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UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO
Maestría en Ciencias de la Producción y de la Salud
Animal
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
Efecto antagónico de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 sobre una cepa de
Escherichia coli O157:H7
T E S I S
Tutor: Dr. Guillermo Valdivia Anda. FES Cuautitlán
Académico Invitado: Dra. Adriana Llorente Bousquets. FES Cuautitlán
Comité Tutoral: Dra. Alma L Núñez del Arco. FES Cuautitlán
Dr. José Fernando Núñez Espinosa.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, C.U.
CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO DE MÉXICO 2013
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
P R E S E N T A
OSCAR ARTURO HERNÁNDEZ CASTILLO
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL
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2
Aunque el ingenio humano pueda crear invenciones varias […] nunca producirá ninguna
invención más bella, ni más simple, ni más apropiada que las que hace la �aturaleza;
porque en sus invenciones nada falta, nada es superfluo.
— Leonardo da Vinci
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Dedicatorias
A mis abuelos, Antonio Castillo † y Paula Castro † porque gracias a ellos empecé mi camino, esto es para ustedes.
A mis padres, Norma Castillo y Arturo Hernández quienes a base de sacrificios y esfuerzos toda mi vida me han dado más de lo que siempre he deseado.
A mi hermano, Omar; aunque siempre tenemos alguna diferencia, se que tu apoyo nunca me faltará.
A mi familia, cuya unión y apoyo incondicional han servido de pilares para superar todos los retos a los que me he enfrentado.
A mis amigos: Dan, Alma, Jonathan, Alex, Juan, JJ, César; Itz, Tere, Marco, Ana y Marco. Mis hermanos de aprendizaje, en distintas etapas pero
incondicionalmente a mi lado.
A mis tutores: Dra. Adriana Llorente y Dr. Guillermo Valdivia, quienes sin conocerme abrieron las puertas de sus laboratorios para brindarme la
oportunidad de crecer, concediéndome al mismo tiempo su valiosa amistad.
A mis profesores y maestros: MVZ. Marco Mendoza, Dr. Alejandro Martínez, Dr. Hugo Ramírez, M en A. Jorge López, M en C. Ricardo Oropeza, M. en C. María
Eugenia Posada, Dr. Jorge Tortora, Dr. Francisco Montiel quienes han contribuido en mi formación como mentores y amigos.
A Adriana, por seguir siendo mi fuente de inspiración aunque estemos recorriendo caminos separados.
A Mich, por todo lo que hiciste por mí y por la luz que brindaste a mi vida, mi niña.
A mis amigos de la Facultad: Viri, Mari Cruz, Nancy, Pamela, Carmen, Iván, Victor, Carlos, Aura, Patxi, Ricardo, Jonathan, Bety y todos mis cómplices que
compartieron conmigo sufrimientos y dichas durante el posgrado.
"Por fin lo entiendo. El hogar no es donde descansas. Es por lo que luchas."
—Elspeth Tirel
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ESTE TRABAJO FUE REALIZADO CON EL APOYO DE LOS PROYECTOS:
Programas de Apoyo de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)
IT202312
Programas de Apoyo de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)
IT224311-3
Programas de Apoyo de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) IN216005.
Programa de Apoyo a Proyectos para el Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME) PE 200707
El trabajo fue realizado con el equipo e instalación del:
Laboratorio de Bioconservación de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la FESC, Campo 4
Laboratorio de Patogenicidad Microbiana de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal de la FESC, Campo 4
Asimismo se recibió el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) con la beca: 245783
Agradezco a mis profesores y mentores de la Universidad Nacional Autónoma
de México quienes con sus enseñanzas y guía han contribuido a mi formación y
crecimiento.
“Por mi Raza Hablara el Espíritu”
Cuautitlán Izcalli, 2013
5
I"DICE
I"DICE DE TABLAS ................................................................................... 8
I"DICE DE FIGURAS ................................................................................. 8
RESUME" .................................................................................................... 9
I"TRODUCCIO" ....................................................................................... 10
1. MARCO TEÓRICO ............................................................................. 12
1.1 Inocuidad Alimentaria ....................................................................................................... 12
1.1.1 Patógenos emergentes..................................................................................................... 13
1.1.2 Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) .......................................................... 13
1.1.3 Escherichia coli O157:H7 ............................................................................................... 14
1.1.3.1 Escherichia coli en alimentos mínimamente procesados ........................................... 15
1.2 Bioconservación ................................................................................................................ 16
1.3 Bacterias Ácido Lácticas .................................................................................................... 17
1.3.1 Metabolitos de Bacterias Ácido Lácticas .......................................................................... 19
1.3.1.1 Ácidos orgánicos ...................................................................................................... 19
1.3.1.2 Bacteriocinas ............................................................................................................ 19
1.3.1.3. Enzimas ................................................................................................................... 22
1.3.1.4. Otros metabolitos ..................................................................................................... 22
1.3.2. Otros mecanismos ...................................................................................................... 23
1.4. Pediococcus acidilactici .................................................................................................... 23
2. A"TECEDE"TES ................................................................................ 24
3. JUSTIFICACIÓ" ................................................................................. 26
6
4. OBJETIVO GE"ERAL ....................................................................... 26
4.1. OBJETIVOS PARTICULARES ........................................................................................ 26
5. HIPÓTESIS ........................................................................................... 26
6. METODOLOGÍA ................................................................................. 27
6.1 Cepas Bacterianas .............................................................................................................. 27
6.1.1 Caracterización de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 ............................................. 27
6.1.1.1 Cinética de crecimiento de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en medio MRS
modificado. .......................................................................................................................... 27
6.1.1.2. Obtención del Sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 ...................... 28
6.1.2. Caracterización de Escherichia coli O157:H7 ............................................................. 28
6.1.2.1. Cinética de crecimiento de Escherichia coli O157:H7 .............................................. 29
6.1.2.2. Identificación de los genes de virulencia (stx1, stx2 y eae) mediante PCR ................ 29
6.2. Prueba del sobrenadante mediante difusión en agar (Llorente, 2008) .................................. 31
6.3. Prueba de inhibición en co-cultivo líquido (modificado de Ogawa et al, 2001) ................... 32
6.4. Prueba de toxicidad en células VERO (modificado de Parreira y col, 1994) ....................... 32
6.5. Prueba de co-cultivo separado por membranas ................................................................... 35
7. RESULTADOS ..................................................................................... 37
7.1 Caracterización de Cepas .................................................................................................... 37
7.1.1 Pediococcus acidilactici ATCC 8042 ........................................................................... 37
7.1.2. Escherichia coli O157:H7 ........................................................................................... 37
7.1.2.1 Confirmación de Genes de Virulencia: stx1 (+), stx2(+), eae(+)................................. 37
7.1.3 Cinéticas de Crecimiento ................................................................................................. 38
7.2 Prueba de Difusión en Agar. ............................................................................................... 40
7.3. Prueba de inhibición en co-cultivo líquido ......................................................................... 41
7.4. Prueba de Toxicidad en Células VERO.............................................................................. 45
7
7.5 Prueba de co-cultivo separado por membranas .................................................................... 48
8. DISCUSIÓ" .......................................................................................... 51
8.1 Prueba de difusión en agar .................................................................................................. 51
8.2 Pruebas de inhibición en co-cultivos ................................................................................... 52
8.3 Prueba en células VERO .................................................................................................... 54
8.4 Efecto inhibitorio ............................................................................................................... 55
8.5 Aplicaciones y sugerencias a posterior ................................................................................ 57
8.5.1 Fraccionamiento y purificación de sobrenadante .......................................................... 57
8.5.2 Pruebas enzimáticas ..................................................................................................... 58
8.5.3 Proyección a futuro como alternativa de Bioconservación ............................................ 58
9. CO"CLUSIO"ES ................................................................................... 60
10. REFERE"CIAS ................................................................................. 61
8
I"DICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición de la mezcla de Reacción para PCR. 30
Tabla 2.- Protocolo de amplificación para PCR de los genes de Virulencia de E. coli O157:H7. 30
Tabla 3.- Comparación de las curvas de crecimiento en los medios de cultivo utilizados. 43
I"DICE DE FIGURAS
Figura 1.- Esquema general de la fermentación de la glucosa en BAL. 13
Figura 2.- Mecanismos de acción de las Bacteriocinas de BAL. 20
Figura 3.- Distribución de las soluciones (caldo MRSm) y sus diluciones en las placas de 96 pozos. 33
Figura 4.- Esquema de distribución de las soluciones (caldo LB) y diluciones en las placas de 96 pozos. 34
Figura 5. Esquematización del dispositivo de co-cultivo con separación por membranas. 35
Figura 6.- Corrimiento electroforético en Gel de Agarosa, amplificados del PCR de E. coli O157:H7. 38
Figura 7.- Curva de crecimiento de E. coli O157:H7 en caldo LB. 38
Figura 8.- Curva de crecimiento de E. coli O157:H7 en caldo MRSm. 39
Figura 9.- Curva de crecimiento de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en caldo MRS modificado. 39
Figura 10.- Prueba de Difusión en Agar. 40
Figura 11.- Co-cultivo simultáneo (CC1) inóculo simultáneo en MRSm. 41
Figura 12.- Co-cultivo desfasado (CC2): P. acidilactici ATCC 8042 + E. coli.O157:H7 en MRSm. 42
Figura 13.- Co-cultivo desfasado (CC3): E. coli O157:H7 + P. acidilactici ATCC 8042 en MRSm. 43
Figura 14.- Fotografías de Microscopio óptico de los pozos de cultivo de células VERO. 48
Figura 15.- Comparación de las curvas de crecimiento del co-cultivo separado por membranas. 49
Figura 16.- Corrimiento electroforético de SDS PAGE en gel de poliacrilamida al 12% y en condiciones desnaturalizantes de los sobrenadantes de los cultivos bacterianos. 50
$Figura 17.- Cinética de crecimiento del co-cultivo separado por membrana millipore. 50
9
RESUME"
La tendencia mundial hacia el consumo de alimentos poco procesados pone de manifiesto la
importancia de garantizar que estos sean inocuos y de calidad. Patógenos emergentes como
Escherichia coli serotipo O157:H7 (E. coli enterohemorrágica o productora de Toxina de Shiga por
sus siglas en inglés: EHEC, STEC) representan un problema importante de salud pública. El
consumo de productos naturales poco procesados representa gran importancia sanitaria ya que
pueden estar contaminados con este patógeno. En la obtención y elaboración de estos productos
(embutidos cárnicos y quesos madurados) aparte de la materia prima de origen animal se utilizan
los llamados cultivos iniciadores (bacterias acidolácticas, BAL) cuyo metabolismo permite que el
producto adquiera sus características deseables. Entre estas bacterias, Pediococcus acidilactici
ATCC 8042 ha demostrado ser capaz de producir sustancias con actividad antibacteriana que
inhiben a otras bacterias ácido lácticas utilizadas en la industria alimentaria, así como a bacterias
Gram Positivas y Gram negativas de interés en alimentos.
En el presente trabajo evaluó la actividad inhibitoria de Pediococcus acidilactici ATCC 8042, en
contra de una cepa de referencia de Escherichia coli O157:H7. Utilizando técnicas de co-cultivo,
difusión en agar de sobrenadantes y citotoxicidad en cultivos celulares, se evaluó la actividad que P.
acidilactici ejerce sobre E. coli O157:H7.
Con los resultados obtenidos se pudo observar que la bacteria ácido láctica no ejerce un efecto
significativo por si misma, inclusive el medio de cultivo utilizado en los ensayos (MRS modificado)
es un factor estresante para el crecimiento del patógeno. También se ideo un dispositivo de co-
cultivo con el que se probó el crecimiento de los microorganismos en conjunto con un control sobre
las sustancias que entraban en contacto con cada uno de ellos.
También las pruebas realizadas sobre células VERO no permitieron una correcta apreciación de un
efecto de inhibición de la producción de toxina de shiga por parte de E. coli cuando está sometido a
una competencia de crecimiento con P. acidilactici.
