de glucógeno (0.1470.017 mg **) con el tratamiento
de insulina comparado con el control(0.7850.136 mg). De manera similar, el
tratamiento con IGF-I (0.2900.018mg) ocasiono una disminución comparado con el
tiempo inicial, sin embargo el efecto no fue significativo con respecto al tratamiento
control. En el tiempo 3, el tratamiento con insulina causo una disminución altamente
significativa (0.1100.016mg **) en el nivel de glucógeno comparado con el control
(0.2850.017mg), asi como el tratamiento con IGF-I presento diferencia significativa
(0.1810.019mg*) frente al control (0.2850.017mg). En el tiempo cinco se registro
una leve disminución significativa de glucógeno con el tratamiento de insulina
(0.0790.017mg*) mientras que IGF -I no presento diferencias significativas
(0.1310.018mg).
Tanto los tratamientos como el control ocasionaron una disminución de glucógeno a
través del tiempo siendo el tratamiento con insulina el que ocasiono disminución de
glucógeno en todos los tiempos post inyección medidos, notándose diferencias
altamente significativo (P < 0.01) en el tiempo uno y tres. Mientras que el tratamiento
con IGF-1 solo mostró diferencias significativas (P < 0.05) en el tiempo tres (Fig. 14).
Fig. 14. Efectos de concentraciones de insulina/IGF-I sobre el nivel de glucógeno enmúsculo, por gramo de tejido, barras verticales indican el error estándar. El asteriscoindica que el valor es significativamente (P< 0.05) diferente del control.
3.2.2.5. Branquias.
La concentración de glucógeno en branquias fue significativamente diferente con el
tratamiento de insulina, después de una hora de la inyección con valores de 0.0780.016
mg**, mientras que el tratamiento de IGF -I no presento diferencias significativas
(0.0610.016 mg) frente al control (0.0380.017 mg). Ambos tratamientos ocasionaron
un ligero incremento en el contenido de glucógeno con respecto al registrado en el
tiempo inicial (0.0660.012mg). En el tiempo 3, el tratamiento de insulina produjo un
incremento altamente significativo (P < 0.01) en el nivel de glucógeno, mientras que
con el tratamiento de IGF-I no se observo variaciones respecto al contenido inicial de
glucógeno y al control. En el tiempo 5, el tratamiento de insulina se muestra similar al
*
** ** *0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 3 5Horas post Inyección
mg
Glu
coge
no/g
Tejid
o
IGF-IInsulinPBS
tiempo 3, siendo estadísticamente superior (P < 0.05) al control(0.1310.017 mg),
mientras que IGF-I mostró una disminución en el nivel de glucógeno (0.0790.018
mg) comparado al control (0.1310.017 mg) y al tiempo cero (0.0660.012mg) (Fig.
15).
Fig. 15. Efectos de concentraciones de insulina/IGF-I sobre el nivel de glucógeno enbranquias, por gramo de tejido, barras verticales indican el error estándar, barrasverticales indican el error estándar. El asterisco indica que el valor essignificativamente (P< 0.05) diferente del control.
***
**
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 1 3 5
Horas post Inyección
mg
Glu
coge
no/g
tejid
o
IGF-IInsulinPBS
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