universidad mayor de san andrÉs instituto de...
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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
MAESTRíA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICAS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQuíMICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FÁRMACO BIOQuíMICAS
EVALUACiÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE DERIVADOS
SINTÉTICOS Y NATURALES.
Estandarización de modelos in vitro sobre cultivos de Plasmodium
falciparum
TESIS PARA OPTAR Al TíTULO DE MAGíSTER SCIENTARUM EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y
BIOMÉDICAS
MENCiÓN PARASITOLOGíA
POSTULANTE:
ASESORES:
Doynel David Gutiérrez Yapu
Alberto Giménez Ph.D.
Eric Deharo Ph.D.
2005
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IlFB - UMSA
DEDICATORIA
Dedicado a la memoria de la familia que nos dejo, pero que
siempre estará con nosotros, a mi hermano José Luis,
a mi prima Lourdes y a mi tía Maruja (Q.E.P.D.)
"Querida Familia, alqún día Dios hará caso a nuestras
plegarias y todos estaremos juntos como
antes, con la familia reunida"
DAVID
David Gutiérrez Yapu ÁIea de Quimioterapia Experimental - IIF8 - UMSA
AGRADECIMIENTOS
Al proyecto CYTED, programa X y Proyecto Antiparasitario X.S por la capacitación
del personal deII.I.F.B. y contactos iberoaméricanos.
Al proyecto Flora Regional O.E.A., por el apoyo financiero que brindó para la
adquisición de equipos y reactivos.
Al 1. R. D. (lnstitut de Recherche pour le Développement), por el apoyo brindado en
cuanto a la formación, que se me otorgó en este nivel.
Al Instituto de Investigaciones Científicas Avanzadas y Servicios de Alta Tecnología
(/ND/CASAT) dependiente de la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e
Innovación (SENACYT), en la República de Panamá, por la capacitación que se
proporcionó en esa.
A la fundación "Alexander Von Hurnboldt-Shtiffun" , por la donación de equipos.
Al Doctor Eduardo Ortega, por toda la colaboración brindada en dependencias de
INDICASAT-SENACYT, República de Panamá.
AL Lic. José María Gonzáles, por todo el apoyo y colaboración desinteresada que se
me brindó en la capacitación llevada a cabo en la Repúblíca de Panamá
Al Dr. Alberto Giménez, por perrnitirme ser parte del 1.1. F.B. Y guiarme en el trabajo
desarrollado.
Al Dr. Eric Deharo, por la colaboración y guía en el trabajo desarrollado.
David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experimental - "FB - UM~~
A Patricia Oporto, que fue la persona que inculcó en mi, el interés por esta área y me
guío en los primeros pasos que di en esta rama de la Parasitología.
Al personal perteneciente al Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (lIFB),
de forma especial a Grace Ruiz, Fernando Vargas, Lucia Acebey, Crispin Paredes,
Magali Paz, que siempre me brindaron su desinteresada colaboración.
A mis compañeros de Tesis, Marco Antonio Paco y Efrain Salamanca, que además
de ser compañeros de trabajo son grandes amigos y sin los cuales no hubiera podido
concluir el presente.
A Isabel, Andrés, Dina, Ruth, Evelyn, Lidia, David, Rubén, Bertha y toda mi demás
familia, por haber aguantado este tiempo más de estudio.
A todos los amigos y compañeros de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímicas, por la colaboración y apoyo que me brindaron de una u otra forma.
Fecha:
MAESTRíA EN L7ENCIAS BIOLÓGICAS y BIOMÉDICASMención: Parasitología
La Paz, 23 de Septiembredel 2004
Inltitución: Realizó la Tésis en el Institutode Investigaciones Fármaco Bioquímicas- JIFB
Tít~lo del tema: EVALUACION DE LA ACTIVIDADANTIMALÁRICA DE DERIVADOSSINTÉTICOS y NATURALES· Estandarización de modelos in vitro sobre
cultivos de Plasmodsumfalciparum.
Postulante: Doynel David Gutiérrez Yapu
Tutor: Dr. Alberto Giménez, Ph.O.
Dr. Eric Deharo, Ph, O.
Revisor: Dra. Luz 1. Romero. MD.Institución: Coordinadora Técnica-Centro de Estudios Biomédicos -Instituto de Investiga
ciones Científicas Avanzadas y Servicios de Al!.1 Tecnologia (lNDICASAT)
Calificaciónsobre el 100% en base a: Porcentaje Calificación
l. Presentaciónde resultados y proyección de1trabajo 30% 25'~/()
2. Revisión Bibliográfica 25% 22%
3. Protocolo de investigación 2{)~ó 20%
4. Claridad del documento presentado 15% 15%
5. Cumplimiento de Hipótesis y/o Objeti..'os 10% 9%
91%Nota: Lacalificación mínima de aprobación es 61%,
Firma Revisor
Fecha: 13 de mayo de 2005
A,·, Saavedra N"2224.30 piso • Tel. Fu'C (591-2) 2240347- casilla de correo 3239
La Paz-Bolivia
MAESTRlA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICASMención: Parasitología
..
Fecha: La Paz, 23 de Septiembre del 2004
Institución: Realizó la Tésis en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas - lIFB
Título e1el tema: EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE DERJVADOSSINTÉTICOS y NATURALES - Estandarización de modelos in vitro sobrecultivos de Plasmodium falciparum.
Postulante: Doynel David Gutiérrez Yapu
Tutor: Dr. Alberto Giménez, Ph.D.Dr. Eric Deharo, Ph.D.
Rcvísor:: Dr. Roberto Pinzón, Ph.D.Institución: Facultad de Ciencias, Dpto. de Farmacia Universidad Nacional de Colombia.
Fecha:
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;J' r= ..Calificación sobre el 100% en base a: Porcentaje Calificación
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l. Presentaciónde resultados y proyección del trabajo 30% 3D2. Revisión Bibliográfica 25%
2S"3. Protocolo de investigación 20%
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4. Claridad del documento presentado 15%.Á,f
y.Cumplimiento de Hipótesis y/o Objetivos 10%
/4:P;. '. (
Nora: Lacalificación mínima de aprobación es 61%. ¡/PAVFirma Revisor
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~.. ":~ :....,;. ~: oo.
Av, Sanvcdra N" 2224 - JO piso - Tel. Fnx (591-2) 2221)021 cnsüln de correo J2JI)
LIII'IIJ.·llnllvln
.'L~:':.:~.I.':J..J ENCTENCIAS BIOr..ÓG/t',.,,,, y Bl0MÉDrC4SMenci6n: ParBSitología
Institución; R.etli~'" Tésis en el fnstihM de invcstigacioT1t:i Farmaco Bioquunic~ - IlFB
Tlhll" d~1 r.mn: i'''", .:'.".CIOX DE L\ ftLílVIDAP ANTIMAf..\RIC.\ DE DERIV.'I.DOS SrN~·TleOS y NATU~¡\l.ES - E:sw.ndat'znctor. de nocicl,," itl vi/ro ~obre culti\n:l d;Flas.""-odiWM !óicipan./tt
P01tnhntt: Doyne! Devid Guti~rret Y<1p1.l
·r.tor:Co-Tutor:
Dr. AIIk"o UimC0c2 Ph.D.
Dr. Erk D~aro I'h.D.
lbvi.1lOr: Miche! Sauvsfn ?b.D. -lROl.!ltlrudón. Investigador AStVillr\o - lJnivcr~ite Paul Sabntier - Toulousc, Francia.
C¡Jifi",ción 30blC al ! :10":'. ~n )a~e a. -~orcentn.Jc Calificación
-l. Prestn.lllCior, de resUltAdo5 y proveccion del trabajo 30% ..., .,e t'
2. Rev\~i,," Bibllognttlca ~:S% ¡ .'¡-
3. Proiocoto de investigación --::0% ,(7
~/ <--4. Caridad de documento I're'S~ntado !5% )f
r' '
5. Curnplirmcntc de Hipóre~is '1.'0 Objetivos 10°/" ---(
/ ')}ÚIL./:
t\v~iill <;ll~.eC~J ,,- ::1 4 ;01-1 '-" /5,'1 .2',l2W.147 ':AP!l1\ d~ correo 3D'!
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David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
El presente trabajo se realizó en el Área de Quimioterapia Experimental
del Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas,
perteneciente a la Facultad de Ciencias
Farmacéuticas y Bioquímicas
Universidad Mayor de San Andrés
La Paz - Bolivia
David Gutiénez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
íNDICE GENERAL
índice General. .
índice de Figuras................... iv
índice de Cuadros........................................................................................................ v
índice de Tablas............................................. . v
índice de Anexos.............................. vi
RESUMEN 1
SUMMARY 2
1. INTRODUCCiÓN 3
2. ANTECEDENTES 6
2.1 CONCEPTO E HISTORIA............................................................................ 7
2.2 SITUACiÓN MUNDIAL DE LA MALARIA................................................... 8
2.3 SITUACiÓN DE LA MALARIA EN BOLIVIA................................................ 10
2.4 LOS PARÁSITOS CAUSANTES DE LA MALARIA.................................... 17
2.5 CLASIFICACiÓN TAXONÓMiCA................................................................. 18
2.6 CICLO BIOLÓGICO DE Plasmodium............................... 19
2.6.1 VECTOR, Anopheles........................................................ 19
2.6.2 CICLO VITAL DEL Plasmodium................................................... 21
2.6.3 DESARROLLO DEL PARÁSITO EN EL VECTOR..................... 22
2.6.4 DESARROLLO DEL PARÁSITO EN EL HOMBRE.................... 23
2.6.5 CARACTERíSTICAS DE Plasmodium falciparum...................... 25
2.7 PATOGENIA Y FISIOPATOLOGíA.............................................................. 26
2.8 DROGAS ANTIMALÁRICAS........................... 28
2.9 ENSAYOS BIOLÓGICOS in vitro DE ACTIVIDAD ANTIPALÚDICA......... 31
2.9.1 ENSAYO SOBRE PARÁSITO ENTERO...................................... 31
2.9.2 MÉTODOS EMPLEADOS PARA DETERMINAR LA
INHIBICIÓN DE LA MADURACiÓN DE ESQUIZONTES........... 32
2.9.2.1 MICROMÉTODO ViSUAL.............................................. 32
2.9.2.2 MICROMÉTODO RADIOISOTÓPICO............................ 34
2.9.2.3 MÉTODO BIOQuíMICO (Prueba in vitro de la Lactato
Oeshidrogenasa parasitaria)........................................... 34
2.9.2.4 MÉTODO FLUOROMÉTRICO........................................ 36
David Gutiérrez Yapu
3. JUSTIFiCACiÓN................. 38
4. OBJETIVOS............. 42
4.1 OBJETIVO GENERAL........................ 43
4.2 OBJETIVOS ESPECíFiCOS........................................................................ 43
5. MATERIAL Y MÉTODOS.................................................................. 44
5.1 DISEÑO METODOLÓGiCO........................................................................ 45
5.2 CULTIVO DE ESTADíos INTRAERITROCITARIOS DE P. tetciperum.. 46
5.2.1 OBTENCiÓN DE GLÓBULOS ROJOS....................................... 46
5.2.2 OBTENCIÓN DE SUERO O PLASMA...................... 46
5.2.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO RPMI-1640 SiGMA.................... 47
5.2.4 DESCONGELACiÓN DE LOS AISLADOS DE P. tetciperum.c. 47
5.2.5 CONGELACiÓN DE LAS CEPAS DE P. falcipaf1.lm................... 48
5.2.6 ADAPTACiÓN A CULTIVO in vitro............................................... 48
5.2.7 DETERMINACiÓN DE LA PARASITEMIA.................................. 51
5.3 SINCRONIZACiÓN DE CULTIVOS in vitro de P. falcipaf1.lm..................... 51
5.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. tetciperum A LAS
DROGAS: MICROMÉTODO ViSUAL...................................... 51
5.4.1 PREPARACiÓN DE LA DROGA DE REFERENCIA Y
EXTRACTOS.................................................................................. 51
5.4.2 PREPARACiÓN DE LA PLACA................................................... 52
5.4.3 MÉTODO ViSUAL............ 53
5.4.3.1 PREPARACiÓN DE REACTIVOS QUíMiCOS............. 53
5.4.3.2 MÉTODO......................................................................... 53
5.4.3.3 INTERPRETACiÓN......................................................... 54
5.4.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. tetciperum
A LAS DROGAS: MÉTODO BIOQuíMICO (PRUEBA in vitro DE
LA LACTATO DESHIDROGENASA PARASiTARIA).................... 55
5.4.4.1 PREPARACiÓN DE LOS REACTiVOS.......................... 55
5.4.4.2 MÉTODO 55
5.4.5 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. tetciperum
A LAS DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO.......................... 57
5.4.5.1 PREPARACiÓN DE LA DROGA DE REFERENCIA Y
EXTRACTOS 57
5.4.5.2 PREPARACiÓN DE LA PLACA..................................... 57
11
David Gutiérrez Yapu Ares de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
5.4.5.3 PREPARACiÓN DE REACTIVOS QUíMiCOS.............. 57
5.4.5.4 MÉTODO 57
6. RESULTADOS Y DISCUSiONES 59
6.1 EVALUACiÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE PRODUCTOS
SINTÉTICOS Y NATURALES POR EL MÉTODO VISUAL......................... 60
6.1.1 SALAMANCA - PRODUCTOS SINTÉTiCOS........... 60
6.1.2 CHILE - PRODUCTOS NATURALES............................... 62
6.1.3 GUATEMALA - PRODUCTOS NATURALES 63
6.1.4 COLOMBIA - PRODUCTOS NATURALES..................... 64
6.1.5 ARGENTINA - PRODUCTOS NATURALES................................. 65
6.1.6 MÉXICO - PRODUCTOS NATURALES 66
6.1.7 PERÚ - PRODUCTOS NATURALES............................................ 66
6.1.8 BOLIVIA - PRODUCTOS NATURALES 67
6.2 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS
DROGAS: ESTANDARIZACiÓN DE PARÁMETROS DEL MÉTODO
BIOQuíMICO (PRUEBA in vitro DE LA LACTATO DESHIDROGENASA
PARASiTARIA) 69
6.3 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE P. falciparum A
LAS DROGAS: ESTANDARIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DEL
MÉTODO FLUOROMÉTRICO...................................................................... 72
7. CONCLUSiONES 75
8. RECOMENDACiONES 80
9. BIBLIOGRAFíA 82
1O.ANEXOS 95
111
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIF8 - UMSA
íNDICE DE FIGURAS
Figura 1. La Malaria a nivel Mundial, 2003.......................... 10
Figura 2. La Malaria en Bolivia, 2000........................................... 12
Figura 3. índice Parasitario Anual de Malaria en Bolivia............................................. 13
Figura 4. Ciclo evolutivo del mosquito Anopheles........................................................ 19
Figura 5. Mosquito Anopheles (Hembra)...................................................................... 20
Figura 6. Esquema del ciclo biológico de Plasmodium......................................... ...... 22
Figura 7. Evolución del Plasmodium falciparum dentro del eritrocito........................ 25
Figura 8. Reloj biológico de Plasmodium falciparum........ 26
Figura 9. Estructura de la Quinina........... 29
Figura 10. Estructura del Qinghaosu 29
Figura 11. Estructura de la Cloroquina... 30
Figura 12. Esquema de la transformación de lactato en piruvato........ 35
Figura 13. Estructura Molecular del NBT (Nitro Blue Tetrazolium).............................. 35
Figura 14. Estructura Molecular del HOECHST 33258................................................ 37
Figura 15. Cultivo de cepas de P. falciparum in vitro............................... 49
Figura 16. Cambio de Medio de Cultivo........................................................................ 50
Figura 17. Disposición y distribución de los productos evaluados, el control y la
droga de referencia................... 52
Figura 18. Proceso de tinción (Giemsa)............ 54
Figura 19. Proceso de lectura de absorbancias en el lector ELlSA............................. 56
Figura 20. Estructuras de Productos activos procedentes de Chile............................. 63
IV
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
íNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Incidencia Parasitaria Anual de Malaria en Bolivia, (1990-2000)............... 13
Cuadro 2. Evolución de la Malaria en Bolivia (1990-2000)................................ 14
Cuadro 3. Distribución de la Población. Área Malárica, Bolivia - 2001........... 16
íNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Notificación de la Malaria por especie parasitaria e indicadores. Sedes y
Distritos, Bolívia-2001.................................. 15
Tabla 2. Enfermedades ocasionadas por especies diferentes de Plasmodium.......... 18
Tabla 3. Clasificación Taxonómica del Plasmodium...................................................... 18
Tabla 4. Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos realizados en la
Universidad de Salamanca, sobre cepas de P/asmodium falciparum F32... 61
Tabla 5. Evaluación de la actividad in vitro de Diterpenoides aislados de especies
de Azorella compacta, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32............ 62
Tabla 6. Evaluación de la actividad in viiro de extractos de plantas procedentes de
Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 ., 63
Tabla 7. Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32................................. 64
Tabla 8. Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32.... 66
Tabla 9. Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32......................................... 67
Tabla 10.Evaluaci6n de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Bolivia, sobre cepas de Plasmodium tetciperum F32...................................... 68
Tabla t t.Valores de ICso presentados por los productos en estudio por fos métodos
Visual y Bioquímico 71
Tabla 12.Valores de ICso presentados por los productos en estudio por los métodos
Visual, Bioquímico y Fluorométrico 74
v
David Gutiérrez Vapu
íNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1: GRÁFiCOS 96
Gráfico 1: Ultraestructura del Merozoito.... 96
Gráfico 2: Ultraestructura del estadio anillo........................ 96
Gráfico 3: Ultraestructura del Trofozoito............................. 97
Gráfico 4: Ultraestructura de! Esquizonte......................... 97
Gráfico 5: Gráfico del Plasmodium falciparum, estadio de esquizonte....... 98
Gráfico 6: Gráfico del Plasmodium falciparum, estadio de anillo...... 98
ANEXO 2: MATERIAL Y REACTiVOS.................................................................... 99
A) MATERIAL REQUERIDO PARA CULTIVO DE ESTADIOS
INTRAERITROCITARIOS DE P. falciparum................................................ 99
B) MATERIAL REQUERIDO PARA LA SINCRONIZACJÓN DE CULTIVOS
in vitro DE P. falcíparum..................................................... ........ 101
C) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD
in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS: MICROMÉTODO VISUAL........ 101
D) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD
in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO BIOQUíMICO
(PRUEBA in vitro DE LA LACTATO DESHIDROGENASA PARASITARIA).. 102
E) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD
in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO.. 102
ANEXO 3: DESCRIPCiÓN DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS 104
Cuadro 1: Derivados sintéticos correspondientes al Departamento de Química
Farmacéutica, Facultad de Farmacia de la Universidad de
Salamanca, Salamanca - España 104
Cuadro 2: Productos correspondientes al Laboratorio de Productos Naturales.
Universidad de Antofagasta, Antofagasta - Chile.................... 106
Cuadro 3: Productos naturales procedentes de Guatemala............ 108
Cuadro 4: Productos naturales procedentes de Colombia.................. 109
Cuadro 5: Productos naturales procedentes de Argentina........................ 111
Cuadro 6: Productos naturales procedentes de México...................... 112
Cuadro 7: Productos naturales procedentes de Perú............ ... ...... 113
VI
David Gutiérrez Yapu /vea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Cuadro 8: Fracciones purificadas de Solanum argentinum procedentes de
Bolivia oo oo. oo oo oo oo ., oo oo " .. 115
ANEXO 4: RESULTADOS TOTALES DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS
SOBRE CEPAS DE Plasmodium falciparum F32.................................... 116
Cuadro 9: Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos
realizados en la Universidad de Salamanca, sobre cepas de
Plasmodium falciparum F32oo oo oo 116
Cuadro 1O:Evaluación de la actividad in vitro de Diterpenoides aislados de
especies de Azorelfa compacta, sobre cepas de Plasmodium
falciparum F32 oo oo' oo " oo oo. 118
Cuadro 11:Evaluación de la actividad in vitro de plantas procedentes de
Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32... ......... 119
Cuadro 12:Evaluación de la actividad in vitro de plantas procedentes de
Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 .. o...... ..... 120
Cuadro 13:Evaluación de la actividad in vitro de plantas procedentes de
Argentina, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32oo. o., ........ 123
Cuadro 14:Evaluación de la actividad in vitro de plantas procedentes de
México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 oo... 124
Cuadro 15:Evaluación de la actividad in vitro de plantas procedentes de
Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 ,. 126
Cuadro 16:Evaluación de la actividad in vitro de fracciones de Solanum
argentinum procedentes de Bolivia, sobre cepas de Plasmodium
falciparum F32 oo. oo oo oo oo oo oo oo.. 128
Cuadro 17:Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración
de esquizontes, obtenidos por los métodos visual y bioquímico.... 130
Cuadro 18:Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración
de esquizontes, obtenidos por los métodos visual, bioquímico y
f1uorométrico oo.oo oo oo .. oooo .. oooo.oo oo 131
VIl
David GutiérrezYapu
RESUMEN
Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
El presente trabajo forma parte del Proyecto "Flora Regional - OEA, Proyecto X.5 - CYTED,
Búsqueda, Obtención y Evaluación de Nuevos Agentes Antiparasitarios", teniendo dos metas
fundamentales, la evaluación de la actividad antimalárica de productos sintéticos y naturales,
y la estandarización de dos métodos alternativos mediante los cuales se llega a medir esta
actividad.
Se llegaron a evaluar 50 productos sintéticos y 276 productos naturales, con lo que se
alcanzó un total de 326 productos, provenientes del estudio de plantas, así como de
modificaciones químicas realizadas a estructuras conocidas.
De todas estas evaluaciones se pudo obtener 56 productos activos, de los cuales 20 son
sintéticos y 36 naturales, además de 270 productos inactivos, 40 sintéticos y 240 naturales,
mediante el método óptico.
Con el fin de contar con métodos alternativos más rápidos y menos tediosos que el óptico, se
trabajó en la estandarización de dos métodos alternativos que involucran el cultivo de cepas
de Plasmodium falciparum. Estos métodos son: el Bioquímico que se basa en la reacción de
la Lactato deshidrogenasa parasitaria (pLDH) y el método Fluorométrico que se basa en la
incorporación del colorante en el DNA parasitario para su posterior cuantificación.
En esta parte del trabajo, se procedieron a evaluar 10 diferentes productos mediante los
métodos Visual y Bioquímico y 5 productos empleando los tres métodos Visual, Bioquímico y
Fluorométrico, apreciándose que los valores de actividad encontrados, no difieren en estos
tres métodos, dado que los valores obtenidos en inhibición y concentración inhibitoria del
50% (ICso), estos no presentan una diferencia significativa y lo más importante, no influyen
en la interpretación de su actividad por lo que estos datos son aceptados.
La estandarización de estos métodos, proporcionará grandes beneficios en el trabajo que
venimos desarrollando, ya que el tiempo que tarda cualquiera de los dos métodos
estandarizados, es muy inferior al método visual, eso es de suma importancia cuando existe
gran cantidad de productos a evaluar.
David Gutiérrez Yapu
SUMMARY
Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
The present work is part of the Project "Regional Flora - OEA, Project X.5 - CYTED, Search,
Obtaining and Evaluation of New Antiparasitics Agents", having two fundamental objetives,
the evaluation of the antimalarial activity of the synthetic and natural products, and the
standardization of two alternative methods by means of which you ends up measuring this
activity.
We ended up evaluating 50 synthetic products and 276 natural products, with that a total of
326 products was reached, coming from the study of plants, as well as of chemical
modifications carried out to known structures.
Of all these evaluations one could obtain 56 active products, of which 20 are synthetic and 36
natural, besides 270 inactive poducts, 30 synthetic and 240 natural, by rneans of the optíc
method.