Aunque los resultados obtenidos no permitirán una aplicación como alternativa a futuro en la
industria alimentaria, se obtuvieron datos que indican una posible inhibición de este patógeno por
parte de P. acidilactici bajo ciertas condiciones de cultivo.
10
I"TRODUCCIO"
Uno de los retos que el ser humano ha tenido que enfrentar desde el inicio de su existencia, radica
en la obtención y aprovechamiento de fuentes de alimento. Esto ha ido evolucionando desde el
desarrollo de la cacería en sus etapas de nómada, hasta la necesidad de mantener en buen estado y
almacenados durante distintos periodos de tiempo, los alimentos que eran obtenidos (Campbell-
Platt, 1994).
Registros de diversos métodos de conservación datan de tiempos tan remotos como 6000 años a.C.
y entre ellos destacan la utilización de procesos de fermentación. Entre los alimentos que se han
conservado a través del tiempo mediante estas técnicas destacan los lácteos, vegetales y los
productos cárnicos (Caplice y col. 1999; Ross y col. 2002).
Con el paso de los años y tras las revoluciones industriales, se han desarrollado métodos cada vez
más eficientes de conservación de alimentos que, sin embargo, aún se basan en las técnicas
desarrolladas en la antigüedad, pero con conocimiento cada vez mejor aplicados (Ross y col. 2002).
En todo el mundo, los alimentos fermentados representan cerca de un tercio del total del consumo
de alimentos en los seres humanos. Los alimentos fermentados tienen su mayor producción en
Norteamérica, Europa y África, mientras que las bebidas fermentadas se producen principalmente
en Sudamérica, en el medio Oriente se estilan más los productos lácteos fermentados y finalmente
en la región de la India los alimentos fermentados predominantes se basan en cereales y legumbres.
(Campbell-Platt, 1994)
Junto con la mejoría y el desarrollo de dichas técnicas de conservación, se han evidenciado y
estudiado las características inherentes de cada alimento y, a su vez, se han entendido las
interacciones que tienen con ellos los microorganismos presentes en su microambiente. Estos
microorganismos incluyen saprófitos, alterantes que pueden modificar las características del
alimento con el paso del tiempo e incluso patógenos que causan enfermedades de diversa magnitud
(Caplice, 1999).
La tendencia actual en el consumo y comercialización de alimentos se ha enfocado cada vez más a
su elaboración y conservación mediante procesos que no impliquen una industrialización ni
utilización excesiva de aditivos e ingredientes artificiales. La preferencia por alimentos
mínimamente procesados y la aparición de enfermedades emergentes causadas por alimentos (como
la salmonelosis, listeriosis y enfermedades gastrointestinales causadas por otras variedades de E.
11
coli) ha dado pié a la investigación y al desarrollo de procesos que aseguren que los alimentos sean
de calidad y aun mas importante que sean seguros para el consumo de manera natural (Campbell-
Platt, 1994).
El uso de microorganismos que permitan obtener productos con características agradables al
consumidor y que garanticen la seguridad de su consumo se ha vuelto un área en la que la
investigación debe proporcionar alternativas viables para satisfacer un mercado y resolver la
problemática emergente que el ser humano ha estado sufriendo a lo largo de los últimos años.
(Campbell-Platt, 1994; Steinkraus, 1986)
12
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Inocuidad Alimentaria
Para que un alimento sea considerado como seguro para su consumo, este debe cumplir con ciertas
características que deben estar aseguradas por aquellos involucrados en su proceso de producción.
El término de Inocuidad Alimentaria tiene varias definiciones, entre las que destacan, “La garantía
de que los alimentos no causarán daño al consumidor cuando se preparen y/o consuman de acuerdo
con el uso al que se destinen” (Codex Alimentarius, 2003). “Las prácticas que aseguran que los
alimentos no causen un daño al consumidor”. En ese mismo texto, se menciona que el término de
seguridad es muchas veces confundido con lo concerniente a la calidad y viceversa (Lawley, 2008).
Las actividades que garantizan que un alimento sea inocuo pueden clasificarse dentro de uno de
estos 3 rubros:
• La protección del alimento contra contaminaciones
• La prevención del desarrollo y diseminación de contaminación
• La remoción efectiva de los contaminantes
Para garantizar la inocuidad de los alimentos, se utilizan diversas técnicas que a lo largo de los años
se han venido mejorando, una de ellas es la utilización de microorganismos benéficos y sus
productos metabólicos que ayudan a cambiar propiedades y características en los alimentos: la
Bioconservación, que se define como el aumento en la vida de anaquel y la mejora en la seguridad
de los alimentos utilizando microbiota natural o controlada y/o sus productos antibacterianos que
producen naturalmente (Stiles, 1996).
Según Hugas (1998), la bioconservación puede lograrse aplicando cuatro métodos básicos:
1) Agregando un cultivo puro de bacterias viables y productoras de Bacteriocinas.
2) Agregando una preparación cruda de Bacteriocinas, licor de fermentación o concentrados
obtenidos del crecimiento de bacterias productoras de Bacteriocinas en un medio complejo.
3) Agregando las sustancias antagonistas purificadas o semi-purificadas.
4) Agregando bacterias acido lácticas mesofílicas que entren en acción cuando se rompa la
cadena fría.
13
1.1.1 Patógenos emergentes
Un patógeno emergente se define como aquel que causa enfermedades en una nueva población o
cuya incidencia ha ido aumentando a través de las últimas dos décadas. Al igual que las nuevas
tecnologías han permitido una producción cada vez más eficiente y segura de alimentos, los
organismos vivos tienden a adaptarse y evolucionar para poder sobrevivir a los estímulos
cambiantes del ambiente en el cual se desarrollan. Las bacterias no son la excepción y estos por su
simplicidad pueden sufrir cambios adaptativos de una manera acelerada. Debido a esto, algunos
agentes patógenos han sufrido cambios que los involucran con nuevos escenarios de aparición o
nuevos hospedadores a los cuales se han adaptado, incluso enfermedades que no se habían
reportado en una región o tiempo determinado han ido aumentado en su frecuencia de aparición.
(Adams & Motarjemi, 2006, CDC, USA).
Esto es de importancia en materia de inocuidad, ya que algunos de estos patógenos son
transmisibles a través de los alimentos (Meng, 1998).
1.1.2 Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA)
Es inherente de los alimentos el contener organismos vivos en ellos, ya que ningún alimento es
estéril (aun sufriendo técnicas de esterilización, necesita conservar ciertas características de
empaque para conservarse así) por la naturaleza ubicua de los microorganismos. Dentro de estos
podemos encontrar grupos que pueden ser benéficos o dañinos para el consumidor. La eliminación
de microbiota indeseable en los alimentos puede tener niveles aceptables si se trata de aquellos que
alteran las propiedades de los alimentos. En contraste, para los microorganismos patógenos (en
particular aquellos con una dosis infectante baja) el grado de inactivación debe ser mayor para
proveer un nivel aceptable de seguridad. Por ejemplo, varios brotes de enfermedad causada por
alimentos se han atribuido al consumo de salami madurado contaminado con Staphylococcus
aureus, Salmonella spp. y otros patógenos. (Adams, 2001)
El grupo de las enterobacterias es probablemente el mayormente asociado con la presentación de las
enfermedades transmitidas por alimentos, aunque no es necesario que existan malestares
gastrointestinales para considerar una ETA como tal. Dentro de las ETA pertenecientes al grupo de
las enterobacterias e inclusive que puede ser clasificada como enfermedad emergente se encuentra
la Colítis Hemorrágica causada por la Escherichia coli serotipo O157:H7 perteneciente al grupo de
las E. coli Entero-Hemorrágicas o Vero-Toxigénicas (EHEC o VTEC por sus siglas en inglés)
(Doyle, 1991).
14
1.1.3 Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli del serotipo O157:H7 ha sido reconocido como patógeno desde la década de los
80, siendo considerado desde ese entonces como un microorganismo transmitido por alimentos. Su
importancia radica en que es causante de Colitis Hemorrágica que puede complicarse con Síndrome
Urémico Hemolítico (SUH) (Feng, 1995).
Este serotipo posee genes para la producción de toxina de Shiga (Stx) la cual interfiere en la síntesis
de proteínas en células que poseen el receptor Globotriaosil-cerámido GB3 (células endoteliales y
del glomérulo renal principalmente). A su vez, posee la Isla de Patogenicidad del gen de adherencia
y borrado de vellosidades (LEE, Locus of Enterocyte Effacement o A/E , attaching and effacing) el
cual le permite alterar la función absortiva a nivel intestinal al codificar una adhesina y sus sistemas
de secreción que resultan en destrucción de microvellosidades del epitelio intestinal (Karmali,
2010).
Aislamientos del serotipo O157:H7 fueron implicados por primera vez en una enfermedad
producida por alimentos en 1982, con aproximadamente 30 brotes registrados (en Estados Unidos)
en la década siguiente. En 1993, recibe de nuevo atención al ocurrir un brote de enfermedad
producido por alimento el cual fue rastreado hacia el consumo de carne de hamburguesas mal
cocida y contaminada, proveniente de un restaurante de comida rápida. En este brote, más de 700
personas resultaron infectadas, con 51 casos reportados de SUH y 4 muertes. Desde ese brote, se
ha llevado a cabo un mejor monitoreo de este patógeno y han aumentado los reportes de casos
(Feng, 1995).
La contaminación de canales de bovino con E. coli O157:H7 productora de toxina de Shiga fue
recientemente demostrada en plantas de sacrificio de animales en el estado de Jalisco en México,
con un muestreo de 258 canales durante un periodo de 12 meses. En total se obtuvieron 7
aislamientos de E. coli O157:H7 de 258 canales muestreadas lo cual representa un 2.71% (Varela-
Hernández, 2007).
Los brotes por alimento causados por E. coli O157:H7 se asocian principalmente al consumo de
productos de origen bovino; sin embargo, recientemente se han reportado nuevos vehículos de
infección menos comunes como mayonesas, sidras de manzana e incluso chocolate; lo cual
demuestra que el microorganismo puede tener características no determinadas (Feng, 1995).
En la presente década se realizaron muestreos en dos plantas procesadoras de productos cárnicos,
una de cerdo y una de bovino de la Comarca Lagunera (Durango-Coahuila) en México que
15
confirman lo anterior. De un total de 18 muestras (nueve de cerdo y nueve de res), seis de cerdo
(66,66%) y seis de bovino (66,66%) fueron positivas por PCR (amplificando los genes rfbE, fliC,
stx1, stx2 y eaeA) para la presencia de E. coli serotipo O157:H7, demostrándose así que este
patógeno puede estar presente en ambos tipos de canal (Gallegos y col, 2009).
Las canales de bovino y las de cerdo pueden ser portadoras de E. coli O157:H7, lo que refleja la
habilidad de este patógeno para colonizar también a la especie porcina. Los resultados obtenidos a
través de PCR constituyen un aporte valioso en materia de inocuidad alimentaria y salud pública al
demostrar la presencia de E. coli O157:H7 enterohemorrágica en estos tipos de alimentos (Gallegos
y col, 2009).
Vazquez en el 2008, logró aislar 20 cepas de E. coli O157:H7 (40.8%) a partir de muestras
provenientes de cerdos de una explotación en México (12 casos que dieron 119 clonas de las cuales
se obtuvieron 49 cepas de E. coli). Las cepas identificadas estuvieron relacionadas a un cuadro de
diarreas hemorrágicas en cerdos.
1.1.3.1 Escherichia coli en alimentos mínimamente procesados
Los alimentos mínimamente procesados se han preferido por sobre otros tipos de alimentos debido
a sus características organolépticas. Sabores, aromas y texturas son características que son buscadas
y apreciadas cada vez mas por los consumidores alrededor del mundo. Estos incluyen alimentos sin
conservadores, producidos orgánicamente y en el caso del tema actual, los alimentos madurados
que se obtienen a partir de la fermentación de un sustrato para obtener un producto final con una
mayor vida de anaquel y que conservan o superan las características del producto original. (Caplice,
1999).
