universidad nacional agraria de la selva · 2017. 3. 22. · facultad de recursos naturales...
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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES
PRÁCTICA PRE PROFESIONAL
PARAMETROS FISICOQUÍMICOS DE EFLUENTES MINEROS PARA EL
DESARROLLO DE CONSORCIOS BACTERIANOS EN BIORREACTORES AIR
LIF CON SOPORTES DE LECHOS DE PVC
EJECUTOR : BECERRA BRAVO, Natalia
ASESOR : Ing. Dr. ORE CIERTO, Luis Eduardo
LUGAR DE EJECUCION : LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE
LA SELVA
FECHA DE INICIO : 13 de enero
FECHA DE CULMINACIÓN : 13 de abril
TINGO MARÍA - PERÚ
2014
ÍNDICE
Contenido Página
I. INTRODUCCIÓN......................................................................…… 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA…….................................................... 4
2.1. Biorreactores…………………..………..………………………... 4
2.1.1. Tipos de biorreactores................................................... 5
2.1.2. Birreactor tipo Airlift…………………..…………………... 6
2.2. Biopelículas……………………………………………………….. 9
2.3. PVC flexible.………….…………………………......................... 12
2.3.1. Catéteres de PVC flexible y biopelículas………………. 13
2.4. Biología de los consorcios microbianos: naturaleza y
principios…………………………………………………..………
13
2.5. Aguas ácidas de minas…………………………………………. 14
2.5.1. Factores de generación del drenaje Ácido de minas…. 15
2.5.2. Efectos de la acidez en el agua…………………………. 17
2.5.3. Bacterias a partir del drenaje ácido de minas…………. 17
2.6. Legislación ambiental para efluentes mineros………………... 18
2.6.1.Límite Máximo Permisible para la descarga de
efluentes…………………………………………….…...
18
2.7. Indicadores fisicoquímicos……………………………………… 19
2.7.1.Oxígeno Disuelto………………………………………….. 19
2.7.2. pH………………………………………………………….. 20
2.7.3. Demanda Bioquímica de Oxigeno……………………… 21
2.7.4. Temperatura………………………………………………. 22
2.8. Bacterias del género Thiobacillus……………………………….. 23
III. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................ 25
3.1. Ubicación………………………................................................ 25
3.1.1. Ubicación política………………………………….….….. 25
3.1.2. Aspectos ambientales................................................... 25
3.2. Unidades en estudio................................................................. 26
3.3. Materiales y equipos…………………....................................... 27
3.4. Metodología………………….................................................... 27
3.4.1. Toma de muestra para la evaluación………………...... 27
3.4.2. Enumeración y aislamiento de bacterias...................... 28
3.4.3. Conservación de cepas bacterianas…….……………... 28
3.4.4. Preparación de los biorreactores de lecho circulante
airlift……………….……………………………….……....
29
3.4.5. Preparación del medio de cultivo……………………..… 30
3.4.6. Adecuación del pH en el sistema…………………..…… 30
3.4.7. Etapas de la operación de corrección de pH…............. 30
3.4.8. Datos a evaluar……………………………..…….........… 31
IV. RESULTADOS………………........................................................... 36
4.1. Aislamiento y curva de crecimiento de bacterias acidófilas..... 36
4.2. Evaluación de los parámetros fisicoquímicos………………..… 39
4.2.1. Datos de la primera evaluación en lechos de 1.5 cm…. 39
4.2.2. Datos de la segunda evaluación en lechos de 3 cm…. 46
4.3. Identificación de microorganismos por tinción Gram……….…. 53
4.4. Biomasa en lecho de cada tratamiento……………………….... 54
V. DISCUCIÓN…………………………………………………..………… 55
VI. CONCLUSIONES............................................................................. 58
VII. RECOMENDACIONES.................................................................... 59
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................. 60
IX. ANEXOS........................................................................................... 64
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1. Efectos de la acidez sobre los peces………………………………... 17
2. Límites Máximos permisibles para la descarga de efluentes
Líquidos de Actividades Minero - Metalúrgicas……………………..
19
3. Punto seleccionado para la colecta de efluente minero…………… 26
4. Resultados de la siembra, por dilución y por horas para el
recuento (cél/mL) para la determinación la curva de crecimiento
de bacterias acidófilas………………………………………………….
37
5. Promedio de la temperatura en cada tratamiento por día………... 39
6. Promedio del oxígeno disuelto de cada tratamiento por día en la
primera evaluación…………..………………………………….……...
40
7. Promedio del pH de cada tratamiento por día………………….… 41
8. Promedio de los parámetros evaluados de los diez días de la
primera evaluación en los lechos de espesor de 1.5 cm de cada
tratamiento por cada repetición……………………………………..
42
9. Promedio de los parámetros evaluados de la primera evaluación
por tratamiento en los lechos de espesor de 1.5 cm………….……
42
10. Promedio de la temperatura en cada tratamiento por
día………………………………………………….………...………......
46
11. Promedio del oxígeno disuelto de cada tratamiento por día en la
segunda evaluación………………………………………………...….
47
12. Promedio del pH de cada tratamiento por día…………………….... 48
13. Promedio de los parámetros evaluados de los diez días de la
segunda evaluación en lechos de espesor de 3 cm de cada
tratamiento por cada repetición…………………………………….....
49
14. Promedio de los parámetros evaluados de la segunda evaluación
por tratamiento en los lechos de espesor de 3 cm………………….
49
15. Datos de la primera evaluación con lechos de espesor 1.5 cm en
los diez días……………………………………………………………..
73
16. Datos de la segunda evaluación con lechos de espesor 3 cm en
diez días………………………………………………………………….
75
17. Peso de la biomasa adherida a los lechos de 1.5 cm de espesor
de cada tratamiento…………………………………………………….
77
18. Peso de la biomasa adherida a los lechos de 3 cm de espesor de
cada tratamiento………………………………………………………...
77
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1. Configuración de diferentes contactores….…………………….... 9
2. Esquema del crecimiento de las bacterias acidófilas…………… 38
3. Variación de la temperatura en los días de la primera
evaluación evaluación……………………………………………….
39
4. Variación del OD de cada tratamiento en los días de
evaluación…………………………………………………………….
40
5. Variación del pH de cada tratamiento en los días de la primera
evaluación…………………………………………………………….
41
6. Variación de la biomasa, temperatura interna y temperatura
ambiental en cada tratamiento…………………………...………...
43
7. Variación de la biomasa en relación al oxígeno disuelto por
tratamiento……………………………………………………………
43
8. Variación de la biomasa en relación al pH por tratamiento…….. 44
9. Variación de la biomasa en relación al DBO5 por tratamiento.... 44
10. Variación de los parámetros evaluados por tratamiento……….. 45
11. Variación de la DBO5 con respecto a la biomasa producida por
tratamiento………………………..………………………………………………
45
12. Variación de la temperatura en los días de la segunda
evaluación…………………………………………………………....
46
13. Variación del OD de cada tratamiento en los diez días………… 47
14. Variación del pH de cada tratamiento en los días de la segunda
evaluación…………………………………………………………….
48
15. Variación de la biomasa, temperatura interna y temperatura
ambiental por tratamiento…………………………………………..
50
16. Variación de la biomasa en relación al oxígeno disuelto por
tratamiento…………………………………………………………....
50
17. Variación de la biomasa en relación al pH por tratamiento…….. 51
18. Variación de la biomasa en relación al DBO5 por tratamiento… 51
19. Variación de los parámetros evaluados en los tres tratamientos 52
20. Variación de la DBO5 con respecto a la biomasa producida en
los tres tratamientos……………………………….………………...
52
21. Coloración de tinción gram…………………………………………. 53
22. Comportamiento de la biomasa en la primera
evaluación………………………………………………….…………
54
23. Comportamiento de la biomasa en la segunda
evaluación………………………..…………………………………..
54
24. Esquema del funcionamiento del biorreactor………………….… 65
25. Mapa de ubicación de colecta microbiológica de efluentes
líquidos mineros……………………………………………………...
66
26. Toma de muestras de agua residual minera…………………….. 67
27. Preparación de los biorreactores de lecho circulante airlift…….. 67
28. Funcionamiento de los biorreactores de lecho circulante airlift... 68
29. Biorreactores en funcionamiento………………………………..… 68
30. Formación de la biopelícula……………………………………….. 69
31. Determinación del pH y la temperatura…………………………… 69
32. Enumeración, selección y aislamiento de bacterias…………..… 70
33. Recuento de microorganismos para realizar el crecimiento
cinético………………………………………………………..………
70
34. Observación en el microscopio óptico………………..…………... 71
35. Muestras para realizar el DBO5…………………………………… 71
36. Determinación del DBO5…………………………………………… 72
1
I. INTRODUCCIÓN
Los factores fisicoquímicos son importantes en el desarrollo de los
microorganismos pues condicionan la adaptabilidad de estos sobre los sustratos
que encuentran para degradar y desarrollarse eficientemente.
La cantidad mínima de sustratos alimenticios no asegura por si sola la
asimilación y posterior utilización para la producción de masa celular, si es que no
se considera factores intrínsecos del crecimiento del desarrollo celular entre ellos
el diferencial del potencial de óxido de reducción (Eh), el oxígeno disuelto,
disponible concentración de hidrógenos para utilizar en la generación de energía
una adecuada producción de biomasa y generación de residuos orgánicos en una
temperatura que asegure la continuación de los procesos bioquímicos celulares.
Es importante determinar las condiciones fisicoquímicas de las
bacterias que les posibiliten desarrollar en aguas de efluentes mineros, ya que en
la actualidad no se conocen las óptimas, formando agregados o consorcios que a
su vez facilitarían su crecimiento en biopelículas que expresen propiedades de
biodegradación sobre compuestos tóxicos residuales presentes en dichos
efluentes.
2
Los efluentes mineros mantienen condiciones adversas para el
desarrollo de muchos microorganismos por la presencia de factores extremos para
estos no obstante un cierto número de bacterias pueden adaptarse a condiciones
que se presentan en las aguas residuales de minería y tratar de adaptarse a
diferentes concentraciones de sustratos que pueden degradar no obstante de ser
originalmente tóxicos para ello.