With the purpose of having quícker and less more tedious alternative methods that the optic
one, one worked in the standardization of two alternative methods that they involve the
cultivation of stumps of Plasmodium fafciparum. These methods are: the Biochemical one
that is based on the reaction of the parasitic Lactate dehydrogenase (pLDH). and the
f1uorometric meted that is based on the incorporation of the dye in the parasitic DNA for their
later quantification.
In this part of the work, we have proceded to evaluate 10 different products by Visual and
Biochemical methods and 5 products using three methods, Visual, Biochemical and
Fluorometric, being appreciated that the opposing activity values, don't differ in these three
methods, since the values obtained in inhibition and inhibitory concentration of 50% (lCso),
these they don't present a significant difference. and the most important thing they don't
influence in the interpretation of their activity, for what these data are accepted.
The standardization of these methods, will provide big benefits since in the work that we
come developing, the time that takes anyone of the two standardized methods, it is ver¡
inferior to the visual meted, that is of supreme importance, when they exist great quantity of
products to evaluate.
2
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB • UMSA
La enfermedad de la malaria, está íntimamente relacionada con la historia de la humanidad.
Hasta nuestros días, esta enfermedad permanece con una prevalencia considerable en el
mundo, obstaculizando el desarrollo económico de comunidades y países considerados
zonas endémicas. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (O.M.S.), casi la
mitad de la población del mundo vive en áreas donde los individuos tienen el riesgo de
adquirir la enfermedad.
La malaria también conocida como paludismo es una enfermedad transmitida por mosquitos
hembras del género Anopheles y causada por diminutos parásitos protozoos del género
Plasmo dium, los cuales infectan al humano y al insecto alternativamente (Knell 1991).
En el mundo esta enfermedad provoca la muerte de cerca a tres millones de personas y
entre 300 a 500 millones de casos clínicos se registran cada año. Esto se debe a que la
mayoría de la población está distribuida en zonas altamente endémicas que corresponden a
zonas subtropicales y tropicales con una incidencia elevada en: África, Sud y Sudoeste de
Asía, Sud y Centro América, donde el ríesgo de infección es permanente (Kondrachine el al.
1997).
Plasmodium falciparum causante de la Malaria Terciana Malígna, se encuentra entre las
cuatro especies que provocan la malaria humana, la más peligrosa y mortal. La gravedad de
esta enfermedad y su erradicación se ha complicado más con el desarrollo de resistencia del
parásito frente a las drogas antipalúdicas de elección. Otro problema con el que han tenido
que tropezar las organizaciones de salud pública mundial en la erradicación de la malaria, es
el desarrollo de la resistencia del mosquito vector frente a los insecticidas utilizados para su
eliminación y prevención en la transmisión (OMS 1994).
La situación actual de la Malaria es motivo de constante preocupación al ser una de las
principales Endemias Parasitarias que tenemos en nuestro territorio; la población boliviana
estimada en riesgo de contaminación de enfermedades transmitidas por vectores está en
constante incremento al aumentar la población y actividad económica de subsistencia en las
zonas endémicas del país, siendo algunos datos de interés que aproximadamente 3 000 000
de personas están expuestas, el 75 % del territorio tiene posibilidades de albergar al
mosquito causante de la enfermedad.
4
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Además contribuye a las complicaciones de los embarazos que terminan en abortos y/o peso
bajo al nacer de los neonatos, además provoca anemia en mujeres y niños, aumentando su
vulnerabilidad a otra enfermedades, todos estos aspectos afectan de gran manera en la
situación social boliviana. (Mollinedo y col, 2000)
Debido al desarrollo de resistencia del parásito a los diferentes antipalúdicos, se han sufrido
consecutivos fracasos en el tratamiento de la malaria en zonas endémicas, específicamente
en los casos de malaria causada por P. falciparum, también está la reaparición de esta
enfermedad en áreas donde ya se la había erradicado. Por estas razones, se ha venido
trabajando continuamente en la búsqueda de drogas con actividad sobre P. falciparum; ya
sean moléculas sintéticas o moléculas obtenidas a partir de extractos vegetales siendo este
último caso, donde la etnobotánica se constituye en una herramienta muy útil para dirigir
estudios de actividad antimalárica, con base en la medicina tradicional.
Para conocer la actividad antipalúdica de los extractos que se obtienen de las diferentes
especies es necesario recurrir a las pruebas in vitro sobre cultivo continuo de P. falciparum ,
bajo condiciones estrictamente controladas.
En este trabajo presentamos tres métodos para la determinación de la actividad antimalárica
de productos naturales o sintéticos, el método visual que es el que habitualmente se emplea
en este tipo de trabajos, y dos métodos relativamente nuevos en nuestro medio, el método
bioquímico (Lactato deshidrogenasa) y el método fluorométrico, que fueron adaptados a las
condicionesestablecidas en el laboratorio.
En este trabajo se evaluó la actividad antimalárica de compuestos por el método visual,
por el método bioquímico y por el método fluorométrico. La parte experimental de este
trabajo fue desarrollada en el Laboratorio de Quimioterapia Experimental del Instituto de
Investigaciones Fármaco Bioquímicas de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés en la Ciudad de La Paz con el apoyo
del Institut de Recherche pour le Développement (IRD) y el proyecto "Flora Regional como
fuente de Fármacos antiparasitarios, antifúngicos y anticancerígenos", financiado por la
Organización de Estados Americanos (O.E.A.)
5
David Gutiérrez Yapu
2.1 CONCEPTO E HISTORIA
El término malaria deriva de la expresión italiana "mala aria", que quiere decir "mal aire"
asociado con las zonas pantanosas donde crecen los mosquitos que difunden la
enfermedad, la malaria se conoce desde hace miles de años y las primeras menciones
registradas datan de antes del 1500 a. de C., en China y Egipto. La enfermedad fue, hace
tiempo, frecuente incluso en zonas frías como el Norte de Europa, donde afectaba regiones
de Inglaterra y Escandinavia. Fue erradicada de Italia al final de la Segunda Guerra Mundial
y en los años sesenta todavía se produjeron algunos casos en la cuenca mediterránea. En
los años cincuenta, se produjeron casos de malaria incluso en Canadá y Alaska.
El primer hito real en el conocimiento de la malaria fue en 1880, por el cirujano militar francés
Alphonse Laveran quíen logró determinar que esta enfermedad era causada por un
microorganismo unicelular. Poco después, Ronald Ross, siguiendo una sugerencia de otro
médico escocés, demostró que los mosquitos transmitian la enfermedad mientras se
alimentaban de sangre. Este descubrimiento fue la clave para el control de la infección y
condujo a fa desecación de fos pantanos donde crecían los mosquitos, el uso de mosquiteros
por la noche para evitar la picada cuando los mosquitos son más activos y finalmente, al
desarrollo de insecticidas eficaces. La quinina, obtenida de fa corteza de Cinchona, fue
llevada a Europa desde Sudamérica por misioneros jesuitas, a comienzos del siglo XVII, la
quinina todavía se usa extensamente. (P.Oporto, 2002)
La propiedad curativa de esta planta, despertó un gran interés en varios investigadores como
los franceses Pelletier y Caventou en 1820, quienes fueron los que aislaron el principio activo
la QUININA. Debido a este gran éxito, durante la Segunda Guerra Mundial y en nuestros
días, la búsqueda de nuevos componentes con propiedades antipalúdicas similares,
derivados de plantas, es de gran importancia para la Organización Mundial de la Salud.
(Boteroy col. 1998)
Hace aproximadamente 40 años, la mayoría de médicos confiaban en la erradicación de la
malaria y en que esta enfermedad ya no constituia un problema sanitario grave, ya que
estaba perfectamente controlada en zonas en las que, antaño había sido muy común donde
además, se disponía de medicamentos efectivos. No obstante, en los últimos años, se ha
producido un fuerte aumento en el número de casos de malaria, pues los parásitos
7
David Gutiéfrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- JlFB - UMSA
causantes de la malaria y los mosquitos vuelven rápidamente a colonizar las zonas de donde
anteriormente habían sido erradicados mediante quimioterapia, uso de insecticidas y otras
medidas. Actualmente se realizan abundantes esfuerzos para encontrar una cura eficaz.
2.2 SITUACIÓN MUNDIAL DE LA MALARIA
Algunos expertos estiman un aumento del 20% anual del índice de enfermedades y muertes
relacionadas con la malaria, no existe ninguna otra enfermedad occidental tan resistente.
Cada año, en todo el mundo, la malaria destruye, por lo menos, el equivalente a 35 millones
de vidas humanas productivas y sanas, por muertes prematuras y discapacidades, siendo los
niños mucho más vulnerables a la malaria.
Actualmente, 90 países en el mundo son considerados palúdicos, con casi la mitad de ellos
localizados en la región del sub.-Sahara en África, el 90% de los casos y muertes mundiales
se producen en ésta región. Epidemias palúdicas son comunes en Burundi, Rwanda y la
República Democrática del Congo (antes Zaire) (Trigg and Kondrachine 1997).
La malaria es rara en el Norte de África, donde se encuentran las especies P. vivax y P.
ma/ariae y una menor proporción de P. ovale. En el este, en Madagascar, una verdadera
epidemia hizo estragos entre 1987-1988, lo mismo que en Etiopía (Trigg and Kondrachine
1997). La endemia reapareció en La Reunión y en la Isla Maurice (Gentilini et al, 1995).
En Asia, el paludismo castiga intensamente las regiones de: Asia Menor, Península Indiana,
China, Tailandia y Vietnam, donde predominan P. falciparum y P. vivax (Gentilini et al, 1995).
En 1998, la malaria invadió áreas que anteriormente se encontraban bajo control, podemos
citar Azerbaiján, Tayikistán, Irak y Turquía, Rajas tan y Bangla Desh (Trigg and Kondrachine
1997).
Gracias al Programa Global de Erradicación de la Malaria ejecutado por la OMS entre 1955 y
1969, la transmisión de la malaria ocasionada por P. falciparum fue detenida y erradicada en
Norte América, Europa Meridional, la antigua Unión Soviética y algunos territorios de Asia y
Sud América. Sin embargo, son muy frecuentes los casos de importación de ésta
enfermedad por la migración, ó a través de los viajes aéreos (WHO, 1998).
8
David Gutiérrez Yapu AJeade Quimioterapia Experimental- IIF8 - UMSA
Esta enfermedad existe en Sud América, donde está en progresión, particularmente en
Brasil, ya que dos tercios de los casos de malaria que ocurren en América se dan en la
cuenca Amazónica, también se presentan casos de paludismo en las Guayanas y en Haití,
estando ausente en las Antiilas Francesas (Gentílini et al. 1995).
Algunas islas de Oceanía son afectadas por la malaria: Nueva-Guinea, Islas Salomón,
Vanuatu. Tahití, Nueva-Caledonia, y las Islas Lealtad están totalmente libres y han
desaparecido íos focos palúdicos del noreste de Australia. En Francia el paludismo de
importación va en pleno aumento, debido a desplazamientos frecuentes hacia países
tropicales y negligencia en la profilaxis, siendo otra causa el transporte de mosquitos
infectados en los aviones (Gentilini et al, 1995).
En 1999, la población de la Región de las Américas ascendía a 818 millones de habitantes,
de los cuales 299 millones (36,5%) vivían en zonas de condiciones ecológicas propicias para
la transmisión de la malaria. De los 35 países y territorios que son miembros de la
OPS/OMS, 21 informan tener zonas con transmisión activa de malaria. Todos ellos
(Argentina, Belice, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Guayana
Francesa, Guatemala, Guyana, Haití, Honduras, México, Nicaragua, Panamá, Paraguay,
Perú, República Dominicana, Surinam y Venezuela) han reorientando sus programas de
control de acuerdo con los lineamientos de la Estrategia Mundial para el Control de la Malaria
(EMCM) adoptada en Arnsterdarn en 1992 (OMS, 2002).
En resumen podriamos afirmar que el panorama mundial del paludismo muestra que
aproximadamente el 90 % de los casos con malaria se encuentra en la región Sub-Sahara
del África, pero en la región Norte de África es poco frecuente, en Europa esta casi
erradicado, se presenta en casos de migración, algunas Islas en Oceanía presentan esta
enfermedad. (Fig. 1 )
9
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental-IIFB - UMSA
Figura 1: La Malaria a nivel Mundial, 2003
Malaria Endemic Countries, 2003
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• No Malaria
D Countnes with Malaria RISk
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Fuente: http://www.med.sc.edu:85/parasitology/ malariamap-2003.gif
2.3 SITUACIÓN DE LA MALARIA EN BOLIVIA
La historia de la lucha de la erradicación de la malaria en nuestro país se inicia en 1920, con
la creación del Servicio de "Lucha antipalúdica", realizando la primera prueba de
saneamiento antipalúdico durante un período de tres años en el valle de Mizque
(Cochabamba). Este programa consistía en un tratamiento antipalúdico en base a quinina y
la erradicación del vector con insecticidas. En 1932 con el inicio de la Guerra del Chaco se
paralizaron todas las actividades dirigidas a la lucha contra la malaria, y debido a esto
además de la gran movilización de contingente militar hacia la región del Chaco y viceversa
se produjo la diseminación de ésta enfermedad en el país.
Entre 1947 Y 1951 se dio prioridad a la lucha antimosquito con la utilización de OOT, siendo
en 1957 el año en la que se aprobó el decreto supremo para la Erradicación de la Malaria. A
partir de este año el gobierno destina un presupuesto exclusivo para la lucha contra la
malaria, de tal manera que en 1958 se crea el Servicio Nacional de Erradicación de la
Malaria (SNEM). A pesar de esto, los recursos no son del todo suficientes, y año tras año los
casos de infecciones por P. falciparum y P. vivax se incrementan en nuestro territorio
(Méndez 1982).
10
DavidGutiérrezYapu Area de Quimioterama ExpedmelltaJ -¡IFB - UMSA
En la fase de erradicación en 1956 se determina y delimita el área geográfica de transmisión,
ubicación, así como una programación logística para la lucha contra la malaria siendo en
1959 cuando se pone en marcha la fase de ataque con la cooperación de USAID y UNICEF
y en 1963 de forma sorprendente el área de transmisión, se redujo de 821.346 a 201.806
krrr'.
Hasta 1965se mantuvo la fase de ataque por rociamiento con DDT en los departamentos de
La Paz, Cochabamba, Chuquisaca, Santa Cruz y Tarija. Sin embargo, a medida que fue
disminuyendo la cooperación exterior, pese a la disminución de los rociamientos, la situación
epidemiológica se mantuvo sín deterioro desde 1966 hasta 1969.
A partir de 1977 se experimentó un extraordinario incremento de casos, con un pico máximo
en 1978. En 1979 se amplió la cobertura de rociamientos gracias al Programa PL-480,
adminístrándose quimioterapia temporal supresiva, especialmente en ros focos de mayor
incidencia rnalárica, sin embargo el número de casos fue ascendiendo año tras año (Méndez
1982).
En Bolivia, aproximadamente 3/4 partes del territorio (75% de la superficie total)
corresponden a zonas tropicales y subtropicales que son afectadas por el paludismo (Figura
2). Beni es el departamento más afectado por las características climatológicas que
presenta, ya que más del 90% de los casos se registran en las localidades de Riberalta,
Guayaramerín y Magdalena que son las zonas endémicas declaradas (Ávila, 1993).
11
David Gutiérrez Yapu Área de Quimiot¡>Japia Experimental - IIFB - UMSA
Figura 2: La malaria en olivia, 2 00
A'u t-nMnlkn : i 5- I!.'.
PobLstih u riu~() : .\.%'U9:; h.b.
"f'7 ., ,-~; ~.; -o ,.. 'i.;: ,p:liiatitodJLiuJálCJiloom ' '. ~ ... -' . ..,',: . . " . ,'" .: : ". ,:;/
.<7f,'~~..~~~~n~w} ! t1~lIiÜ:'~1 'Ih':d
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Fuente: www.paho.org/spanish/ad/dpc/cd/bahia-bol.pdf
Es necesario mencionar que la malaria es uno de los mayores problemas de salud pública
para Bolivia, donde aproximadamente el 75% del territorio nacional se considera área
endémica y por tanto vulnerable y receptiva a la transmisión de malaria. Según datos del año
2000, la población en riesgo se estima en 3.569.495 habitantes, considerando como
indicador para los niveles de riesgo el índice de Incidencia Parasitaria Anual (IPA). (Fig. 3 Y
Cuadro 1)
12
David Gutiérrez Vapu
Figura 3: índice Parasitario Anual de a en 8 Iivia, ZOOO
1PA vtayor a 10 1. I.(}(IO bab.
IPA (lItrl.' l' 9 X 1.lIl1 0 hub.
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Cuadro 1: Inc idencia Parasit ria nuaí de Malaria en olivia, (1 0-
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13
lavid Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
.a enfermedad afecta mayormente a hombres (58%) y a la población económicamente
ictiva (51,9%), principalmente a aquellos que se dedican a las actividades económicas de
:arácter agrícola que muchas veces implican migración desde las zonas altiplánicas. Le
,igue en importancia la población en edad escolar con el 26,5%. Mas allá de su efecto letal,
as consecuencias económicas de la malaria son inmediatamente tangibles en términos de
educción de la fuerza productiva, sea en el caso extremo de muerte o a/ considerar las
iérdidas por la discapacidad laboral producida por la enfermedad.
:n un estudio reciente sobre la pérdida de producción económica de Bolivia como
onsecuencia directa de la enfermedad y mortalidad de la población económicamente activa
or malaria, se estimó que este costo equivale a un 3%0 del PIB. Si bien este cálculo se
estringe a las pérdidas directas de la producción, el costo social puede alcanzar cifras más
I/tas.
:n nuestro país la malaria es una de las enfermedades que merece atención, ya que a
ina/es de 1998 la situación epidemiológica presentó una hiperendemia, la más crítica de
:>do el historial malárico en los últimos 40 años. (Cuadro 2).
Cuadro 2: Evolución de la malaria en Bolivia (1990-2000)
6.000
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ifl \J he»w:t' I1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000
AJl;¡OS
.'VE"TE.: DeS - PROGRAl\L\.~ACIONAL l>E MALARIA
Fuente: www.paho.org/spanish/ad/dpc/cd/bahia-bol.pdf
14
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
En 1998 se produjo este aumento alarmante debido principalmente a los cambios
climatológicos provocados por el fenómeno de El Niño, ya que éste provocó excesivas
lluvias, con lo que se registraron más de 6.000 casos de malaria causada por P. falciparum
que en 1997.
Por el contrario, en 1999 el total de los casos de malaria disminuyeron a menos de 8.000
casos en relación a 1998 que registró más de 11000 casos de malaria terciana maligna
(Cuadro 2). Si bien estos datos indican la reducción del número de casos en este año, no
significa que la enfermedad haya sido erradicada (PNEM., 2000).
Hasta el año 2001 (Tabla 1), los casos de malaria en el territorio han ido en descenso, y el
departamento de Oruro se mantiene libre de esta enfermedad (PNEM 2002) (Cuadro 3).
Tabla 1.- Notificación de ia !Vlaiaría por especie parasitaria e indicadores. Sedes y
Distritos, BOLIVIA-2001
-
I Población óleal
Especie parasitaria
Sedes y Distritos Casos I P. vivax , P. telciperum IMixla iiI malárica positivos I
251Riberalta (a) 75,158 3,351 3,043 283
Guayaramerin (a) 46,414 2,057 1,897 [ 159 / 1
Magdalena (a) 17,492 429 362 66 1
Resto-Beni 82,373 1,200 224 720 I 41Cochabamba 397,511 1,780 1,780 - -Chuquisaca 195,912 1,821 1,821 - -La paz 289,608 311 I 307
1 41 -1Panda 58,142 1,536 1,294 241 1
Santa Cruz 1,757,411 2,506 2,484 18[ 41Tarija 181,795 1,649 1,648 1 -
Potosí (b) 37,989 101 101 - -TOTALES 3,139,805 15,765 14,957 1 776 1 32,
~I ! !
(a) Distritos de Salud(b) En su mayoría la notificación es de casos clínicosFuente: Programa Nacional de lv/aiada, 20ü2.
i5
David Gutiérrez Yapu ÁreA de Quimiotempia Experim ental - I/FB - UMSA
Cuadro 3.- istribución de la oblación - Área Malárica. BOLIVIA - 2001
o Ríberalta (a.)
• G.1ayanmerin (a)
O M:agdalem. (a)
O Resto-Beni
• Cochabamba
O Clniquisaca
11I La paz
O Pando
• Santa Cruz
Ii Tarija
O Potosí (b)
Fuente: Programa Nacional de Malaria, 2002
Son muchos los factores que han intervenido para que esta enteuneuad aumente
dram áticamente en lo que se refiere a riesgo e incidencia . Entre las principales causas se
pueden citar el insuficiente apoyo ñnanciero dei Gobierno Centrai, insumos iaboraiotiaies y
de medicamentos insuficientes, coberturas de control limitadas y discontinuas, y en algunos
departamentos, exceptuando Seni y Panda, ia faiia de apoyo de palie de las prefecturas y
municipios (Mollinedo, Comunicación directa 1999).
Todo lo anterior dificulta la continuidad en la erradicación y controi dei mosquiio vector, el
mantenimiento de programas de profilaxis y tratamiento en las zonas endémicas de alta
incidencia. Otro factor que se observa es el inadecuado tratamiento, esto siqniñca un
tratamiento inconcluso, ó dosis inadecuada (automedicación), corriendo el riesgo de que el
parásito desarrolle resistencia a los antipalúdicos administrados. Finalmente, la deficiente
situación económica, la precaria construcción de las viví n as, la inadecuada utilización o
inexistencia de mosquiteros, el constante cambio de hábitat en busca de fuentes de trabajo y
la migración permanente de colonos a zonas endémicas son otros factores que aumentan los
problemas en la erradicación de esta enfermedad.
En 1999 se controló el avance y la dispersión de la malaria, se disminuyó en un 38% el
número de casos en relación a 1998 (Mollinedo 1988). Para manejar la complejicac de la
lucha contra la malaria, el Ministerio de Salud y Previsión Social (MSPS) ha elaborado el
16
David Gutiérrez Yapu /vea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Programa Nacional de Fortalecimiento y Consolidación de las actividades de Prevención,
Vigilancia y Control de la Malaria en Bolivia, 2001-2005 (PNM) que desarrollará actividades
integradas y sistemáticas en las zonas endémicas del pais, sobre la base de una estructura
centralizada en aspectos de normalización y coordinación de procedimientos e insumos, y
desconcentrará la gestión de recursos humanos para permitir la ejecución de acciones a
nivel departamental y distrital.
El PNM tiene un costo del orden de US $ 12,7 millones, de los cuales ya se cuenta con
financiamientos asegurados del Canadá, UNICEF, USAID y la OPS. Restan financiar US $ 6
millones que el país solicita al BID.
2.4 LOS PARÁSITOS CAUSANTES DE LA MALARIA
La malaria está causada por el Plasmodium, un microorganismo o protozoo unicelular.
Existen cuatro formas diferentes de malaria en el hombre causadas también por cuatro
especies distintas de Plasmodium: P. falciparum, P. vivex, P. ovale y P. malariae. Estas
especies de Plasmodium son exclusivamente parásitos del hombre, excepto en el caso de P.
malariae que puede infectar a otros primates. Por consiguiente, a diferencia de algunas otras
enfermedades tropicales, no existe un reservorio animal de la infección, excepto el mosquito
que difunde la enfermedad.
El P. falciparum es el parásito causante de malaria más importante por diversos motivos,
pudiendo ser los más importantes los siguientes:
• Es altamente infectante .
• Es la forma más agresiva y provoca una gran morbilidad.
• Es el único tipo de malaria con una tasa importante de mortalidad.
• Está ampliamente distribuido en las regiones tropicales y subtropicales .
• Es la causa más frecuente de malaria endémica, especialmente en África
(provoca un 80 % de los casos de malaria)
• Existen cepas quimioresistentes
Los otros dos tipos, P. ovale y P. meietiee, raramente causan problemas sanitarios graves.