En lo que respecta a alimentos madurados; en diciembre de 1994, en el estado de Washington se
implicó como origen de un brote el serotipo O157:H7 en salamis madurados (Feng, 1995). Estudios
han demostrado la tolerancia de condiciones de acidez (tan bajo como 3.5), bajas temperaturas
(congelación) y desecación (que aumenta cuando existe sacarosa disponible) por parte de este
microorganismo, lo cual implica que alimentos que anteriormente se consideraban como
potencialmente seguros por sus características, ya no pueden ser considerados como tales
(Alexander, 1995) (Moore, 2004).
Otros brotes de importancia confirmados por productos cárnicos fermentados ocurrieron en
California del Norte (Tilden et al., 1996) y en Ontario, Canada (Williams et al., 2000); ocasionados
por salami madurado y salami de Genoa respectivamente.
16
En respuesta al brote reportado en 1994 proveniente de salami madurado, el Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos, en conjunto con el Servicio de Inspección de Seguridad de los
Alimentos (USDA/FSIS) desarrolló lineamientos que requerían que los fabricantes de productos
fermentados validaran que su proceso alcanzara una reducción significativa sobre E. coli O157:H7.
Varios estudios han demostrado que es capaz de sobrevivir al proceso de maduración de cárnicos.
Se ha demostrado que en brotes de enfermedad causados por E. coli O157:H7 la dosis mínima
infectante (DMI) es de tan solo 10-50 bacterias en población susceptible. (Tilden, 1996) Solamente
al aplicar procesamientos térmicos adicionales o periodos más largos de maduración se han
demostrado la factibilidad de alcanzar la reducción requerida (no detectable) (Karr, 2010).
1.2 Bioconservación
La Bioconservación es una manera de mejorar la vida de anaquel y la seguridad en los alimentos a
través de la utilización de microbiota competitiva, lo que además les confiere mejores
características sensoriales (Ross, 2002).
La inactivación o inhibición de microorganismos no deseados es parte esencial de la conservación
de alimentos. Una de las técnicas más utilizadas para conservar alimentos es la fermentación, la
cual se vale de cambios producidos por el metabolismo de sustratos por parte de los
microorganismos que ayudan al control de crecimiento e incluso a la eliminación de otros
microorganismos indeseables. Alimentos como productos lácteos, vegetales, carnes, pan y bebidas
(vino, cervezas) son producidos con ayuda de microorganismos específicos que transforman a lo
largo de su proceso de crecimiento los sustratos que darán lugar a productos deseables que son los
que confieren las características inherentes a cada alimento (Hugas, 1994; Caplice, 1999; Ross,
2002).
Dependiendo del tipo de fermentación (láctica, alcohólica, etc.), microorganismos patógenos
pueden ser (parcialmente) eliminados o su crecimiento puede ser inhibido por las sustancias
antibacterianas que se producen (ácido láctico, ácido acético, alcohol, entre otros). (Adams, 2001)
Se sabe que los microorganismos acido lácticos pueden producir un amplio rango de compuestos
antimicrobianos: sustancias proteicas (bacteriocinas, enzimas) y ácidos orgánicos; que pueden
inhibir o reducir microbiota indeseable en productos alimenticios. Hay autores que reportan la
inhibición de bacterias patógenas y putrefactivas por Bacterias Ácido Lácticas (BAL). Este tipo de
microorganismos se utilizan en productos madurados, ya que por su metabolismo son de utilidad
para madurar y conservar alimentos (Caplice, 1999).
17
Por otro lado, numerosos estudios han demostrado que inclusive en el tracto digestivo de diversos
animales, las bacterias acidolácticas realizan funciones benéficas como microbiota ya que proveen
sustancias necesarias, ayudan a metabolizar otras e implican una competencia para otros
microorganismos que podrían llegar a ser dañinos (Servin, 2004).
1.3 Bacterias Ácido Lácticas
Las Bacterias Acido Lácticas (BAL) son clasificadas dentro del grupo de las mesofílicas (pero
pueden crecer en rangos entre 4 y 45 °C) y crecen en pH mayormente ácidos (Caplice, 1994). La
característica primordial de este grupo de bacterias es la producción de ácido láctico a partir del
metabolismo de hexosas (Figura 1), obteniendo su energía por una fosforilación a nivel de sustrato
al carecer de un ciclo de Krebs funcional, obteniendo así ácidos orgánicos, alcohol y dióxido de
carbono a partir de carbohidratos. Dependiendo del tipo de metabolismo por el cual se obtiene el
ácido láctico, estas pueden clasificarse en homofermentativas que solamente producen lactato como
producto final a través de la vía Embden – Meyerhoff y heterofermentativas por producir lactato y
etanol como productos finales mediante la vía de las Pentosas; siendo las primeras las de aplicación
en la industria alimentaria. Como resultado de estas vías metabólicas, también se producen
sustancias que le dan las características deseables a los alimentos fermentados tal es el caso de
diacetilo, acetaldehído y algunos compuestos que pueden tener implicaciones positivas en la salud
de los consumidores como algunas vitaminas, antioxidantes y péptidos bioactivos. También se les
considera como pobremente proteolíticas aunque existen algunas excepciones (Caplice, 1999; Ross,
2002).
18
Figura 1 .- Esquema general de la fermentación de la glucosa en BAL (Modificado de Caplice, 1994)
En la maduración de productos cárnicos se utilizan diferentes cepas de BAL como cultivo iniciador,
entre ellas destacan los géneros: Lactobacillus, Bifidobacterium y Pediococcus.
A lo largo de los últimos años, el uso de estos cultivos iniciadores y sus metabolitos ha sido
reconocido como apto en los alimentos de consumo humano. La denominación GRAS (Generally
Recognized As Safe) otorgada por la FDA (Food and Drug Administration) de los Estados Unidos
de Norteamérica es una característica importante que le permite ser una alternativa viable en la
obtención de alimentos inocuos (Caplice, 1999).
Los alimentos fermentados han sido generalmente considerados como menos propensos que los
alimentos frescos, para fungir como vehículos de infecciones asociadas a alimentos o
intoxicaciones. Esto debido a la actividad competitiva y los metabolitos de la microbiota funcional.
Para lograr una interferencia entre microorganismos se establecen mecanismos como la
competición por los nutrientes, generación de ambientes desfavorables y la competencia por sitios
de adherencia o unión a sustratos (Caplice, 1999).
Para asegurar una fermentación satisfactoria y controlar el crecimiento de patógenos, se recomienda
el uso de iniciadores específicos. Los factores antibacterianos presentes en los alimentos
fermentados pueden afectar tanto el crecimiento como la supervivencia de patógenos bacterianos
que estén presentes en la materia prima cruda. En la mayoría de los alimentos fermentados, la
19
inhibición del crecimiento es más común y puede asegurar en la mayoría de los casos, niveles
seguros de microbiota (Hugas, 1994; Caplice, 1999).
1.3.1 Metabolitos de Bacterias Ácido Lácticas
1.3.1.1 Ácidos orgánicos
La producción de ácidos orgánicos como acético, propiónico y láctico por parte de las BAL es un
hecho confirmado y su mecanismo de acción está muy bien estudiado. Los ácidos orgánicos
interfieren con la membrana citoplasmática de la bacteria (tanto en su forma disociada como la no
disociada) al alterar su potencial de membrana y reducen el pH intracelular causando la inhibición
de una variedad de procesos metabólicos. Estos ácidos son capaces de inhibir bacterias, hongos y
levaduras (Caplice, 1999; Ross, 2002).
1.3.1.2 Bacteriocinas
Por definición, las Bacteriocinas son péptidos pequeños, estables al calor, producidos por bacterias,
que son activos en contra de otras bacterias y para las cuales el organismo productor cuenta con un
mecanismo específico de inmunidad (Cotter, 2005).
Al menos el 30% de las bacterias produce cuando menos una bacteriocina (y se piensa que hasta el
99%). Desde el descubrimiento de las colicinas producidas por cepas de E. coli se han estudiado sus
características, mecanismo de acción y posibles aplicaciones. En las BAL, el interés por conocer las
Bacteriocinas que son producidas y sus mecanismos de acción (Figura 2), radica en su proyección a
futuro como aditivos y herramientas de bioconservación.
Cotter en el 2005 propone un nuevo esquema de clasificación (modificando el anterior que constaba
de 5 grupos) con 3 clases principales para las Bacteriocinas producidas por BAL:
20
Figura 2.- Mecanismos de acción de las Bacteriocinas de BAL. Fuente Cotter, 2005.
� Clase I (Lantibióticos).- Son péptidos pequeños de entre 19 y 38 aminoácidos de longitud
que posee residuos de lantionina en su estructura y que en su síntesis sufren de
modificaciones post-traduccioón. Estos residuos de lantionina se caracterizan por formar
enlaces covalentes entre sus aminoácidos resultando en estructuras de anillos internos. A su
vez estos se dividen por su estructura y modo de acción en:
• Lantibióticos catiónicos anfifílicos elongados: causan la formación de poros que
conducen a la disipación del potencial de membrana y a la pérdida de metabolitos
pequeños de las células sensibles.
• Lantibióticos globulares: actúan a través de la inhibición enzimática.
21
Existen también algunos como la Nisina que poseen ambos mecanismos de acción y se les
asocia una molécula receptora la cual es el Lipido II responsable del transporte de
fragmentos de peptidoglicán a través de la membrana celular para su síntesis en la mayoría
de los casos.
� Clase II (Bacteriocinas que no contienen lantionina).- Estas Bacteriocinas actúan
induciendo la permeabilidad de la membrana, provocando así la salida de moléculas hacia
el exterior de la célula. Su clasificación tiene mayor complejidad:
• Clase IIa: Bacteriocinas tipo-pediocina, poseen un espectro limitado de acción que
a su vez está mayormente enfocado hacia el patógeno de alimentos Listeria
monocytogenes. Presentan entre 37 y 48 residuos de aminoácidos y poseen uno o
dos puentes disulfuro. La más representativa es la pediocina PA1 de Pediococcus
acidilactici.
• Clase IIb: Bacteriocinas de dos péptidos, necesitan de ambos para ejercer su efecto
el cual también implica una pérdida del potencial de membrana y la salida de iones
o la disminución de ATP intracelular.
• Clase IIc: Bacteriocinas cíclicas, unidas por un enlace covalente entre su porción C
y N terminal. Dentro de estas se encuentran la gassericina A y la reutericina & que
son Bacteriocinas no-lantibióticos que poseen D aminoácidos.
• Clase IId: el resto de las Bacteriocinas se engloba en este grupo, siendo definido
como “misceláneo” o “grupo linear de no-pediocinas de un péptido”.
� Clase III (Bacteriolisinas).- Proteínas antimicrobianas grandes y termolábiles. Actúan
mediante la lisis de las células blanco al catalizar la hidrólisis de la pared celular, cuentan
con un sitio activo de hidrólisis (similar a endopeptidasas) en el extremo N terminal y el
sitio de reconocimiento probablemente está en el extremo C terminal. Otra característica
importante es que a diferencia de los otros tipos de Bacteriocinas, las bacterias que las
producen no tienen genes de inmunidad en contra de ellas sino que su protección se basa en
la modificación de la estructura de su pared celular.
22
1.3.1.3. Enzimas
Los sistemas enzimáticos de las BAL son variados, pero dentro de ellos las proteasas juegan un
papel importante después de las enzimas encargadas de la degradación de los carbohidratos. Se han
reportado proteasas en los géneros Lactococcus, Streptococcus y Lactobacillus. Entre estas destacan
en importancia por su posible aplicación en la conservación de alimentos las Peptidoglicano
hidrolasas (PGH), las cuales tienen un efecto hidrolítico sobre la pared celular bacteriana. Aparte
del efecto en la maduración de los alimentos, estas enzimas proteolíticas juegan un papel en el
efecto inhibitorio mostrado en estudios en contra de microorganismos alterantes y patógenos de los
alimentos (Llorente, 2008).