Objetivo general
- Determinar los parámetros fisicoquímicos que inducen el desarrollo en
consorcios de aislados bacterianos, a partir de efluentes mineros extraídos del
Bofedal Bethania (Huancavelica), en biorreactores tipo air lift de lecho escurrido
con soportes de policloruro de vinilo (PVC).
Objetivos específicos
- Establecer las condiciones del desarrollo en consorcio de bacterias aisladas del
Bofedal Bethania en biorreactores de lecho escurrido tipo air lift con soportes de
lechos de PVC.
- Identificar preliminarmente los microorganismos presentes en el consorcio
bacteriano desarrollado a partir del Bofedal Bethania en biorreactores de lecho
escurrido tipo air lift con soportes de lechos de PVC.
3
- Determinar la biomasa fija de los lechos por cada tratamiento presentes en el
consorcio bacteriano desarrollado a partir del Bofedal Bethania en biorreactores
de lecho escurrido tipo air lift con soportes de lechos de PVC.
4
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Biorreactores
Según CHISTI Y MOO-YOUNG., (2002), un biorreactor es cualquier
dispositivo empleado para que se lleven a cabo una o más reacciones
bioquímicas para convertir cualquier material inicial (sustrato) en productos. La
conversión ocurre a través dela acción de un biocatalizador como las enzimas,
microorganismos, células de animales y plantas, o estructuras sub celulares
como cloroplastos y mitocondrias (SANDOVAL, 2006).
El sustrato inicial puede ser un compuesto orgánico simple, un
compuesto inorgánico o materiales complejos. Los productos de conversión
pueden ser células (biomasa) y compuestos químicos de diversas clases. El
proceso que ocurre en un biorreactor puede ser resumido como (SANDOVAL,
2006).
→
Los biorreactores son utilizados en toda clase de procesos,
incluyendo aquellos relacionados con la preparación de alimentos, para el
tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales, en la fabricación de
vacunas y antibióticos, etc (SANDOVAL, 2006).
5
Existen diferentes tipos de biorreactores, entre los que se puede
mencionar a los que utilizan agitación mecánica (Reactores Agitados
Mecánicamente o RAM); algunos que aprovechan el aire suministrado con
fines de mezclado (reactores con agitación neumática) como son las columnas
de burbujeo o los reactores airlift; los que utilizan el bombeo de parte del mismo
medio para el mezclado (biorreactores de chorro) y otros que se utilizan para el
cultivo de células o enzimas inmovilizadas, como los reactores de lecho fijo,
lecho fluidizado y los de membrana. De todos éstos los más comunes son los
RAM, las columnas de burbujeo y los reactores airlift (SANDOVAL, 2006).
Los biorreactores no convencionales son actualmente el objeto de
estudio en muchos laboratorios de ingeniería bioquímica; el éxito de un proceso
de fermentación industrial depende altamente del desempeño del reactor
(LOPEZ, 2006).
2.1.1. Tipos de biorreactores
2.1.1.1. Tanque agitado
Reactor con agitación mecánica interna y entrada del gas en el
fondo por medio de una flauta u otro tipo de dispersor. En éste grupo se
incluye el tradicional tanque agitado –STR (LOPEZ, 2006).
2.1.1.2. Columna de burbujeo
Es el equipo de contacto gas-líquido más sencillo que podemos,
consiste en un tubo largo con una boquilla de entrada del gas en el fondo,
6
pueden contener platos perforados para la redistribución de la fase gaseosa
(LOPEZ, 2006).
2.1.1.3. Reactores de corrientes
En este tipo encontramos todos aquellos que poseen lazos internos
de recirculación (LOPEZ, 2006).
2.1.1.4. Reactores de corrientes con impulsor
Son aquellos en que el movimiento se produce por el uso de un
impulsor que genera un lazo interno de recirculación (LOPEZ, 2006).
2.1.1.5. Reactores Air lift
En esta categoría se incluyen las columnas de burbujeo que
poseen recirculación, la cual es producida por el movimiento fluido de las fase
gaseosa dispersa. Los reactores Air lift están agitados neumáticamente y la
circulación tiene lugar en un modelo cíclico definido a través de un conducto
que divide el reactor en dos zonas: una de flujo ascendente y una de flujo
descendente. La zona de difusión de gas del aro, tiene mayor retención de gas
que la zona relativamente libre de gas, dónde el flujo es descendente (LOPEZ,
2006).
2.1.2. Biorreactor tipo Air lift.
Un sistema de tratamiento biológico tipo Airlift, consiste
básicamente en una columna en cuyo interior se encuentra una fase liquida
7
móvil que contiene al lecho filtrante en suspensión y una fase continua de
reacción de gas o líquido.
Para BLENKLE et al., (2002), un reactor de biopelicula de lecho
circulante típico tiene dos fases: una fase sólida y una fase liquida que crean el
movimiento de los sólidos dentro del biorreactor. Pueden estar presente
también una fase gaseosa la cual proporciona el sustrato gaseoso y/o generar
el movimiento de la biopelicula. Los contaminantes a ser degradados por la
biopelicula deben estar presentes en la fase liquida.
Según ZUBER et al., (1997), los biorreactores del tipo Airlift son
extensamente utilizados para el tratamiento de agua; sin embargo, su
aplicación al tratamiento de gases ha sido escasamente desarrollada.
Originalmente los biorreactores Airlift se desarrollaron para el pos tratamiento
de aguas industriales tratadas anaeróbicamente, existiendo instalaciones a
nivel industrial en funcionamiento (HEIJNEN. et al., 2001).
Los biofiltros han sido utilizado extensamente en el pasado para
tratar gases contaminantes, sin embargo en la actualidad los reactores Airlift
han sido recientemente estudiados y utilizados para la eliminación de
hidrocarburos volátiles, de los solventes y de otros contaminantes orgánicos,
tales como el benceno, xileno y etilbenceno). A pesar de que los biofiltros han
ganado la aceptación pública como sistema de tratamiento, presentan ciertas
desventajas a largo plazo, las que repercuten en la eficiencia de eliminación de
estos sistemas (EDWARDS. et al., 2002).
8
El desempeño del bioreactor Airlift, depende del tipo de
contaminante tratado y sus concentraciones, así como también de los criterios
de diseño. Cuando se encuentran los criterios óptimos de diseño y operación,
las bacterias con capacidad de formar biopelícula se adsorberán sobre el lecho
lecho de soporte y permitirán posteriormente la corrección del pH (LOPEZ,
2006).
El biorreactor Airlift, así como la columna de burbujeo, son
reactores sin agitación mecánica, en los que la aireación y la mezcla se
realizan mediante la inyección de gas, estos sistemas son de difícil escalado.
Como alternativa se puede considerar el uso de microburbujeadores, que
aunque involucran un costo de capital relevante, la inversión se puede
recuperar en el escalado de la producción por los bajos costos de operación.
Una gran cantidad de procesos químicos o bioquímicos en
ingeniería se basan en reacciones que ocurren entre moléculas que se
encuentran separadas por una fase gaseosa y una líquida. Los dispositivos
utilizados para cumplir con la operación, recibe el nombre de aireadores,
contactores gas líquido, absorbedores, etc.
La propiedad más importante de estos equipos es la de mejorar el
contacto gas-líquido para que la reacción pueda ser llevada a cabo.
Estos equipos se dividen en dos según la forma en que ocurre la
transferencia a la fase líquida: contactores de superficie y contactores de
volumen, (o aireadores de superficie y volumen respectivamente). Y según su
eficacia en la aireación:
9
Figura 1. Configuración de diferentes contactores.
2.2. Biopelículas
El término biopelícula (biofilm) hace referencia a una serie de
microorganismos que se encuentran agregados en un exopolímero compuesto
de glicocálix (75%) y que se organizan en forma de colonias adheridas a
diferentes superficies, ya sean blandas, animadas e inanimadas. El
exopolisacárido (EPS) que es producido por los mismos microorganismos,
forma una matriz adherente en donde estos quedan atrapados y comienzan a
organizarse en colonias con diferentes requerimientos metabólicos.
Una de sus características es la heterogeneidad, lo que las hace
organizaciones únicas que pueden estar conformados por bacterias, hongos y
protozoos. Se ha visto entonces, que los microorganismos al ser variados
dentro de esta organización presentan diferentes microambientes de pH,
10
tensión de oxígeno, concentración de iones, carbono y nitrógeno; la
hidrodinámica juega un papel importante en el desarrollo pues estas
organizaciones se desarrollan en interface líquido-sólido donde la velocidad del
flujo que lo atraviesa influye en el desprendimiento físico de los
microorganismos. Además poseen un sistema de canales que les permite el
transporte de nutrientes y desechos. Otra característica de las biopeliculas es
su resistencia a las defensas del hospedero y agentes antimicrobianos.
Mientras que los microorganismos aislados son susceptibles a estos factores
de control, las colonias organizadas e incluidas en el exopolímero forman una
capa impermeable en donde sólo los microorganismos más superficiales se
ven afectados (BETANCOUR et al, 2004).
Las biopelículas pueden estar formadas de una población
población que se desarrolla a partir de especies únicas o una comunidad de
múltiples especies microbianas (MCLEOD et al., 1990). Sin embargo, la
coexistencia de diferentes microorganismos en una biopelícula otorga
beneficios tales como asociaciones sintróficas estables que se caracterizan por
ser procesos metabólicos en los que dos o más microorganismos cooperan
para llevar a cabo un proceso que un solo microorganismo no podría realizar.
No obstante, debido a la variedad de microorganismos presentes en la
biopelícula también puede existir competencia por un mismo sustrato en
presencia de un aceptor de electrones específico (THAUER et al., 2007).
El desarrollo de una biopelícula es el resultado de diferentes
fenómenos tales como la adhesión de los microorganismos a la superficie
11
sólida, adsorción y desorción de microorganismos, así como crecimiento y
desprendimiento de la biopelícula. Dentro de la biopelicula los contaminantes
gaseosos llegan a la biopelícula por un mecanismo de la transferencia de masa
entre la fase líquida y vapor, por lo que los gases deben ser fácilmente solubles
en la biopelícula para que así estén disponibles para los microorganismos ya
que la degradación de los mismos ocurre en la fase líquida o de biopelícula. No
solamente los contaminantes difunden en la biopelícula, sino también lo hace el
oxígeno, dióxido de carbono y otros posibles compuestos bajo la influencia de
gradientes de concentración (CRESSON et al., 2006).