La enfermedad causada por cada tipo de parásito se conoce con distintos nombres:
17
David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experi[T1ental- IIFB - UMSA
íabla 2: Enfermedades ocasionadas por especies diferentes
de Plasmodium.
TIPO DE Plasmodium ENFERMEDADP. falciparum Malaria causada por P. falciparum, fiebre terciana maligna
P. ovale Malaria causada por P. ovale, fiebre terciana por P. ovale
P. vivax Malaria causada por P. vivex, fiebre terciana benignaI
P. ma/ariae Fiebre cuartana, fiebre cuartana benigna I
Fuente: Deharo et al. 2000
2.5 CLASIFICACiÓN TAXONÓMICA.
fabla 3: Cíasificación taxonómica del Plasmodium
I_=~_,",.""".- =-- •. _~.--:c-:-. ".-__ "" -_"..::.:"_ -_.,..~_-.~------------~------_~ ---I~-
Reino AnimaliaSubreino ProtozoaPhylum Sporozoa (apicomplexa)Clase SporozoaeSubclase CoccidiaSuperorden EuccocidiaeOrden HaemosporidaSuborden AconoidinaFamilia HaemosporidaeGénero PlasmodiumEspecies (en el humano) falcíparum........................................................ malariae......................................................... ovale......................................................... vivax
Fuente: Deharo et al. 2000
18
David Guliérrez Yapu
2.6 CICLO BIOLÓGICO DE Plasmo ium
2.6.1 VECTOR, Anopheles.
El mosquito Anopheles es el vector de la malaria y no su causa, existen 380 especies de
Anopheles, pero sólo 60 de ellas son capaces de diseminar la malaria, de estos, dos infestan
a Bolivia A. darlingui y A. pseudopunctipennis. Los parásitos causantes de la malaria se
transmiten de una persona a otra únicamente mediante la succión de sangre que se produce
por pica~ura de los mosquitos hembras que son las que necesitan de sangre. Los machos no
transmiten la enfermedad ya que sólo se alimentan de la savia de las plantas. El ciclo
evolutivo del mosquito se muestra a continuación .
Figura 4: Ciclo evo lutivo del mosquito Anoptietes
1. Larva 2. Pupa
3. Adulto
/' .
4. Huevo
arel..:=.:..:..:..:::..:....:..:..:===::.:........:=-=~=.:.:=..:..:.:.=.::==
www.arbovirus. qui
El mosquito hembra del género Anopl1eles (Huésped definitivo) se constituye en el vector de
transmisión del paludismo y en este se lleva a cabo el ciclo sexual del parásito luego pasa
hacia los mamíferos donde se desarrolla la fase asexual. El desarrollo desde el huevo a
nuevos adultos Anopheles toma de 7 a 21 días, dependiendo de la temperatura ambiente.
19
lavid Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
Jn Anopheles hembra necesita alimentarse con sangre que contiene los elementos nutritivos
iecesaríos para que sus huevos maduren.
>on más de 380 especies de mosquitos anofelinos las que existen, pero solo 60
lproximadamente actúan como huéspedes definitivos del parásito del paludismo en el
nundo (Botero y Restrepo 1998).
.as especies que predominan en América Latina son principalmente:
Anopheles albimanus
Anopheles aquaralis
Anopheles darfingi
Anopheles nuñezioveri
Anopheles pseudopunctipennis
Anopheles punctimacula
Anopheles vestitipennis
Figura 5: Mosquito Anopheles (Hembra)
Anopheles Mosquito(AdUllremall2'}
Fuente: http://www.enchantedlearning.com/mgifs/Mosquito bw.GIF
20
David Gutiérrez Yapu
2.6.2 CICLO VITAL DEL Plasmodium.
Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
El parásito causante de la maJaria tiene un ciclo vital que se reparte entre un huésped
vertebrado (el hombre u otro mamífero) y un insecto vector. Debe vivir en ambos para
completar el ciclo, que se muestra en la Figura 6 y que se detalla a continuación:
A Multiplicación esquizogónica exo-eritrocitaria.
1 Mosquito Anophe/es hembra. que ya ha succionado sangre infectado de un mamífero (o
persona), inoculando esporozoitos a otro mamífero (o persona) no infectado. 2 Los
esporozoitos inoculados infectan las células del hígado. 3 Estos se encuentran madurando a
esquizontes. 4 Los merozoitos son liberados al torrente sanguíneo.
(El P. vivex y el P. ovale poseen un estadío latente en el hígado llamados hypnozoitos
pueden emerger a intervalos de semanas, meses o hasta años y provocar recaídas de
malaria).
8 Multiplicación esquizogónica intra-eritrocitaria.
5 Los merozoitos infectan glóbulos rojos. 6 El estadio anillo de trofozoito madura a
esquízonte , con la posterior liberación de los merozoitos. 7 Algunos parásitos se diferencian
sexualmente en gametocitos. (Los cambios de estadios en el torrente sanguíneo, son los
responsables de las manifestaciones clínicas características de esta enfermedad).
7 Los gametocítos, macho (microgametocito) y femenino (macrogametocito), son ingeridos
por el mosquito Anopheles mientras succiona sangre (pues necesita hemogiobina para que
maduren sus huevos)
e Los parásitos multiplicados en ros mosquitos corresponden al ciclo esporogónico.
8 Cuando los gametocitos llegan al estomago del mosquito, los microgametocitos maduran
formando un gran numero de microgametos, que son elementos flagelados, estos nadan en
busca de macrogametos (macrogametocitos maduros) esto origina el cigoto. 9 Cuando el
cigoto se alarga, y se mueve se llama ookineto. 10 El ookineto atraviesa la pared estomacal
del mosquito, y se redondea adhiriéndose a la cara extema de esta pared, convirtiéndose en
ooquiste. 11 Los ooquistes sobresalen en la parte extema del estomago del mosquito,
conduciendo a la producción asexuada de numerosos esporozoitos. 12 Al liberarse estos
21
David Gutiérrez YBpU Area de Quimioterapia Experimental - i1FB - UMSA
esporozoitos se dispersan en el cuerpo del mosquito, se anidan en las glándulas salivales
con 100 hasta 70000 esporozo itos, estos son inyectados con la saliva del insecto en el
momento de la picadura.
Figura 6.- Esquem del ciclo biológico de Plasmodium
Exf!aQel'.ale<l 'm.cmcJ"'!ll<l~1é
A" Inf;;-d¡"'" SI.J9')
A:o Di,.~I"lO'S~ Slilge
Fuente: http://www.dpd.cdc.g v/pdx/HTMLlMalaria.htm
2.6.3 DESARROLLO DEL PARÁS ITO EN EL VECTOR
Cuando fa hembra del mosquito Anopheles pica a una persona infectada con Plasmodium ,
toma parásitos que son inyectados dentro de la sangre de una persona sana cuando esta es
picada por dicho mosquito (Knell 1991; Markell et al. 1994).
22
David Gutiérrez Yapu ÁIea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
La fertilización y exflagelación, en la fase sexual o esporogónica del Plasmodium tienen lugar
en el estómago del mosquito. Los gametocitos escapan de los glóbulos rojos y llegan a ser
gametos libres. La unión de un gameto masculino y femenino da lugar a la fertilización, así
se origina el cigoto. Este desarrolla hasta el ooquineto invasivo, el cual perfora el interior de
la pared del estómago y llega a ser un ooquiste. Los ooquistes crecen, se dividen y revientan
produciendo miles de esporozoitos invasivos. Una vez libres migran a través del cuerpo del
mosquito e invaden sus glándulas salivares. El desarrollo de Plasmodium en el mosquito
toma como mínimo 8 días y máximo 35 días (KneIl1991; Markell et aI.1994).
2.6.4 DESARROLLO DEL PARÁSITO EN EL HOMBRE
. Este ciclo es también conocido como esquizogónico o asexual (Botero y Restrepo, 1998). Se
conocen algunas variantes como la esquizogonia hepática, donde los esporozoitos
ínoculados en el torrente sanguíneo pasan rápidamente al interior del higado, entonces se
multiplican en las células hepáticas en los próximos 7 a 10 días, sin causar síntomas. La
esqulzoqonía hepática, la primera fase asexual, ocurre en las células de Kupffer de la vía
hepática. Los esporozoitos llegan a ser trofozoítos. Ellos se dividen hasta producir miles de
merozoítos invasivos (10-30.000 oocistos) (Markell et al. 1994).
En las cuatro especies tiene lugar una multiplicación asexual en el interior de las células
hepáticas, pero en P. vivax y P. ovale, una parte de los esporozoitos infectantes pasa a una
fase de reposo antes de comenzar la multiplicación asexual, mientras que el resto empieza a
multiplicarse de inmediato. La fase de reposo del parásito se denomina hipnozoíto. Tras el
periodo de algunas semanas hasta dos años, la reactivación del hipnozoíto inicia la división
sexual.
A la reactivación de los hipnozoitos se atribuyen las recaídas características de P. vivax y P.
ovale. En P. falciparom y P. ma/ariae no se encuentran hípnozoítos. No se producen
recaidas en el caso de P. falciparom. En el caso de P. ma/ariae, fas recaídas pueden
sobrevenir durante por lo menos 3 años, algunas veces hasta 20 años y más. Este fenómeno
sería debído a las formas eritrocitarias latentes y se expresa cuando las defensas
inmunológicas del huésped bajan. (Figura 6)
23
David Gutiérrez Yapu kea de Quimioterapia Experimental - "FB - UMSA
También se conoce la esquizogonia eritrocítica que también es conocida como fase asexual,
donde el parásito revienta de las células hepáticas para invadir los eritrocitos y multipiicarse
de nuevo. Los merozoítos invaden los glóbulos rojos y llegan a ser trofozoitos eritrocíticos
que crecen y se dividen entre 8-16 nuevos merozoítos. Cuando maduran, ios glóbulos rojos
revientan y los merozoítos son liberados y el ciclo comienza de nuevo, cada 2 o 3 días.
El merozoíto es la forma de vida más corta del ciclo de vida de Plasmodium y está
especializado para reconocer y atacar a molécuias especificas en la membrana de un
eritrocito e invade por sí mismo la membrana del eritrocito. Entre 20 a 30 segundos el
merozoito está dentro del eritrocito después del primer contacto y conexión. El anillo de
fusión se alarga y se mueve hacia atrás sobre el merozoíto, empujando ei cuerpo del
parásito dentro del glóbulo rojo.
La cubierta más externa de la superficie del merozoíto es mudada en este proceso. El
merozoíto ahora desarrolla rápidamente hasta trofozoíto eritrocítico y se alimenta por
ingestión de la hemoglobina y citoplasma de [a célula huésped a través del área
especializada de la membrana (citosomas). Los merozoítos están desprovistos de la vacuola
parasitófora hasta la ruptura de la célula huésped y liberación de elfos para invadir nuevos
glóbulos rojos (Knell 1991; Markell et a1.1994) (Figura 7).
24
Área de Oulrnioteraoia Experimental- IIFB - UMSA
Figura 7: Evolución del Plasmodium dentro del eritrocíto
[ Merozoite ]
[ Ring stage]
Whole developmental cycleof erythrocytic phase SchiIOnt ]
( Trophoroite1
Clri¡:ioI.lfirm' m .....1yu...a!r.B"""'.. ' . • pDm!/iD,..P..... ¡" .. \Ylody\h ..... l~lI) LB.fu.»., J1J.¡¡"~~.U.l<;"'¡', l. l'.rilo.o. u.l GB.lliI::l»n Át.a.fl]g-ttt,\¡4Gda.", 'lA UlmstI'll:1IDIo ofPW:m.ol.iJml~~N.~~(,.l r1ll.~u .pp .H7·.B. Co~(10I)O~ w;i:tt..~l:i)J~.fum..Ulnu.r kj¡,U:;1II
Fuente: http://www. sites.hujLa : Ima\aria/maps/wh \ecyclepath.h
2.6.5 CA ACTE íSTICA D las modium falciparum
Es la especie más tem ible, mortal y la más ampliamente distribuida en 1 regiones trop ica!es
y subtropicales. Así , el desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura
superior a los 18 "C , a esto se debe la ausencia de este hematozoario en las montañas
tropicales y en regiones templadas. Su ciclo exoeritrocitario es el periódo más corto, dura
solamente 7 a 15 dias en promedio y no presenta reviviscencia esquizogónica; la longevidad
del parásito no pasa habitualmnte de 2 meses , mas puede lleqar a los 6 meses o un año.
P. falciparum parasíta todos los hematíes, por esto 10 de 100 gló bulos rojos pueden ser
parasitados. La esquizogonia eritrocitaria dura habitualmente 48 horas y se efectúa
exclusivamente en los cap ilares vi cerales, especialmente encefálicos (Figura 8). En el frotis
de sangre e observa la presen cia uniforme de trofozoitos anulares (esquizontes y rosáceas
2S
David Gutiérrez Yapu
se encuentran en capilares profundos), el poliparasitismo de un glóbulo rojo es frecuente . El
nombre de esta especie se debe a sus gametocitos en forma de cigarro o banana (Botero y
Restrepo, 1998; Gentilini et al, 1995)
Figura 8. e oj biológico de Plasmodium falciparum
Fuente: Deharo et al, 2000
2.7 PATOGE lA y FISJOPATOLOGíA
Estadioanillo
. '.... ,'
La hemó!isis de los glóbulos rojos parasitados y no parasitados, la liberación de los
metabolitas del parásito, la respuesta inmunológica del huésped al antígeno y la formación
del pigmento palúdico se traducen en [os primeros efectos patológicos de fa infección
palúdica.
Además, en P. falciparum la esquizogonia tiene lugar en los capilares de los órganos
internos, esto porque en [a superficie del eritrocito parasitado se forman unas protuberancias
electrodensas cuando e! parásito comienza a dividirse. La isquemia provocada por la
obstrucción de los vasos lleva a síntomas que varían según el órgano fectado, otro factor
26
David GutiérrezYapu hea de Quimioterapia Experimental- IIFB- UMSA
que favorece la obstrucción vascular es la menor deformidad de los glóbulos rojos
parasitados (Markel/ et a', 1994).
Las diferentes especies de Plasmodium se diferencian por su tendencia a infectar distintos
glóbulos rojos. Los merozoitos de P. vivex y P. ovale invaden soro reticulocitos, en cambio
los merozotos de P. malaria e se limitan a células viejas, casi al final de su vida. De esta
manera, estas infecciones tienen un límite natural, P. falciparum es capáz de invadir por
igual, glóbulos rojos de todas las edades, es por esto que las infecciones con este parásito
llevan rápidamente a la anemia. Sin embargo, junto a la destrucción masiva de los glóbulos
rojos se presentan otras alteraciones en muchos casos irreversibles (Markell et al, 1994).
El acceso simple se caracteriza por la fiebre que es provocada por el estallido de los
esquizontes que liberan el pigmento malárico en el torrente sanguíneo. La anemia resulta
tanto del estallido de los esquizontes como de la fagocitosis de los eritrocitos sanos. La
esplenomegalia y la hepatomegalia frecuentes después de cierto tiempo de evolución
demuestran la hiperactividad y la congestión de estos órganos (Markell et al, 1994).
Las particularidades sintomáticas del acceso pernicioso palúdico se deben a la multiplicación
rápida, particularmente de P. tetciperum o en ros capilares viscerales que provocan una
anoxia de los tejidos, predominantemente a nivel del encéfalo, riñones, hígado y pulmones
por anemia hemolítica, disturbios de la microcirculación y fenómenos dtotóxicos. La
gravedad de la hemólisis en el acceso pernicioso es la consecuencia de la parasitemia
elevada.
Las alteraciones de los capilares viscerales son de intensidad variable, los hematíes
parasitados por los esquizontes desarrollan en su superficie protuberancias que los adhieren
al endotelio de los capilares, los eritrocitos sanos se aglutinan a los parasitados formando asi
las rosetas. Estos dos fenómenos provocan la obstrucción de la luz vascular y la retardación
de la circulación, los microtrombos capilares se forman por los eritrocitos aglutinados que se
lisan y liberan una sustancia fosfolipídica que a veces lleva a un proceso de coagulación
lntravasculardifuso.
Se confirma el aumento de la concentración plasmática de TNF que más importante y
durable que el acceso pernicioso es grave, esta citocina de los monocitos cumple un rol
27
David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
importante en la fiebre, en diversos desórdenes metabólicos, en reacciones inflamatorias y
en el sufrimiento cerebral por la producción de radicales libres oxidantes que esta induce. La
liberación de substancias vasoactivas agravan los disturbios de la microcirculación, llevando
a una vasodilatación de los capilares y los infiltrados hemorrágicos perivasculares. Los
fenómenos de anoxia citotóxlca serían provocados por la toxina hipotética del parásito
"sustancia plasmática de Maegraith".
Finalmente la hipoglicemia, la acidosis sanguínea y los desórdenes hidroeléctricos aumentan
la hiponatremia (GentiJini et al, 1995). Todas estas alteraciones pueden agravarse y llegar a
una anemia severa, ictericia, desequilibrio electrolítico, falla renal, hipertermia, colapso
respiratorio, alteraciones de la coagulación o sangrado, vómito incoercible, infección
asociada, edema pulmonar, hipog/icemia y hemoglobinuria (Botero y Restrepo, 1998), hasta
malaria cerebral, un coma o finalmente la muerte (Markell et al, 1994).
2.8 DROGAS ANTIMALÁRICAS
Los únicos antipalúdicos naturales son la Quinina (Figura 9), y el Qinghaosu (Figura 10),
actualmente existen más de 1600 derivados de los que tan solo 5 están usándose en la
práctica curativa. Naturales o de sintésis, estos fueron divididos en los años 60 en dos
grupos: según su rapidez de acción y su capacidad de inducir una resistencia por parte del
hematozoario, el grupo I comprende la quinina y las 4-aminoquinoleínas, antipalúdicos de
acción rápida y para los cuales la resistencia es lenta y difícil de aparecer y el grupo "
comprende los antifólicos (sulfonas y sulfonamidas) y los antifolínicos (diguanidas y
diaminopirimidinas), antipalúdicos de acción lenta y por lo cual la resistencia aparece
rápidamente (Gentilini et al, 1995)
28
David Gutiérrez Yaou Afea de Quimioterapia Exp~rimental- IIF8 - UMSA
Figura 9: Estructura de la Quinina
H
quinina
Fuente: www.sbq.org.br/PN-HET/causo4.htm
En 1973 se aisló de un arbusto de China (Artemisia annua L.) el Oinghaosu que es un
sesquiterpeno lactona peróxido, que es un nuevo esquizonticida del que existen muchos
derivados hidrosolubles y liposolubles, por lo tanto administrables por las vías intravenosa e
intramuscular. La actividad del Oinghaosu es rápida, en especial sobre las cepas de P.
falciparom cloroquino-resistentes (Gentilini et al, 1995).
Figura 10: Estructura del Qinghaosu
Fuente:http://www.lctjussieu.fr/manua/s/programes/Gaussian98/cancer.htm
La c1oroquina es un fármaco que pertenece al grupo de ras 4-aminoquino!einas (Figura 11),
este fármaco sintético es activo contra las formas asexuales eritrocíticas de la mayoría de
cepas de Plasmodium ma/ariae, ovale, vivax y fafciparom. Se utiliza para tratar la malaria
29
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IlFB - UMSA
pero también se ha usado ocasionalmente en artritis reumatoidea y lupus discoide por sus
efectos antiínflamatorios, pero a dosis mucho más altas.
Figura 11. Estructura de la Cloroquina
•
e18H26el r·,)~; Cloroquina
Fuente: www.med.javeriana.edu.colfisiologia/fw/c802.htm
La Cloroquina fue desarrollada como un fármaco antimalárico durante la segunda guerra
mundial, aunque al finalizar esta se descubrió que el fármaco existía en Alemania desde
1934, esta aún en dosis masivas, no produce un efecto significativo sobre los estadios
tisulares exoeritrocíticos de los plasmodios; por lo tanto, este fármaco no es un agente
profiláctico y no previene el establecimiento de la infección. Sin embargo, es muy efectiva
contra las formas eritrocíticas asexuadas del P. vivex y de las cepas sensibles del P.
falciparum y gametocitos del P. vivex.
La resistencia a la cloroquína se ha desarrollado principalmente en cepas de P. tetciperum.
por lo que es importante determinar esta resistencia en el área geográfica donde se vaya a
administrar el tratamiento.
El número de nuevas drogas con que cuenta el arsena! de antipalúdicos es limitado y la
amenaza de la resistencia del parásito a las drogas se incrementa. Desafortunadamente, no
existe una vacuna con un impacto operacional de magnitud, además los instrumentos de
diagnóstico proporcionados deben ser mejorados. Ahí está la necesidad de toma de
conciencia de los gobiernos y sectores privados de cada nación de la importancia de los
recursos esenciales para asegurar que estos requerimientos sean disponibles (Trigg y
Kondrachine, 1998).
30
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - lIFB - UMSA
2.9 ENSAYOS BIOLÓGICOS in vitro DE ACTIVIDAD ANTIPALÚDICA
2.9.1 ENSAYO SOBRE PARÁSITO ENTERO
El cultivo continuo in vitro de P. falciparum fue puesto a punto en 1976 por William Trager y
James Jensen y consiste en el mantenimiento in vitro a 37°C en microaerofilia, de glóbulos
rojos humanos infectados con cepas o aislados de P. falciparum suspendidos en el medio de
cultivo celular RPMI suplementado con suero humano. Esta técnica no solo ha permitido el
estudio de drogas antimaláricas, sino también las interacciones parásito-célula huésped
(Trager y Jensen, 1978). Gracias a este método se han abierto nuevas puertas para el
estudio de la biologia, bioquímica, quimioterapia e inmunología de P. falciparum (Chulay,
1983).
El método de determinación de la sensibilidad in viiro de P. falciparum fue introducido por
Rieckmann en 1968 que inicialmente en su macrométodo utilizaba sangre infectada de la
que después de 24 horas de incubación en presencia de diferentes concentraciones del
medicamento se extendían frotis a partir de los diferentes tubos de sangre.
En el micrométodo se empleaban las placas de 96 pozos conteniendo sangre infectada y la
solución del medicamento a diferentes concentraciones, posteriormente se realizaba un frotis
teñido con Giemsa pasadas las 24 horas de incubación, para de esta manera estimar la
inhibición de la maduración de esquizontes (Deloron, 1981)
Las investigaciones sobre paludismo humano adelantaron con los estudios de técnicas de
cultivo continuo in vitro de Trager y Jensen. Las primeras fases erítroclticas obtenidas de
esta forma fueron de P. fafciparum (OMS, 1987).
Gracias a las técnicas de cultivo se pueden estudiar en todo el mundo los parásitos del
paludismo de mayor importancia clínica. Estas técnicas son la base de muchos adelantos en
la biología, bioquímica, parasitología, inmunología y quimioterapia del paludismo (OMS,
1987):
El cultivo de estadios intraeritrocitarios de P. falciparum se basa en dos aspectos
fundamentales, el uso de un medio de cultivo específico el RPMI (Roswell Park Memorial
31
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Institut) y el incremento de dióxido de carbono entre 3 a 5 %, además de la reducción de la
concentración de oxígeno. En este tipo de cultivos se debe tener precaución en fa
preparación del medio con agua de mala calidad, el medio suplementado con suero
proveniente de donadores tratados con antibióticos o antimaláricos, la temperatura variable,
un pH no optimo, la frecuencia inadecuada en el cambio de medio de cultivo y los procesos
de congelación y/o descongelación de las cepas inadecuados.
Posteriormente, Trager describió un micrométodo a partir de un cultivo continuo de parásitos,
en el que el medio de cultivo era reemplazado por otro fresco después de 24 horas,
realizándose la lectura de los frotis a las 48 horas.