1.3.1.4. Otros metabolitos
• Peróxido de Hidrógeno.- Es producido durante el crecimiento en condiciones aeróbicas. Su
modo de acción es mediante el efecto oxidante que ejerce hacia los lípidos de membrana y
las proteínas celulares. Cabe destacar que las BAL carecen de un sistema de catalasa para
degradar el peróxido de hidrógeno, pero algunas cuentan con un sistema de pseudo-
catalasa o catalasa dependiente de un grupo heme (Manual Bergey’s , 1986; Caplice, 1999;
Mares, 1994).
• Diacetilo.- Producto del metabolismo del citrato, confiere el característico olor y sabor a
mantequilla de los fermentados. Es más efectivo contra Gram negativos, levaduras y
hongos aunque los niveles logrados durante la fermentación no pueden asegurar una
participación activa en los mecanismos de inhibición. Se cree que interfiere con la
utilización de Arginina (Caplice, 1999).
• Reuterina.- Inhibe a la ribonucleótido reductasa. Se produce durante la fase estacionaria, en
condiciones anaeróbicas y en presencia de glicerol. Lactobacillus reuteri es la especie
productora por excelencia (Caplice, 1999; Ross, 2002).
• Dióxido de Carbono.- Formado sólo durante las fases de heterofermentación, contribuye a
la formación de un ambiente anaeróbico e inhibe el crecimiento de otros microorganismos
al actuar sobre la membrana celular y reduciendo el pH extra e intracelular (Caplice, 1999).
23
1.3.2. Otros mecanismos
Se ha demostrado que la producción de Bacteriocinas obedece al fenómeno del Quorum Sensing en
el cual la llegada a un nivel de la población bacteriana produce el aumento en la producción de un
inductor (en el caso de Gram positivos un péptido autoinductor) que activa o inhibe la expresión de
genes. Los autoinductores utilizados por las BAL son en la mayoría de los casos las mismas
Bacteriocinas o péptidos tipo bacterionina (Kuipers, 1998). Aunque no hay estudios específicos al
respecto, la interacción de bacterias de otros géneros con estos autoinductores puede también ser un
mecanismo de regulación e inhibición en las poblaciones de los microorganismos en los alimentos.
1.4. Pediococcus acidilactici
El género Pediococcus (pedium – superficie plana, plano; coccus – mora, baya; “cocos creciendo en
un plano”) tiene como características la forma esférica, bacterias Gram + , no esporuladas, no
móviles, anaerobios facultativos. El nombre hace referencia a su forma de división ya que se divide
en 2 planos, causando su típica agrupación en dupletes o tétradas. Miden de 0.6 a 1.0 µm de
diámetro dependiendo de la especie. Sus colonias son esféricas, de 1 a 2.5 mm de diámetro, lisas y
de un color blanco grisáceo. Pediococcus acidilactici (ácido láctico, productor de ácido láctico)
taxonomicamente se encuentra emparentada cercanamente con Pediococcus pentosaceus. (Garvie:
Manual Bergey’s, 1986)
Antes conocido como Pediococcus cerevisiae, P. acidilactici fue utilizado por primera vez como
cultivo iniciador en 1957 (Garvie: Manual Bergey’s , 1986; Llorente, 2008). Se ha utilizado como
producto iniciador principalmente en cárnicos, aunque su aislamiento inicial proviene de productos
lácteos y vegetales fermentados.
24
2. A"TECEDE"TES
Se ha demostrado que la producción de ácido láctico por parte de las BAL, puede reducir el
crecimiento de patógenos, incluida E. coli O157:H7 (Carey, 2008; Vallejo, 2009).
En 1999, Kang y Fung realizaron un estudio para determinar si al estimular el crecimiento de un
cultivo iniciador cárnico (Pediococcus acidilactici) en un medio de laboratorio (caldo BHI +
Cloruro de sodio 2.3% + 1.5% de sacarosa: LBHI) y durante la fermentación cárnica, se podría
controlar a E. coli O157:H7. Se demostró que el cultivo iniciador en salamis redujo el número de
E. coli de 7 a 5.1 Log, mientras que el mismo cultivo iniciador al ser estimulado con Manganeso y
un sistema enzimático que propicia un ambiente anaerobio (Oxyrase tm) logró reducirlo de 7 a 3.65
Log.
Vallejo y col (2008) utilizaron diferentes cepas de Lactobacillus aisladas de productos lácteos
elaborados con leche ovina y los enfrentaron a 3 cepas de E. coli O157:H7 en pruebas de difusión
en agar. Obtuvieron reducciones significativas en las poblaciones del patógeno y después de aplicar
tratamientos enzimáticos a los sobrenadantes de los cultivos iniciadores sin lograr alterar esta
actividad inhibitoria, llegaron a la conclusión de que la actividad se debía a los altos niveles de
producción de ácido láctico.
Otros productos del metabolismo de las BAL también son capaces de inhibir el crecimiento de
bacterias patógenas presentes en los alimentos. (Karska-Wysocki, 2009)
Estudios anteriores con otras BAL realizadas en co-cultivo han demostrado que son capaces de
sobrepasar e interferir en el crecimiento de ciertos patógenos gracias a los productos metabólicos
que estas producen (Litopolou, 1987).
En el año 2001, Ogawa y colaboradores lograron la completa inhibición de E. coli O157:H7 en un
modelo de fermentación in vitro utilizando Lactobacillus (casei y acidophilus) tras un periodo de 24
horas atribuyendo este efecto a la producción de ácido láctico.
Carey y colaboradores, en el 2008 utilizaron distintas cepas de bacterias acidolácticas (entre ellas
Pediococcus acidilactici) para probar la capacidad de alterar los mecanismos de producción de
toxina, específicamente de Stx2, llegando a la conclusión de que el pH es el que tiene un efecto de
regulación en contra de este factor de virulencia.
25
Se ha demostrado que Pediococcus acidilactici ATCC 8042 ejerce un efecto de bioconservación
primero in vitro (Llorente, 1998 y 2008) y después en embutidos cárnicos tipo salami, con una
disminución de la cuenta total de mesófilos aerobios, de bacterias ácido lácticas y de S. aureus. Este
efecto es mayor cuando se emplea el cultivo completo que cuando se emplean sobrenadantes
neutralizados (Rivera, 2005).
Llorente, en el 2008 demostró que la cepa de Pediococcus acidilactici ATCC 8042, que posee una
actividad lítica debido a peptidoglicano hidrolasas diferente a la producida por bacteriocinas
reportadas, y estos resultados ofrecen una nueva alternativa a las herramientas metabólicas
tradicionalmente utilizadas. También demostró que esta cepa carece de plásmidos similares a los
reportados como responsables de la actividad de pediocina en otras cepas del género. Reportó que el
daño celular producido en los microorganismos de prueba observados mediante Microscopía
Electrónica de Barrido fue un efecto lítico diferente al causado por la bacteriocina Nisina.
Asimismo dmostró la presencia de una actividad proteolítica sobre caseína y gelatina, que además
fue capaz de reconocer e hidrolizar a la elastina y que está asociada a la actividad antibacteriana en
otros géneros. Se encontró también una actividad peptidoglicano hidrolasa extracelular.
En Pediococcus acidilactici ATCC 8042, no pediocinogénica y con capacidad limitada de producir
ácido láctico está presente un grupo de enzimas con capacidad lítica (una con actividad de
peptidoglicano hidrolasa) de amplio espectro lo que explica su efecto bioconservador (Llorente,
2008).
García-Cano y colaboradores (2011) demostraron que Pediococcus acidilactici ATCC 8042 posee
al menos dos enzimas líticas, una con actividad de Peptidoglicano hidrolasa que se encuentra
adosada a la pared celular y que ejercen un efecto inhibitorio en contra de diversas cepas
bacterianas y entre ellas E. coli.
Se pretende demostrar el efecto de esta cepa de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en contra de
un patógeno con una Dosis Mínima Infectante (DMI) tan baja como lo es E. coli O157:H7 e
inclusive el efecto que pueda tener no solo en su crecimiento, sino en la producción de toxinas.
26
3. JUSTIFICACIÓ"
Debido a la presentación a nivel mundial de brotes de enfermedad causados por E. coli O157:H7
relacionados con alimentos mínimamente procesados y el impacto de estos en la salud pública, se
probará el efecto que tiene Pediococcus acidilactici ATCC 8042 al ser cultivados de manera
conjunta para evaluar su actividad inhibitoria ya que ha demostrado tener propiedades diferentes a
otros cultivos anteriormente probados en la industria alimentaria y así evaluar su posible utilización
como una nueva alternativa de Bioconservación.
4. OBJETIVO GE"ERAL
Evaluar la acción de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 in vitro sobre E. coli O157:H7.
4.1. OBJETIVOS PARTICULARES
• Evaluar la capacidad inhibitoria del sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC 8042
en contra de E. coli O157:H7 (EDL 933).
• Evaluar el efecto en el crecimiento de E. coli O157:H7 (EDL 933) por parte del cultivo
completo de Pediococcus acidilactici ATCC 8042.
• Determinar el efecto de la interacción de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 sobre la
producción de toxina de shiga por parte de E. coli O157:H7.
• Discutir la causa del efecto observable por parte de Pediococcus acidilactici ATCC 8042
sobre E. coli O157:H7.
5. HIPÓTESIS
Si Pediococcus acidilactici ATCC 8042 se enfrenta a un crecimiento conjunto con E. coli O157:H7
ejercerá un efecto inhibitorio y logrará afectar el crecimiento del patógeno.
27
6. METODOLOGÍA
6.1 Cepas Bacterianas
La cepa de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 liofilizada, fue proporcionada por la Dra. Adriana
Llorente Bousquets del laboratorio 7 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria (UIM) de la
FES Cuautitlán, UNAM.
La cepa de E. coli O157:H7 (EDL 933, cepa de referencia) fué proporcionada por el Dr. Guillermo
Valdivia Anda del laboratorio 3 de la (UIM) de la FES Cuautitlán, UNAM.
6.1.1 Caracterización de Pediococcus acidilactici ATCC 8042
Para Pediococcus acidilactici ATCC 8042, se verificó su caracterización, por medio de las
siguientes pruebas y en el orden que a continuación se presentan:
• Microscopía óptica de frotis teñido mediante tinción de Gram
• Siembra en agar Man Rogosa y Sharp modificado (MRSm)
• Perfil bioquímico mediante las pruebas de Catalasa, Oxidasa y API50 CH.
6.1.1.1 Cinética de crecimiento de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en medio MRS
modificado.
Se preparó un pre-inóculo, en 40 mL de Caldo MRSm y se incubó a 32 ± 2˚C, durante 16 a 18
horas, utilizando un agitador orbital; posteriormente, se inoculó un 2% del pre-inóculo, en 40ml de
caldo MRSm, en un matraz con capacidad de 50 mL y se incubó bajo las mismas condiciones.
Se construyó su gráfica de crecimiento, para determinar su fase logarítmica, velocidad de
crecimiento y tiempo de duplicación/generación; para esto, se tomó una muestra del contenido del
matraz previamente inoculado, al inicio y a las 4, 8, 12, 16, 20 y 24 horas (tiempo de muestreo), se
determinó la densidad óptica con un bio-fotómetro (Eppendorf AG 22331, Hamburgo Alemania),
utilizando el mismo medio sin inoculo como control. En cada tiempo de muestreo, se realizaron
diluciones decimales seriadas y se sembraron por goteo 20 µL de cada dilución por triplicado en
cajas con agar MRSm y se realizó el conteo de colonias para determinar las UFC/mL (Llorente,
28
2008). A partir de los datos obtenidos se graficaron UFC/mL contra tiempo y se obtuvieron los
datos de velocidad de crecimiento y tiempo de generación a partir de las siguientes fórmulas:
6.1.1.2. Obtención del Sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC 8042
Se inocularon matraces de 500 mL de caldo MRSm con cultivos de Pediococcus acidilactici ATCC
8042 en fase logarítmica y se incubaron durante 8 horas a 32 ± 2˚C para alcanzar nuevamente la
fase logarítmica (Llorente, 2008). Posteriormente se centrifugó el cultivo a 10,000g/20 min a 4˚C
(centrífuga refrigerada Eppendorf-Netheler-HinzGmbh 22331 Hamburg, Centrifuge 5403); se
decantó el sobrenadante y enseguida se esterilizó con membrana Millipore (0.22 µm). Se
alicuotaron tubos de 50 mL con 35 mL de sobrenadante filtrado y estos se almacenaron en un
ultracongelador REVCO a -70˚C durante 24 horas. Posteriormente se sometieron a liofilización
durante 36-48h y ya liofilizados se almacenaron a -20˚C hasta su uso. Para utilizarse se
reconstituyeron con 3.5 mL de agua destilada estéril, logrando concentrar el sobrenadante 10 veces.