En la célula, la hidrofobicidad de superficie depende de la
presencia de fimbrias y flagelos y la producción de exopolisacárido (EPS).estos
tres factores influyen en la velocidad y el grado de unión de las células
microbianas a un determinado lecho de asentamiento. La mayoría de las
bacterias tienen carga negativa en la superficie de su pared y membrana, que
es compatible con sectores moleculares conformados por sustancias
hidrófobas. Las fimbrias, (apéndice no flagelares diferentes a los pili, implicados
en la transferencia de ácidos nucleicos virales o bacterianas), contribuyen a la
hidrofobicidad de la superficie celular, dado su alto contenido en residuos de
aminoácidos hidrofóbicos (LOPEZ et al, 2006).
Ciertamente, la superficie sólida sobre la que se desarrolla la
biopelícula, también presenta características que condicionan el proceso de
adhesión. CHARACKLIS et al. (1990) que el grado de colonización microbiana
parece aumentar a medida que aumenta la rugosidad superficial. En general, la
12
adherencia se produce más fácilmente sobre superficies ásperas, más
hidrofóbicas, una vez se ha recubierto la superficie por una película de
acondicionamiento. Esto se debe a que las fueras de corte se reducen, y la
superficie es mayor en superficies más ásperas.las propiedades físico-químicas
de la superficie también ejercen una fuerte influencia en el índice y grado de
vinculación.
De forma general se ha contrastado, que los microorganismos se
adhieren más rápidamente a superficies hidrofóbicas no polares, tales como el
teflón y otros plásticos, así como también se adhieren a materiales hidrofílicos,
como vidrio o metales (THAUER et al., 2007).
2.3. PVC flexible
El Policloruro de Vinilo o PVC, es una combinación química entre
carbono, hidrógeno y cloro. Es un material termoplástico, es decir, que bajo la
acción del calor se reblandece, y puede así moldearse fácilmente; al enfriarse
recupera la consistencia inicial y conserva la nueva forma. Presenta un peso
molecular variable entre 0.650 a 1.348, así como una densidad entre 1.36 y
1.40 g/cm3, presenta una temperatura de procesamiento de resina baja por
tanto es procesada más fácilmente, las propiedades físicas en el producto
terminado, tales como la tensión y la resistencia al rasgado, son pobres; en
cambio el brillo y la capacidad de aceptar más cargas son mejores y la
fragilidad a baja temperatura es menor entre -35°C a 60° C. El PVC flexible es
empleado en la fabricación de zapatos, tenis, sandalias, suelas, películas para
13
forro de carpetas cortinas para baño, cintas adhesivas, pañales, envolturas,
empaques para alimentos, recubrimientos de piso, materiales médicos, etc
(VAN HAANDEL y LETTINGA, 1998).
2.3.1. Catéteres de PVC flexible y biopelículas.
Las mangueras de los catéteres son elaborados con PVC flexible
de grado médico y esterilizados con rayos gamma (PISA, 2011). La pared
externa sirve de lecho físico para una proliferación bacteriana que se organiza
en capas de biopelícula. Las bacterias se mantienen adheridas mediante
elementos específicos como las fimbrias y también mediante mecanismos
inespecíficos como la producción de glicocálix y películas biológicas. En éstas
últimas, las bacterias están protegidas del arrastre de los fluidos orgánicos y
posiblemente de la acción antibiótica, por tanto los catéteres de PVC parecen
tener el mayor índice de adherencia de microorganismos en comparación con
los de teflón MR, silicona o poliuretano (VAN HAANDEL y LETTINGA, 1998).
La formación de biopelículas en lechos sintéticos, el PVC muestra
una inferioridad en la ganancia de biomasa frente a la fibra de nylon, vidrio,
acero y poliamida (THAUER et al., 2007).
2.4. Biología de los consorcios microbianos: naturaleza y principios
La microbiología, como ciencia biológica básica, ha suministrado
algunas de las herramientas de investigación más versátiles para determinar la
naturaleza de los procesos característicos de la vida en sus diversas
14
formas.Entre otros aspectos, esta ciencia se ocupa de cómo el conocimiento de
los microorganismos, un extenso y variado grupo de organismos
microscópicos, puede ayudar a comprender mejor la biología de los
organismos superiores, incluido el hombre. A diferencia de las células de
animales y plantas, las células microbianas pueden vivir aisladas en la
naturaleza. Una célula microbiana aislada es, en general, capaz de llevar a
cabo sus procesos vitales de crecimiento, generación de energía y
reproducción, independientemente de otras células de la misma o de diferente
especie. Sin embargo, en la naturaleza, las células microbianas rara vez viven
solas; su estrategia de supervivencia es la agrupación. Un Consorcio
microbiano es una asociación natural de dos o más poblaciones microbianas,
de diferentes especies, que actúan conjuntamente como una comunidad en un
sistema complejo, donde todos se benefician de las actividades de los demás.
La asociación refleja estilos de vida sinérgicos o sintróficos (que significa
"comiendo juntos") en el que el crecimiento y el flujo cíclico de nutrientes se
conduce más efectiva y eficientemente que en poblaciones individuales
(LÓPEZ et al, 2007).
2.5. Aguas ácidas de minas
Las Aguas acidas de mina o Drenaje ácido de mina es el agua
contaminada originada de la explotación minera, ya sea superficial o profunda,
típicamente de alta acidez, rica en sulfato y con niveles elevados de metales
pesados, principalmente hierro, manganeso y aluminio. Debido a la alta
15
cantidad de hierro oxidado, el drenaje ácido de la mina es a menudo rojizo
coloreado.
En términos generales, el DAM se caracteriza por:
- Valores de pH que oscilan de 1,5 a 7.
- Niveles de alcalinidad decreciente y de acidez creciente.
- Concentraciones elevadas de sulfatos y metales disueltos totales.
- Concentraciones elevadas de sólidos disueltos totales: alta conductividad
específica.
(SALAZAR et al, 2000)
Las concentraciones medidas del drenaje de la mina de carbón se
extienden a partir del 50 a 300 mgFe/L, 20 a 30 mgMn/L, 20 a 2000 mg SO4 2-
/L, y 3,0 a 5,5 unidades estándares del pH.
2.5.1. Factores de generación del Drenaje Ácido de Minas
Diversas investigaciones han establecido una serie de factores
importantes para la generación del DAM, entre los que se destacan los
siguientes factores:
- La configuración geológica, principalmente, en lo referente a vetas.
- La variada mineralogía con potencial para contribuir con diferentes
contaminantes en el tiempo, y en diferentes lugares.
- La asociación del mineral con la pirita como el principal mineral sulfurado.
- El pH.
- La temperatura.
16
- El contenido de oxígeno en la fase acuosa que ayuda a la oxidación y que
va asociado al porcentaje de saturación de oxígeno en el agua.
- La actividad química de los sulfuros de Fe.
- El área superficial expuesta de los sulfuros.
- La energía de activación requerida para iniciar la generación de la acidez.
- La actividad bacteriana.
En el ambiente geológico se presentan diversos minerales del
grupo de los sulfuros (Pirita, Marcasita, Pirrotina, Galena, Esfalerita, Calcosita,
etc.); de ellos, los más comunes son los sulfuros de hierro (Pirita, Marcasita,
Pirrotina), que son los más susceptibles de formar el DAM; sin embargo, todos
los sulfuros, de una u otra forma, tienen el potencial de generación de este tipo
de agua contaminante (SALAZAR et al, 2000).
La alta acidez de DAM es causada a menudo por la oxidación de la
pirita, la forma cristalina del sulfuro del hierro (FeS2). Como resultado de esa
oxidación, el ácido sulfúrico se genera dando condiciones ácidas a los
efluentes de la mina. La pirita es comúnmente asociada tanto con las
situaciones de minas de carbón como las minas de metal, pero el drenaje ácido
de minas de metal presenta un problema más severo que la mayoría de
drenajes de mina de carbón porque los agentes prioritarios de contaminación
tal como AS, Cd, Pb, Hg, Cu y Zn pueden estar presentes en peligrosas
concentraciones (GAMONAL, 2010).
17
2.5.2. Efectos de la acidez en el agua
La acidez, con el descenso del pH del agua, tiene las siguientes
consecuencias principales:
- El agua se hace fuertemente corrosiva.
- La solubilidad de muchos metales pesados aumenta, con lo que las aguas
llegan a ser tóxicas el ecosistema fluvial se degrada, hasta ser incapaz de
mantener muchas formas de vida acuática, y los sistemas acuíferos se
contaminan (BAQUERO et al, 2008).
Cuadro 1. Efectos de la acidez sobre los peces.
pH Efecto
<4.0 Muerte directa
4.0–5.0 Efecto subletal que incluye perdida de sales, daños branquiales,
reducción en la puesta, crecimientos pobres, menor resistencia a
enfermedades.
5.0 – 6.0 Pobre productividad en sistemas extensivos.
9.0 – 10.0 Subletal
10.0 – 11.0 Letal subletal según la especie. Daños en branquias y ojos.
>11 Letal salvo si existen elevadas concentraciones de oxígeno disuelto.
Fuente: Buxadé 1997.
2.5.3. Bacterias a partir del drenaje ácido de minas.
Entre los microorganismos que son responsables de la disolución
de metales a partir de los minerales se encuentran los géneros Thiobacillus,
Leptospirillum, Sulfolobus, Sulfobacillus y Acidianus. Ellos son capaces de
soportar condiciones extremas de pH y temperatura, y presentan unos
requerimientos de nutrientes específicos.
18
Según SEGURA (1998), los drenajes ácidos de mina (DAM)
caracterizados por acidez extrema pH (2.5-4.0) y altas concentraciones de
metales pesados, contienen poblaciones nativas de bacterias oxidantes,
responsables de la oxidación progresiva de los sulfuros. Dentro de los
microorganismos encontrados en los ambientes ácidos y dentro de la familia de
los procariotas se ha identificado las bacterias del género de Thiobacillus,
Leptospirillum y ácidophilium, capaces de contribuir en la degradación de
sulfuros metálicos (ARIAS et al, 2013).