2.9.2 MÉTODOS EMPLEADOS PARA DETERMINAR LA INHIBICIÓN DE LA
MADURACIÓN DE ESQUIZONTES
El método empleado mayormente para determinar la inhibición de la maduración de
esquizontes, como ya se mencionó anteriormente es la lectura de frotis realizados de los
cultivos, con este método se necesitaban contar 2000 glóbulos rojos como mínimo en una
prueba, siendo el total un número muy grande debido a la gran cantidad de compuestos en
estudio, el método resulta muy lento, por lo que se comenzó a desarrollar nuevos métodos
que permitan obtener resultados similares, confiables y lo más importante mucho más
rápidos que los empleados.
De esta manera se desarrollaron diversos métodos como el Micrométodo Radioisotópico, el
Método Bioquímico y el Método Fluorométrico (Deharo y col. 2000).
2.9.2.1 MICROMÉTODO VISUAL
Las pruebas in vitro permiten en principio, una medida objetiva de la sensibilidad de una
cepa de P. falciparum con respecto a los esquizonticidas sanguíneos de acción directa.
Esta técnica, introducida por Rieckmann en 1968 ha sufrido numerosas modificaciones
adaptadas para el cultivo continuo in vitre de P. falciparum que fue descrito y puesto a punto
por Trager y Jensen (Deloron, 1981). Los tests in vitre miden la concentración de la droga
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
que inhibe la reproducción asexual de P. falciparum en los glóbulos rojos de pacientes
infectados.
Algunas ventajas de las técnicas in vitro son la obtención de información confiable con
cantidades pequeñas de material (orden de miligramos y microgramos), el nivel de
inmunidad, dificil de evaluar en sujetos residentes en zonas de transmisión, la mayor
precisión de la medición que generalmente no es accesible con sistemas de test in vivo, y la
evaluación de un mayor número de compuestos en un experimento, comparado con el
método in vivo.
El aumento de las restricciones que involucra el uso de animales, han provocado que la
mayor parte de los ensayos usados hoy en día sean cultivos in vitro de parásitos; todas estas
características generalmente hacen de estos métodos más eficaces y menos costosos que
los métodos in vivo.
Sin embargo, estos métodos in vitro tienen limitaciones en cuanto a la incapacidad de
determinar la actividad potencial de drogas antimaláricas que requieren activación
metabólica como el proguaniJ. En el caso de esta y otras drogas como el cicloguanil, la
pironaridina, se prepara un medio de cultivo con baja concentración de ácido fólico y ácido p
aminobenzoico, ya que la acción de estas drogas es justamente sobre la ruta metabólica de
esos dos ácidos metabólicos (OMS, 1987).
Otras limitaciones podrían ser la poca validez en la medición de ciertos parámetros de
actividad con determinados modos de acción, la incapacidad para distinguir selectivamente
la seguridad y toxicidad de compuestos con respecto a la tolerancia de! huésped y los
problemas de ciertas propiedades fisicoquímicas como la solubilidad acuosa y adherencia al
vidrio o plástico.
El principio básico de este método se basa en la coloración de frotis sanguíneos utilizando
Giemsa, que es un colorante neutro compuesto por eosinato (colorante ácido) y violeta de
metileno o azul de metileno (colorante básico); el colorante neutro que precipita es insoluble
en agua pero soluble en alcohol metílico, el colorante se activa al contacto con al agua que
provoca la precipitación del colorante neutro.
33
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIF8 - UMSA
Los protozoarios disocian el colorante de tal manera que los núcleos se tiñen de rojo y el
citoplasma se tiñe de azul (Deharo y col, 2000). El método aplicado en este estudio
corresponde al semimicrométodo de De/oron.
2.9.2.2 MICROMÉTODO RADIOISOTÓPICO
Plasmodium es incapaz de sintetizar ex novo las bases purinas (hipoxantina, adenina y
guanina), pero sí [as pirimidinas (uracilo, timína y citosina). Por lo tanto, extrae las purinas
exógenas para la síntesis de sus nucleótidos púricos. La hipoxantina es la base utilizada
principalmente por el parásito para la síntesis de sus nucleótidosadenosina y guanosina.
Si se introduce en el medio de cultivo hipoxantina marcada, los parásitos la incorporarán en
sus ácidos nucleicos. Con un contador beta se puede detectar el nivel de radioactividad, que
es proporcionar a [a parasitemia. La incorporación de la hipoxantina es mayor en los
. trofozoitos y esquizontes que en los estadios anillos. El ruido de fondo de [os glóbulos rojos
sanos es débil puesto que no sintetizan ADN ni ARN (Desjardins et al, 1979)
2.9.2.3 MÉTODO BIOQuíMICO (Prueba in vitro de la Lactato
Deshidrogenasa parasitaria)
Los estudios de las vías metabólicas del Plasmodium han conducido a la identificación de
enzimas estructuralmente diferentes de las del huésped, la Lactato Deshidrogenasa (LDH)
del parásito ha sido identificada como diferente de la LDH humana tanto a nivel bioquímico
como a nivel inmunológico. Los Plasmodium necesitan de la presencia de /a LDH para
asegurar el metabolismo de los carbohidratos (25-30 veces mayor que en los glóbulos rojos
sanos), considerando que requieren un alto nivel de producción energética para una rápida
multiplicación durante el desarrollo intraeritrocitario.
La LDH parasitaria (pLDH) puede ser detectada en el estadio anillo como en el estadio
trofozoito. La pLDH y la del eritrocito, utilizan la nicotinamida-adenina dinucleótido (NAO)
para la transformación de lactato en piruvato; pero solo la pLDH tiene la capacidad de utilizar
la coenzima 3-acetilpiridina adenina dinucleótido (APAD). La lactato deshidrogenasa es la
última enzima de [a vía glicolítica que regenera el NAO necesario para la producción de ATP,
el incremento de la lactato deshidrogenasa está en relación directa con la densidad
34
David Gutiérrez Yapu
parasitaria; por lo tanto, la enzima puede ser utilizada como un marcador de P. tetciperum
(Figura 12).
Figura 12: Esquema de la transformación de lactato en piruvato
'" t-.cwed~'Ilrog=í••
Fuente: Rawn et al, 1989
En presencia de la coenzima APAD, la detección de la LDH es específica de la enzima
parasitaria y su medición permite la evaluación de la intensidad parasitaria n el cultivo; la
evaluación de la actividad de la LDH se basa en la reacción bioquímica que conduce a la
formación del piruvato a partir de la L-Iactato en presencia de la LDH parasitaria y de la
coenzima APAD; esta reacción lleva a la formación de APAD reducida que en su momento
reduce el NBT (Nitro Blue Tetrazolium) (Figura 13), formando un derivado formazán azul,
detectable a 650 nM (Makler et al, 1993).
Figura 13: Estructura Molecular del NBT (Nitro Blue Tetrazolium)
Fuente: http://www.sh.lsuhsc.edu/intragrad/cell_mol_phys/210/alexander_PDF/NBT.PDF
35
David Gutiérrez Yapu /vea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
La tipificación enzimática de la LDH de los diferentes plasmodiales, reveló diferencias entre
P. tetciperum (3 bandas), P. gallinaceum (1 banda), P. berghei (2 bandas), P. cynomolgi (4
bandas) y P. knowlesi (5 bandas). Los Plasmodios necesitan la presencia de la LDH para
asegurar el metabolismo de los carbohidratos (25-50 veces mayor que en los glóbulos rojos
sanos), considerando que requieren un alto nivel de producción energética para una rápida
multiplicación durante el desarrollo intraeritrocitario.
La acidosis láctica complica frecuentemente las infecciones severas constituyéndose en
señal predictiva de mortalidad.
Este método es tan útil como el método visual y el radioisotópico, pero tiene la desventaja de
que la parasitemia inicial tiene que ser superior a 0,5 %, obteniéndose buenos resultados si
se inicia con una parasitemia del 1 Ó 2 % y un hematocrito de 1,5 % y es necesario
mencionar que un hematocrito de! 5 % conduce a un ruido de fondo demasiado elevado, esto
por la actividad de la LDH humana (Makler et al, 1993)
2.9.2.4 MÉTODO FLUOROMÉTRICO
El método se basa en la determinación de la fluorescencia del f1uorocromo Hoechst 33258
(Figura 14), insertado en el ADN de Plasmodium tetciperum, los ensayos biológicos son
realizados en placas de 24 alveólos, en las cuales el parásito es confrontado con las drogas
a diferentes concentraciones, el número de parásitos es directamente proporcional a la
cantidad de ADN de los mismos, por lo tanto la concentración inhibitoria del 50 % puede ser
determinada a través de la cuantificación de ADN presenteal terminar el ensayo biológico.
Se aisla el ADN y se agrega el fluorocromo de la familia de los bis-benzimidazoles, Hoechst
33258, que tiene la capacidad de fijarse sobre los ácidos nucleícos al nivel de la adenina y
de (a timidina. La sensibilidad llega hasta niveles de ng/ml con un afinidad 100 veces más
alta para ADN que para ARN, posteriormente se mide la fluorescencia y se calcula el leso
(Smeijesters et al, 1996)
36
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Figura 14: Estructura Molecular del HOECHST 33258
Fuente: http://omlc.ogi.edu/spectralPhotochernCAD/htmUhoechst-33258(DMF).htmI
37
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Sabiendo que la malaria es una enfermedad que se transmite a través de las picaduras del
mosquito Anopheles y que en los últimos años ocasionaron alrededor de 500 millones de
casos todo el mundo, esta enfermedad mantiene en peligro a la humanidad hace miles de
años, hoy el problema básico en la lucha de la erradicación de la malaria es la inexistencia
de una vacuna que sea capaz de permitir la erradicación completa de esta enfermedad
además de la resistencia que el parásito desarrolla constantemente frente a las drogas
antipalúdicas, rápidamente propagada en muchas áreas tropicales y se debe
fundamentalmente a la gran adaptabilidad de Plasmodium y al uso inadecuado de
antipalúdicos.
Por otro lado, a través de la historia de la búsqueda de drogas eficaces para el tratamiento y
erradicación de las enfermedades infecciosas se han desarrollado una serie de técnicas y
métodos que permiten un mejor estudio del mecanismo biológico, bioquímico y molecular de
los agentes causales de las enfermedades, los vectores que las transmiten en algunos
casos, y el mecanismo de acción de las drogas eficaces y de aquellas moléculas con algún
efecto letal sobre los microorganismos patológicos.
En el caso de la malaria, el desarrollo de resistencia tanto en los microorganismos patógenos
(Plasmodium) a los antipalúdicos como de los agentes transmisores (vectores) a los
insecticidas ha opacado constantemente los descubrimientos de nuevas moléculas.
El arsenal terapéutico a disposición de los clínicos para luchar contra el paludismo, no
solamente está limitado en términos de accesibilidad económica, sino también en términos
de eficacia debido a: la emergencia de resistencia a los terapéuticos, los fenómenos de
migración de poblaciones no inmunes hacia el interior de zonas endémicas y el fuerte
crecimiento de poblaciones en riesgo y estructuras y políticas de salud pública carentes de
medios económicos, es por esta razón que es urgente encontrar nuevas alternativas
terapéuticas en la lucha contra la malaria.
Como ya se mencionó anteriormente, una alternativa interesante para el hallazgo de nuevos
fármacos es estudiar la actividad antiparasitaria de nuevos compuestos ya sean naturales o
sintéticos mediante ensayos biológicos in vitro e in vivo.
39
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
La búsqueda de nuevos antimaláricos, requiere la utilización de estos modelos de estudio,
tanto in vitro como in vivo para evaluar la eficacia de las drogas sobre el desarrollo
parasitario, en el caso de Plasmodium, los modelos in vitre requieren en la actualidad
diversas técnicas para la cuantificación de la parasitemia, desde el mantenimiento del cultivo
del parásito hasta la determinación de la actividad antipalúdica de productos o drogas
potencialmente activas.
Para poder realizar estos estudios, se tiene el método de determinación de la sensibilidad in
vitre de P. talciparum que fue introducido por Rieckmann en 1968, que inicialmente en su
macrométodo utilizaba sangre infectada de la que después de 24 horas de incubación en
presencia de diferentes concentradones del medicamento se extendían frotis a partir de los
diferentes tubos de sangre.
Posteriormente se aplicó el micrométodo donde se empleaban las placas de 96 pozos
conteniendo sangre infectada y la solución del medicamento a diferentes concentraciones,
teniendo como prueba final un frotis teñido con Giemsa pasadas las 24 horas de incubación,
para de esta manera estimar la inhibición de la maduración de esquizontes (Deloron, 1981)
Posteriormente, Trager describió un micrométodo a partir de un cultivo contínuo de parásitos,
en el que el medio de cultivo era reemplazado por otro fresco después de 24 horas,
realizándose la lectura de los frotis a las 48 horas, siendo esta lectura el método
mayormente empleado para determinar la inhibición de la maduración de esquizontes, pero
actualmente debido a la gran cantidad de compuestos en estudio, este procedimiento resulta
ser muy lento, especialmente ante los grandes requerimientos de resultados confiables y
rapidos ; por esta razon se comenzó a desarrollar nuevos métodos que permitan obtener
resultados similares, confiables y lo más importante mucho más rápidos que los empleados.
De esta manera se comenzó a desarrollar diversas técnicas en diferentes países, como son
el Método Radioisotópico, el Método Bioquímico y el Método Fluorométrico, que
proporcionen estos requerimientos, con los cuáles podamos responder a la exigencia que
nos demanda la gran cantidad de extractos vegetales y derivados sintéticos que se
encuentran en estudio, estas tecnicas serían de gran ayuda en el trabajo que se desarrolla
en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas donde se realiza este trabajo con
diferentesorganizaciones a nivel mundial, en un trabajo de cooperación.
40
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- lIFB - UMSA
Por estas razones es que nosotros intentamos desarrollar los métodos que nos convendrían
por contar con los equipos necesarios, y por ser los que no trajeran mayores inconvenientes
en cuanto a eliminación de los deshechos, siendo los Métodos Bioquímico y Fluorométrico
los elegidos.
41
David Gutiérrez Yapu
4.1 OBJETIVO GENERAL
AJea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
• Evaluar la actividad in vitro de productos sintéticos y naturales sobre la cepa de
P/asmodium tetclperum F32 sensible a la Cloroquina.
4.2 OBJETIVOS ESPECíFICOS
• Identificar la actividad antimalárica in vitro sobre P/asmodíum telciperum de
productos sintéticos y naturales por el método visual.
• Estandarizar el método Bioquímico (Reacción de [a Lactato deshidrogenasa), para
la detección de la actividad de compuestos sintéticos o naturales contra
P/asmodíum fa/cíparom.
• Estandarizar el método Fluorométrico, para la detección de la actividad de
compuestos sintéticos o naturales contra P/asmodium telcipetum.
• Obtener valores de ICso de especies naturales conocidas como activas, para
realizar una comparación con los resultados obtenidos en el estudio.
• Comparar los resultados obtenidos por el método visual clásico con aquellos
obtenidos con los métodos desarrollados.
43
DavidGutiérrez Yapu
5.1 DISEÑO METODOLÓGICO
Area de Quimioterapia Experimental - IfFB- UMSA
II
IrIL ,
I
I
I
r
I
I
I
I
Ir----------------I
rI
1
~ ----o 1__
: IT.
45
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
5.2 CULTIVO DE ESTADíos INTRAERITROCITARIOS DE P. falciparum
5.2.1 OBTENCIÓN DE GLÓBULOS ROJOS
El método de cultivo continuo in vitre fue desarrollado en 1976 por Trager y Jensen (Trager
and Jensen, 1978). De acuerdo a este método, la sangre para el cultivo fue colectada
estérilmente en un tubo conteniendo 1,5 mI de ACD para 10 mi de sangre total, mezclando la
sangre con el anticoagulante con movimientos suaves de inversión. Los donadores no
debieron haber recibido tratamiento alguno en los dias previos a la toma de sangre, siendo la
sangre empleada para este experimento del grupo 0, factor Rh +.
Después de centrifugar 10 minutos a 780 g a una temperatura superior a 20°C, se colectó el
plasma en otro tubo, eliminando la capa intermedia que contiene los elementos nucleados de
la sangre para dejar así solo los eritrocitos, síendo el siguiente paso el lavado por
centrifugación durante 5 minutos a 466 g dos veces con RPMI, resuspendiendo los eritrocitos
en volumen igual al plasma eliminado, descartando cada vez el sobrenadante.
Luego de eliminado el sobrenadante, estos eritrocitos fueron empleados en los cultivos
durante un tiempo no mayor a una semana y conservados a 4°C.
5.2.2 OBTENCIÓN DE SUERO O PLASMA
El plasma fue obtenido de acuerdo a mecanismos anteriormente señalados, aprovechando el
procedimiento de recolección de glóbulos rojos. Para la obtención de suero se dejó retraer el
coágulo de sangre colectada sin anticoagulante (por lo menos durante una hora), luego se
centrífugo durante 15 minutos a 1250 o 1750 g, el suero fue decantado y centrifugado
nuevamente para eliminar totalmente los glóbulos rojos aún presentes, luego se procedió a
esterilizar con filtros descarta bIes tipo Millipore de 0,22 prn.
Finalmente se procedió a decomplementar (inactivar el complemento) el suero por 45
minutos a 56°C, el suero fue alicuotado en tubos estériles de 50 mi y congelado a -70°C. El
suero utilizado debía ser compatible con el grupo sanguíneo de los eritrocitos, (Grupo O,
factor Rh+).
46
David Gutiérrez Yapu AJea de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
5.2.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO RPMI-1640 SIGMA
Este medio fue empleado tanto para lavar los glóbulos rojos como para el cultivo in vitro,
añadiéndole suero o plasma como suplemento, este fue preparado disolviendo el contenido
del frasco de RPMI-1640 SIGMA (15,89 g) en 900 mi de agua bidestilada desionizada con 60
mg de gentamicina y 2,1 g de bicarbonato de sodio, completando a un volumen final de 1
litro. Posteriormente, se ajustó el pH a 7,4 con ayuda de ácido clorhídrico o hidróxido de
sodio según el caso y se distribuyó en frascos de 250m/ con su correspondiente
identificación, este medio de cultivo fue esterilizado por filtración con membranas Millipore de
0,22 IJm y fue conservado a 4°C (no mas de cuatro semanas).
5.2.4 DESCONGELACIÓN DE LOS AISLADOS DE P. falciparum
Los eritrocitos son sensibles al choque osmótico y mas todavía aquellos infectados por P.
tetciperum, por lo tanto la criopreservación debe seguir rigurosamente los pasos de
enfriamiento con agentes crioprotectores para impedir el fenómeno de lisis. Al bajar fa
temperatura en el interior las células, se forman cristales de hielo que las pueden dañar,
puesto que el volumen del hielo es superior que del agua liquida, además la cristalización
provoca una deshidratación responsable de cambios en la concentración de sales y
metabolitos, el agua así eliminada del medio interno crea un desequilibrio osmótico que
puede impedir la recuperación de la célula.
Existen varios tipos de crioprotectores tales como el sorbitol, el glicerol, la dextrosa, el
dimetilsulfóxido (DMSQ) que tienen la capacidad de bajar el punto de congelación del agua,
de permeabilizar las membranas y reducir el grado de contracción de las células durante el
proceso de congelación, evitando así el choque osmótico, estos crioprotectores penetran
rápidamente en el interior de la célula a congelar, protegiendo a la célula del fenómeno de
cristalización y así provocan una dismínución del fenómeno que aumenta las fuerzas iónicas.
La eliminación de estas moléculas durante la descongelación es una etapa clave que se
debe realizarpor grados progresivos para evitar la lisis.
Los criotubos que contenían los GRI por las cepas fueron sacadas del congelador, para ser
descongeladas inmediatamente en baño maría a 3rC durante 1 minuto, en esta etapa
fundamental, el contenido del criotubo ya descongelado (aproximadamente 0,5 mi) fue
47
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
llevado a un tubo estéril de 15 mi añadiéndose 0,1 mi de una solución estéril de cloruro de
sodio a/12%, una gota por segundo, agitando con suavidad y con mucho cuidado.
Luego de 5 minutos se añadieron 5 mi de una solución estéril de cloruro de sodio al 1,6%,
una gota por segundo y agitando siempre con suavidad, esta suspensión fue centrifugada a
500 g durante 10 minutos, eliminándose luego el sobrenadante sin dejar sedimento seco, a
este sedimento se añadieron 5 mI de una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% con
dextrosa al 0,2% (una gota por segundo), agitando siempre con suavidad.
Finalmente después de centrifugar a 500 g, durante 10 min, (eliminando el sobrenadante
pero sin dejar sedimento seco los glóbulos rojos fueron puestos en suspensión de RPMI
suplementado con suero al 20% para el inicio del cultivo.
5.2.5 CONGELACiÓN DE LAS CEPAS DE P. fa/ciparum
Para congelar primero se verificó si la parasitemia era superior o igual al 4 % en el estadio
anillo. Si era así entonces se eliminaba la fase superior de la caja Petri, lavando esta con 4
mi de RPMI, el sedimento (que contiene glóbulos rojos infectados), fue centrifugado durante
10 minutos a 500g y se eliminó el sobrenadante.
Previamente se atemperó la solución de congelamiento a 37 "C, (esta solución contiene 28
mi de glicerol. 3.024 g de sorbitol. 0.65 de cloruro de sodio. 72 mI de agua destilada estéríl),
para terminar se añadió la solución de congelamiento, gota a gota agitando con suavidad, en
una relación de 4 volúmenes de la solución de congelamiento estéril a 1 volumen del
sedimento que se obtuvo (Glóbulos rojos con una parasiternia del 4 %).
Este fue distribuido en criotubos de 0.5 mi para luego ser conservados a -20 oC por 24 horas
y luego trasladados a-52 ó -70 "C. (se tuvo el cuidado de que los criotubos estén
correctamente identificados y fechados).
5.2.6 ADAPTACiÓN A CULTIVO in vitro
Luego de descongelar los parásitos, el sedimento fue colocado en cajas Petrí tipo Fa/con
1016 de 60 mm de diámetro y 15 mm de profundidad, cada caja recibió 5 mi de suspensión
48
David Guliérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimenlal- IIFB - UMS6
de eritrocitos, con un hematocrito de 5 % Y una par sitemia inicial de 0,5-1 %, esto significa
en volumenes:
0,25 mI de eritrocitos parasitados y no paras ltados
4,5 mi de RPM!
0,5 mi de suero o plasma
Se colocó la caja Petri con ef cultivo en el interior de un "Cancle Jarr" y este a la vez fue
colocado permanentemente en una c~:;,,;fz. a 37 (le, (El Can'::;.:; ":0;"( es un íccipit;i¡l¡;; de vidrio
con una tapa de cierre nermético que tiene una ¡¡m/c de paso, con una vela encendida en su
interior, esta permite la sal ida de oxigeno y la saturación con di6:x.¡cJcj de carbono en el
interior, cerrando la nave de paso cuando se apague la vela) (Figura 15),
Figura 15: Cultivo de cepas de P. telciusrum in viiro
El cambio de medio de cult ivo por otro fresco se lo realizó diariamente; este paso es
fundamental debido a que la producción de ácido láct ico por el parás ito es importante y como
resultado disminuye el pH del medio de cultivo, Para realizar el control de la parasitemia
(cada 48 horas al inicio cuando los cultivos tienen pocos parásitos, y cada 24 horas cuando
se observa buen desarrotlo), se sacaron f s cajas de cult ivo de la incubadora
cuidadosamente, para no resuspender los eritrocitos que se encontraban asentados en una
delgada capa,
49
David Guliérrez Yapu Área de Quimioleraoia Experjmenlal- IIFB - UMSA
Para eliminar el medio de cultivo se inclinó ngeramente la caja y con ayuda de una pipeta
Pasteur se aspiró una pequeña parte de sedimento globular, después se procedió a teñir con
el colorante Giemsa al 10%, Esto permite tener un control de la parasitemia, así como el
desarrollo del parásito en el cultivo ya sea con la mariología adecuada, duración normal de
cada estadía intraeritrocitario, aspecto de los eritrocitos, contaminación por bacterias u
hongos.