(Llorente, 1998; 2008).
6.1.2. Caracterización de Escherichia coli O157:H7
Para E. coli O157:H7, la verificación de su identidad requirió de realizar las pruebas siguientes, en
estricto orden:
• Microscopía de frotis con tinción de Gram,
29
• Siembra en agar MacConkey.
• Perfil bioquímico mediante pruebas de Catalasa, Oxidasa e IMVyC.
• Se detectaron los genes de virulencia (stx1, stx2 y eaeA) mediante PCR.
6.1.2.1. Cinética de crecimiento de Escherichia coli O157:H7
Se preparó un pre-inóculo en 40 mL de cada medio a utilizar (caldo Luria Bertani (LB) y caldo
MRS modificado (MRSm, Apéndice 1) ) y se incubó a 35 ± 2˚C durante 16 a 18 horas;
posteriormente se inoculó un matraz de 50 mL con 40 mL del mismo medio con el 2% del pre-
inóculo y se incubó bajo las mismas condiciones.
Se construyó su gráfica de crecimiento para determinar su fase logarítmica, velocidad de
crecimiento y tiempo de duplicación; para esto, se tomaron muestra del contenido del matraz
previamente inoculado al inicio, 30, 60, 90, 120 minutos y 3, 4, 5, 6, 7 y 8 horas (para el caldo LB)
o cada 4 horas para el caldo MRSm. Se determinó la densidad óptica con un biofotómetro
Eppendorf modelo AG 22331 (Hamburgo, Alemania) utilizando el mismo medio sin inocular, como
control según el caso. En cada tiempo de muestreo se realizaron diluciones decimales seriadas
(hasta 10-7) y se sembraron por goteo 20 µL de cada dilución en cajas con agar nutritivo y se realizó
el conteo de colonias para determinar las UFC/mL. Con los datos obtenidos se graficaron UFC/mL
contra tiempo y se obtuvieron los datos de velocidad de crecimiento y tiempo de generación a partir
de las fórmulas mencionadas con anterioridad.
6.1.2.2. Identificación de los genes de virulencia (stx1, stx2 y eae) mediante PCR
Para identificar la presencia de los genes de virulencia característicos del patotipo EHEC en el
serotipo O157:H7 (producción de Toxina Shiga y locus de adherencia y eliminación de
microvellosidades) se utilizaron los siguientes iniciadores:
stx1 F 5´ CTG GAT TTA ATG TCG CAT AGT G 3´
R 5´ AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC 3´
stx2 F 5´ GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC 3´
R 5´ TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G 3´
eaeA F 5´ GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC 3´
R 5´CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG 3´
López y col, 2003
30
Se llevó a cabo el protocolo de PCR (basado en el protocolo tipo multiplex de López y col, 2003)
con las modificaciones que a continuación se mencionan:
Tabla 1. Composición de la mezcla de Reacción para PCR.
Componente / (concentración inicial) Cantidad /
(concentración final)
Solución amortiguadora (10x) (Mg Cl215 mM) 2.5 µL (1x) (Mg Cl21.5 mM)
d"TP’s (10mM) 1 µL (0.4 mM)
Iniciadores (1:10 del original) stx1 0.45 µM c/u
stx2 0.37 µM c/u
eaeA 0.3 µM c/u
Taq Polimerasa (0.5 U/µL) 2 µL (1 U)
H2O Cbp
AD" (muestra) 2 µL
Total 25 µL
Tabla 2.- Protocolo de amplificación para PCR de los genes de Virulencia de E. coli O157:H7
(modificado de López y col, 2003)
Fase
Desnaturalización
Inicial Alineación Extensión Desnaturalización Alineación Extensión Enfriamiento
T °C 94° 55° 72° 94° 55° 72° 4°
T 5 min 2 min 45 seg 45 seg 45 seg 10 min 4 min
CICLOS 1 1 35 1 1
31
• Protocolo de extracción de ADN
Para obtener el extracto de ADN un cultivo puro de E. coli O157:H7 fue cultivado toda la noche
sobre placas de Agar Soya Tripticaseína, se tomó una colonia con un asa de platino estéril y se
colocó en un vial Eppendorf de 1.5 mL de capacidad conteniendo 1 mL de agua estéril. El inóculo
se homogeneizó con un vórtex y la solución se sometió a ebullición durante 10 minutos, seguido de
un choque térmico por 5 minutos por inmersión en agua helada. Inmediatamente después se
centrifugó a 16000 g durante 10 minutos en una microcentrífuga 16K de BIORAD y se retiró el
sobrenadante a un nuevo vial el cual se guardó en refrigeración a 4 °C para su utilización como
muestra en la reacción de PCR. El mismo procedimiento se realizó a una cepa de E. coli, de
referencia (K12)., negativa a la presencia de los tres genes
Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de Agarosa al 1.5% (90 minutos,
85 V) teñido con bromuro de etidio (5µL en 70 mL de agarosa) y visualizados mediante luz UV en
un transiluminador.
6.2. Prueba del sobrenadante mediante difusión en agar (Llorente, 2008)
Se prepararon cajas de Petri de vidrio con 15mL de Agar Antibióticos no. 11. Una vez solidificadas,
se colocaron 7 penicilindros estériles de acero inoxidable distribuidos en la caja. Al mismo tiempo
se prepararon alícuotas de 15 mL de Agar LB semisólido (utilizando caldo LB adicionado de Agar
al 0.6%) a 40 °C aproximadamente, al cual, una vez pasada la prueba de esterilidad se le
adicionaron 20 µL de un cultivo de toda la noche de E. coli O157:H7, se mezcló suavemente y se
vertió en la caja una vez pasada la prueba de esterilidad. Se dejó solidificar a temperatura ambiente
durante 30 minutos y se retiraron los penicilindros. En los pozos formados se colocaron 150µL de
cada tratamiento: sobrenadante liofilizado y reconstituido (2 mg de proteína) y sus diluciones (1, 0.5
y 0.025 mg de proteína), caldo MRSm sin inocular, agua destilada estéril y ácido láctico al 2% (los
3 últimos como controles). Las cajas se dejaron en 2 condiciones: una a temperatura ambiente y otra
en refrigeración durante 2 horas e incubadas a 35±2°C durante 24 horas. La actividad inhibitoria se
evidenció por la presencia y medición de halos sin crecimiento alrededor del pozo.
32
6.3. Prueba de inhibición en co-cultivo líquido (modificado de Ogawa et al, 2001)
En un matraz con 40 mL de Caldo MRS se adicionaron 500 µL (con aproximadamente 108
UFC/mL) de cada cepa en cultivo de toda la noche. Ambas cepas debieron tener un tiempo de
crecimiento tal que se encontraran en la mitad de la fase logarítmica de crecimiento.
Se incubaron a 32 °C ± 2°C y se tomaron muestras del cultivo a las 0, 4, 8, 22 y 24 h. Se muestreó 1
mL para realizar diluciones seriadas que permitieran el conteo bacteriano. A cada tiempo de
muestreo se realizó la medición del pH en el medio.
De cada muestreo, se sembraron 2 agares para conteo colonial: MacConkey y MRS (E. coli
O157:H7 y Pedioco-ccus acidilactici ATCC 8042 respectivamente) con 20µL por dilución y por
triplicado. Se incubaron a 32°C por 18-24 h y se compararon las cuentas de UFC para cada
microorganismo en cada tiempo para determinar su comportamiento en crecimiento en co-cultivo.
*Se realizó la prueba también en caldo MRSm y utilizando 3 diferentes esquemas de inoculación:
cultivo simultáneo, cultivo inicial con Pediococcus acidilactici ATCC 8042 y posteriormente con E.
coli O157:H7 (tras 8 horas de incubación) y cultivo inicial con E. coli O157:H7 y posteriormente
con Pediococcus acidilactici ATCC 8042 (tras 8 horas de incubación). Esto para permitir evaluar
tanto el efecto del cultivo iniciador sobre el patógeno como el efecto inverso de estar presente.
Asimismo acercó la prueba a un escenario de “simulación” que correspondería a una contaminación
con el patógeno y su posterior interacción con el cultivo iniciador.
6.4. Prueba de toxicidad en células VERO (modificado de Parreira y col, 1994)
Se prepararon placas de cultivo celular de 96 pozos, cada uno con una monocapa de células VERO
cultivadas en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 2% de Suero fetal Bovino, durante
24-48h. Una vez obtenida la monocapa, se adicionaron 200 µL de las siguientes soluciones (las
cuales se centrifugaron y filtraron para eliminar células bacterianas) y sus diluciones con solución
Salina Fisiológica (SSF), por duplicado como se muestra en la figura 3:
33
I. Caldo MRSm sin inocular
II. Caldo LB sin inocular
III. Caldo LB inoculado con E.
coli O157:H7
IV. Caldo MRSm inoculado con
Pediococcus acidilactici
ATCC 8042
V. Caldo MRSm inoculado con
E coli O157:H7
VI. Sobrenadante de Co- Cultivo
(8h de crecimiento)
VII. Sobrenadante de Co- Cultivo
(12h de crecimiento)
VIII. Sobrenadante de Co- Cultivo
(16h de crecimiento)
IX. Sobrenadante de Co- Cultivo
(20h de crecimiento)
X. Sobrenadante de Co- Cultivo
(24h de crecimiento)
XI. Solución Salina Fisiológica
estéril
XII. Testigo sin tratamiento.
A. Sin diluir
B. 1:2
C. 1:4
D. 1:8
E. 1:16
F. 1:32
G. 1:64
H. 1:128
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 3.- Distribución de las soluciones (caldo MRSm) y sus diluciones
en las placas de 96 pozos.
*Las columnas 11 y 12 no se sometieron a diluciones.
34
Se incubaron las placas a 37º C en atmósfera 5% de CO2 durante 72 h. Se observó al microscopio
invertido la integridad y el estado de la monocapa celular en cada caso a las 24, 48 y 72 horas.
Siguiendo la misma metodología descrita anteriormente, se prepararon placas de 96 pozos con
células VERO y se sometieron a desafío con sobrenadantes de cultivos bacterianos en caldo LB
como se menciona a continuación:
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
A
B
C
D
A
B
C
D
Figura 4.- Esquema de distribución de las soluciones (caldo LB) y sus
diluciones en las placas de 96 pozos.
I Sin Diluir
II 10-1
III 10-2
IV 10-3
V 10-4
VI 10-5
VII 10-6
VIII 10-7
IX 10-8
X 10-9
A Caldo LB inoculado con P. acidilactici ATCC 8042
B Caldo LB inoculado con E. coli O157:H7
C Sobrenadante de co-cultivo de caldo LB con 0.65 g de proteína.
D Sobrenadante de co-cultivo de caldo LB con 1.35 g de proteína
Caldo LB sin inocular
Solución salina Fisiológica estéril
Sin tratamiento
35
6.5. Prueba de co-cultivo separado por membranas
Se ideó un dispositivo de co-cultivo para lograr la separación física de ambos microorganismos
mediante membranas, para propiciar la interacción de los productos de su metabolismo e impedir el
contacto directo de las células entre ellas.
Este dispositivo se esquematiza en la figura 5 y constó de lo siguiente:
• Contenedor de virio con tapa metálica en la cual se ajusta el compartimiento interno.