2.6. Legislación ambiental para efluentes mineros
2.6.1. Límite Máximo Permisible para la descarga de Efluentes
2.6.1.1. Líquidos de Actividades Minero Metalúrgicas
Medida de la concentración o del grado de elementos, sustancias o
parámetros físicos, químicos o biológicos, que caracterizan al efluente líquido
de actividades minero-metalúrgicas, y que al ser excedida causa o puede
causar daños a la salud, al bienestar humano y al ambiente. Su cumplimiento
es exigible legalmente por el Ministerio del Ambiente y los organismos que
conforman el sistema de gestión ambiental.
El límite en cualquier comento es el valor del parámetro que no
debe ser excedido en ningún momento. Para la aplicación de sanciones por
incumplimiento del límite en cualquier momento, éste deberá ser verificado por
el fiscalizador o la Autoridad Competente mediante un monitoreo realizado de
19
conformidad con el Protocolo de Monitoreo de Aguas y Efluentes (EL
PERUANO, 2010).
Cuadro 2. Límites Máximos Permisibles para la descarga de efluentes
Líquidos de Actividades Minero – Metalúrgicas.
Parámetro Unidad
Límite en
cualquier
momento
Límite para el
Promedio Anual
pH 6 – 9 6 – 9
Sólidos totales en
suspensión mg/L 50 25
Aceites y grasas mg/L 20 16
Cianuro total mg/L 1 0.8
Arsénico Total mg/L 0.1 0.08
Cadmio Total mg/L 0.05 0.04
Cromo Hexavalente mg/L 0.1 0.08
Cobre total mg/L 0.5 0.4
Hierro (Disuelto) mg/L 2 1.6
Plomo total mg/L 0.2 0.16
Mercurio Total mg/L 0.002 0.0016
Zinc Total mg/L 1.5 1.2
Fuente: DECRETO SUPREMO 010-2010-MINAM. PERUANO, 2010.
2.7. Indicadores fisicoquímicos
2.7.1. Oxígeno Disuelto.
El oxígeno disuelto es dependiente de la temperatura. Aguas más
cálidas son capaces de disolver menores cantidades de oxígeno. Por esto, una
descarga de agua caliente puede significar la disminución del OD a niveles por
debajo del límite necesario para algunas formas de vida. El OD se puede
20
expresar en miligramos por litro (mg/L) o en porcentaje de saturación (%). La
primera de las opciones expresa directamente la masa de oxígeno por litro de
agua, mientras la segunda se expresa como el porcentaje de la concentración
de saturación para determinada temperatura (GOYENOLA, 2007).
2.7.2. pH
Nos indica el comportamiento acido básico del agua. Es una
propiedad de carácter químico de vital importancia para el desarrollo de la vida
acuática. Es un buen parámetro de carácter general para determinar la calidad
de un agua. Habitualmente las aguas naturales tiene un cierto carácter básico
con unos valores de pH correspondidos entre 6,5 a 8,5 (ROMERO, 1998).
Según DIGESA (2007), el pH es uno de los parámetros indicadores
de la calidad del agua. Para que la desinfección con cloro sea eficaz es
preferible que sea un pH inferior a 8, es recomendable la medición in situ, de
modo que no se modifique los equilibrios iónicos. Debido al trasporte o una
permanencia prolongada en recipientes cambia cuando es llevado al
laboratorio. Según la EPA los valores recomendados son de 6.5 a 8.5 unidades
de pH. Según la OMS el pH recomendable de 6.5 y 9.5.
Según BARRENECHEA (2004), el pH del agua es de suma
importancia para la vida de los microorganismos acuáticos, ya que valores muy
altos o muy bajos ofrecen a los microorganismos un medio adverso, con
excepción de los quistes de amebas, que soportan pH tan altos como 13 ó tan
bajos como 1. Por otra parte, la acción de los desinfectantes es fuertemente
21
influenciada por el pH del agua. De acuerdo con su naturaleza, cada
desinfectante tiene un rango de pH de mayor efectividad. Sin embargo, la
práctica demuestra que cuanto más alcalina es el agua requiere mayor dosis
de desinfectante para una misma temperatura y tiempo de contacto.
2.7.3. Demanda Bioquímica de Oxigeno
La Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) mide la cantidad de
oxígeno necesaria o consumida para la descomposición microbiológica
(oxidación) de la materia orgánica en el agua, se define como la cantidad total
de oxígeno requerido por los microorganismos para oxidar la materia orgánica
biodegradable (CAN, 2005).
La DBO es un indicador importante para el control de la
contaminación de las corrientes donde la carga orgánica se debe restringir para
mantener los niveles deseados de oxígeno disuelto. El aporte de carga
orgánica acelera la proliferación de bacterias que agotan el oxígeno,
provocando que algunas especies de peces y otras especies acuáticas
deseables ya no puedan vivir en las aguas donde están presentes dichos
microorganismos (CAN, 2005).
Según DIGESA (2007), la DBO5 expresa la materia orgánica en
términos generales, pero no indican su composición, la cual es muy variada.
Como su origen proviene de organismos, y sus productos de degradación o de
metabolismo, se puede afirmar que la componen proteínas, carbohidratos y
lípidos y/o sus productos de degradación: aminoácidos, monosacáridos,
22
hidrocarburos, ácidos grasos, alcoholes, más otros componentes propios de los
vegetales como pigmentos. Determina la cantidad aproximada de oxígeno que
se requerirá para estabilizar biológicamente la materia orgánica presente.
Se define la DBO5 como el monto de oxígeno consumido por
microorganismos para oxidar biológicamente la materia orgánica, cuando se
incuba una muestra en la oscuridad durante 5 días a 20°C. Es un indicador de
consumo de oxigeno por microorganismo, el consumo de esta agua con alto
contenido de DBO5 presenta riesgos a la salud.
2.7.4. Temperatura
Según BARRENECHEA (2004), la temperatura es uno de los
parámetros físicos más importantes en el agua, pues por lo general influye en
el retardo o aceleración de la actividad biológica, la absorción de oxígeno, la
precipitación de compuestos, la formación de depósitos, la desinfección y los
procesos de mezcla, floculación, sedimentación y filtración. Múltiples factores,
principalmente ambientales, pueden hacer que la temperatura del agua varíe
continuamente.
Según DIGESA (2007), la temperatura es un indicador de la calidad
del agua, que influye en el comportamiento de otros indicadores de la calidad
del recurso hídrico, como el pH, el déficit de oxígeno, la conductividad eléctrica
y otras variables fisicoquímicas. El oxígeno es menos soluble en agua caliente
que en agua fría. Es causa frecuente del oxígeno presente en las aguas
superficiales, reduciéndose más en los meses de verano. La temperatura
23
aceptable para el consumo humano para una concentración máxima aceptable
de 15°C, en temperaturas altas disminuye la concentración de OD, y otras
legislaciones consideran la temperatura del agua de la zona con una variación
de 3°C. La temperatura recomendable en periodos extendidos de inmersión
entre 15-35°C.
2.8. Bacterias del género Thiobacillus
El género Thiobacillus comprende bacilos Gram negativos
pequeños (0.5 X 1.0-4.0 µm) con flagelación polar que pueden obtener energía
de la oxidación de azufre elemental, sulfuros y tiosulfato; su temperatura de
crecimiento óptimo se encuentra entre los 50-60 °C. Todas las especies
pueden fijar dióxido de carbono por medio del Ciclo de Calvin y son capaces de
crecer autotróficamente; algunas especies son quimiolitotróficas obligadas,
mientras otras son capaces de crecer fuente de energía son el ácido
sulfhídrico, el azufre elemental y el tiosulfato. En la mayor parte de los casos el
producto final de la oxidación es el sulfato, y el número total de electrones
implicados desde el H2S (estado de oxidación -2) al sulfato (estado de
oxidación +6) es de 8. La oxidación del compuesto más reducido, H2S, ocurre
en fases, y el primer paso de oxidación origina la formación de azufre
elemental. Algunas bacterias oxidantes del H2S, depositan dentro de la célula
el azufre elemental que se forma. El azufre depositado como resultado de la
oxidación inicial es una reserva de energía, y cuando el suministro de H2S se
agota, se puede obtener energía adicional del azufre a sulfato (DURAN, 2005).
24
Las especies del género Thiobacillus son las más importantes para
oxidar el azufre en las aguas. Su difusión es muy amplia y por eso puede
comprobarse su presencia en la mayoría de los ríos, lagos y aguas costeras.
Se multiplican bajo condiciones apropiadas donde quiera que se produzca H2S.
Por eso en los lagos eutróficos suele haber una capa limitante muy neta entre
la masa de agua que contiene H2S y la portadora de O2. Esta capa limitante es
el emplazamiento principal de los Thiobacillus aerobios sobre todo cuando se
encuentra en la zona afótica; en cambio sí radica en la eufótica, los
microorganismos que la pueblan son principalmente las sulfobacterias púrpuras
y /o las clorobacterias, en cuyo caso los Thiobacillus solo pueden tener un
papel subordinado en ella; estos microorganismos provocan fluctuaciones
diarias en la concentración de H2S (DURAN, 2005).
Sin embargo, estos organismos no pueden realizar la reducción
asimilatoria de nitrato y necesita amonio como fuente de nitrógeno. En las
operaciones de lixiviado a cielo abierto, la luz puede ejercer un efecto inhibidor
sobre el desarrollo de algunas especies de Thiobacillus, cuya máxima
inhibición ocurre a longitudes de ondas cortas
La presencia de microorganismos es necesaria para una efectiva
remoción de H2S. Cultivos mixtos de microorganismos han sido usados en la
operación de biofiltros y son requeridas de 1 a 3 semanas como tiempo de
aclimatación. Recientemente, el uso de cultivos puros está ganando gran
atención debido a que requieren menos tiempo de arranque y se obtienen
mayores eficiencias en remoción. Algunas bacterias autótrofas como los
miembros de las especies del género Thiobacillus han sido empleadas dentro
de bioreactores y han sido usadas para metabolizar H2S. Los productos de la
oxidación de H2S, dependen de la especie de Thiobacillus empleada (DURAN,
2005).
25
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación
3.1.1. Ubicación política
Las prácticas se desarrollaron en las instalaciones del laboratorio
de Microbiología General en el área de Biotecnología Ambiental, de la
Universidad Nacional Agraria de la Selva, políticamente ubicado en la ciudad
de Tingo María, distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado, Región
Huánuco.