Finalmente se añadió un volumen igual de medio RPMI al que se eliminó , suplementado con
10% de suero o plasma inactivado, si la parasitemia era mayor al 2% se la disminuía
añadiendo glóbulos rojos no parasitados de /8 siguiente manera:
IPnrrpnbip nA I11' -- "-:'~-J'~ -- _ 'V _ 'v• 'v _ ' v
1Il'parasitemta'1 Cantidad de 3/4 2/3 % OGR :lI plirnin:llr 1
1I 1II .. ~ ~ ........~.
75% 66% I 50% 0% ¡1IVolumen. enporcentaje I
• Se añadieron glóburos rojos frescos conservando el hematocrito al 2%
Figura 16. Cambio de Medio de Cultivo
50
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
5.2.7 DETERMINACiÓN DE LA PARASITEMIA
Para determinar el porcentaje de parasitemia se realizó la lectura de un frotis del sedimento
teñido con Giemsa y se empleaba la siguiente fórmula:
Número de glóbulos rojos parasitadosPorcentaje de parasitemia =------------------------ x 100I Número de glóbulos rojos totales
5.3 SINCRONIZACiÓN DE CULTIVOS in vitro DE P. falciparum
Plasmodium requiere para su multiplicación el aporte externo de sustratos y catabolitas,
necesarios para el metabolismo del parásito que se produce en el interior de la célula
huésped, por lo que el parásito debe permeabilizar la membrana eritrocitaria para
incrementar el tráfico celular.
La gran permeabilidad de Jos eritrocitos infectados por P. tetciperum a las hexosas es una
característica que se aprovecha en cultivo in vitro para lisar de manera selectiva los glóbulos
rojos infectados con parásitos maduros y concentrar formas jóvenes de P. tetcioerum,
realizando un tratamiento del cultivo con sorbitol (Oeharo y col).
El cultivo de P. tekiperum (con mayor porcentaje del estadio anillo), se centrifugó a SOO g
durante 5 minutos, para posteriormente eliminarse el sobrenadante y añadiéndose nueve
partes de sorbitol al 5% a una parte de sedimento, luego se incubó durante 10 minutos a
37°C y centrifugado nuevamente a sao 9 por 5 minutos. El sedimento es colocado en cultivo,
para ser utilizado 6 horas después.
5.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS
DROGAS: MICROMÉTODO VISUAL
5.4.1 PREPARACION DE LA DROGA DE REFERENCIA Y EXTRACTOS
Se empleo Oifosfato de Cloroquina (CQ) (Sigma, PM=51S), como droga de referencia a partir
de una solución madre a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas en
51
David Gutiérrez Yapu Area de Ouimiotempia Experimental- IIFB - UMSA
concentraciones de 10 a 1000 nM, que fueron distribuidas por duplicado en la microplaca de
titulación en orden creciente.
Además se prepararon soluciones madre de los extractos naturales o sintéticos, disolviendo
el extracto en DMSO a una concentración de 10 mg/ml, a partir de esta solución se
realizaron diluciones seriadas de 0,1 - 1 - 10 f.Jg/ml, distribuidas de menor a mayor
concentración y también por duplicado.
5.4.2 PREPARACIÓN DE LA PLACA
Primeramente se colocaron 200 ¡JI de agua destilada estéril en todos los bordes superior e
inferior a la placa de 96 pozos, para evitar el "efecto borde". En cada pozo se colocaron 100
¡JI de una suspensión de glóbulos rojos con un hematocrito del 2 % (para esto se utiliza RPMI
con suero o plasma al 20 %), además de una parasitemia del 1 % (los parásitos deben estar
en estadio anillo en su mayoría, no se toman en cuenta los otros estadios), luego se
añadieron las concentraciones seriales de las drogas (dando un volumen final de 200 ¡JI),
esta placa se incubó a 37 "C por el lapso de 48 horas, al cabo de este tiempo se evaluó la
actividad de los extractos por el método visual (Figura 17).
Figura 17: Disposic ión y distribución de los productos evaluados,
el control y I droga de referencia
1 2 31 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B l o~~ ];~_..;,:¡ b10 b1Q d1Q d i Q If10 If1Q . h1 h1 li1 Ih I
. ..-~ 1""0 ,,""
:U10C a01 a01 C01 Co1 eo 1. e01 . z···"" " 2:r- hlO hio _ li10
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..... --"'-G b1 b1 ' "" d1 d1 " f1 ' h0 1 ho f Uo 1 01 , I~~"~ 11.'3"7é'ffi
H I I I I--.J I I I I I I (! ! ! ! ! ! ! ! !
a-j: productos (subíndices concentración IJg/ml)
cq: cloroquina (concentración nM)
T: test igo (RPMI + DMSO)
52
David Gutiérrez Yapu
5.4.3 MÉTODO VISUAL
Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
5.4.3.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS QUíMICOS
El colorante Giemsa se preparó disolviendo 0,76 g de polvo Giemsa en 50 mi de glicerina,
sometiendo este sistema a 60 OC para su completa disolución, luego se completó a 100 mi
con Metanol, disolviendo este con ayuda del agitador magnético por 6 horas, cubierto o
protegido de la luz solar, finalmente se incubó en oscuridad por 5 días, filtrándose
posteriormente.
El Tampón fosfato PBS, se preparó disolviendo 0,2 g de KH2P04y 0,5 g de Na2HP04 (2H20),
en 980 mI de agua destilada, ajustándose luego el pH a 7,4 con Hel 0,1 N o NaOH 0,1 N,
para finalmente enrasarlo a 1000 rnl.
5.4.3.2 MÉTODO
Luego que la placa de 96 alveólos fue incubada, se eliminó completamente la fase superior
del cultivo, se hizo un frotis del sedimento de cada alveólo, fijando primeramente con metanol
y realizando la tinción por 15 minutos con la solución de Giemsa (al 20 % con PBS),
posteriormente este se lavo con agua. Dejando secar a medio ambiente (Figura 18).
53
David Gutiérrez Yapu
Figura 18: roceso de tinción (Giemsa)
Por último se observó en el microscopio, con lente de inmersión X 100, contando tanto
glóbulos rojos no infectados (GRL) como infectados (GRI), para así tener el % de inhibición,
el cual se calculó mediante la siguiente fórmula:
(G RL - G 1)% Inh = ------------------- x 100
GRL
El cálculo para hallar la Concentración Inhibitoria del 50% en la maduración de los
esquizontes (lCso), se hizo por el método gráfico mediante el programa Cricket Graph 1,3.
5.4.3.3 INTERPRETACiÓN
Los resultados del ICso (Concentración de la droga o extracto que inhibe el 50% de
maduración de esquizontes jce interpreta de la siguiente manera:
54
David Gutiérrez Yapu
Inactivo >
Activo <
Patrón (Cloroquina) =
Área de Quimioterapia Experimental- "Fe -UMSA
10 ¡Jg/ml
10 ¡Jg/ml
0,02 ¡Jg/ml (34 nM)
5.4.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS
DROGAS: MÉTODO BIOQuíMiCO (PRüEah in vitro DE LA LACTATO
DESHIDROGENASA PARASITARIA)
La preparación de la droga de referencia, preparación de los extractos y la placa son
similares a los del método visual.
5.4.4.1 PREPARACiÓN DE LOS REACTIVOS
En cuanto a la preparación de la solución de APAD (coenzima) y L-lactato (substrato), se
mezclaron 13,8 ¡JI de Tritón X 100 con 5 mi de agua destilada desionizada a 50 "C hasta su
disolución, añadiéndose luego 220 mg de L-Iactato y 60,5 mg de tampón TRIS, mezclando
hasta su disolución y luego enfriar. Posteriormente se añadieron 40,7 mg de APAD y se
agregó agua hasta un volumen de 11 mi, verificándose el pH de 9,2.
El colorante se preparó disolviendo 32 mg de NBT y 1,6 mg de PES en 20 mi de agua
bidestifada desionizada.
5.4.4.2 MÉTODO
Luego que la placa de 96 alveólos fue incubada, siguiendo los mismos parámetros que los
descritos en el método visual, se homogenizaron los contenidos de los pozos y se pasaron
20 ¡JI de estos homogenizados a otra placa limpia (no estéril), para llevarla a congelación.
Llegado el momento de la prueba, se descongeló las fases anteriormente señaladas y se
colocaron 100 ¡..JI de la solución de APAD previamente preparada, a cada pozo para incubar a
temperatura ambiente por 30 minutos.
55
David Guliérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
Pasado el tiempo de incubación, se añadieron 25 ¡.JI de la solución NBT/PES en cada alveólo
y se incubó nuevamente por un lapso de 35 minutos a temperatura ambiente, protegiendo
con papel aluminio de la luz, finalmente se añadieron 25 ¡..ti de una solución de ácido acético
al 25% para parar la reacción enzimática y leer a una densidad óptica de 630 nm,
determinándose luego el porcentaje de inhibición (Figura 19).
Figura 19: Proceso de lectura de absorvancias en el lector ELl5A
La fórmula empleada para calcular el porcentaje de inhibición fue la siguiente:
(DO T - DO M)% Inh =----------.--.-------..-x 100
DOT
El cálculo para hallar la Concentración Inhibitoria del 50% en la maduración de los
esquízontes (ICso), se realizó por el método gráfico mediante el programa Crícket Graph 1.3.
La interpretación fue la misma que la señalada anteriormente .
56
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimentar - "FB • UMSA
5.4.5 EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. fa/ciparum A LAS
DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO
5.4.5.1 PREPARACIÓN DE LA DROGA DE REFERENCIA Y EXTRACTOS
La preparación de la droga de referencia y la preparación de los extractos son similares a los
del método visual.
5.4.5.2 PREPARACiÓN DE LA PLACA
En cada pozo de una placa de 24 alveólos, se colocaron 600 ¡JI de una suspensión de
glóbulos rojos con un hematocrito del 2% (para esto se utiliza RPMI con suero o plasma al
20%), y una parasitemia del 1 % (los parásitos deben estar en estadio anillo en su mayoría,
no se toman en cuenta los otros estadios), luego se añadió un volumen similar de las
concentraciones seriales de las drogas, esta placa se incubó a 37 "C por el lapso de 48
horas en Candle Jarr.
5.4.5.3 PREPARACiÓN DE REACTIVOS QUíMICOS
Para la preparación de la saponina al 0,08%, se disolvieron 0,2 g de esta en 250 mi de PBS
con un pH 7,4, el guanidinium HCI 6 M, se preparó disolviendo 57,32 9 de guanidinium HCI
en 100 mI de una solución de acetato de sodio 0,1 M del Tampón TNE.
El reactivo fluorométrico, fue el que mayores cuidados tuvo en cuanto a su preparación,
debido a los peligros que posee el reactivo en sí, el manejo fue con todas las medidas de
seguridad posibles, en este proceso se disolvió Hoechst 33258 en agua bidestilada, para
alcanzar una concentración de 1 mg/ml, para luego mezclar 33 ~I de esta solución madre de
Hoechst 33258 con 100 mI del Tampón TNE.
5.4.5.4 MÉTODO
Luego que la placa de 24 alveólos fue incubada, se pipetearon 0,42 mI de cada pozo de la
placa a un Tubo Eppendorf de 2 mI, agregándose luego la misma cantidad de saponina al
57
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - Uf\1~6
0,08% para mezclar ambos. Luego se centrifugó durante 3 minutos a 15 800 g,
inmediatamente después de que la lisis de los glóbulos rojos se haya completado,
posteriormente se eliminó el sobrenadante y se trabajó con el sedimento disolviéndolo
nuevamente en 50 ¡.JI de Guanidinium HCI 6 M en acetato de sodio pH 5,5, cuidando de que
el volumen sea el mismo en todos los tubos.
Luego se añadieron 2 mI del reactivo fluorométrico y 50 ¡.JI de una solución de
cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), para mezclar todo y centrifugar a 15 800 g por el tiempo
de un minuto. Luego se transfirió este volumen a una cubeta efel fluorómetro y se midió la
fluorescencia del Hoechst 33258, posteriormente se procedió a calcular los porcentajes de
inhibición y los ICso correspondientes de la misma manera que en los anteriores métodos.
58
David Gutiéfrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
6.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE PRODUCTOS
SINTÉTICOS Y NATURALES POR EL MÉTODO VISUAL
Se realizaron las pruebas de evaluación de la sensibilidad in vitre de 326 productos,
sintéticos y naturales, sobre el Plasmodium falciparum, procedentes de Salamanca (50
productos), Chife (10 productos), Guatemala (30 productos), Colombia (70 productos),
Argentina (6 productos), México (68 productos), Perú (40 productos) y Bollvia (52 productos);
haciendo totales parciales de 50 productos sintéticos y 276 productos naturales.
De todas estas pruebas se pudo seleccionar 56 productos activos, siguiendo los siguientes
criterios de valoración en cuanto a ICso :
Activo
Inactivo
<
>
10 ~tg/ml
10 ).lg/ml
ICso de Difosfato de Cloroquina: 0,02 )lg/ml (34 nM)
6.1.1 SALAMANCA - PRODUCTOS SINTÉTICOS
Estos productos corresponden al Departamento de Química Farmacéutica de la Facultad de
Farmacia, dependiente de la Universidad de Salamanca, corresponden a modificaciones
quimicas de estructuras preestablecidas. Luego de realizadas las pruebas de sensibilIdad
sobre las cepas correspondientes, se pudieron obtener los valores de ICso correspondientes
a los 50 productos, los cuáles se encuentran en el Cuadro 9 del Anexo 4 y la Tabla 4, la que
nos presenta los productos activos solamente.
60
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - /lFB - UMSA
Tabla 4. Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos realizados en la
Universidad de Salamanca, sobre cepas de Ptesmodium faiciparum F32
N° código
1
leso I Actividad Iuglml I I
1 F-10S1 I 3,9 ACTIVO2 F-1071 I 5 ACTIVO3 F-l0Bl ! '" -, ACTiVO.:>,f
4 F-l091 3,1 ACTIVO5 1-1070 1,9 I ACTIVO6 1-1090 0,18 ACTIVO7 1-21020 0,05 ACTIVO8 1-21060 0,49 ACTIVO9 1-21070 0,07 ACTIVO10 1-21080 S ACTIVO11 1-21090 0,02 ACTIVO12 E-lOSO 4,8 ACTIVO13 F-210S1 3,3 I ACTIVO14 F-21091 10 ACTIVO15 F-1S0S1 10 ACTIVO16 \-21110 0,59 ACTIVO17 1-1020 0,03 ACTIVO18 1-1020i 0,3 ACTIVO19 1-1100 0,03 ACTIVO20 1-1080 0,3 ACTIVO
De acuerdo a lo observado, podemos apreciar que existen 20 compuestos activos y 30 que
resultaron inactivos (Ver Cuadro 9 del Anexo 4), entre estos 20 que resultaron ser activos
podemos apreciar que 4 (1-21020, 1-21070, 1-21090 e 1-1020), poseen unos valores muy
similares a los de la sustancia patrón como es la Cloroquina, por lo que pueden ser
considerados de gran importancia e interés, así mismo los demás que también presentan
actividad son compuestos que pueden ser tomados en cuenta para estudios posteriores.
Todos estos corresponden a modificaciones en cuanto a la estructura molecular tal como se
presenta en los Anexos correspondientes.
61
David Guliérrez Yapu
6.1.2 CHILE· PRODUCTOS NATURALES
Área de Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA
Los productos corresponden al Laboratorio de Productos Naturales, dependiente de la
Universidad de Antofagasta, Antofagasta-Chile, estos productos corresponden a
diterpenoides aislados de especies de Azorella compacta.
Se determinó la ICso de 10 productos naturales, mediante los ensayos de sensibilidad,
apreciándose los resultados de los productos activos en la Tabla 5, y los resultados totales
en el Cuadro 10 del Anexo 4.
Tabla 5. Evaluación de la activldad in viiro de Dtterpenoides alslados de especies de
Azorella compacta, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° I Código I IC50 ActividadI ug/rnl
1 Y-6 5 ACTIVO2 Mc-E 0,4 ACTIVO
De acuerdo a los resultados presentados, se aprecia la actividad de dos productos, Y-6 YMc
E (Figura 20), los cuales corresponden a estructuras mostradas en los Anexos . De ambos,
el producto Mc-E es el que presenta mucha mayor actividad y se convierte en el más
atractivo para estudios posteriores.
62
DavidGutiérrez Yapu /vea de Quimioterapia Exnerimental>- HFB - UMSA
Figura 20. Estructuras de Productos activos procedentes de Chile
C20HJ,40 z
M= 306
Y-6
CZZH320 S
M =392
Mc-E
6.1.3 GUATEMALA - PRODUCTOS NATURALES
Estos productos son extractos de plantas recolectadas de la flora guatemalteca, debido a
que se les atribuye cierta actividad antifúngica y antiparasitaria, fueron preparados en función
a órganos seleccionados (Cuadro 3 del Anexo 3), a estos productos también se fes hizo las
pruebas de sensibilidad con las cepas correspondientes otorgándonos los resultados
presentados de los productos activos en la Tabla 6, y los resultados generales en el Cuadro
11 del Anexo 4.
Tabla 6. Evaluación de la actividad in viiro de extractos de plantas procedentes de
Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° I Código Especie ICso Actividadug/ml
1 GUA-0311 iPiper ama/ago 9,4 ACTIVO2 GUA-0312 Senecio salignus 2,9 ACTIVO
63
DavidGutiérrez Yapu
De acuerdo a los resultados presentados, podemos apreciar que dos especies de plantas
recolectadas en Guatemala tienen carácter activo, el Piper amalago con un leso de 9,4
I-lg/ml y el Senecio salignus, con un IC50 menor al anterior, cuyo valor es de 2,9 I-lg/ml. Estas
dos especies, resultan ser tomadas en cuenta para estudios posteriores como ser el
fraccionamiento adecuado y encontrar los principios activos responsables de esta acción.
Si bien los valores no son similares a la Cloroquina, estos puedes ser comparados con otras
sustancias patrón, que resultan ser extractos crudos de especies con actividad sobre el
Plasmodium fa/ciparum, estos son la Cinchona officinalis y la Cinchona pubescens cuyos
valores de ICso son 4,2 y 1 I-lg/ml respectivamente. Con estos nuevos parámetros podemos
afirmar que la actividad es aceptable para la continuación de los nuevos estudios.
6.1.4 COLOMBIA - PRODUCTOS NATURALES
Estos productos corresponden a extractos etanólicos de plantas, de acuerdo a órganos
seleccionados que se detallan en los anexos, así como también de fracciones de algunas
plantas colombianas, que fueron evaluadas de acuerdo a características anteriormente
señaladas, probando la sensibilidad de Plasmodium fa/ciparum frente a estas. Los resultados
de los productos activos se presentan en la Tabla 7, y los resultados generales en el Cuadro
12 del Anexo 4.
Tabla 7. Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código Especie ICso ActividadJJg/ml
1 C6 Piper barbatum L. 6,9 ACTIVO2 D6 Piper umbellatum L. 10,2 ACTIVO3 E 12 Annona muricata 10,1 ACTIVO4 18 Chromolaena leivensis 5,4 ACTIVO5 J6 Calea peruviana 19 ACTIVO6 L3 Miconia buxitoiie 15 ACTIVO7 N3 Miconia so 7,3 ACTIVO8 CO-221 fr01 Piper barbatum H.B.K. 2,1 ACnVO9 CO-243 fr01 Bocconia integrifolia
Humb & Bonpl 9 ACTIVO
64
David Gutíérrez Yapu Área de Quimioterapia Experiment,l- IIFB - UMSA
Estos extractos presentaron una mayor cantidad de productos activos en un tamizaje inicial,
pero lamentablemente se pudo apreciar que esta actividad presentada inicialmente poco a
poco fue desapareciendo, por esta razón es que se obtuvo un número menor de productos
activos, los cuales corresponden a las especies Piper barbatum L., Piper umbellatum L.,
Annona muricata, Chromo/aena leivensis, Ca/ea peruviana, Miconia buxifo/ia, Miconia sp,
Piperbarbatum H.B.K y Bocconia integrifo/ia Humb & Bonpl (Frutos).
Debido a esta característica, se tomaron en cuenta a dos especies Ca/ea peruviana y
Miconia buxifo/ia, como activos aun cuando presentaron valores de ICso por encima del
límite, de 19 y 15 Ilg/ml respectivamente, esto con la intención de verificar que una vez
realizadas las purificaciones y aislamientos correspondientes estas actividades aumenten.
De estas especies, Ca/ea peruviana y Miconia buxifo/ia son las que presentaron una
disminución leve en cuanto a su actividad, por lo que se los consideró como moderadamente
activos, pero podrían tener componentes activos dentro de sus componentes, sobre los
cuáles se podría trabajar.
Las demás especies presentan valores de ICso relativamente altos en comparación a los
productos naturales que nos sirven de comparación como son las especies de Cinchona,
pero son incluidas por estar en el límite aceptable de actividad.
6.1.5 ARGENTINA· PRODUCTOS NATURALES
Estos productos pertenecen a la Universidad de Rosario - Argentina y corresponden a
extractos con diferentes solventes y distintos órganos de las plantas como se aprecian en los
anexos, los cuales también fueron evaluados para determinar la sensibilidad del P/asmodium
fa/ciparum hacia estos.
El número de productos activos, que se pudo apreciar fue de cero, ya que ninguno presentó
un porcentaje de inhibición de la maduración de esquizontes considerable (Cuadro 13 del
Anexo 4), por lo tanto no fue necesario realizar los cálculos de ICso.
65
David Gutiérrez Yapu
6.1:6 MÉXICO - PRODUCTOS NATURALES
Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Estos productos también corresponden a extractos de especies vegetales colectadas en
México, los cuáles también fueron evaluados de manera similar a los anteriores, con los
siguientes resultados de los productos activos (Tabla 8), Jos resultados totales se muestran
en el Cuadro 14 del Anexo 4.
Tabla 8. Evaluación de la actividaó in viiro de extractos de plantas procedentes de
México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código IC 50 Actividadproducto J.Ig/ml
1 MX-14 3,1 ACTIVO2 MX-26 2,2 ACTIVO3 MX-27 0,2 ACT1VO4 MX-28 0,13 ACTIVO5 MX-71 5,8 ACTIVO
Estos productos, también poseen los resultados tanto positivos como negativos, de los
cuáles podemos mencionar que todos los productos positivos presentan valores muy
cercanos y más aun algunos presentan valores menores a los de los controles como son las
especies de Cinchona, por lo que un posterior estudio de estas será de gran importancia en
un futuro no muy lejano. Estos estudios se basarán sobre todo en el fraccionamiento de esta
especies vegetales para encontrar el o los principios activos responsables de esta tan
importante actividad.
6.1.7 PERÚ - PRODUCTOS NATURALES
Los mencionados productos procedentes del Perú, forman parte de una colecta de especies
vegetales en la amazonia peruana, trabajo realizado por la Universidad Nacional de la
Amazonía Peruana, mediante la facultad de Farmacia Química y Bioquímica, realizándose la
preparación de los extractos en diferentes solventes y de acuerdo a los órganos de estas
plantas tal como se puede apreciar en las tablas correspondientes a los anexos.
66
David GutiérTez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Todas estas también fueron evaluadas de manera similar a las anteriores con los resultados
de los productos activos presentados en la Tabla 9 y los resultados generales en el Cuadro
15 del Anexo 4.