• El compartimiento interno formado por un tubo de acero inoxidable en forma de “T”
invertida unido a la tapa del recipiente de vidrio en cuyos extremos se colocaron mediante
uniones con rosca y empaques las membranas de separación.
• Membranas: de filtración (Millipore) con tamaño de poro de 0.22µm y membrana de
diálisis con poro de separación para partículas mayores a 12 KDa.
• Agitador magnético en el compartimiento exterior el cual permitió generar una corriente de
recambio del medio entre ambos compartimentos.
Figura 5. Esquematización del dispositivo de co-cultivo con separación por membranas.
36
Se sometió el dispositivo primero a un tratamiento de esterilización con agua destilada para eliminar
sustancias que pudieran ser dañinas para los cultivos y para corroborar la integridad de las
membranas. Posteriormente se ensambló el dispositivo y se llenó el compartimento interior y el
exterior con caldo MRSm y se esterilizó mediante calor húmedo (121 °C, 15 minutos, 15 Lb de
presión). Tras haberlo incubado toda la noche para garantizar su esterilidad, se procedió a realizar la
prueba de inhibición en co-cultivo (como se describió anteriormente) al inocular a Pediococcus
acidilactici ATCC 8042 en el compartimiento interior y a E. coli O157:H7 en el compartimiento
exterior. Esto con la finalidad de lograr la separación física de las células pero permitiendo la
interacción de sus productos metabólicos con pesos moleculares menores a 12 KDa gracias a la
membrana de diálisis y el filtro millipore.
En un experimento subsecuente se utilizó solamente la membrana Millipore (0.220.22µm) para
poder dilucidar el efecto de todos los metabolitos de las cepas bacterianas sin permitir el contacto
entre las células.
Para corroborar la integridad de las membranas utilizadas, se procedió a correr un perfil general de
proteínas mediante electroforésis en gel de poliacrilamida al 12 % en condiciones desnaturalizantes
(SDS PAGE) corriendo a la par los sobrenadantes del compartimiento interno, el compartimiento
externo y el medio (MRSm) sin inocular y un marcador de peso molecular (Amersham®, Low-
Range Rainbow Marker RPN755) como referencia de los pesos moleculares obtenidos,
posteriormente se tiñó el gel con nitrato de plata.
37
7. RESULTADOS
7.1 Caracterización de Cepas
Confirmación de Pureza e identidad de las cepas
7.1.1 Pediococcus acidilactici ATCC 8042
� Cocos Gram positivos. Agrupados en tétradas.
� Crecimiento en Medios MRS y MRS modificado (colonias pequeñas, redondeadas y
blanquecinas).
� Sin crecimiento en Agar MacConkey.
� Perfil de Fermentación de Carbohidratos (API 50CH, Biomereux) Tabla 3.
De acuerdo con el perfil de fermentación obtenido y analizado con el Software APILAB Plus
(Analytical Profile Index V 3.2.2) se establece una correlación de 99.9% con Pediococcus
acidilactici. (Apéndice 2)
7.1.2. Escherichia coli O157:H7
� Bacilos Gram –
� Crecimiento en Medios MRS y MRS modificado (lento, colonias transparentes, pequeñas y
redondeadas-difusas)
� Crecimiento en Agar MacConkey (colonias medianas, color rosa sólido)
� Lo anterior en conjunto con los resultados de las pruenas bioquímicas (Indol +, MR +, VP -
Citrato -) confirman la identidad de la cepa EDL 933 como Escherichia coli.
7.1.2.1 Confirmación de Genes de Virulencia: stx1 (+), stx2(+), eae(+)
Se logró la amplificación de 3 bandas de distinto peso molecular, que corresponden a los genes de
virulencia stx1 (150 pb), stx2 (255 pb) y eaeA (384 pb) como se observa en la Figura 6:
38
Figura 6.- Gel de Agarosa al 1.5% tras corrimiento electroforético y teñido con Bromuro de Etidio. Carril 1: Marcador de tamaño
INVITROGEN® 1kB DNA Ladder, Carriles 2 a 4: amplificados de la cepa EDL933 de E. coli O157:H7. Las bandas que se observan
corresponden a los 3 genes de virulencia probados: (2) stx1 150 pb, (3) stx2 255 pb, (4) eae 384 pb. Carril 5 Cepa E. coli K12 (control
negativo), Carril 6 , blanco.
7.1.3 Cinéticas de Crecimiento
Escherichia coli O157:H7 tuvo un crecimiento muy rápido en el caldo LB, alcanzando su fase
estacionaria a las 3 horas de haber sido inoculado, con una velocidad de crecimiento de 2.7
generaciones por hora y un tiempo de duplicación de 0.3 horas. Se presenta su gráfica de
crecimiento en la figura 7.
Figura 7.- Curva de crecimiento de E. coli O157:H7 en caldo LB
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
0 2 4 6 8 10
Log
UFC
/mL
Tiempo (h)
E. coli O157:H7 en caldo LB
1 2 3 4 5 6
39
Por otra parte, en caldo MRSm su comportamiento se vió alterado, aunque logró crecer de una
manera favorable, su velocidad de crecimiento disminuyó a 0.43 generaciones por hora y su tiempo
de duplicación aumentó a 2.32 horas. La fase estacionaria la alcanzó entre las 8 y las 12 horas con
una pendiente de crecimiento ligera que se extiende hasta las 16 horas (figura 8).
Figura 8.- Curva de crecimiento de E. coli O157:H7 en caldo MRS modificado.
Pediococcus acidilactici ATCC 8042 tuvo un crecimiento muy favorable en caldo MRSm,
alcanzando una fase estacionaria después de las 8 horas de inoculación, tuvo una velocidad de
crecimiento de 0.65 generaciones por hora y un tiempo de duplicación de 1.51 horas (figura 9).
Figura 9.- Curva de crecimiento de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en caldo MRS modificado.
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Log
UFC
/mL
Tiempo (h)
E. coli O157:H7 en Caldo MRSm
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Log
UFC
/mL
Tiempo (h)
Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en Caldo MRSm
40
7.2 Prueba de Difusión en Agar.
Se probaron diluciones del sobrenadante liofilizado y reconstituido de Pediococcus acidilactici
ATCC 8042 sobre un césped de E. coli O157:H7. Sin embargo no se observaron halos inhibitorios
en ningún caso. Los controles introducidos en la prueba evidenciaron que solamente el ácido láctico
al 2% proporcionaba un halo de inhibición evidente, el cual midió 1.7 cm de diámetro en el caso de
la prueba que se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas y 2.2 cm de diámetro en el caso
de la prueba que se refrigeró durante 2 horas antes de ser incubada (figura 10).
Figura 10.- Diluciones seriadas del sobrenadante de Pediococcus acidilactici sobre un césped de E. coli O157:H7. A:
Prueba a temperatura ambiente por 2 horas previa incubación, B: prueba refrigerada 2 horas previa incubación.
I: Sobrenadante concentrado, II: sobrenadante diluido 1 en 2, III: sobrenadante diluido 1 en 4, IV: sobrenadante diluido 1
en 8, V: ácido láctico al 2%, VI: caldo MRSm sin inocular y sin diluir, VII: Agua destilada estéril.
II
III IV
V
I VI
VII
A
I
II
III IV
V
VI
VII
B
41
7.3. Prueba de inhibición en co-cultivo líquido
Se encontraron diferentes resultados de acuerdo al esquema de inoculación que se utilizó en cada
caso, pudiéndose observar un comportamiento de disminución en el crecimiento de E. coli O157:H7
solamente en uno de los casos.
Primero, en el caso del co-cultivo simultáneo, el crecimiento de E. coli O157:H7 no rebasó las 8
horas, mostrando una disminución total de su crecimiento pasado este tiempo. En contraste,
Pediococcus acidlilactici ATCC 8042 creció favorablemente hasta las 12 horas de inoculación, pero
mostró un ligero descenso en su conteo que lo situó en números similares a los que tenía de inicio,
lo cual nos indica que posiblemente exista un efecto también sobre el crecimiento del cultivo
iniciador por algún efecto atribuible al patógeno (figura 11). Las variables que se calcularon en las
cinéticas normales de crecimiento, no fueron calculadas en el caso de E. coli O157:H7 ya que se
careció de los datos necesarios al no haber un crecimiento pasadas las 8 horas. En cuanto a
Pediococcus acidilactici ATCC 8042 su velocidad de crecimiento fue de 0.56 generaciones por
hora y su tiempo de duplicación fue de 1.77 horas, no logrando alcanzar una fase estacionaria
evidente.
Figura 11.- Co-cultivo simultáneo (CC1) inóculo simultáneo en MRSm.
Segundo, cuando se inoculó a Pediococcus acidilactici ATCC 8042 de inicio y a las 8 horas de
crecimiento se inoculó a E. coli O157:H7, el comportamiento fue más favorable para el patógeno.
Pediococcus acidilactici ATCC 8042 mostró un crecimiento similar a su cinética normal, solamente
que alcanzó la fase estacionaria hasta las 12 horas, con una velocidad de crecimiento de 0.62
generaciones por hora y u tiempo de duplicación de 1.5 horas. En cuanto a E. coli O157:H7 se
1.00E+01
1.00E+03
1.00E+05
1.00E+07
1.00E+09
0 5 10 15 20 25 30
UFC
/mL
Horas
Curva de crecimiento en Caldo MRSm
Pediococcus
E. coli
42
observó un comportamiento anormal ya que entre las 16 y las 20 horas presenta una “meseta” en su
crecimiento y posteriormente continúa creciendo, presenta una velocidad de crecimiento de 0.88
generaciones por hora y un tiempo de duplicación de 1.12 horas. En el tiempo medido no se
observó que alcanzara una fase estacionaria evidente (figura 12).
Figura 12.- Co-cultivo desfasado (CC2) inóculo Pediococcus acidilactici ATCC 8042 + E. coli.O157:H7 en
MRSm
Tercero, el último escenario de desafío que se utilizó fue la inoculación inicial de E. coli O157:H7 y
una posterior inoculación de Pediococcus acidilactici ATCC8042 transcurridas 12 horas de
crecimiento, esto para simular una situación de contaminación natural y un intento por interferir con
el patógeno al agregar un cultivo iniciador. E. coli O157:H7 mostró una cinética de crecimiento
favorable durante casi todo el tiempo de muestreo con el inicio de su fase estacionaria a las 12 horas
y fue sólo hasta después de las 24 horas (tiempo coincidente con el inicio de la fase estacionaria de
Pediococcus acidilactici ATCC 8042) que se observó una alteración en su cuenta viable, las
determinaciones en este caso fueron de una velocidad de crecimiento de 0.7 generaciones por hora y
un tiempo de duplicación de 1.41 horas. Para Pediococcus acidliactici ATCC 8042 se observó una
cinética de crecimiento de forma normal, alcanzando una fase estacionaria después de 12 horas de
incubación y manteniéndola hasta el último momento del muestreo. Sus determinaciones dieron una
velocidad de crecimiento de 0.48 generaciones por hora y un tiempo de duplicación de 2.05.
Aunque no se logró una inhibición total en los tiempos utilizados, se observa una disminución
aparente en los conteos de E. coli de 6x109 a 1.3x108 (figura 13).
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
0 5 10 15 20 25 30
Log
UFC
/mL
Horas
Curva de crecimiento en Caldo MRSm
Pediococcus
E. coli
43
Figura 13.- Co-cultivo desfasado (CC3) inóculo E. coli O157:H7 + Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en
MRSm.
Para realizar la comparación de las variables obtenidas en cada determinación, se agruparon en una
tabla donde se incluyen los datos de las cinéticas de crecimiento de cada microorganismo por
separado (tabla 3).
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
0 10 20 30 40
Log
UFC
/mL
Horas
Curva de crecimiento en Caldo MRSm
Pediococcus
E. coli
44
Tabla 3.- Comparación de las curvas de crecimiento (Tiempo de Duplicación y Tasa de crecimiento) en los medios de
cultivo utilizados.