3.1.2. Aspectos ambientales
Ecológicamente de acuerdo a la clasificación de zonas de vida o
formaciones vegetales del mundo y el diagrama bioclimático de HOLDRIDGE
(1982), Tingo María se encuentra en la formación vegetal bosque muy húmedo
Pre-montano Tropical Bmh-PT, y de acuerdo a las regiones naturales del Perú
corresponde a Rupa Rupa o Selva Alta.
Hidrográficamente pertenece a la cuenca del río Huallaga; el
comportamiento climático es variable, con una precipitación anual promedio de
3328.9 mm. Las mayores precipitaciones se producen entre los meses de
septiembre a abril y alcanza un máximo extremo en el mes de febrero con un
26
promedio mensual de 608.4 mm. En los últimos años se han registrado los
siguientes datos climatológicos relacionados con el proyecto (Estación
meteorológica José Abelardo Quiñones, 2014).
Temperatura máxima : 30,70 º C
Temperatura mínima : 18,90 º C
Temperatura promedio : 24,90 º C
Humedad relativa promedio : 86 %
Velocidad del viento máxima : 22,2 m/s
3.2. Unidades en estudio
Cepas bacterianas con capacidad de desarrollarse en el lecho de
fragmentos de policloruro de vinilo (PVC); aisladas de las muestras de
efluentes mineros extraídos del siguiente punto de colecta:
Cuadro 3. Punto seleccionado para la colecta de efluente minero
Punto de colecta
Tipo de Muestra
E (m) N (m) Z (m.s.n.m.)
Bofedal Bethania
Efluente 390307 8970408 4820
27
3.3. Materiales y equipos
- Biorreactores air lift -Software Excel 2010
- Bombas de aireación -Estufa
- Oxímetro -Balanza analítica
- Termómetro -libreta de apuntes
- Frascos de vidrio transparente -Filtros.
(300 mL) -mufla.
- Guantes, mascarilla. -pHmetro.
- Material de laboratorio (probetas, pipetas, vasos precipitados, crisoles,
embudos, matraces).
3.4. Metodología
3.4.1. Toma de muestras para evaluación
3.4.1.1. Muestras de efluente
Las muestras etiquetadas fueron recepcionadas en el Laboratorio,
habiéndose tomado del pantano de altura o bofedal Bethania (Distrito de
Acobambilla, Provincia de Huancavelica, Departamento de Huancavelica),
utilizándose para ello frascos de vidrio esterilizados, de boca ancha con
capacidad de 1 litro debidamente rotulados y enviados en recipientes de
tecknopor con hielo al laboratorio de Microbiología General (INSTITURO DE
SALUD PÚBLICA, 2004).
28
3.4.2. Enumeración y aislamiento de bacterias
De las muestras de efluentes mineros, previa homogenización se
tomaron 25 mL adicionándolos a 225 mL de Caldo Peptona 0.1% en un matraz
de 500 mL, obteniéndose una primera dilución decimal y partir de la cual se
realizaron diluciones hasta 10-4 , sembrando posteriormente alícuotas (0.1 mL)
de las diluciones en sendas placas con Medio Plate Count a pH 4.5
adicionados de sulfato férrico al 1 % [Sulfato de hierro III = Fe2(SO4)3], para
determinar el número de bacterias en el efluente.
Asimismo se tomó de las últimas diluciones alícuotas (0.1 mL) para
sembrarlas sobre los medios Mueller Hinton, CLED y Cetrimide, todos con
Fe2(SO4)3 adicionados con Nistatina (250 μg/mL) para evitar el desarrollo de
fungi (hongo) y así poder aislar las bacterias acidófilas que pudiesen
encontrase en dichas muestras (LOPEZ et al, 2006).
3.4.3. Conservación de cepas bacterianas
Las colonias desarrolladas sobre los medios de aislamiento se
repicaron en tubos con Medio Cepa y luego de incubación por 24 horas se
llevaron a refrigeración (4° a 8°C) para su mantenimiento (LOPEZ et al, 2006),
hasta la etapa de reactivación para la adaptación al desarrollo en diferentes
concentraciones de pH.
29
3.4.4. Preparación de los biorreactores de lecho circulante airlift
Los biorreactores tipo air lift que se utilizaron se prepararon en el
laboratorio, con un soporte trípode con una bomba aireadora para oxigenar la
cámara de cultivo, un lecho de policloruro de vinilo, una cámara de cultivo
cilíndrica de vidrio de 100 mm de diámetro 200 mm de altura, tubo de
distribución central de 80 por 28 mm y frascos filtros para aire con solución
saturada de NaCl. La fuente de aireación fue una bomba de aire de pecera
(AIR PUMP JUNIOR) la que proporcionó 1,100 mL/min, unos 0.9 vvm (volumen
de aire por volumen de líquido por minuto) (LOPEZ, 1998; MIRANDA et al.,
2006).
Los catéteres de policloruro de vinilo tienen un mayor índice de
adherencia de microorganismos en comparación con estructuras de silicona y
poliuretano; además este tipo de lecho no presenta una tendencia de
acidificación extrema (BETETA, 2012).
Los biorreactores se esterilizaron al vapor de agua (cámara de
cultivo y tubo central de distribución) utilizando el autoclave así como por
sumersión en solución alcohol-ácida al 1 % (etanol más ácido clorhídrico)
(LOPEZ, 1998; MIRANDA et al., 2006).
Se ensamblaron los soportes dentro de los biorreactores previo a la
esterilización en solución alcohol-ácida, se trabajó con tres espesores de lecho
de PVC, para el primer tratamiento con un espesor de 1.5 cm y para el
segundo con un espesor de 3 cm, asimismo con tres niveles iniciales de pH
(tratamiento 1: pH 3, tratamiento 2: pH 4 y tratamiento 3: pH 5), la
30
concentración del inóculo fue del 15 % del volumen de trabajo o volumen medio
total en el biorreactor (VM) y cada tratamiento con tres repeticiones.
3.4.5. Preparación del medio de cultivo
Se preparó un medio mínimo de sales (MMS) según la formulación
del Medio 9K adicionado de Fe2 (SO4)3, se llevó a ebullición por 10 minutos y se
añadió a los biorreactores esterilizados en un volumen de 800 ml, sobre el cual
se añadirá el inóculo (15 % del VM), se ajustó los pH en la concentración
correspondiente, según el espesor del lecho incluido.
3.4.6. Adecuación del pH en el sistema
La adición de ácido sulfúrico para alcanzar los niveles de pH
deseados se determinó por la adición gradual de dicho ácido a los
biorreactores hasta alcanzar los niveles de pH 3 en el primer tratamiento, pH 4
en el segundo tratamiento y pH 5 en el tercer tratamiento.
3.4.7. Etapas de la operación de corrección de pH
3.4.7.1. Aclimatación-Adaptación de las cepas
Se utilizaron para la reactivación de cepas Medio 9K solido con una
incubación a 35° C (en incubadora universal) por 24 horas, en condiciones
aeróbicas. Se repicaron sobre ocho placas Petri con medio sólido de Mueller
Hinton con 0.1 % de Fe2 (SO4)3 y adicionado con Nistatina (250 μg/ml),
adicionándose paulatinamente a las placas, de la primera a la última, H2SO4 a
31
concentraciones desde 5 μg/m3 a 40 μg/m3. Las siembras se incubaron a 35° C
por 24 a 48 horas. La placa donde se obtuvo el mayor desarrollo de colonias,
fue la concentración adecuada de H2SO4 para su uso en la operación de
inducción de consorcio en los biorreactores.
3.4.7.2. Inducción de formación de consorcios bacterianos.
Las cepas bacterianas adaptadas se trasladaron a medio MSM 9K
para reactivarlas y se utilizaron como inóculos, considerando un 15% del
volumen del medio total en los biorreactores, conteniendo una concentración
de H2SO4 según el diseño adoptado, con retroalimentación por tres veces
durante la operación que durará cuatro días. La operación se inició al poner en
marcha la bomba aireadora que movilizó el contenido de la cámara de
crecimiento del biorreactor. Las bacterias con capacidad de formar consorcios
bacterianos se adsorben sobre el lecho y permiten posteriormente la corrección
del pH de la etapa no probada.
3.4.8. Datos a evaluar
3.4.8.1. Curva de crecimiento de bacterias acidófilas
Las colonias conservadas en el medio cepa 9 K semisólido se
repicarán en medio mínimo de sales minerales 9K líquido para determinar la
curva de crecimiento, realizando diluciones decimales y sembrando cada 6
horas en medio sólido Tripticasa Soya Agar (TSA) mas Fe2 (SO4)3 adicionado
de H2SO4 según la concentración obtenida en la adaptación y realizando
32
enumeraciones del crecimiento para evaluar su velocidad de crecimiento (µ ó
K), tasa de crecimiento (Y/ó) y tiempo de generación (tg) (MADIGAN et al,
1998).
dB/dT = KB
B = número de células iniciales
dB/dT = cambio del número de biomasa (=n)
K = representa el crecimiento instantáneo (tasa constante de
crecimiento en un momento dado = r)
ln 2 0.69
Si K = --------- = -------- ln 2 = K . Tg
Tg Tg ln Bt
Y ln 2 = --------
ln B0
Tg = tiempo de generación, tiempo en que se duplica una célula.
Bt = Cifra de células a un tiempo determinado (final).
B0 = Masa de células en tiempo cero (inicial).
K, puede ser determinada mediante la pendiente (m) de la curva de crecimiento
durante la fase LOG, expresada en logaritmo base 2:
Log2 Bt – Log2 B0
K = m = -------------------------- donde : T = t1 – t0
T El cálculo del tiempo de generación o Tg :
Tg = 1/r
33
t 1
Tg = --------------------- = ----- ln 2 = K. Tg
Log2 Bt - Log2 B0 K
3.4.8.2. Determinación de parámetros fisicoquímicos
3.4.8.2.1. pH
Se sacó una pequeña cantidad de muestra en un vaso precipitado
y se medió con el pH-metro (EXTECH) debidamente calibrado. Las mediadas
se realizaron diariamente.
3.4.8.2.2. Temperatura
Se determinó diariamente midiendo in situ en el biorreactor con un
termómetro ROAST digital, la temperatura interna y ambiental.
3.4.8.2.3. Oxígeno disuelto (OD)
Se determinó diariamente mediante el uso del método de
membrana con un Oxímetro debidamente calibrado. Los resultados se
reportaron en mg/L. según lo recomienda APHA (2001).