Tabla 9. Evaluación de la Actividad in viiro de extractos de plantas procedentes de
Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Órgano Especie le 50 ActividadIJg/ml
1 Hojas Crescienta cujete 3,4 ACTIVO2 Madera 1 ZI IAspidosperma rigidum 4 ACTIVO3 Corteza 1 ZI IAspidosperma rigidum 9 ACTIVO4 Hojas IBixa oreJ/ana 3,9 ACTIVO5 Raíz 3 ZNI IAspidosperma rigidum 10,1 ACTIVO6 Flores Psychotria poeppigiana 5,4 ACTIVO7 Hojas Remijia peruviana (CHC/3) 1,4 ACTIVO8 Hojas Remijia peruviene (EtOH) 0,08 ACTIVO9 Hojas Remijia peruviene (Hex) 0,18 ACTIVO
En el análisis de los resultados presentados por estos extractos podemos apreciar la
existencia de 9 productos con valores de ICso considerables en relación a los patrones
conocidos de la Cínchona, estos valores son muy próximos a los de los productos patrón, por
lo que un estudio con mayor profundidad de estos vendría a ser de gran ayuda en un futuro.
El estudio ahora se basará en un fraccionamiento de estas especies, tratando de encontrar el
principio activo de estas.
6.1.8 BOLIVIA - PRODUCTOS NATURALES
Estos productos pertenecen a un estudio ya establecido sobre la actividad antimalárica de
extractos de plantas procedentes de las etnias Guaraníes, de donde se preparó el extracto
etanólico de una de las plantas con mayor actividad como es el So/anum argentinum, y luego
de heber evaluado a este en experiencias anteriores, proporcionándonos un ICsa de 0,42
llg/ml, se procedió a su fraccionamiento y un subfraccionamiento por métodos de
Cromatografía Líquida al vacio y Cromatografía en Columna respectivamente, con sistemas
de efusión diferentes los cuales estan detallados en el Cuadro 8 del Anexo 3, de donde se
67
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB- UMSA
obtuvieron un total de 52 fracciones y subfracclones que fueron evaluadas de la misma forma
que los anteriormente señalados.
Los resultados de los productos activos se presentan en la Tabla 10 Y los resultados
generales en el Cuadro 16 del Anexo 4.
Tabla 10. Evaluación de la Actividad in vitro de fracciones de So/anum argentinum
procedentes de Bolivia, sobre cepas de Ptesmoüium faíciparum F32
N° Código IC 50 ActividadProducto IJgfml
1 F3 4,5 ACTIVO2 F4 1,3 ACTIVO3 F5 2,1 ACTIVO4 F3-7 2,1 ACTIVO5 F4-10 3,3 ACTIVO6 F4-12 2,1 ACTIVO7 F5-17 3,2 ACTIVO8 F5-18 5,8 ACTIVO9 S.argentinum 0,42 ACTIVO
De acuerdo a resultados expresados en [a tabla, en un primer fraccionamiento se obtuvieron
5 fracciones activas de 9 (F-3, F-4, F-S, F-8 y F~9), las cuales poseían valores de ICso
aceptables para continuar el estudio, lamentablemente no se pudo fraccionar más las dos
últimas por ser muy polares, ya que fueron eluidas con acetato de etilo, en cuanto a las tres
primeras al ser fraccionadas nuevamente, pudimos obtener un total de 42 subfracciones.
De estas 5 tuvieron una actividad considerable en relación a nuestros productos patrón, de
los cuales se escogió la fracción F3-7 por ser la más activa con una actividad mayor a la que
tenía cuando aún no la habíamos fraccionado, además que las otras fracciones van
perdiendo su actividad a medida que vamos fraccionando estas; se escogió esta fracción
para elucidar su estructura.
68
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- I/FB - UMSA
6.2 EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS
DROGAS: ESTANDARIZACiÓN DE PARÁMETROS DEL MÉTODO
BIOQUíMICO (PRUEBA in vitro DE LA LACTATO DESHIOROGENASA
PARASITARIA)
Se viene dando hace algunos años atrás un estudio sobre la Lactato deshidrogenasa del
Plasmodium (pLDH) como un método de detección y cuantificación del crecimiento del
parásito en cultivos in vitre, empleando diferentes técnicas (Makler M.T.et al. 1998).
Todo comenzó cuando se pudo determinar que la actividad de la Lactato deshidrogenasa
parasitaria (pLDH) es distinguible de la LDH del huésped usando 3-acetil piridina adenina
dinucleótido (APAD), análogo de la nicotinamida adenina dinucleótido (NAO). (Makler M.T.et
al, 1993), también se estableció este método para diagnóstico de malaria empleando
anticuerpos monoclonales (Piper R. et al. 1999)
En cuanto a su aplicación en los cultivos in vitre, la LDH parasitaria puede ser detectada en
el estadio anillo como en el trofozoito. La pLDH y la LDH de los glóbulos rojos, emplean NAO
para la transformación de lactato en piruvato, pero solo la pLDH tiene la capacidad de utilizar
el APAD, el incremento de la LDH está en relación directa con la densidad parasitaria,por lo
tanto la detección de esta enzima puede ser utilizada como marcador de P. falciparum.
En presencia de la coenzima APAD, la detección de la LDH es específica de la enzima
parasitaria y su medición permite la evaluación de la intensidad parasitaria en el cultivo, la
evaluación de la actividad de la LDH se basa en la reacción bioquímica que conduce a la
formación de piruvato a partir de la L-Jactato en presencia de la LDH parasitaria y de la
coenzima APAD. Esta reacción lleva a la formación de APAD reducida que en su momento
reduce NBT (Nitro Blue Tetrazolium) formando un derivado formazán azul, detectable a 650
nm. (Deharo y col. 2000)
Esta técnica fue desarrollada en algunos sitios de investigación, como un medio alternativo al
convencional como es el de la lectura de frotis, con buenos resultados, ya que una
comparación con otros métodos específicos como son el anteriormente mencionado y el
método radioisotópico, estos se encuentran en relación directa.
69
David GutiérrezYapu Área de Quimioterapia Experimental - I/FB - UMSA
En el presente trabajo, se desarrollaron los parámetros necesarios para poder adoptar esta
técnica, y así poder alivianar el trabajo que demanda la lectura de frotis, esto lo realizamos
siguiendo los pasos descritos a continuación:
• Preparación de los reactivos necesarios
• Realización de la prueba con Patrones posfívos (Cloroquina) y patrones negativos
(RPMI)
• Realización de la prueba con solución Patrón a diferentes concentraciones y
patrones negativos
• Realización de la prueba con extractos sintéticos y naturales seleccionados por la
disponibilidad de muestra y por su actividad (positivos y negativos).
• Cálculo de los porcentajes de inhibición y valores de leSO, si correspondiera.
En una primera fase al trabajar solo con patrones, se verificó la existencia o no de diferencias
en cuanto a las lecturas de absorbancias, lo que nos permitió tener clara la idea de la
diferencia numérica que existía entre estos dos puntos extremos.
Luego se procedió a realizar la prueba de sensibilidad aplicando el método bioquímico,
tomando en cuenta a extractos con ambos tipos de actividades tanto positivo como negativo,
estos productos son procedentes de la región boliviana, peruana, mexicana, productos
tomados como patrón como son las especies de Cinchona y la Cloroquina.
Posteriormente se procedió a calcular los porcentajes de inhibición de maduración de
esquizontes mediante fórmulas matemáticas, haciendo una comparación posterior con el
método visual que resultó ser nuestro control. (Cuadro 17 del Anexo 4)
De acuerdo a la tabla presentada y realizando una comparación con los resultados obtenidos
con ambas pruebas, apreciamos una relación directa entre los productos activos e inactivos,
con ligeras diferencias en cuanto a valores numéricos, siendo las diferencias más
significativas las que presentan las fracciones BMI 43 V2 que presenta unos porcentajes de
inhibición de 11,6% Y 44% en los métodos visual y bioqulmlco respectivamente, si bien estas
diferencias parecen ser muy altas, se mantienen en el rango de activos e inactivos,
asumiendo que el límite inferior para ser considerados activos es de 50%.
70
David Gutiérrez Yapu AJea de Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA
Los criterios de valoración en cuanto a ICso ,fueron los mismos que empleamos en el
Método Visual:
Activo < 10 Jl9/ml
Inactivo > 10 Jl9/ml
Posteriormente se realizaron los cálculos para hallar los valores de ICso correspondientes,
también por duplicado realizando la comparación de ambos métodos apreciándose los
resultados de la Tabla 11.
Tabla 11. Valores de IC 50 presentados por los productos en estudio por los métodos
Visual y Bioquímico
N° Extracto IC 50 (ug/ml) IC so (ug/ml)
Método Visual Método LDH
1 IBMIIF17 3,6 3,8
2 iBMlfF16 >10 >10
3 iBMIIF15 > 10 >10
4 BMI43V2 >10 >105 Remijia peruviene 4 4
6 Mx 11 3 I 1,8
7 Mx 71 > 10 > 108 Cinchona officínalis 4,2 4,9
9 Cinchonapubescens 1 4,5
10 boroquina 36 nM ! 39 nM
Con ayuda de esta comparación, podemos afirmar que los valores están en relación directa
por ambos métodos, ya que las diferencias numéricas no son altas, y menos aún, no se
contraponen en el sentido de resultar activo con un método e inactivo con otro.
Por estas razones podemos afirmar que el método alternativo bioquímico proporciona
resultados de similar manera a el método convencional que es el Visual.
71
DavidGutiérrez Yapu
6.3 EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS
DROGAS: ESTANDARIZACiÓN DE LOS PARÁMETROS DEL MÉTODO
FLUOROMÉTRICO
El procedimiento no requiere reactivos o equipos sofisticados, y puede ser completado en un
lapso de tiempo muy corto. siendo de gran ayuda en pruebas con un gran número de
muestras a ensayar. El ensayo es altamente sensible, según los estudios que se realizaron
con Cloroquina, y la evaluación de la intensidad de fluorescencia en diferentes estadios
parasitarios. (Smeijsters et al, 1996)
Los métodos de cuantificación de DNA están normalmente basados en medidas
espectrofotométricas, siendo uno de los colorantes más empleados el Bisbenzimide H33258
(Hoechst), esto debido a que las medidas por métodos f1uorométricos, tienen mucha más
sensibilidad . Además de este colorante, también existen otros como el Pico Green el cual
fue empleado como reactivo específico en [a cuantificación de DNA en muestras de tierra
(Sandaa et al, 1997).
A nivel de la determinación de la susceptibilidad de drogas sobre Plasmodium faIciparum ,
los trabajos comenzaron con éxito al realizar análisis de la intensidad parasitaria en
diferentes estadios, por medio de cultivos sincronizados, y verificando la actividad de la
Cloroquina, en estos ensayos los resultados son altamente específicos, todo esto con el
reactivo Hoechst 33258 cuya sensibilidad es del orden de los nanogramos.
Es necesario mencionar que este fundamento ya fue aplicado con éxito en Panamá,
empleando el Pico Green como colorante, cuyo fundamento es similar al del Hoechst 33258,
este método fue usado para determinar la inhibición del crecimiento parasitario y los valores
de concentración inhibitoria del 50% que fueron reportados frente a diversos agentes
antímaláricos. (Corbett et al, 2004)
Este método basado en la determinación de la fluorescencia del f1uorocromo Hoechst 33258
- ADN de Plasmodium falciparum, se realizó en placas de 24 alvéolos en Jos cuales el
parásito fue confrontado con extractos y drogas patrón a diferentes concentraciones, al ser
el número de parásitos. evidenciado por conteo visual, directamente proporcional a la
72
iavid Gutiérrez Yapu kea de Quimioteraoia Experimenta! - IIFB - UMS~
.antldad de DNA de los mismos, la concentración inhibitoria del 50% puede ser determinada
I través de la cuantificación de ADN presente al terminar el ensayo biológico. (Deharo et al ,
!OOO)
:specíficamente en este ensayo se siguieron parámetros establecidos en experiencias
mteriores y se adaptaron estos de acuerdo a el material existente en el laboratorio,
ealizándose las pruebas respectivas, de manera similar a la prueba bioquímica, tomando en
:uenta compuestos naturales, activos e inactivos, y compuestos patrón con valores
sstablecdos previamente.
)e la misma forma primeramente se establecieron valores como son los porcentajes de
nhibición a diferentes concentraciones, y realizando una comparación con el método
xmvencional como es el visual y el método desarrollado recientemente, el Bioquímico
nediante la LDH, estableciéndose los resultados en el Cuadro 18 del Anexo 4.
:;on los resultados apreciados, podemos determinar que los valores al igual que en el
anterior método, tienen gran relación que tiene que ser considerada muy importante ya que
nantiene el vínculo de la actividad, es decir los tres métodos reportan resultados
::onsiderados como activos e inactivos simultáneamente.
.os criterios de valoración en cuanto a ICSO ,fueron los mismos que empleamos en el
Vlétodo Visual:
Activo < 10 Jlg/ml
Inactivo > 10 ).lg/ml
t.os valores no llegan a ser exactos pero se guarda una cercanía en estos, lo que nos
oroporciona cierta exactitud en los tres métodos, y especialmente en el Fluorométrico que
venimos desarrollando. Con todos estos parámetros. se procedió a realizar los cálculos
::orrespondientes para determinar los valores de ICSO que se detallan a continuación en la
Tabla 12.
73
David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Tabla 12. Valores de leso presentados por los productos en estudio por los métodos
Visual, Bioquímico y Fluorométrico
N° Extracto IC 50 (ug/ml) IC 50 (ug/ml) IC 50 (ug/ml)
Método Visual Método LDH Mét.FluorométricoI
>10 > 10 >101 ¡Mx 712 !SMIIFI6 >10 >10 > 103 Cmchonapubescens 1 4,5 5,84 Cinchona officinalis 4,2 4,9 7,15 !Cloroquina 36 nM 39 nM 15 nM
Estos valores nos demuestran la confiabilidad que posee el método desarrollado, el
Fluorométrico, ya que los valores están catalogados en el rango de actividad establecido
anteriormente, ya que realizando una comparación entre los tres no se puede negar que los
valores representan actividad.
Además, el método f1uorométrico proporcionó valores que diferencian los activos y los
inactivos por lo tanto se convierte en un método confiable.
74
David Gutiérrez Yapu
En el presente trabajo se llevaron a cabo dos aspectos fundamentales, el ensayo de
quimiosensibilidad en productos sintéticos y naturales, e! desarrollo de dos nuevas técnicas
de evaluación de la sensibilidad del Plasmodium falciparum como son el Método Bioquímico
(mediante la reacción de la Lactato deshidrogenasa) y el Método Fluorométrico.
En cuanto al primer aspecto, se evaluaron un total de 326 productos evaluados, de los
cuales 60 eran sintéticos y 266 naturales procedentes de diferentes lugares, de todos estos
34 productos naturales resultaron ser activos contra 232 que resultaron ser inactivos, lo que
proporcionalmente nos da a lugar un 12,78% de extractos activos.
Estos extractos serán sometidos a nuevos procesos ya sea de' purificación o
fraccionamiento, para obtener el o los componentes que proporcionan a estos su actividad,
esto va en relación a todo trabajo realizado con especies vegetales como nuevas alternativas
contra la malaria.
En cuanto a los productos sintéticos, 22 resultaron contar actividad contra Plasmodium
falciparum, lo que representa un 36,66% del total de productos sintéticos, la diferencia de la
relación porcentual en cuanto a los productos naturales, se debe a que estos productos
sintéticos son en su mayoría derivados de compuestos reportados como activos
anteriormente, por lo que existe mayor posibilidad de encontrar actividad en estos que en los
otros.
Los productos sintéticos, serán sometidos a nuevas pruebas, como ser la toxicidad para
poder determinar nuevos aspectos muy importantes en cuanto al estudio de estos productos.
Las fracciones serán nuevamente evaluadas para determinar además si la actividad se
mantiene o no, todo este proceso se llevará a cabo en los lugares de procedencia y serán
evaluadas en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, La Paz - Bolivia.
Como parte del segundo aspecto que era el desarrollo de nuevas técnicas in vitro para
determinar la sensibilidad de Plasmodium telcipetum a diferentes productos, tenemos el
Método Bioquímico que se basa en la reacción de la Lactato deshidrogenasa parasitaria, el
cual fue llevado a cabo con éxito ya que se pudo verificar la aplicabilidad de este método
76
David Guliérrez Yapu
debido a que los resultados presentados, se encuentran en el mismo rango que los
obtenidos con el método control como es el visual.
En este desarrollo se emplearon diversos productos con actividad predeterminada y
productos que no tenían reportes sobre si eran activos o no; se procedió a evaluar estos con
ambos métodos tratando de encontrar valores similares, los resultados fueron aceptables,
pues en productos con actividad desconocida como eran los productos BMIIF17, BMIIF16 Y
. BMIIF15, se pudo apreciar que el primero poseía actividad contra Plasmodíum falcíparum
con un ICso de 3,6 y 3,8 Jlg/ml por los métodos visual y bioquímico respectivamente, los otros
dos resultaron ser inactivos, con valores obtenidos con ambos métodos.
También se hicieron los ensayos sobre Jos productos que ya habían sido reportados como
activos anteriormente y de la misma manera los resultados que estos productos presentaron,
fueron activos para la Remijía peruvíana, el producto Mx 11 y las dos especies de Cínchona,
e inactivo para el producto Mx 71.
Los resultados numéricos, tambíén se encuentran en el rango considerado como activos, por
lo tanto los resultados obtenidos por el Método Bioquímico mediante la reacción de la Lactato
deshidrogensa parasitaria, son considerablemente aceptables, para la determinación de la
actividad de productos contra Plasmodium fa/cíparum.
Esto puede ser comprobado mediante los resultados presentados en cuanto a porcentaje de
inhibición, donde se aprecian que valores considerados como negativos y positivos
presentan estos en ambos métodos, con ligeras variaciones en el valor numérico.
Las diferencias de los valores de ICso calculados no son considerables y por lo tanto se
encuentran en el rango de actividad correspondiente, esto nos proporciona muchas ventajas
sobre el anterior método empleado en relación al tiempo empleado para realizar las pruebas,
ya que con este método no necesitamos más de 90 minutos para poder determinar valores
que visualmente nos tomarían días, siendo además su rendimiento casi del 100%.
77
DavidGutiérrez Yapu
En cuanto al segundo método que fue desarrollado en este trabajo, el Método Fluorométrico,
que se basa en la determinación de la fluorescencia del fluorocromo Hoechst 33258 - ADN
de Plasmodium falciparum se tomaron en cuenta todos los parámetros con el mayor cuidado
posible, pues el trabajo con DNA así lo demanda.
También se tuvo el cuidado de realizar las pruebas con productos con actividad positiva
como negativa, verificada anteriormente, además que se hizo la prueba con los productos
por triplicado, tomando como métodos control, el Visual y el Bioquímico desarrollado
anteriormente.
Una vez que se realizaron las pruebas correspondientes, se calcularon los valores de los
porcentajes de inhibición y estos se encontraban con valores diferentes pero dentro de los
rangos establecidos como activos e inactivos, por lo tanto estos resultados son confiables.
Nuevamente se demostró que aquellos productos inactivos como son el producto Mx 71 y el
BMIIF16, nuevamente presentaron esta falta de actividad luego de hacerse el ensayo con el
método Fluorométrico, y de manera similar, los productos con actividad demostrada,
volvieron a presentar estos resultados con el nuevo métododesarrollado.
Una vez que se calcularon los valores de leso se aprecia una diferencia más notable que en
el método bioquímico, pero aun se mantiene en los rangos aceptables de actividad, por lo
que podemos afirmar que el método desarrollado es considerablemente aceptable.
Este método también presenta una gran ventaja sobre el convencional que es el visual, ya
que puede ser realizado en 30 minutos, a diferencia del anterior que demanda un lapso de
tiempo mucho mayor, presentando además una gran efectividad en cuanto a resultados.
Ambos métodos, el Bioquímico y el Fluorométríco, presentaron resultados que comparados
con el convencional, el visual, son completamente aceptables y confiables para continuar el
trabajo que se viene realizando, aplicando estos métodos el tiempo que se necesitaría para
obtener resultados confiables sería disminuido de gran manera, contando además que los
equipos empleados no son altamente sofisticados y los reactivos no son difíciles de
co~seguir.
78
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Este problema del tiempo surge a raíz de la gran demanda de resultados debido a la gran
cantidad de productos en estudio, con la aplicación de estos dos nuevos métodos, se tendría
la posibilidad de cubrir toda esta demanda y continuar con el trabajo establecido, teniendo
como pilar fundamental el de contar con tres diferentes métodos que validarían nuestro
trabajo.
79
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Es necesario mencionar que el tamaño de muestra empleado para este trabajo, no es
significativo, por lo que necesitamos continuar con el mismo, tomando en cuenta un mayor
número de estas, verificando siempre sus actividades por los tres métodos, teniendo en
cuenta siempre que los resultados obtenidos fueron alentadores
También es necesario realizar un trabajo sobre la influencia del color del producto a evaluar,
sobre la actividad que presenta, para determinar si este es un factor negativo en las lecturas
calorimétricas que se hacen.
Una última recomendación es la de realizar un seguimiento biodirigido, a través de un
fraccionamiento cromatográfico de especies seleccionadas, mediante una comparación de
los tres métodos empleados.
81
David Gutiéfrez Yapu
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121. Weiss, C.; Moideen, S.; Croft, S. y Hoghton, P. Activity of extracts and isolated
naphthoquinones from Kigelia pinnata against Plasmodium tetciperum. Journal
ofNatural Produets. 2000. e3, 1306-1309
122. Windsor, S. y Tinker, M. Binding of biologically important molecules to DNA,
probed using electro-fluorescence polarizatlon spectroscopy. Biophysieal
Chemistry. 1996. 58, 141-150
93
DavidGutiérrez Yapu
123. Winter, V.; Cameron, A.; Tranter, R.; Sessions, R. y Brady, R. Crystal structure of
Plasmodium berghei lactate dehydrogenase indicates the unique structural
differences of these enzymes are shared across the Plasmodium genus.
Molecular & Biochemical Parasitology. 2003. 131, 1-10
124. Wissing, F.; Sanchez, C.; Rohrbach, P.; Ricken, S. y Lanzert, M. IIumination of the
malaria parasite Plasmodium falciparum alters intracellular pH. The American
Society for Biochemistry and Molecular Biology. 2002. Vol 277 N° 40. 37747-37755
125. Wu, Y.; Chen, H.; Yiang, K.; Li, Y.; Shan, F.; Wang, D. y Wang, Y. Interaction of
biomolecules with qinghaosu (artemisinin) and its derivatives in the presence of
ferrous lon-an exploration of antimalarial mechanism. Chemistry Pure Applicate.