Cepa Medio Tiempo de duplicación (G) Tasa de crecimiento
E coli LB (sola) 0.3 h 2.72 gen/h
E coli MRSm (sola) 2.3 h 0.43 gen/h
Pediococcus MRSm (sola) 1.5 h 0.65 gen/h
E. coli MRSm (cc1) - -
Pediococcus MRSm (cc1) 1.7 h 0.56 gen/h
E. coli MRSm (cc2) 1.1 h 0.88 gen/h
Pediococcus MRSm (cc2) 1.5 h 0.62 gen/h
E. coli MRSm (cc3) 1.4 h 0.70 gen/h
Pediococcus MRSm (cc3) 2.0 h 0.48 gen/h
Claves:
cc1: Co-cultivo iniciando al mismo tiempo
cc2: Co-cultivo iniciando con Pediococcus acidilactici ATCC 8042 y agregando E. coli O157:H7 a
las 8 horas.
cc3: Co- cultivo iniciando con E. coli O157:H7 y agregando Pediococcusacidilactici ATCC 8042 a
las 12 horas.
LB: caldo Luria Bertani
MRSm: Caldo MRS modificado.
- : Sin crecimiento
45
7.4. Prueba de Toxicidad en Células VERO
Se utilizaron placas de 96 pozos cultivadas con células VERO. Adicionadas con medio mínimo
esencial (MEM) y 2% de suero fetal bovino para retrasar su crecimiento. Se sometieron al contacto
con distintos tipos de sobrenadantes de cada medio sin células como se detalló anteriormente y se
incubaron a 36 ± 1°C durante 5días. Se presentan los resultados del día 2 y del día 5.
Día 2
En todos los casos, al utilizar la solución SIN DILUIR se observó que las células fueron afectadas
en su totalidad. A partir de la primera dilución el efecto fue variable:
• MRSm sin inocular: Resultó un medio con componentes demasiado agresivos para permitir
el crecimiento celular normal, observándose solamente un crecimiento moderado a partir de
la dilución 1:8 de alrededor de un 60% de células normales, correspondiendo el otro 40% a
células con alteraciones citoplasmáticas y redondeadas
• Luria sin inocular.- Permitió un crecimiento bastante bueno desde la primera dilución,
observando un aumento en la confluencia de la monocapa celular y sin observarse cambios
morfológicos aparentes.
• Luria inoculado con E. coli O157:H7.- Se observo escaso crecimiento celular (5%) con
alteraciones citoplasmáticas (vacuolización) desde la dilución 1:4, pero este aumento
conforme la dilución progresa hasta llegar al 40% de normalidad y un 60% con alteraciones
citoplasmáticas y redondeadas.
• MRSm inoculado con Pediococcus.- Se observo crecimiento normal a partir de la dilución
1:32 con un 70% (el 30% restante se observan redondeadas) y este fue aumentando.
• MRSm inoculado con E. coli.- Desde la primer dilución se aprecio un crecimiento de un
60% con alteraciones citoplasmáticas sin estar redondeadas, conforme la dilución avanza,
este disminuyo.
• Diluciones de Sobrenadante del co-cultivo en MRSm a distintos tiempos.- Se observaron
alteraciones del crecimiento con cambios citoplasmáticos en un 40% y células redondeadas
en el 60% restante. Esto a partir de las diluciones 1:32 en todos los casos. Cabe señalar que
en los tratamientos de las 16 y 20 h se pudo apreciar un ligero crecimiento (30%) solamente
con cambio vacuolizante en citoplasma y el restante 70% se observaron redondeadas y no
tan afectadas.
46
• SSF.- Se observo un crecimiento normal en un 90% de las células, el 10% se observaron
redondeadas.
• MEM.- Se logro apreciar un crecimiento sin cambio morfológico aparente de un 80% de las
células, el 20% restante se observaron redondeadas.
Día 5
• MRSm sin inocular.- El crecimiento normal disminuyo hasta un 30-50%, habiendo incluso
menos células con cambios morfológicos (alrededor del 30% solamente). Se observaron
menos células en total.
• Luria sin inocular.- A partir de la segunda dilución, el crecimiento de células normales se
encontró en un estable 95% del total, con solo un 5% de células redondeadas y una
confluencia excelente que abarco casi la totalidad del pozo.
• Luria inoculado con E. coli.- A partir de la dilución 1:8 se observo crecimiento escaso y
entre un 2 y un 40% de la población se observo con alteraciones citoplasmáticas (vacuolas).
El número total de células se vio disminuido considerablemente.
• MRSm inoculado con Pediococcus.- A partir de la dilución 1:16 se observo buen
crecimiento de células normales y un 90% de ellas no presentaron cambios aparentes, es
decir se observó un crecimiento favorable de las células.
• MRSm inoculado con E. coli.- Se observo un crecimiento errático que no concuerda con las
diluciones empleadas. El porcentaje de células fue desde un 6% de crecimiento con
cambios citoplasmáticos, hasta un 80% de células normales en la dilución 1:32.
• Diluciones de Sobrenadante a distintos tiempos.- Se observo un crecimiento disminuido en
los pozos con los sobrenadantes más concentrados. Las muestras de los tiempos 16, 20 y 24
lograron un crecimiento aceptable (40% con cambio citoplasmático en la hora 20 hasta un
95% de células normales en el tratamiento de la hora 24) en las diluciones 1:64. Existió una
mayor confluencia de la monocapa en estos casos. Se aprecia un mejor crecimiento celular
y solo era notable un ligero cambio citoplasmático a comparación de la medición anterior.
• SSF.- Presento una confluencia casi total de la monocapa con un 90% de las células en
buen estado. La pérdida de monocapa es atribuible al tiempo de crecimiento del cultivo
celular.
• MEM.- La monocapa se perdió un poco y se observaron cúmulos aislados de células
normales. La pérdida de monocapa es atribuible al tiempo de crecimiento del cultivo
celular.
47
Para obtener el título de citotoxicidad, se debe utilizar el recíproco de la mayor dilución que indujo
un 50% de cambios citopáticos como lo refieren Konowalchuk y colaboradores (1977). Tomando
en cuenta la columna 3 (E. coli crecida en caldo LB), a partir de la dilución 1:8 en el día 7 se
observaron algunas células sin cambio en número hasta del 40%, es decir que el 60% aún se
observaban alteradas; y no se recuperaron en la última dilución (1:256). Por lo tanto el título de la
Toxina se conservo incluso hasta la última dilución y no fue posible obtenerlo en esta prueba.
En cuanto a la segunda prueba de desafío utilizando solamente caldo LB, se obtuvieron los
siguientes resultados. En los primeros días las características celulares eran similares:
Dia 3
Los controles de solución salina, caldo LB sin inocular y las células sin tratamiento se observaron
con una buena confluencia y el 100% de las células observadas presentaron una morfología normal,
con citoplasma y núcleo definidos y sin daño observable (Figura14 D).
El tratamiento del sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 presentó alteraciones sólo
en la columna I en la cual se colocó concentrado, observándose sólo un 40% de confluencia en el
pozo y la mitad de las células se observaron con daño citopático, redondeadas pero aún adheridas al
fondo del pozo (Figura 14 C). A partir de la dilución 1:10 las células no presentaron cambios.
En el tratamiento del sobrenadante de E. coli O157:H7 se observaron daños en la totalidad de las
células hasta la dilución 1:100, observándose daño citolítico y células encogidas, muy pequeñas y
despegadas del fondo del pozo (Figura 14 A y B). El efecto se observó con disminución a partir de
la dilución 1:1000 y se eliminó por completo a la dilución 1:1 000 000, por lo que la última dilución
en la cual se observó daño celular fue en la 1:100 000. Así, el título de toxina se estima en 5x105
UC/mL (unidades citotóxicas por mililitro).
Los tratamientos de co-cultivo de igual forma se observaron con daños citopáticos y citolíticos,
observándose un menor daño a las células en el tratamiento con 1.35 g de proteína de sobrenadante,
pero aún así el daño persistió hasta la dilución 1:10 000, el daño en el caso del tratamiento con 0.65
g de proteína de sobrenadante se observó hasta la dilución 1:1 000 000.
Dia 5
Se observó de manera similar el comportamiento de todos los pozos, el único cambio distinguible es
la muerte celular en el caso de los pozos que no obtuvieron tratamiento.
48
Figura 14.- Fotografías de Microscopio óptico (aumento 40x) de los pozos de la placa de 96 pozos con cultivo de células
VERO a las 72 horas post desafío con sobrenadantes de cultivo en caldo LB. A y B: pozos con sobrenadante de E. coli
O157:H7 concentrado y dilución 1:1000 respectivamente, C: pozo con sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC
8042 concentrado, D: pozo con solución salina fisiológica estéril (control).
7.5 Prueba de co-cultivo separado por membranas
Se realizó el muestreo (0,16, 20, 24 y 38 horas) y conteo colonial de los compartimentos interno y externo (correspondiente a Pediodoccus acidilactici ATCC 8042 y E. coli O157:H7 respectivamente). De igual forma al alcanzar las 24 horas de cultivo se tomaron muestras de ambos compartimentos y se centrifugaron y filtraron para obtener el sobrenadante y realizar el corrimiento electroforético.
Para realizar los conteos coloniales se sembró en agar MacConkey y agar MRS a los tiempos 0, 12, 16, 20 y posteriormente a las 38 horas de iniciado el inóculo, obteniéndose los valores mostrados en la figura 15.
No se obtuvo desarrollo de E. coli internamente ni de Pediococcus acidilactici en el compartimiento exterior.
A B
C D
49
Figura 15.- Comparación de las curvas de crecimiento del co-cultivo separado por membranas.
En cuanto a la prueba de integridad de las membranas del dispositivo de co-cultivo mediante el
corrimiento de electroforesis SDS PAGE se obtuvieron diferentes perfiles de proteína como se
puede apreciar en la figura 16, donde se observan 4 bandas comunes a ambos cultivos entre 20 y 30
KDa siendo más intensas en el caso de Pediococcus acidilactici ATCC 8042, bandas que se
encuentran en ambos compartimientos y también están presentes en el medio de cultivo sin inocular
(entre 20 y 30 KDa), bandas que están presentes solo en el sobrenadante de E. coli O157:H7 de más
de 30 KDa y bandas que sólo están presentes en el caso del sobrenadante de Pediococcus
acidilactici ATCC 8042 que se encuentran en pesos de 7, 13 y 16 KDa aproximadamente.
Las bandas sólo presentes en el sobrenadante de E. coli O157:H7 pueden corresponder a la toxina
de Shiga por corresponder con los pesos moleculares reportados en la bibliografía (Karmali, 2010).
De igual forma, las proteínas encontradas en el sobrenadante de P. acidilactici son productos de su
metabolismo.
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
1.00E+11
0 10 20 30 40
Log
UFC
/mL
Horas
Curvas de crecimiento en co-cultivo separado por membranas
Pediococcus acidilactici ATCC 8042
E coli O157:H7
50
Figura 16.- Corrimiento electroforético de SDS PAGE en gel de poliacrilamida al 12% y en condiciones desnaturalizantes. Tinción con nitrato de plata. *kDa: kiloDálton, MPM: marcador de peso molecular, MRSm SI: caldo
MRSmodificado sin inocular.
El segundo experimento que se realizó con separación de membranas (utilizando solamente membrana millipore de 0.22 µm) evidenció que el contacto estrecho entre las dos bacterias es necesario para lograr un efecto inhibitorio. Ya que la separación fue efectiva entre los compartimientos y no se observó alteración en los comportamientos de crecimiento. (Fig 17)
Fig 17.- Cinética de crecimiento del co-cultivo separado por membrana millipore
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
1.00E+10
0 10 20 30
Log
UFC
/mL
Horas
Curvas de crecimiento en co-cultivo separado por membrana millipore
Pediococcus acidilactici ATCC 8042
E coli O157:H7
51
8. DISCUSIÓ"
8.1 Prueba de difusión en agar
Las pruebas de difusión son utilizadas primordialmente para evaluar la actividad antibacteriana de
diversos compuestos (principalmente antibióticos) sobre una capa de agar y utilizando un
microorganismo susceptible para encontrar la dosis mínima inhibitoria o contra un organismo
problema. Estas pruebas también pueden servir para detectar la resistencia hacia los
antimicrobianos y para evaluar el comportamiento de microorganismos contra nuevas sustancias
(Jorgensen, 1998).