3.4.8.2.4. Demanda bioquímica de oxígeno (DBO5)
En la determinación de DBO5, se utilizó una botella para incubación
de 300 mL de capacidad con tapones de vidrio por biorreactor. Después de
medir el oxígeno disuelto de cada muestra, se colocó 3.3 mL de la muestra en
34
una botella de 300 mL con un porcentaje de dilución de 1% para cada
tratamiento. La botella se aforó con agua destilada todo el volumen para evitar
burbujas de aire al taparlo. Para el blanco se llenó la botella con agua destilada
y se medirá el oxígeno antes de taparlo. Después se incubará las botellas por
cinco días a 20°C y volver a medir el oxígeno disuelto (RAMALHO, 2003).
Para calcular el DBO5 se utilizó con la siguiente fórmula:
* (
)+
Dónde:
= demanda bioquímica de oxígeno en cinco días.
= Oxígeno disuelto inicial en la muestra.
= Oxígeno disuelto final en el blanco.
=Oxígeno disuelto final en la muestra.
= Volumen de la botella.
= Volumen de la muestra.
3.4.8.3. Observación de bacterias acidófilas por tinción Gram.
De las placas con medio de aislamiento se obtuvo una alícuota de
las colonias desarrolladas con anza de siembra y se llevó a un portaobjetos con
35
una gota de suero fisiológico sobre la cual se disolvió la muestra y se realizó
una extensión o frotis sobre la superficie del portaobjetos, se deshidrató o secó
al mechero y se procedió a realizar la técnica de coloración de GRAM.
3.4.8.4. Biomasa en lecho
Se evaluó en la fracción e peso en gramos (g) ganados por los
lechos después de los 7 días de iniciada la operación.
Dónde: =variación de biomasa en lecho.
=Peso final del lecho (g).
36
IV. RESULTADOS
4.1. Aislamiento y curva de crecimiento de bacterias acidófilas
De acuerdo a la metodología establecida se obtuvieron colonias
bacterianas de aproximadamente 1 0 1.5 milímetros de diámetro, aerobios.,
colonias anaranjadas, de bordes enteros, de elevación convexa, desarrolladas
en medio acido con pH 3, 4 y 5 .A la coloración gram se mostraron
morfológicamente como bacilos gramnegativos cortos de extremos romos en
cadenas cortas .denominándoseles como bacterias acidófilas en la realización
de la operación en biorreactores.
La realización de la cinética del crecimiento para las bacterias
aisladas a partir de muestras de efluentes mineros del Bofedal Bethania,
permitió determinar la tasa de crecimiento, la velocidad de crecimiento y el
tiempo de generación de las bacterias acidófilas.
En el cuadro 4 se indican los resultados en cada una de las
siembras por dilución y hora consideradas para la curva de crecimiento que
permitió la gráfica del crecimiento y la determinación del tiempo de generación
37
y la velocidad del desarrollo. En la figura 2 se presenta el esquema de la curva
de crecimiento.
Cuadro 4. Resultados de la siembra, por dilución y por horas para el
recuento (cél/mL) para la determinación la curva de crecimiento
de bacterias acidófilas.
Tiempo Curva Dilución siembra Rcto.cél/mL
Reactivación Cepa 0
t 0 (0 hs) 0 3250
t 1 (2 hs) -3 400000
t 2 (4 hs) -3 828000
t 3 (6 hs) -4 3520000
t 4 (8 hs) -5 74800000
t 5 ( 10 hs) -5 128200000
t 6 (12 hs) -6 992000000
t 7 (20 hs) -8 40000000000
t 8 (28 hs) -10 1.048E+13
t 9 (30 hs) -11 4.12E+13
t 10 (42 hs) -12 4.04E+14
t 11 (54 hs) -13 1.15E+15
t 12 (72 hs) -13 8.2E+14
38
3750
400000
828000
3520000
74800000
128200000
992000000
40000000000
1.048E+13
4.12E+13
4.04E+14
1.15E+15
8.2E+14
y = 603.61e2.3336x R² = 0.9713
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
1E+09
1E+10
1E+11
1E+12
1E+13
1E+14
1E+15
1E+16
0 2 4 6 8 10 12 20 28 30 42 54 72
Re
cu
en
to (
ce
l/m
l) Rcto.cél/mL
Exponencial(Rcto.cél/mL)
Tiempo (horas)
Figura 2. Esquema del crecimiento de las bacterias acidófilas.
39
Asimismo se determinó que las bacterias aún se encontraban en
fase de crecimiento exponencial, y se calculó lo siguiente:
Tg =1.060
µ = K =0.6539
4.2. Evaluación de los parámetros fisicoquímicos
4.2.1. Datos de la primera evaluación en lechos de 1.5 cm
Cuadro 5. Promedio de la temperatura en cada tratamiento por día.
Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 29.6 28.6 28.6 28.9 29.1 31.6 29.2 30.0 30.9 30.3
T2 29.6 28.7 28.7 28.2 29.2 30.4 29.5 30.1 30.1 30.7
T3 29.5 28.0 28.0 28.9 29.5 29.8 29.8 30.6 28.9 29.4
Figura 3. Variación de la temperatura en los días de la primera evaluación.
26.0
27.0
28.0
29.0
30.0
31.0
32.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tem
pe
ratu
ra (°
C)
Días
T1
T2
T3
40
Cuadro 6. Promedio del oxígeno disuelto de cada tratamiento por día en la
primera evaluación.
Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 4.150 2.783 3.247 3.877 3.500 3.293 3.763 4.513 5.103 4.530
T2 2.587 2.823 2.760 3.937 3.580 2.983 2.933 3.860 5.367 5.373
T3 0.830 3.053 3.140 3.630 3.460 2.880 3.053 3.503 4.933 4.580
Figura 4. Variación del OD de cada tratamiento en los días de evaluación.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
OD
(m
g/l)
Días
T1
T2
T3
41
Cuadro 7. Promedio del pH de cada tratamiento por día.
Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 3.00 1.66 1.80 1.91 1.98 2.44 2.41 2.39 2.36 3.12
T2 4.00 3.94 3.97 4.29 4.20 4.37 4.50 4.41 4.36 3.80
T3 5.00 4.51 4.81 4.95 4.99 5.06 5.07 5.10 4.93 4.86
Figura 5. Variación del pH de cada tratamiento en los días de la primera
evaluación.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Días
T1
T2
T3
42
Cuadro 8. Promedio de los parámetros evaluados de la primera evaluación en
los lechos de espesor de 1.5 cm en cada tratamiento por cada
repetición.
PROMEDIO
TRATAMIENTOS BIOMASA (g) T (° C) OD (ppm) PH T AMB. (° C) DBO5 (ppm)
T1R1 0.118 29.6 4.02 1.95 26.9 67.3
T1R2 0.101 29.6 3.67 2.27 26.9 68.2
T1R3 0.110 29.8 3.89 2.70 26.9 68.5
T2R1 0.343 29.4 3.90 4.09 26.9 67.8
T2R2 0.379 29.6 3.49 4.24 26.9 66.1
T2R3 0.335 29.5 3.47 4.23 26.9 65.1
T3R1 0.154 29.3 3.22 4.70 26.9 66.4
T3R2 0.153 29.3 3.48 4.58 26.9 64.0
T3R3 0.163 29.3 3.22 5.50 26.9 65.0
Cuadro 9. Promedio de los parámetros evaluados de la primera evaluación por
tratamiento en los lechos de espesor de 1.5 cm.
PROMEDIO
TRATAMIENTOS BIOMASA (g) T (° C) OD (ppm) PH T AMB. (° C) DBO5 (ppm)
T1 0.110 29.7 3.86 2.31 26.9 68.0
T2 0.352 29.5 3.62 4.19 26.9 66.3
T3 0.157 29.3 3.31 4.93 26.9 65.2
43
Figura 6. Variación de la biomasa, temperatura interna y temperatura ambiental
en cada tratamiento.
Figura 7. Variación de la biomasa en relación al oxígeno disuelto por
tratamiento.
0.110 0.352 0.157
29.7 29.5 29.3
26.9 26.9 26.9
0
5
10
15
20
25
30
35
T1 T2 T3
Tratamientos
BIOMASA (g)
T (° C)
T AMB. (° C)
0.110=T1
0.352=T2
0.157=T3
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
3.20 3.40 3.60 3.80 4.00
Bio
mas
a (g
)
OD (ppm)
44
Figura 8. Variación de la biomasa en relación al pH por tratamiento.
Figura 9. Variación de la biomasa en relación al DBO5 por tratamiento.
0.110=T1
0.352=T2
0.157=T3
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
65.00 66.00 67.00 68.00 69.00
Bio
mas
a (g
)
DBO5 (ppm)
0.110=T1
0.352=T2
0.157=T3
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00
Bio
mas
a (g
)
pH
45
Figura 10. Variación de los parámetros evaluados por tratamiento.
Figura 11. Variación de la DBO5 con respecto a la biomasa producida por
tratamiento.
0.110 0.352 0.157 2.31
4.19 4.93
29.7 29.5 29.3
26.9 26.9 26.9
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
T1 T2 T3
Tratamientos
T AMB.
OD (ppm)
T (° C)
PH
BIOMASA (gr)
0.110 0.352 0.157
68.02 66.30 65.15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
T1 T2 T3
DBO5
BIOMASA (gr)
46
4.2.2. Datos de la segunda evaluación en lechos de 3 cm.
Cuadro 10. Promedio de la temperatura en cada tratamiento por día.
Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 29.3 28.3 29.3 29.3 30.2 26.0 28.5 27.5 29.2 30.2
T2 29.7 28.4 30.0 31.4 27.2 26.2 28.7 27.8 29.5 30.3
T3 29.8 27.8 29.6 30.2 25.6 26.4 28.7 27.6 29.1 30.8
Figura 12. Variación de la temperatura en los días de la segunda evaluación.
26.0
27.0
28.0
29.0
30.0
31.0
32.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tem
per
atu
ra (°
C)
Días
T1
T2
T3
47
Cuadro 11. Promedio del oxígeno disuelto de cada tratamiento por día en la
segunda evaluación.
Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 4.687 4.210 5.230 5.293 4.533 5.327 5.210 5.140 5.170 5.470
T2 2.217 2.323 3.063 3.553 4.540 4.877 4.567 4.550 5.363 5.413
T3 0.327 1.457 1.357 1.507 2.953 2.833 3.997 3.250 4.933 4.580
Figura 13. Variación del OD de cada tratamiento en los diez días.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
OD
(m
g/L)
Días
T1
T2
T3
48
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Días
T1
T2
T3
Cuadro 12. Promedio del pH de cada tratamiento por día.
Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 3.00 3.38 2.99 3.30 3.54 3.73 3.88 3.82 3.92 3.84
T2 4.00 5.01 4.45 4.39 4.57 4.73 4.74 4.50 4.41 4.35
T3 5.00 5.29 4.41 4.06 4.42 4.79 4.66 4.63 4.62 4.40
Figura 14. Variación del pH de cada tratamiento en los días de la segunda
evaluación.
49
Cuadro 13. Promedio de los parámetros evaluados en los diez días de la
segunda evaluación en lechos de espesor de 3 cm de cada
tratamiento por cada repetición.
PROMEDIO
Tratamientos biomasa (g) T OD PH TAMB. DBO5
T1R1 0.217 28.88 4.975 3.405 25.77 67.34
T1R2 0.180 28.76 5.161 3.622 25.77 68.19
T1R3 0.165 28.68 4.945 3.593 25.77 68.54
T2R1 0.595 29.28 4.495 4.381 25.77 67.79
T2R2 0.659 28.76 3.827 4.707 25.77 66.05
T2R3 0.506 28.75 3.818 4.457 25.77 65.05
T3R1 0.251 28.54 2.88 4.462 25.77 66.44
T3R2 0.244 28.53 2.644 4.618 25.77 64.01
T3R3 0.239 28.61 2.634 4.802 25.77 65.01
Cuadro 14. Promedio de los parámetros evaluados de la segunda evaluación
por tratamiento en los lechos de espesor de 3 cm.
PROMEDIO
Tratamientos BIOMASA (g) T (° C) OD (ppm) PH T AMB. (° C) DBO5 (ppm)
T1 0.187 28.8 5.03 3.54 25.8 68.0
T2 0.587 28.9 4.05 4.52 25.8 66.3
T3 0.245 28.6 2.72 4.63 25.8 65.2
50
Figura 15. Variación de la biomasa, temperatura interna y temperatura
ambiental por tratamiento.
Figura 16. Variación de la biomasa en relación al oxígeno disuelto por
tratamiento.
0.187 0.587 0.245
28.8 28.9 28.6
25.8 25.8 25.8
0
5
10
15
20
25
30
35
T1 T2 T3
Tratamientos
BIOMASA (g)
T (° C)
T AMB. (° C)
0.187=T1
0.587=T2
0.245=T3
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00
Bio
mas
a (g
)
OD (ppm)
51
Figura 17. Variación de la biomasa en relación al pH por tratamiento.
Figura 18. Variación de la biomasa en relación al DBO5 por tratamiento.
0.187=T1
0.587=T2
0.245=T3
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
Bio
mas
a (g
)
pH
0.187=T1
0.587=T2
0.245=T3
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
65.00 66.00 67.00 68.00 69.00
Bio
mas
a (g
)
DBO5 (ppm)
52
Figura 19. Variación de los parámetros evaluados en los tres tratamientos.
Figura 20. Variación de la DBO5 con respecto a la biomasa producida en los
tres tratamientos.
0.1877 0.5867 0.2452 3.540 4.515 4.627
28.8 28.9 28.6
25.8 25.8 25.8
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
T1 T2 T3
Tratamientos
TAMB.
OD
T
PH
biomasa (g)
0.1877 0.5867 0.2452
68.02 66.30 65.15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
T1 T2 T3
DBO5
biomasa (g)
53
4.3. Identificación de microorganismos por tinción Gram.
En la figura 21 se mostraron morfológicamente como bacilos cortos
de extremos romos en cadenas cortas, tintorialmente gramnegativos, colonias
anaranjadas a amarillo verdosas, convexa, lisas, enteras.
Figura 21. Coloración de tinción gram
54
4.4. Biomasa en lechos en cada tratamiento.
Figura.22. Comportamiento de la biomasa en la primera evaluación.
Figura 23.Comportamiento de la biomasa en la segunda evaluación.
0.118
0.101
0.11
0.343
0.379
0.335
0.154 0.153
0.163
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
T1R1 T1R2 T1R3 T2R1 T2R2 T2R3 T3R1 T3R2 T3R3
bio
mas
a (g
)
Tratamientos
BIOMASA(gr)
0.1804
0.217
0.1656
0.595
0.659
0.506
0.2514
0.2447 0.2395
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
T1R1 T1R2 T1R3 T2R1 T2R2 T2R3 T3R1 T3R2 T3R3
bio
mas
a (g
)
Tratamientos
biomasa (g)
55
V. DISCUSIÓN
Los acidófilos son microorganismos capaces de vivir en un rango
de pH que va desde 1,4 a 6,0. Se sabe que estas bacterias mantiene un pH
interno cercano a 6,5 por lo que cuenta con un sistema que le permite
adaptarse a los cambios que se puedan producir en la acidez del medio
externo (DÍAZ, 2007). En nuestro resultado, refiriéndonos a la primera
evaluación (figura 5) se muestra que en el tratamiento 1 el pH inicial fue de 3,
que al transcurrir los días la concentración de pH va disminuyendo hasta el
sexto día (pH 1.5 – 2.0), apreciándose que las bacterias lograron adaptarse al
medio ácido y corregir el pH inicial. En comparación con el tratamiento 2 (con
pH inicial de 4.0) y tratamiento 3 (pH inicial de 5.0), el comportamiento de las
bacterias es casi constante en crecimiento determinándose que se han
adaptado al pH inicial del medio, que paulatinamente lo elevan adaptándose
mejor entre 4.5 a 5.0, observándose que al décimo día tienden a estabilizarse a
pH de 3.5 a más. Desde este punto de vista concuerda con lo establecido por
la teoría mencionada por DIAZ (2007) y el reporte de SEGURA (1998) y
JUAREZ (2004) al desarrollo bacteriano en lo que respecta a pH de 2.4 a 4.0
en minas en donde se aprecian desarrollo de estas bacterias.
56
En el tratamiento 3 el pH tiende a ser mayor (sobre 4.0) pero tiene
una menor cantidad de biomasa en comparación con el tratamiento 2, debido a
que las bacterias son eficientes en este pH (2.0) y se adaptan a una cierta
concentración de ácidos, concordando nuevamente con la teoría que menciona
el rango óptimo de pH para acidófilos está entre 1.4 a 6.0.
En lo que respecta a la relación entre el pH, el OD, temperatura y la
biomasa adherida desarrollada sobre el soporte (lecho) se puede apreciar en
todos los tratamientos que al disminuir el pH del medio la biomasa tiende a ser
mayor y la concentración del OD también se incrementa, al elevarse la
temperatura de operación. Esto es debido a que las bacterias acidófilas una
vez que se han adaptado y corregido el pH encontrado en el medio desarrollan
microaerobicamente, manteniendo o incrementando el oxígeno presente en la
cámara de desarrollo. Esto es coincidente con lo reportado por DURAN (2005)
en trabajos con biorreactores de flujo a pistón.
El desarrollo en consorcio de la biomasa sobre el soporte o lecho
de PVC indica la propiedad innata de las bacterias acidófilas de formar
biopelículas bajo condiciones que simulan el ambiente natural o en condiciones
de adaptabilidad a un factor en particular, tal como lo menciona JUAREZ
(2004) al afirmar que las poblaciones microbianas pueden encontrarse en
hábitats naturales de alteración natural o biolixiviación industrial, cuando se
implica algún proceso de óxido-reducción y/o de disolución de metales
disponiéndose en microcolonias que forman biopeliculas estructuradass en tres
componentes básicos que aseguran la captación de nutrientes, la distribucipon
de estos y la reproducción de las células.
57
Los componentes bióticos de ambientes extremadamente ácidos (pH<3)
en la naturaleza, por ejemplo en algunas zonas geotermales, son
predominantemente microbiológicos, reconociéndose hoy en día
microorganismos, acidofílicos obligados, que no son solo generadores de
condiciones de acidez, sino también son considerados como una alternativa
para remediar ambientes alterados (TICHY et al, 1998). Debe reconocerse que
aun cuando se han aislado arqueas, bacterias, hongos, levaduras, protozoarios
y algas en sitios con residuos mineros, las bacterias son los microorganismos
predominantes en sitios ácidos a extremadamente ácidos (DURAN, 2005).
58
VI. CONCLUSIONES
1. A mayor temperatura el oxígeno disuelto es mayor y optimo el crecimiento
microbiano, con un pH que puede estar entre 4 a 4.5.
2. Las bacterias aisladas y utilizadas en la práctica fueron bacterias acidófilas
del género Thiobacillus. Las bacterias acidófilas presentan la capacidad de
formar consorcio o biopeliculas sobre soportes de PVC.
3. Los lechos con espesor 3.5 cm adhieren mayor biomasa que los lechos de
espesor de 1.5 cm, como los resultados nos indican el pH óptimo para mayor
producción de biomasa es el tratamiento 2.
.
59
VII. RECOMENDACIONES
- Calibrar los equipos antes de hacer las mediciones de los parámetros.
- Tomar los datos de los parámetros a la hora exacta.
- Hacer los estudios de descomposición del desarrollo de consorcios
bacterianos y los sub productos que estos forman al ser tomado sus
parámetros fisicoquímicos.
- Los biorreactores deben ubicarse en lugares donde no exista la
influencia de factores ambientales ya que estos hacen que los datos de
los parámetros varíen severamente además de disminuir el óptimo
desarrollo de los microorganismos.
.
60
VIII. REFENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1‐37
VAN HAANDEL, A. y LETTINGA, G. 1998. Tratamento anaeróbio de esgotos –
Um Manual para Regioes de Clima Quente. EpGraf, Campina Grande –
PB, Brasil.
64
ANEXOS
65
ANEXO A. Esquema de biorreactor Air Lift.
Figura 24.esquema del funcionamiento del biorreactor.
1. Biorreactor de 1000 ml de volumen total. Contenido de 800 ml de medio
mínimo de sales (MMS) con solución de H2SO4 a niveles de pH 3,4 y 5.