1999.71 (6): 1139-1142
126. Ziegler, H.; Staerk, D.; Christensen, J.; Hviid, L.; Haqerstrand, H. y Jaroszewski, J. In
vitro Plasmodium falciparum Drug Scnsitivity Assay: Inhibition of Parasite
Growth by Incorporation of Stomatocytogenic Amphiphiles into the Erythrocyte
Membrane. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. Vol 46 N° 5. 1441-1446
94
David Gutiérrez Yapu
ANEXO 1:
Área de Quimioterapia I=xperimenl(}l - IIFB - UMc A
GRÁFICOS
Gráfico 1: Ultraestructura de Merozoito
Mi1Dchondnon
PI!lStid Mlcrtrtul\.Jles
== RibosomesMERozorre - Ttyee--dlmenslonal <Tg<r1l2abon 01a PJasmoaium tec o etum
merozoue, witll tne peMicle partly 0.1away lOsna.. me In!pmal srucnze.~~"_Vt... · """" ·""' I """-"~O' t.ty"""'IO·)LA "''U, '. ZSo ''-.U. IIlo~ ''Itdo '''' ''' OJl ''' ''l''""" I ~-"'G.-. " _.~ü.lf'c-_.-..1~"'''' p) . tl"I I I.C.~("' ) _"""' ~ L t...U ..... " ,_
Fuente: htt :llsit s.luji.ac.ilImalaria/maps/merozoi
Gráfico 2: Ultraestructura del estadio anillo
R0U9h EA GOIgi comotex(?)
h.html
Cylo>lorno
Plasmamemb<ane
Nud<>us
EXocy\lC vestcíes
Mltoct1lJoorlon
Free rlbo s.'lmeS¡'. ....-.:..to.. lf)' i.;col·"
RJNG STAGE - Three -<lirnenslona l rrganiZanon r:J a PJasmocJ;um fa lcíparumearly nrg sla ge. a cW- lIke rorrn In IhIS example Tne nos t reo 01000 cen(RBC)and pzrasüopnorous vacuoie rnemorane (PVM) are not sho;m. ER encoptasrmr reticulum
~l1ro-""_1yt.."'1! ~"J ...... 1 .,.p__.. t/ r·¿v \.Co-... I I( I. ) L !r.~ r. !L lLJh6l, tKD uoIC Jf ....,"b IO' ... . I~ . .. tlbon._.t~ll;,..__ ,...u'Lin-.l. hto... .J). j l 'J.I ) ).C.~u."\ ~..:-D .a
Fuente: http:// ites.huji.ac.il/maJaria/maps/ringstagepath.html
96
David Guliérrez Yapu Area de QL.imioterapia Experimental - "FB - UMSA
Gr ' fico 3: Ultraestructura d / Trofozoito
rree fOOsomes
TROPHOZOITE - MIll-trophOro r.e staqe 01Ptsstrootum 18.'c'P8run , charac", r!?plj ti)' ns Irregu"', IlJtllne.me íncresse In prolelr>-synmeslZlng appa-alUs, lncreaseo reeding tIlIDugh rnu nrue I)lOstomes, !T'lWttl alOle pigmeO!vacooie , and smxnras assoctateo Wltt1 e"POf101parasi!e frolelns (Golgl ooov, eJ<Ocytlcvesicles). ER - ercopiasmtc rettceturn
~""" "'_\,Io_II. a.-nt • ...-~ . .. ' _ ••o,r...... \4... 1l(1. 1 L..~ .. ~ f . e. lZ-~~' IW O !:. ..~ll ,.
1ofm.c..~. e;,.,. ... o-..._,..(Y~~,.,.•.r-..l~"" " '" fJ In~ )). t '~("""" l ..-.••~n _
Fuente: http://sites.h ji.ac.i Ima/aria/maps/trophozoi ath.htm/
Gráfico 4: Itraestruct a E qui nte
GOIgico"'"lo. nhoplry
SCHIZONT - OrganlZatlon al a P/asmodium lil f(;.'f'arum schlzonl l owards tre em al mal steqe ·~ :;-ra sRJ-~d RBCsmxture. lncludn g Maur",,"s oe ns (de' '9131"0 nere as lm g aro snot elens) aro serace knons 15oeoicted In meapex al eacn merozore tl l lj me aplcal organelles a-e deve' p .ano mnochonala ('7een) ano plast(ls(yellow)are m;grabng mto me buls ER - !'<ldOplasrmc rencuairn.
~~"-y _a~"''''~' '''. P-.''. lY f~ ....-. t(l'l La.a-n' '''.''-'' l...I.. .. _ ..IKIlr''''u.lGJI_'''I ''\O( m..-....o-. tr-. ..._ ••~~ü ....._~ra..¡",.. Pr_ I r'7-4I ).e.~(,.. ~ ..............lIo-.n. .. . ,"•• •
Fuente: http://sites.huji.ac .il/ma/aria/ma
97
David Gutiérrez y apu .Isss.-=,-d "~_ q'iimioterania Experimental - IIFa - MSA
Gráfico 5: Gráñco del tesmo dium tetcip tu , e tadio d esquizonte
Gráfico 6: Gráfico del PI smotiium telciperu m, estadía de anillo
'. :" ~'"
."
'- - ' . 'l' .
98
David Guliérrez Yapu
ANEXO 2: MATERIAL Y REACTIVOS
A) MATERIAL REQUERIDO PARA CULTIVO DE ESTADías INTRAERITROCITARIOS
DE P. falciparum
Material Biológico
• Cepa F32 de Plasmodium falciparum sensible a la c1oroquina (aislada en Tanzania)
• Glóbulos rojos humanos infectados (GRi) con P. falciparom
• Glóbulos rojos humanos no infectados (grupo sanguíneo compatible)
• Suero o plasma humano (compatible con el grupo sanguíneo de los glóbulos rojos
utilizados)
• Medio de cultivo RPMI 1640 (GIBCO 079-03018 A o SIGMA R-4130, con HEPES 25
nM, L-glutamina 300 mglJ y glucosa 2 g)
Material de plástico y de vidrio
• Cajas Petri de diámetro 100 mm, 60 mm y 35 mm
• Criotubos de 2 mI
• Filtros Millipore de 0,22 prn
• Frascos de cultivo de 25 cm2 de cuello inclinado
• Guantes de látex
• Jeringas estériles de 10 mi
• Matraces Erlenmeyer de 1000 mi
• Micropipetas de 200-1000 !JI
• Micropipetas de 50-200 !JI
• Micropipetas de 5-50 !JI
• Micropipetas multicanal 50-200 !JI
• Microplacas de cultivo de 96 alveólos de fondo plano estériles
• Pipetas Pasteur
• Pipetas volumétricas estériles de 1, 2, 5 Y10 mi
• Portaobjetos
• Puntas amarillas de 5-200 !JI
• Tubos de centrífuga de 15 mi
99
David Gutiérrez Yapu
• Tubos de centrifuga de 50 mi
• Tubos Eppendorf de 1,5 mi
Reactivos químicos
• Agua bidestilada desionizada
• Antibióticos (Gentamicina, Cloranfenicol)
• Anticoagulante ACD (Citrato Dextrosa) (Sigma C-3821)
• Bicarbonato de sodio anhidro p.a. (NaHC03)
• Cloruro de sodio p.a. (NaCI)
• Colorante Giemsa (Merck 0-61 9203)
• Dextrosa (O-glucosa) p.a. (Sigma 0-6152)
• Glicerina bidestilada
• Metanol p.a. (CH30H)
• Fosfato diácido de potasio (KH2P04)
• Fosfato ácido de sodio (Na2HP04)
• Sorbitol p.a.
Equipos
• Autoclave (Al! American Modelo H79-ICE)
• Baño Maria (Grant Instruments CB2 SaZ)
• Campana de flujo laminar (Securiplus PSM Modelo 514 24)
• Candle Jarr (Desecador con llave, permite bajar la tensión de oxígeno hasta 17%)
• Centrifugadora (Jovan CR 3i)
• Estufa básica para cultivo (Forma Scientific Modelo 3192)
• Microscopio (Wild Leitz GMBH Tipo: 020-503-030)
• Potenciómetro (Sigma 237, 940-9)
• Agitador Magnético (Barnstead/Lab-Line 1999)
• Congelador (Revco Scientific Modelo 3192)
• . Pipeta Automática (Drummond Scientific Co.Broomell, PA 19008)
• Refrigerador (DLG GR-2525VF)
• Vortex (Scientific Industries, INC Modelo G-560E)
100
David Gutiérrez Yapu
B) MATERIAL REQUERIDO PARA LA SINCRONIZACiÓN DE CULTIVOS in vitro DE
P. falciparum
Reactivos y material biológico
• Cultivo de Plasmodium falciparum
• Solución de O-sorbitol al 5 %
• Material utilizado en adaptación y mantenimiento de cultivos de P. falciparum
C) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro
DE P. falciparum A LAS DROGAS: MICROMÉTODO VISUAL
Material y reactivos
• Tubos de hemólisis de vidrio de 5 mi (Fisher A 14 720 121)
• Tubos Eppendorf de plástico
• Microplacas de titulación de 96 alveólos de fondo plano estériles (Tipo Nunción)
• Oimetil sulfóxido (OMSO) (Sigma 0-5879)
Equipo
• Micropipetas multicanal 50-200 ¡JI
• Micropipetas de 10-200 ¡JI, 50-200 ¡JI Y200-1000¡J1
• Ultrasonicador
101
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
D) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro
DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO BIOQuíMICO (PRUEBA in vitro DE
LA LACTATO DESHIDROGENASA PARASITARIA)
Material y reactivos
• Utilizar el mismo material indicado en los anteriores puntos para el mantenimiento de
cultivos in vitro y la prueba de la sensibilidad
• APAD (3-acetilpiridina adenina dinucleótido)
• L-lactato
• NBT (Nitro Blue Tetrazolium)
• PES (Phenazine Ethosulfate)
• Tampón TRIS (Tris hydroxymethyl aminomethane)
Equipo
• Micropipetas multicanal 50-2001-11
• Micropjpetas de 10-200 ¡JI, 50-200 1-11 Y 200-10001-11
• Espectrofotómetro (Awareness Technology Inc. Stat Fax - 2100)
E) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro
DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO
Material y reactivos
• Utilizar el mismo material indicado en los anteriores puntos para el mantenimiento de
cultivos in vitro y la prueba de la sensibilidad
• Placas estériles de 24 pozos
• Tubos Eppendorf de 2 mi
• Acetato de sodio
• ADN de timo de bovino (para calibrar el f1uorómetro)
• .Alcohol isoamílico
102
DavidGu'tiérrez Yapu
• Cloroformo
• Cloruro de sodio p.a.
• EDTA Na2-2H20
• Guanidinium HCI
• Ácido Clorhídrico
• Hoechst 33258
• Hidróxido de sodio
• Saponina
• Tris HCI
Equipo
• Micropipetas de 10-200 !JI, 50-200 !JI Y 200-1 OOO!JI
• Fluorómetro tipo Hoefer DyNA Quant 200 (Amersham Biotech Pharmacia, espectros
de emisión de 365 nm y detección de 460 nM)
• Cubetas de cuarzo para el lector de fluorescencia
103
David Gutiérrez Yªpu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
ANEXO 3: DESCRIPCiÓN DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS
Cuadro 1: Derivados Sintéticos correspondientes al Departamento de Química
Farmacéutica, Facultad de Farmacia de la Universidad de Salamanca, Salamanca
España
N° Código Fórmula Pesomolecular molecular
1 8-1010 C'6H'202 236,0
2 8-1020 C17H,40 3 266,0
3 8-1060 C'6H1,02C1 270,5
4 8-1080 C,6H1Q02CI2 304,9
5 8-1090 C'6H1002Cb 304,9
6 8-6060 C1sHaN04CI 301,5
7 8-6070 C15HaN04CI 301,5
8 8-6080 C'sH7N04CI2 335,9
9 8-6090 C1sH7N04Cb 335,9
10 8-21010 C1sHa02Cb 290,9
11 8-21020 C16H1003Cb 320,9
12 8-21070 C1sH702CI3 325,4
13 8-21080 C1sH602CI4 359,8
14 8-21090 C1sH602CI4 359,8
15 F-1011 C16H16N20 252,0
16 F-1060 C16H13N2OCI 284,5
17 F-1061 C17H,sN2OCI 298,5
18 F-1070 C16H13N20CI 284,5
19 F-1071 C17H15N2OC\ 298,5
20 F-10S0 C16H12N20Cb 318,9
21 F-1081 C17H14N20C12 332,9
22 F-1090 C16H12N20CI2 318,9
23 F-1091 C17H14N20C12 332,9
24 F-1101 C1aH1aN2S0 310,0
25 F-21011 C16H12N20CI2 318,9
26 F-21020 C16H12N202CI2 334,9
27 F-21070 C1sHgN20CI3 339,4
28 F-21080 C1sHsN20CI4 373,8
29 1-1060 C1aH17N20CI 312,5
30 1-1070 C'8H17N2OCI 312,5
104
David Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 1
Areade Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA
N° Código Fórmula Pesomolecular molecular
31 1-1090 C18H16N20CI2 346,9
32 1-21020 C18H16N202CI2 362,9
33 1-21060 C17H13N20C13 367,4
34 1-21070 C17H13N2OCh 367,4
35 1-21081 C17H12N20C14 401,8
36 1-21090 C17H12N20C14 401,8
37 E-1060 C21H22N02CI 355,5
38 8-1070 C16H1102CI 270,5
39 8-21060 C15H702CI3 325,4
40 F-21061 C16H11CI3N20 353,6
41 F-21071 C16H11ChN20 353,6
42 F-21091 C16H10CI4N20 388,1
43 F-21081 C16H10CI4N20 388,1
44 F-16061 C21H22CIN303 399,9
45 1-21110 C21H16CI2N30 383,3
46 1-1020 C19H20N202 308,4
47 1-1020; C19H20N202 308,4
48 1-1110 C22H20N2O 328,4
49 1-1100 C19H20N20S 324,4
50 1-1080 C18H16CI2N20 347,2
105
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
Cuadro 2: Productos correspondientes al Laboratorio de Productos Naturales.
Universidad de Antofagasta, Antofagasta-Chile
1
2
3
4
5
CODIGO
Y-1
Mc-F
Al. c-1
Y-4
Mc-E
FORMULA ESTRUCTURAL FORMULA
MOLECULAR
PESO
MOLECULAR
320 g/mol
360 g/mol
336 g/mol
330 g/mol
392 g/ mol
106
David Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 2:
Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
CODIGO
6 . Ac-Y-17
7 Y-6
8 Az-m9
FORMULA ESTRUCTURAL FORMULA
MOLECULAR
PESO
MOLECULAR
330 glmol
306 glmol
348 glmol
9
10
Az-m6
LA-7
290 glmol
348 gl mol
107
DavidGutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB- UMSA
Cuadro 3: Productos naturales procedentes de Guatemala
Órgano
N° Código Familia Especie empleado- . --~,.=====
1 G-01 Euphorbiaceae Acalypha guatemalensis Hojas2 G-02 Fabaceae Cassia alata Hojas
3 G-03 Fabaceae Cassia qrendis Hojas4 G-04 Fabaceae Cassia grandis Corteza
5 G-05 ~steraceae Chaptalia nutans Hierba
6 G-06 Verbenaceae Comutia pyramidata Hojas7 G-07 Verbenaceae Comutia pyramidata Tallo
8 G-08 Clusiaceae Hypericum uliqinosum Hojas
9 G-09 lVerbenaceae LiPQié! chiapasensis Hojas10 G-10 lVerbenaceae Liooie areveolens Hojas
11 G-11 Biqnonaceae Parmenteria aculeata Hojas12 G-12 Myrtaceae Pimenta dioice Hojas13 G-13 Sapotacea Pouteria viride Tallo14 G-14 Fabaceae Quercus crispifolia Tallo15 G-15 Lamiaceae Salvia lavanduloides Hierba16 G-16 Smilacaceae Smilax oomioensls Rizoma17 G-17 Sterculiaceae Sterculia apeta/a Corteza
18 G-18 Sterculiaceae Sterculia eoetete Hojas19 G-19 Biqnonaceae Tabebulia rosea Hojas20 G-20 Theaceae Temstroemia teoezeoote Hojas21 G-21 Theaceae Temstroemia tepezapote Flores22 G-22 Asteraceae Tithonia diversifolia Hojas23 G-23 ~steraceae Tithonia diversifolia Tallo24 G-24 Valerianaceae Valeriana prionophylla Raíz25 G-25 Asteraceae Vemonia deppeana Hojas26 GUA-0310 Polymnia maculata Holas27 GUA-0311 Piper amalago Hojas28 GUA-0312 Senecio selkmus Hojas29 GUA-0313 Plumeria rubra Hojas
30 GUA-0314 Monnina xalepensis Hojas-Tallo
108
David GuliérrezYapu
Cuadro 4: Productos naturales procedentes de Colombia
Órgano Tipo de
N° Código Especie empleado muestra
1 A3 Pioer ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 3
2 A6 Piper ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 6
3 A8 Pioer ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 8
4 A 12 Piper ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 12
5 B3 Ca/ea prunifo/ia Planta entera Partición 3
6 B6 Ca/ea prunifo/ia Planta entera Partición 6
7 B8 Ca/ea prunifolía Planta entera Partición 8
8 B 12 Ca/ea prunifolia Planta entera Partición 12
9 e3 Piper barbatum L. Hojas Partición 3
10 e6 Piper barbatum L. Hojas Partición 6
11 e8 Pioer barbatum L. Hojas Partición 8
12 e12 Piper barbatum L. Hojas Partición 12
13 03 Pioer umbe!!atum L. Planta entera Partición 3
14 06 Piper umbe!!atum L. Planta entera Partición 6
15 08 Piper umbe!!atum L. Planta entera Partición 8
16 012 Piper umbe//atum L. Planta entera Partición 12
17 E3 Annona muricata Planta entera Partición 3
18 E6 IAnnona muricata Planta entera Partición 6
19 E8 IAnnona muricata Planta entera Partición 820 E 12 Annona muricata Planta entera Partición 12
21 F3 Coffea arabica Planta entera Partición 3
22 F6 Coffea arabica Planta entera Partición 6
23 F8 Coffea arabica Planta entera Partición 824 F12 Coffea arabica Planta entera Partición 12
25 G3 Cardiospermum qrandiflorum Planta entera Partición 3
26 G6 Cardiospermum grandiflorum Planta entera Partición 627 G8 Cardiospermum grandiflorum Planta entera Partición 8
28 G 12 Cardiospermum grandiflorum Planta entera Partición 1229 H3 Tabebuia rosea Planta entera Partición 3
30 H6 Tabebuia rosea Planta entera Partición 6
31 H8 Tabebuia rosea Planta entera Partición 832 H12 Tabebuia rosea Planta entera Partición 1233 13 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 3
34 16 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 635 18 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 8
36 112 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 12
109
David Gutiérrez Yaou
Continuación del Cuadro 4
Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Órgano Tipo de
N° Código Especie empleado muestra
37 J3 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 3
38 J6 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 639 J 8 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 8
40 J 12 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 1241 K3 Ha/enia asc/epiadeae Planta entera Partición 342 K6 Ha/enia asclepiadeae Planta entera Partición 643 K8 Halenia asclepiadeae Planta entera Partición 8
44 K12 Ha/enia asc!epiadeae Planta entera Partición 1245 L3 Miconia buxifo/ia Planta entera Partición 346 L6 Miconia buxifolia Planta entera Partición 647 L8 Miconia buxifo/ia Planta entera Partición 848 L12 Miconia buxifolia Planta entera Partición 1249 M3 Miconia sp Planta entera Partición 350 M6 Miconia sp Planta entera Partición 6
. 51 M8 Miconia so Planta entera Partición 852 M 12 Miconia sp Planta entera Partición 1253 N3 Miconia sp Planta entera Partición 354 N6 Miconia sp Planta entera Partición 655 N8 Miconia sp Planta entera Partición 856 N 12 Miconia sp Planta entera Partición 1257 03 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 358 06 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 659 08 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 860 012 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 1261 CO-221 fr01 Piper barbatum H.B.K. Frutos Crudo62 CO-243 h01 Bocconia integrifolia Hojas Crudo
Humb & H.Rob63 CO-243 fr01 Bocconia integrifolia Frutos Crudo
Humb &H.Rob64 CO-244 h01 Piper barbatum H.B.K. Hojas Crudo65 CO-245 f101 Critonia morifolia Flores Crudo66 CO-245 fr01 Critonia morifo/ia Frutos Crudo
110
pavid Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 4
Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
Órgano Tipo de
N° Código Ef'Eecie empleado muestra
67 CO-247 h01 Cinchona pubescens Vahl Hojas Crudo68 CO-248 h01 Paullinia densiflora J.E.Smith Hojas Crudo39 CO-249 h01 Sida rhombifolía L. Hojas Crudo
40 CO-250 fi01 Lanata camara L. Flores Crudo
Cuadro 5: Productos naturales procedentes de Argentina
Tipo de
N° Código Especie extracto
1 Pd(Pas)Ac Paríetaria debilísAcuoso
2 Et(Pas)Hex Epbetire tweedíana Hexánico3 As(Pas )OCIM Argemone subfusíformis Diclorometá nico4 Mp(pas)OCIM Míkania periplocifolia Diclorometá nico5 Et(pas)OCIM Ephedra tweedíana Alcohólico6 Pd(Pas)Hex Parietaria debilís Hexánico
111
DavidGutiérrez Yapu Áreade Quimioterapia Experimental - IIFB- UMSA
Cuadro 6: Productos naturales procedentes de México
N° Código
1 MX-11
2 MX-12
3 MX-13
4 MX-14
5 MX-15
6 MX-16
7 MX-17
8 MX-18
9 MX-19
10 MX-20
11 MX-21
12 MX-22
13 MX-23
14 MX-24
15 MX-25
16 MX-26
17 MX-27
18 MX-28
19 MX-29
20 MX-30
21 MX-31
22 MX-32
23 MX-33
24 MX-34
25 MX-35
26 MX-36
27 MX-37
28 MX-38
29 MX-39
30 MX-40
31 MX-41
32 MX-42
33 MX-43
34 MX-44
N° Código
35 MX-45
36 MX-46
37 MX-47
38 MX-48
39 MX-49
40 MX-50
41 MX-51
42 MX-52
43 MX-53
44 MX-54
45 MX-55
46 MX-56
47 MX-57
48 MX-58
49 MX-59
50 MX-50
51 MX-61
52 MX-62
53 MX-63
54 MX-64
55 MX-65
56 MX-66
57 MX-67
58 MX-68
59 MX-69
60 MX-70
61 MX-71
62 MX-72
63 MX-73
64 MX-74
65 MX-75
66 MX-76
67 MX-77
68 MX-78
112
David GuliérrezYapu Áreade QuimioterapiaExperimental - I1F8 - UMSA
Cuadro 7: Productos naturales procedentes de Perú
N° Especie Órgano Tipo de
empleado extracto
1 Maytenus macrocarpa Corteza Acuoso2 Crescienta cuiete Hojas Hexánico3 Crescienta cuiete Hojas Clorofórmico4 !Aspidosperma rigidum Madera 1 ZI Hidroalcohólico5 Pouteria caimito Hojas Clorofórmico
6 IAspidosperma tiqidum Corteza 1 ZI Hidroalcohólico7 Wing coci Planta entera Hidroalcohólico
-
8 !Annona Hojas Acuoso9 Coly cophylum spuamm Corteza Hidroalcohólico10 Crescienta cujete Hojas Hidroalcohólico11 Spondias mombin L. Corteza Acuoso12 Aspidosperma riaidum Raíz 1 ZNI Hidroalcohóllco13 Bixa orellana Hojas Acuoso14 !Aspidosperma exce/sium Madera 1 ZI Hidroalcohólico15 !Aspidosperma rigidum Madera 2 ZI Hidroalcohólico16 !Aspidosperma rigidum Raíz 2 ZNI Hidroalcohólico17 !Aspidosperma rigidum Madera 2 ZNI Hídroalcohólico18 !Aspidosperrna exce/sium Hojas 1 ZI Hidroalcohólico19 Aspidosperrna rigidum Madera 3 ZNI HidroalcohólJco20 !Aspidosperrna rigidum Raíz 3 ZNI Hidroalcohólico21 Dolicarpus dentatus Hojas Hidroalcohólico22 Psvcbotrie poeppigiana Hojas Hidroalcohólico23 Lsndetberaie magnífo/ia Hojas Hidroalcohólico24 Martine/la obovata Hojas Hidroalcohólico25 Remijia ulei Holas Hidroalcohólico26 Remijia u/ei Holas Clorofórmico27 Martinel/a obovata Hojas 1 Clorofórmico28 Landerberqía magnifolia Hojas Clorofórmico29 Psvcbotrie poeppigiana Hojas 1 Clorofórmico30 Psychotria poeppigiana Hojas 2 Clorofórmico31 Dolicerpus dontatus Hojas Clorofórmico32 Remiiie ulei Hojas Clorofórmico33 Martinella obovata Hojas 2 Clorofórmico34 Landerberqia maqnifolia Hojas Hexánico
113
David Gutién"ez Yapu
Continuación del Cuadro 7
Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
N° Especie Órgano Tipo deextracto
35 Psychotria ooeooiaiene Flores Hexánico
36 Psvchotria poeppígíana Holas Hexánico
37 Dolícarpus dontatus Hojas Hexánico38 Remliie peruvíana Hojas Clorofórmico39 Remiiie peruviana Hojas Hidroalcohólico
40 Remíjia peruvíana Hojas Hexánico
114
David Gutiérrez Yaou Área de QuimioterapiaExperimental- IIFB - UMSA
Cuadro 8: Fracciones purificadas de So/anum argentinum procedentes de Bolivia
~ I Código Solvente deproducto elusión
1 F1 OCM2 F2 OCM:MeOH3 F3 OCM:MeOH4 F4 OCM:MeOH5 F5 OCM:MeOH
6 F6 OCM:MeOH7 F7 OCM:MeOH8 F8 Acetato de etilo9 F9 Acetato de etilo10 F3-1 EP:OCM11 F3-2 EP:OCM12 F3-3 EP:OCM13 F3-4 EP:OCM14 F3-5 EP:OCM1S F3-6 EP:OCM16 F3-7 EP:OCM17 F3-8 EP:OCM18 F3-9 OCM19 F3-10 OCM20 F4-1 EP:OCM21 F4-2 EP:OCM22 F4-3 EP:OCM23 F4-4 EP:OCM24 F4-S EP:DCM25 F4-6 EP:DCM26 F4-7 EP:OCM27 F4-8 EP:OCM28 F4-9 EP:OCM29 F4-10 EP:OCM
30 F4-11 EP:OCM31 F4-12 EP:OCM32 F4-13 EP:OCM33 F4-14 EP:OCM34 F5-1 EP:OCM
N° Código Solvente deproducto elusión
-..
35 FS-2 EP:OCM36 FS-3 EP:OCM37 FS-4 EP:OCM38 F5-S EP:OCM39 F5-6 EP:OCM
40 F5-7 EP:OCM41 F5-8 EP:OCM42 F5-9 EP:OCM43 FS-10 EP:OCM44 FS-11 EP:OCM45 FS-12 OCM46 F5-13 EP:OCM47 FS-14 EP:OCM48 F5-15 EP:OCM49 F5-16 EP:OCMSO FS-17 EP:DCM51 FS-18 OCM52 S.arqentinum Crudo
115
DavidGutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
, ANEXO 4: RESULTADOS TOTALES DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS SOBRE
CEPAS DE Plasmodium falciparum F32
Cuadro 9: Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos realizados en la
Universidad de Salamanca, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código IC 50 Actividad
I!g/ml
1 8-1010 > 10 Inactivo
2 8-1020 > 10 Inactivo
3 8-1060 > 10 Inactivo
4 8-10S0 > 10 Inactivo
5 8-1090 > 10 Inactivo
6 8-6060 > 10 Inactivo
7 8-6070 > 10 Inactivo
S 8-60S0 > 10 Inactivo
9 8-6090 > 10 Inactivo
10 8-21010 > 10 Inactivo
11 8-21020 > 10 Inactivo
12 8-21070 > 10 Inactivo
13 8-21080 > 10 Inactivo
14 8-21090 >10 Inactivo
15 F-1011 > 10 Inactivo
16 F-1060 > 10 Inactivo17 F-1061 3,9 ACTIVO
18 F-1070 > 10 Inactivo19 F-1071 5 ACTIVO
20 F-1080 > 10 lmctivo21 F-10S1 3,7 ACTIVO
22 F-1090 > 10 Inactivo23 F-1091 3,1 ACTIVO
24 F-1101 > 10 Inactivo
25 F-21011 > 10 Inactivo
26 F-21020 > 10 Inactivo
27 F-21070 > 10 Inactivo
28 F-21OSO > 10 Inactivo
29 1-1060 >10 Inactivo
30 \-1070 1,9 ACTIVO
116
David Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 9
Area de Quimioterapia Experimen\al-IIFB - UMSA
N° Código IC 50 Actividad
IJg/ml-
31 1-1090 0,18 ACTIVO
32 1-21020 0,05 ACTIVO
33 1-210S0 0,49 ACTIVO
34 1-21070 0,07 ACTIVO
35 1-21080 6 ACTIVO
36 1-21090 0,02 ACTIVO
37 E-10S0 4,8 ACTIVO
38 8-1070 >10 Inactivo
39 8-21060 >10 Inactivo40 F-21 061 3.3 ACTIVO
41 F-21071 > 10 Inactivo42 F-21091 10 ACTIVO
43 F-21081 > 10 Inactivo44 F-1S0S1 10 ACTIVO45 1-21110 0.59 ACTIVO46 1-1020 0.03 ACTIVO47 1-1020i 0.3 ACTIVO
48 1-1110 > 10 Inactivo
49 1-1100 0.03 ACTIVO
117
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Cuadro 10: Evaluación de la actividad in vitro de Diterpenoides aislados de especies
de Azorella compacta, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código IC 50 Actividad~gfml
1 y -1 >10 Inactivo
2 Mc-F >10 Inactivo
3 Az C-1 > 10 Inactivo
4 Y-4 > 10 Inactivo
5 Mc-E 0,4 ACTIVO
S Ac Y -17 >10 Inactivo
7 Y-S 5 ACTIVO
8 Az- m9 > 10 Inactivo
9 Az-mS >10 Inactivo
10 LA-7 >10 Inactivo
118
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimenlal-IIFB - UMSA
I
Cuadro 11: Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código Especie IC 50 ActividadI..IQ/ml
1 G-01 ~calypha guatemalensis >10 Inactivo
2 G-02 Cassia alata >10 Inactivo
3 G-03 Cassia qrandis (Hojas) >10 Inactivo
4 G-04 Cassia grandis (Corteza) >10 Inactivo
5 G-05 Chaptalia nutans >10 Inactivo
6 G-06 Comutia pyramidata (Hojas) >10 Inactivo
7 G-07 Comutia pyramidata (Tallos) > 10 Inactivo
8 G-08 Hypericum uliginosum > 10 Inactivo
9 G-09 Lippia chiapasensis > 10 Inactivo
10 G-10 Liooie qraveolens >10 Inactivo
11 G-11 Parmenteria aculeata >10 Inactivo
12 G-12 Pimenta dioica > 10 Inactivo
13 G-13 Pouteria viride > 10 Inactivo
14 G-14 Quercus crispifolia >10 Inactivo
15 G-15 Salvia lavanduloides > 10 Inactivo
16 G-16 Smilax domioensis > 10 Inactivo17 G-17 Sterculia eoetete (Corteza) >10 Inactivo
18 G-18 Sterculia apetala (Hojas) > 10 Inactivo19 G-19 Tabebulia rosea > 10 Inactivo
20 G-20 Temstroemia te ezapote (Hojas) >10 Inactivo21 G-21 Temstroemia tepezapote (Flores) >10 Inactivo
22 G-22 Tithonia diversifolia (Holes) > 10 Inactivo23 G-23 Tithonia diversifolia (Tallo) > 10 Inactivo
24 G-24 Valeriana prionophylla >10 Inactivo
25 G-25 Vemonia deppeana >10 Inactivo
26 GUA-0310 Polvmnie maculata > 10 Inactivo
27 GUA-0311 Piper amalaqo 9,4 ACTIVO
28 GUA-0312 Senecío salignus 2,9 ACTIVO
29 GUA-0313 Plumeria rubra > 10 Inactivo30 GUA-0314 Monnina xalepensis >10 Inactivo
llQ
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental-IIFB - UMSA
Cuadro 12: Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código Especie IC 50 Actividad
~9./ml
1 A3 Piper holtonni e.D.e. > 10 Inactivo
2 A6 Piper holtonni e.D.e. >10 Inactivo
3 A8 Pipe,- holtonni e.D.e. >10 Inactivo
4 A 12 Piper holtonni e.D.e. >10 Inactivo
5 83 Calea prunifolia >10 Inactivo
6 B6 Calea prunifolia >10 Inactivo
7 B8 CaJea prunifolia >10 Inactivo
8 812 CaJea prunifolia >10 lnactivo
9 C3 Piper barbatum L. >10 Inactivo
10 e6 Piper barbatum L. 6,9 ACTIVO
11 e8 Piper barbatum L. >10 Inactivo
12 e 12 Piper barbatum L. >10 Inactivo
13 D3 Piper umbellatum L. >10 Inactivo
14 06 Pioer umbellatum L. 10,2 ACTIVO
15 D8 Piper umbellatum L. >10 Inactivo
16 D12 Piper umbellatum L. >10 Inactivo
17 E3 'Anoone muricata >10 Inactivo
18 E6 Annona muricata >10 Inactivo
19 E8 IAnnona muricata >10 Inactivo
20 E 12 IAnnona muricata 10,1 ACTIVO21 F3 Coffea arabica >10 Inactivo
22 F6 Coffea arabica >10 Inactivo23 F8 Coffea arabica >10 Inactivo
24 F12 Coffea arabica > 10 Inactivo
25 G3 Ceniiosoermum qrandiflorum >10 Inactivo
26 G6 Cardiospermum grandiflorum >10 Inactivo
27 G8 Cardiospermum grandiflorum >10 Inactivo
28 G 12 Cardiospermum grandifforum >10 Inactivo
29 H3 Tabebuia rosea >10 Inactivo
30 H6 Tabebuia rosea >10 Inactivo31 H8 Tabebuia rosea >10 Inactivo32 H 12 Tabebuia rosea >10 Inactivo
33 13 Chromolaena leivensis >10 Inactivo
34 16 Chromolaena leivensis >10 Inactivo
35 18 Chromolaena leivensis 5,4 ACTIVO1
36 112 Chromolaena leivensis >10 Inactivo
120
David Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 12
Área de QuimioterapiaExperimental-IIFB - UMSA
N° Código Especie IC 50 Actividad
IJglmJ
37 J3 Calea oeruviene >10 Inactivo
38 J6 Ca/ea peroviana 19 ACTIVO
39 J8 Ca/ea peruviene >10 Inactivo
40 J 12 Ca/ea peroviana >10 Inactivo
41 K3 Ha/enia asclepiadeae > 10 Inactivo42 K6 Halenia asclepiadeae >10 Inactivo
43 K8 Ha/enia asc/epiadeae >10 Inactivo
44 K 12 Ha/enia asclepiadeae > 10 Inactivo45 L3 Miconia buxifolia 15 ACTIVO46 L6 Miconia buxifolia >10 Inactivo47 L8 Miconia buxifolia >10 Inactivo
48 L12 Miconia buxifolia >10 Inactivo
49 M3 Miconia sp > 10 Inactivo50 M6 Miconia sp >10 Inactivo51 M8 Miconia st: >10 Inactivo
52 M 12 Miconia sp >10 Inactivo53 N3 Miconia sp 7,3 ACTIVO54 N6 Miconia sp >10 Inactivo55 N8 Miconia sp >10 Inactivo56 N 12 Miconia sp >10 Inactivo57 03 Lafoensia acuminata >10 Inactivo58 06 Lafoensia acuminata >10 Inactivo59 08 Lafoensia ccumineie >10 Inactivo60 012 Lafoensia acuminata >10 Inactivo61 CO-221 fr01 Piper barbatum H.S.K. 2,1 ACTIVO62 CO-243 h01 Bocconia integrifolia >10 Inactivo
Humb & H.Rob63 CO-243 fr01 Bocconia integrifolia 9 ACTIVO
Humb & H.Rob64 CO-244 h01 Piper barbatum H.S.K. >10 Inactivo65 CO-245 fl01 Critonia morifolia >10 Inactivo66 CO-245 fr01 Ca/ea peruviana >10 Inactivo
121
DavidGutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 12
Áreade Quimioterapia Experimental- IIFB- UMSA
N° Código Especie le 50 ActividadIJg/ml
67 CO-247 h01 Cinchan a pubescens Vahl > 10 Inactivo68 CO-248 h01 Paullinia densiflom J.E.Smith >10 Inactivo--39 CO-249 h01 Sida rhombifo!ia L. >10 Inactivo
40 CO-250 fl01 Lanata camara L. >10 Inactivo
122
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Cuadro 13: Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Argentina, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código Especie IC 50 ActividadIJg/ml
1 Pd(Pas)Ac Parietaria debilis (Ae) >10 Inactivo
2 Et(Pas)Hcx Ephedra tweediana (Hex) > 10 Inactivo
3 As(Pas)OCIM Argemone subfusiformis >10 Inactivo
4 Mp(pas)OCIM Mikania periplocifolia > 10 Inactivo
5 Et(Pas)OCIM Ephedra tweediana (EtOH) > 10 Inactivo
6 Pd(Pas)Hex Perieierio debilis (Hex) > 10 Inactivo
123
David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
Cuadro 14: Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Código IC 50 ActividadJ.lg/ml
1 MX-11 >10 Inactivo
2 MX-12 >10 Inactivo
3 MX-13 >10 Inactivo
4 MX-14 3,1 ACTIVO
5 MX-15 > 10 Inactivo
6 MX-16 >10 Inactivo
·7 MX-17 >10 Inactivo
8 MX-18 >10 Inactivo
9 MX-19 >10 Inactivo
10 MX-20 > 10 Inactivo
11 MX-21 >10 Inactivo
12 MX-22 >10 Inactivo
13 MX-23 >10 Inactivo
14 MX-24 >10 Inactivo
15 MX-25 >10 Inactivo
16 MX-26 2,2 ACTIVO17 MX-27 0,2 ACTIVO
18 MX-28 0,13 ACTIVO19 MX-29 >10 Inactivo
20 MX-30 >10 Inactivo21 MX-31 >10 Inactivo
22 MX-32 >10 Inactivo23 MX-33 > 10 Inactivo
24 MX-34 > 10 Inactivo
25 MX-35 >10 Inactivo
26 MX-36 >10 Inactivo27 MX-37 >10 Inactivo
28 MX-38 > 10 Inactivo
29 MX-39 >10 Inactivo30 MX-40 >10 Inactivo31 MX-41 > 10 Inactivo32 MX-42 >10 Inactivo33 MX-43 >10 Inactivo34 MX-44 >10 Inactivo
124
David Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 9
Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
N° Código IC SO Actividad
IJg/ml
35 MX-45 > 10 Inactivo
36 MX-46 >10 Inactivo
37 MX-47 > 10 Inactivo
38 MX-48 > 10 Inactivo
39 MX-49 > 10 Inactivo40 MX-50 > 10 Inactivo
41 MX-51 > 10 Inactivo42 MX-52 > 10 Inactivo
43 MX-53 > 10 Inactivo44 MX-54 > 10 Inactivo45 MX-55 > 10 Inactivo46 MX-56 > 10 Inactivo47 MX-57 > 10 Inactivo
48 MX-58 > 10 Inactivo
49 MX-59 > 10 Inactivo50 MX-60 > 10 Inactivo51 MX-61 > 10 Inactivo
52 MX-62 > 10 Inactivo53 MX-63 > 10 Inactivo54 MX-64 > 10 Inactivo55 MX-65 > 10 Inactivo56 MX-66 > 10 Inactivo57 MX-67 > 10 Inactivo58 MX-68 > 10 Inactivo59 MX-69 > 10 Inactivo60 MX-70 > 10 Inactivo61 MX-71 5,8 ACTIVO62 MX-72 > 10 Inactivo63 MX-73 >10 Inactivo64 MX-74 > 10 Inactivo65 MX-75 > 10 Inactivo66 MX-76 > 10 Inactivo67 MX-77 > 10 Inactivo68 MX-78 > 10 Inactivo
125
David Gutiérrez Yaou Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
Cuadro 15: Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de
Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32
N° Especie Órgano IC 50 Actividadempleado J..Ig/ml
1 Mavtenus macrocarpa Corteza >10 Inactivo
2 Crescienta culeie Holas 3,4 ACTIVO
3 Crescienta cuiete (CHCI3) Hojas >10 Inactivo
4 Aspidosperrna tiqkium Madera 1 ZI 4 ACTIVO
5 Pouteria caimito Hojas >10 Inactivo
6 I,Aspidosperrna tiokium Corteza 1 ZI 9 ACTIVO
7 Wing coci Planta entera >10 Inactivo
8 Annona Hojas > 10 Inactivo
9 Coly cophylum souemm Corteza >10 Inactivo
10 Crescienta cujete (EtOH) Hojas > 10 Inactivo
11 Spondies mombin L. Corteza > 10 Inactivo
12 [Aspidosperma riqidum Raíz 1 ZNI >10 Inactivo
13 Bixa orel/ana Hojas 3,9 ACTIVO
14 Asokiospetme excelsium Madera 1 ZI >10 Inactivo
15 [Aspidosperrna rioioum Madera 2 ZI >10 Inactivo
16 Aspidosperrna rigidum Raíz 2 ZNI >10 Inactivo17 Aspidosperma tiokiutn Madera 2 ZNI >10 Inactivo
18 Aspidosperrna excelsium Holas 1 ZI >10 Inactivo19 Aspidosperrna riaidum Madera 3 ZNI >10 Inactivo
20 Aspidosperrna rigidum Raíz 3 ZNI 10,1 ACTIVODo/icarpus denta tus (EtOH)
r21 Hojas >10 Inactivo
22 Psychotria ooeooiaiene (EtOH) Hojas >10 Inactivo23 Landerbemia magnifo/ia (EtOH) Hojas >10 Inactivo
24 Martine//a obovata (EtOH) Hojas >10 Inactivo
25 Remijia u/ei (EtOH) Hojas > 10 Inactivo
26 Remijia u/ei (CHC/3) Hojas > 10 Inactivo
27 Martinella obovata (CHC/3) Hojas 1 >10 Inactivo
28 Landerbergia magnifolia (CHC/3) Hojas > 10 Inactivo
29 Psvchottie ooepoiaieno (CHC/3) Hojas 1 > 10 Inactivo.-30 Psvcnotrie poeppigiana (CHC/3) Hojas 2 >10 Inactivo31 Dolicerpus dontatus (CHC/3) Hojas >10 Inactivo32 Remiiie u/ei (CHC/3) Hojas >10 Inactivo33 Martina//a obovata CHC/3) Hojas 2 >10 Inactivo34 Lenderberqie magnifolia (Hex) Hojas >10 Inactivo
126
DavidGutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 7
Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA
N° Especie Órgano IC 50 ActividadIJg/ml
35 Psychotria poeppigianaFlores 5,4 ACTIVO
36 Psvchottie poeppigian~ (Hex) Hojas > 10 Inactivo
37 Dolicertius dontatus (Hex) Hojas > 10 Inactivo38 Remiiie oeruviene (CHC/3) Hojas 1,4 ACTIVO
39 Remijia peroviana (EtOH) Hojas 0,08 ACTIVO
40 Remijia petuviens (Hex) Hojas 0,18 ACTIVO
127
David Gutíérrez Yapu
Cuadro 16: Evaluación de la actividad in vitro de fracciones de So/anum argentinum
procedentes de Bolivia, sobre cepas de P/asmodium fa/ciparum F32
N° Código IC 50 Actividad
IJQ/ml
1 F1 > 10 Inactivo
2 F2 > 10 Inactivo
3 F3 4,5 ACTIVO
4 F4 1,3 ACTIVO
5 F5 2,1 ACTIVO
6 F6 > 10 Inactivo
7 F7 > 10 Inactivo
8 F8 > 10 Inactivo
9 F9 > 10 Inactivo
10 F3-1 > 10 Inactivo
11 F3-2 > 10 Inactivo
12 F3-3 > 10 Inactivo
13 F3-4 Muestra insuficiente
14 F3-5 > 10 Inactivo
15 F3-6 Muestra insuficiente
16 F3-7 > 10 Inactivo17 F3-S Muestra insuficiente
18 F3-9 Muestra insuficiente19 F3-10 Muestra insuficiente
20 F4-1 Muestra insuficiente21 F4-2 Muestra insuficiente
22 F4-3 Muestra insuficiente23 F4-4 Muestra insuficiente
24 F4-5 Muestra insuficiente
25 F4-6 Muestra insuficiente
26 F4-7 Muestra insuficiente
27 F4-8 > 10 Inactivo
28 F4-9 > 10 Inactivo
29 F4-10 3,3 ACTIVO30 F4-11 >10 Inactivo31 F4-12 2,1 ACTIVO32 F4-13 Muestra insuficiente33 F4-14 > 10 Inactivo34 F5-1 > 10 Inactivo
128
David Gutiérrez Yapu
Continuación del Cuadro 9
Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA
N° Código IC 50 Actividad
~g/ml
35 F5-2 Muestra insuficiente
36 F5-3 Muestra insuficiente
37 F5-4 Muestra insuficiente
38 F5-5 > 10 Inactivo
39 F5-6 Muestra insuficiente40 F5-7 > 10 Inactivo
41 F5-8 > 10 Inactivo42 F5-9 > 10 Inactivo
43 F5-10 Muestra insuficiente44 F5-11 >10 Inactivo45 F5-12 > 10 Inactivo46 F5-13 > 10 Inactivo47 F5-14 >10 Inactivo
48 F5-15 >10 Inactivo
49 F5-16 > 10 Inactivo50 F5-17 3,2 ACTIVO51 F5-18 5,8 ACTIVO52 S.erqeniinum 0,42 ACTIVO
129
David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia ~xperimental- IIFB - UMSA
Cuadro 17: Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración de
esquizontes, obtenidos por los métodos visual y bioquímico
N° Extracto Concentración % Inhibición % Inhibiciónpg/ml Método visual Método LDH
1 BMII F17 0,1 O O2 BIVIII F17 1 O O3 BMII F17 10 81 904 BIVIII F16 0,1 O O5 BMII F16 1 O O6 BMII F16 10 O 127 BMII F15 0,1 O O8 BMII F15 1 O O9 BMII F15 10 O O10 BMI43 V2 0,1 O O11 BMI43 V2 1 O O12 BMI43 V2 10 11,6 4413 Remiiie peruviana 0,1 O O14 Remijia peruviana 1 O O15 Remijia peruviana 10 83 8316 Mx11 0,1 O O17 Mx 11 1 43 O18 Mx 11 10 83 9819 Mx 71 0,1 O O20 Mx 71 1 O O21 Mx 71 10 O O22 Cinchona officinalis 0,001 O O23 Cinchona officinalis 0,01 O O24 Cinchona officinalis 0,1 O O25 Cinchona officinalis 1 O 15,9926 Cinchona officinalis 10 79 67,227 Cinchona pubescens 0,01 O O28 Cinchona pubescens 0,1 O O29 Cinchona pubescens 1 51 O30 Cinchona pubescens 10 76 72,931 Cloroquina 10 nM 6 532 Cloroquina 100 nM 87 8033 Cloroquina 1000 nM 99 100
nn
David Gutiérrez Vapu Área de Quimioterapia Experimental- IIF8 - UMSA
Cuadro 18: Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración de
esquizontes, obtenidos por los métodos visual, bioquimico y f1uorométrico
N° Extracto Concentración % Inhibición % Inhibición % Inhibición
1l9!ml Método visual Método LDH Mét.Flurométrico
1 Mx71 0,1 O O O2 Mx 71 1 O O O3 Mx71 10 O O O4 BMII F16 0,1 O O O5 BMII F16 1 O O O6 BMII F16 10 O 12 O7 Cinchona pubescens 0,01 O O O8 Cinchona pubescens 0,1 O O 0,59 Cinchona pubescens 1 51 O 16,2410 Cinchona pubescens 10 76 72,9 62,9411 Cinchona officinalis 0,001 O O O12 Cinchona officinalis 0,01 O O O13 Cinchona officinalis 0,1 O O 5,0214 Cinchona officinalis 1 O 15,99 12,0115 Cinchona officinalis 10 79 67,2 59,6816 Cloroquina 0,01 nM O O 2717 Cloroquina 0,1 nM O O 3618 Cloroquina 1 nM O O 4419 Cloroquina 10 nM 6 5 4820 Cloroquina 100 nM 87 80 . 7021 Cloroquina 1000 nM 99 100 86
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