2. Matraz con Sal Saturada 500ml.
3. Trampa de sólidos, envase de 250ml. El contenido será la misma solución
del biorreactor.
4. Lecho de partículas PVC de 1.5 cm, 3.0 cm, 6.0 cm de espesor. Trozos de
mangueras de venoclisis de 5 mm de largo.
5. Bomba compresora para recircular la solución ácida. Marca BOYU modelo
SP-601F, potencia 115v.
6. Bomba simple de inyección de aire.
7. Contenedor de enfriamiento de 1000ml.
66
Anexo B. Mapa de ubicación de la zona de muestreo.
Figura 25. Mapa de ubicación de colecta microbiológica de efluentes líquidos mineros.
67
Anexo C. Fotografías de trabajo en el laboratorio de la Universidad Nacional Agraria
de la Selva.
Figura 26.Toma de muestras de agua residual minera.
Figura 27. Preparación de los biorreactores de lecho circulante airlift
68
Figura 28. Funcionamiento de los biorreactores de lecho circulante air
lift.
.
Figura 29. Biorreactores en funcionamiento.
69
Figura 30. Formación de la biopelícula.
Figura 31. Determinación del pH y la temperatura
70
Figura 32. Enumeración, selección y aislamiento de bacterias
Figura 33. Recuento de microorganismos para realizar el crecimiento
cinético.
71
Figura 34. Observación en el microscopio óptico.
Figura 35. Muestras para realizar el DBO5.
72
Figura 36. Determinación del DBO5.
73
Anexo D. FORMATO DEL ESTUDIO REALIZADO
Cuadro 15. Datos de la primera evaluación con lechos de espesor 1.5 cm en los diez días.
1 2 3 4 5
T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA
T1R1 29.5 4.11 3 27.2 28.7 3.5 1.20 27.2 28.7 3.56 1.43 27 28.7 4.2 1.55 26.5 29.3 3.24 1.63 27.5
T1R2 29.3 4.32 3 27.2 28.6 2.21 1.58 27.2 28.6 3.13 1.75 27 29 3.98 1.86 26.5 28.7 3.89 2.03 27.5
T1R3 28.9 4.02 3 27.2 28.6 2.64 2.20 27.2 28.6 3.05 2.22 27 28.9 3.45 2.31 26.5 29.2 3.37 2.28 27.5
T2R1 30.1 2.89 4 27.2 28.6 3.23 3.48 27.2 28.6 3.12 3.52 27 28 4.02 3.82 26.5 29.3 3.90 4.23 27.5
T2R2 29.5 1.89 4 27.2 28.8 2.67 3.94 27.2 28.8 3.00 3.96 27 28.3 4.1 4.12 26.5 29.1 3.7 4.34 27.5
T2R3 28.8 2.98 4 27.2 28.8 2.57 4.40 27.2 28.8 2.16 4.43 27 28.2 3.69 4.93 26.5 29.1 3.14 4.02 27.5
T3R1 30 1.23 5 27.2 28.2 2.81 4.13 27.2 28.2 2.89 4.37 27 28.7 3.67 4.84 26.5 29.2 3.02 4.91 27.5
T3R2 29.9 1.03 5 27.2 27.5 3.14 4.23 27.2 27.5 3.54 4.42 27 29 3.98 4.48 26.5 29.6 3.24 4.52 27.5
T3R3 29.6 0.23 5 27.2 28.2 3.21 5.16 27.2 28.2 2.99 5.63 27 28.9 3.24 5.52 26.5 29.6 4.12 5.53 27.5
74
6 7 8 9 10
T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA
30.8 3.19 2.51 26.9 29.5 4.23 1.87 26.4 30.3 4.87 1.8 27 31 5.28 1.75 26.2 29.8 5. 23 2.75 26.8
32 3.21 2.2 26.9 29.3 3.42 2.45 26.4 29.6 3.78 2.22 27 30.3 4.59 2.2 26.2 30.4 4.13 3.43 26.8
32.1 3.48 2.6 26.9 28.9 3.64 2.92 26.4 30.1 4.89 3.15 27 31.4 5.44 3.14 26.2 30.8 4.93 3.18 26.8
29.5 3.67 4.35 26.9 30.1 3.56 4.44 26.4 30.4 4.34 4.35 27 28.8 5.13 4.43 26.2 30.9 5.12 4.31 26.8
30.5 2.46 4.54 26.9 29.5 2.67 4.67 26.4 30.2 3.67 4.56 27 30.4 5.42 4.36 26.2 30.5 5.34 3.87 26.8
31.1 2.82 4.22 26.9 28.8 2.57 4.4 26.4 29.7 3.57 4.33 27 31 5.55 4.29 26.2 30.8 5.66 3.23 26.8
29.6 3.17 4.94 26.9 30 2.81 4.83 26.4 31 3.81 4.8 27 28.9 5.52 4.64 26.2 28.9 3.23 4.54 26.8
29.8 2.61 4.62 26.9 29.9 3.14 4.82 26.4 30.4 3.27 4.73 27 28.9 5.61 4.55 26.2 30.1 5.28 4.43 26.8
30 2.86 5.61 26.9 29.6 3.21 5.56 26.4 30.4 3.43 5.76 27 28.9 3.67 5.61 26.2 29.2 5.23 5.61 26.8
75
Cuadro 16. Datos de la segunda evaluación con lechos de espesor 3 cm en diez días.
1 2 3
T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA
T1R1 29.0 4.24 3 27.3 29.1 4.02 3.10 27 29.9 5.01 2.8 27.4
T1R2 29.5 5.08 3 27.3 28.6 4.69 3.54 27 29.3 5.45 3.22 27.4
T1R3 29.3 4.74 3 27.3 27.2 3.92 3.50 27 28.7 5.23 2.96 27.4
T2R1 29.7 2.23 4 27.3 28.9 2.35 5.05 27 29.7 4.76 4.2 27.4
T2R2 29.7 2.99 4 27.3 27.6 3.03 5.09 27 29.5 1.93 4.83 27.4
T2R3 29.6 1.43 4 27.3 28.8 1.59 4.88 27 30.7 2.5 4.33 27.4
T3R1 29.8 0.61 5 27.3 27.9 2.12 5.47 27 28.8 1.37 4.51 27.4
T3R2 30.0 0.23 5 27.3 27.7 1.13 5.30 27 29.7 1.22 4.29 27.4
T3R3 29.7 0.14 5 27.3 27.8 1.12 5.10 27 30.2 1.48 4.42 27.4
76
4 5 6 7 8 9 10
T OD PH TA T OD PH TA
T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA T OD PH TA
29.7
5.02
2.96
26.8
29.6
4.39
3.25
26
26 5.45
3.54
24.9
28.7
5.41
3.66
27.2
27.2
5.32
3.95
26.5
29.5
5.18
3.91
27.8
30.1
5.71
3.88
16.8
29.2
5.65
3.67
26.8
29.7
4.26
3.78
26
25.4
5.35
3.74
24.9
28.3
5.45
4 27.2
27.7
5.02
3.78
26.5
29.4
4.89
3.81
27.8
30.5
5.77
3.68
16.8
28.9
5.21
3.26
26.8
31.3
4.95
3.6 26
26.7
5.18
3.9 24.9
28.4
4.77
3.98
27.2
27.6
5.08
3.73
26.5
28.7
5.44
4.05
27.8
30 4.93
3.95
16.8
32.1
5.78
3.8 26.8
27.9
4.69
4.1 26
26.6
4.94
4.5 24.9
28.6
4.58
4.77
27.2
27.9
5.26
4.5 26.5
30.1
5.12
4.44
27.8
31.3
5.24
4.45
16.8
31.4
2.65
4.91
26.8
27.2
4.21
4.99
26
26.2
4.23
5.12
24.9
28.8
4.31
4.98
27.2
27.7
4.16
4.49
26.5
29.5
5.42
4.34
27.8
30 5.34
4.32
16.8
30.8
2.23
4.45
26.8
26.6
4.72
4.62
26
25.8
5.46
4.58
24.9
28.8
4.81
4.47
27.2
27.7
4.23
4.51
26.5
29 5.55
4.45
27.8
29.7
5.66
4.28
16.8
29.9
1.23
3.9 26.8
26 3.25
4.28
26
26.2
3.95
4.6 24.9
30 3.61
4.48
27.2
27.4
3.91
4.23
26.5
29 5.52
4.1 27.8
30.4
3.23
4.05
16.8
30.3
1.32
3.83
26.8
25.3
2.48
4.13
26
26.4
2.38
4.78
24.9
28.1
4.74
4.58
27.2
27.6
2.05
4.72
26.5
29.5
5.61
4.85
27.8
30.7
5.28
4.7 16.8
30.4
1.97
4.44
26.8
25.6
3.13
4.85
26
26.7
2.17
4.98
24.9
27.9
3.64
4.93
27.2
27.7
3.79
4.94
26.5
28.8
3.67
4.91
27.8
31.3
5.23
4.45
16.8
77
Cuadro 17. Peso de la biomasa adherida a los lechos de 1.5 cm de espesor de cada tratamiento.
BIORREACTORES LECHOS PESO SIN BACTERIAS PESO CON BACTERIAS
BIOMASA (gr)
T3R1 LECHO 2 62.504 62.658 0.154 T3R2 LECHO 1 60.601 60.754 0.153 T3R3 LECHO 9 61.298 61.461 0.163 T2R1 LECHO 8 56.046 56.390 0.343 T2R2 LECHO 10 57.071 57.450 0.379 T2R3 LECHO 4 62.689 63.024 0.335 T1R1 LECHO 6 59.662 59.780 0.118 T1R2 LECHO 3 63.767 63.868 0.101 T1R3 LECHO 5 64.986 65.096 0.110
Cuadro 18. Peso de la biomasa adherida a los lechos de 3 cm de espesor de cada tratamiento.
PESO SIN BACTERIAS PESO CON BACTERIAS biomasa (g)
LECHO 2 91.190 91.4417 0.251 LECHO 1 95.883 96.1278 0.244 LECHO 9 96.1953 96.4348 0.239 LECHO 8 98.126 98.7219 0.595
LECHO 10 99.887 100.5465 0.659 LECHO 4 95.876 96.3835 0.506 LECHO 6 101.94 102.1634 0.217 LECHO 3 93.400 93.5807 0.180 LECHO 5 92.506 92.6717 0.165