El único efecto observado en esta prueba fue evidenciado en los pozos a los cuales se les adicionó
Ácido Láctico al 2%, demostrando que E. coli O157:H7 puede ser afectada en su crecimiento con
una cantidad de ácido que equivale a una concentración de 222 mM (PM del ácido láctico 90.08
g/mol), situación que no fue posible alcanzar en los sobrenadantes del cultivo de Pediococcus
acidilactici ATCC 8042 por el resultado obtenido. Ogawa y col. (2001) demostraron que la
concentración bacteriostática de ácido láctico no disociado para E. coli O157:H7 productora de
toxina está comprendida entre 3.2 (0.028%) y 62 mM (0.55%) y la concentración bactericida se
ubicó por encima de 62 mM. Por lo tanto, el sobrenadante filtrado y concentrado 10 veces no fue
capaz de alcanzar ni siquiera la concentración de 3.2 mM de ácido láctico y por consiguiente no
pudo ejercer ningún efecto al crecimiento de E. coli O157:H7.
Con este resultado se observó que el sobrenadante estéril de Pediococcus acidilactici ATCC 8042
no ejerció ningún efecto sobre E. coli O157:H7 debido a que no se alcanzó la concentración
mínima. Al respecto Llorente (2008) detectó niveles máximos de producción de ácido láctico de
0.189% (21.09mM) por parte de la cepa 8042 de Pediococcus acidilactici esto sin tomar en cuenta
el estado de disociación del ácido láctico. Además, fue evidenciado por la solución de ácido láctico
al 2% (equivalente a 222nM) que solamente niveles tan altos pueden lograr una inhibición real, lo
cual no ocurre con el sobrenadante producido por la cepa ATCC8042.
Por otra parte y tomando en cuenta las concentraciones promedio de proteína que se encontraron en
cada liofilizado del sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 (0.385 g por mL), se
puede aseverar que se necesita una mayor concentración y/o una producción constante por parte de
las bacterias ácido lácticas del componente que ejerce el efecto inhibidor y que al estar en contacto
el sobrenadante sin células de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 con el patógeno, no existió una
52
concentración o producción tal que afectara o impidiera el crecimiento de una proteína liberada al
medio.
8.2 Pruebas de inhibición en co-cultivos
De acuerdo a los resultados obtenidos en los desafíos a destiempo, se pudo observar una alteración
en el crecimiento de ambos organismos, en primera instancia E. coli O157:H7 sufrió una
disminución en su velocidad de crecimiento de 2.7 a 0.4 gen/h cuando se compara su crecimiento en
caldo LB con el crecimiento en MRSm, lo cual nos indica que no es un medio muy apropiado para
su crecimiento. Diez-González y Russel en 1997 mencionaron que E. coli O157:H7 tiene una buena
resistencia al efecto antibacteriano del acetato, el cual se debe a una inhibición del metabolismo
bacteriano, pero a un nivel suficientemente elevado puede ser inclusive bactericida. El medio MRS
contiene acetato de sodio en su composición, lo que podría explicar en cierta medida la alteración
del patrón de crecimiento de E. coli O157:H7 cuando se realizaron las cinéticas de crecimiento y
debe ser un factor influyente en su comportamiento en los co-cultivos.
Al analizar los crecimientos en co-cultivo se pudo apreciar una inhibición total (7 Logaritmos) en el
crecimiento de E. coli O157:H7 cuando los microorganismos se inocularon al mismo tiempo en
MRSm, ocurriendo esta después de las 8 horas. Cuando se inoculó primeramente Pediococcus
acidilactici ATCC 8042 y después E. coli O157:H7 no se logró una inhibición total e incluso la
velocidad de crecimiento del patógeno fue del doble (0.8) que cuando este creció solo y no se vio
afectada la velocidad de crecimiento de Pediococus acidlactici ATCC 8042. Las propiedades
metabólicas de Pediococcus acidilactici permiten su utilización como cultivo iniciador ya que es
capaz de transformar los sustratos derivados de la materia prima cárnica y transformarlos para
obtener productos que resultan agradables y tienen mejores características organolépticas y
nutricionales en el caso de los productos fermentados y madurados para el consumo humano
(Campbell-Platt, 1994; Caplice, 1999; Ruiz-Montayo, 2010). Tomando esto como base, la
transformación de los sustratos contenidos en un medio de cultivo por parte del metabolismo de
Pediococcus acidilactici ATCC 8042 hacia subproductos de mejor aprovechamiento pudo ser lo
que benefició aparentemente el crecimiento de E. coli O157:H7 en el co-cultivo.
Por otra parte, cuando E. coli O157:H7 inició un crecimiento anticipado y luego se puso en contacto
con Pediococcus acidilactici ATCC 8042, su velocidad de crecimiento fue mejor que la que tuvo al
crecer solo, atribuible a la presencia de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 y sus productos
metabólicos y no mostró mas que una disminución después de las 24 horas lo que corresponde a
una fase de muerte celular normal.
53
Se pudo apreciar en todos los casos que el crecimiento de E. coli O157:H7 cuando se encuentra en
co-cultivo se vio mejorado en cuanto a sus parámetros calculados (velocidad de crecimiento y
tiempo de duplicación), no así para su conteo total final en el caso del inóculo simultaneo y cuando
E. coli es inoculada primero. Pediococcus acidilactici ATCC 8042 sufrió una ligera alteración en
sus parámetros al sufrir una pequeña disminución en su velocidad de crecimiento y un ligero
aumento en su tiempo de duplicación, sin embargo en todos los desafíos logró mantener e incluso
superar el efecto que E. coli O157:H7 pudo haber ejercido por la utilización de nutrientes
(competencia) o algún metabolito que sea desfavorable para la bacteria ácido láctica. Escherichia
coli como género bacteriano es capaz de producir sustancias que resulten inhibidoras para otros
géneros como las colicinas las cuales fueron las primeras bacteriocinas descritas (Cotter, 2005), esto
posiblemente sea uno de los factores asociados a la alteración en los parámetros de crecimiento de
Pediococcus acidilactici ATCC 8042. Aún así, el efecto observado evidencia que Pediococcus
acidilactici ATCC 8042 logró adaptarse al efecto adverso (posible metabolito no determinado) y a
la competencia y pudo ejercer un efecto de alteración sobre el comportamiento de E. coli O157:H7
cuando crecen al mismo tiempo en un cultivo en caldo.
Como se puede apreciar luego de revisar los resultados obtenidos, existió solamente un efecto
inhibitorio encontrado en el co-cultivo simultaneo (de 7 Logaritmos) el cual aparentemente tuvo un
origen combinado entre los componentes del medio de cultivo y la actividad por parte de los
metabolitos de Pediococcus acidilactici. La presentación de este efecto sólo bajo esa situación
implica la combinación de efectos adversos en contra del patógeno en un momento de acción que
implica un estado de vulnerabilidad por el tiempo de inoculación (ambos microorganismos en fase
logarítmica), la composición del medio de cultivo (MRSm) que es en si un gran obstáculo para E.
coli, la interacción con la bacteria ácido láctica (competencia y contacto con sus metabolitos aunada
a la ventaja de crecimiento en este medio en particular) que en conjunto hicieron imposible la
correcta adaptación a dichas condiciones y provocó la disminución en los números de E. coli
O157:H7.
El crecimiento de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 no se vio afectado significativamente en
ningún caso ya que aunque sus velocidades de crecimiento disminuyeron un poco, su población se
mantuvo constante.
54
8.3 Prueba en células VERO
Comparado con las diluciones de sobrenadantes de los co-cultivos en caldo MRSm, no se observo
diferencia e inclusive las células VERO aparecieron más afectadas, cosa que es atribuible a la
composición del caldo MRSm que no permitió un desarrollo óptimo de las células. Las células que
estuvieron en contacto solamente con el caldo MRSm sin inocular sólo lograron una confluencia
mínima y el porcentaje de células no afectadas ascendió al 50% en el mejor de los casos y si lo
comparamos con el caldo LB (cuya confluencia llegó hasta el 95%) se distinguió una afectación en
el crecimiento por efecto del medio. Inclusive las células del control a las que solo se les agregó
solución salina presentaron una confluencia del 90%, siendo menor incluso que las del tratamiento
con LB sin inocular.
A raíz de estos resultados con los sobrenadantes de caldo MRSm, no pudieron ser discernibles los
efectos del medio MRSm de la posible producción de toxina por parte de E. coli O157:H7 cuando
se encuentra en co-cultivo con Pediococcus acidilactici ATCC 8042.
Otro punto evidenciado por esta prueba fue que en ningún caso se observó mejoría al utilizar los
sobrenadantes del cultivo mezclado, inclusive el caldo MRSm indujo cierto efecto sobre el
crecimiento de las células VERO, por lo que no es un medio idóneo para evaluar un efecto benéfico
para las mismas.
La prueba de SDS PAGE evidenció bandas de alrededor de 32 kDa (Figura 15) que sólo estuvieron
presentes en el sobrenadante de E. coli O157:H7. Según la revisión de Karmali (2010) la subunidad
A de las Verotoxinas tiene un peso de alrededor de 32 kDa, por lo que sugiere la producción de
Verotoxina por parte de esta cepa de E. coli O157:H7.
Al realizar la determinación utilizando un co.cultivo de ambos microorganismos en caldo LB, se
obtuvieron mejores resultados para evidenciar la producción de toxina por parte del patógeno. Con
el sobrenadante de E. coli O157:H7 se calculó el título de toxina (5x105 UC/mL). No se observó un
efecto sobre la producción de toxina por parte de E. coli O157:H7 al estar en co-cultivo con
Pediococcus acidilactici ATCC 8042, el efecto citotóxico estuvo presente en todo momento cuando
E. coli O157:H7 estuvo creciendo en el sobrenadante que se utilizó en las células VERO. Por lo
tanto, la producción de toxina no se vió afectada por el contacto con Pediococcus acidilactici
ATCC 8042.
55
8.4 Efecto inhibitorio
El crecimiento de un microorganismo depende de una combinación de factores asociados al
ambiente, al microorganismo, la presencia de otros microorganismos y a las interacciones que
existen entre ellos, el metabolismo bacteriano comprende una serie de reacciones que involucran la
utilización de sustratos y la excreción de desechos y secreción de metabolitos que pueden
interactuar con la cepa productora y con otras bacterias que se hallen presentes. Los procesos e
interacciones entre estos factores y los microorganismos son los responsables de la supervivencia o
la muerte de las poblaciones bacterianas en el medio, cada microorganismo tiene diversos modos de
regular sus funciones y adaptarse a los cambios constantes, desde la competencia por nutrientes
hasta la producción de sustancias nocivas para otros microorganismos.
Las posibles causas del efecto observado sobre E. coli O157:H7 pueden atribuirse a:
• Interacción directa (contacto) entre ambas bacterias y competencia.
• Producción de enzimas líticas.
• Producción de bacteriocinas o bacteriolisinas.
• Efecto adverso de los componentes del medio de cultivo sobre el patógeno.
La producción de ácido láctico y la alteración del pH en el medio de cultivo popr parte de la baceria
acido láctica pueden quedar descartados con la prueba de difusión en agar y los resultados
obtenidos por Llorente en el 2008 en los cuales demostró que Pediococcus acidilactici ATCC 8042
produce cantidades mínimas de ácido láctico y los resultados de la medición de pH en las pruebas
realizadas oscilan entre 6.1 y 6.3.
Llorente en el 2008 encontró puntos clave en el efecto antibacteriano producido por Pediococcus
acidilactici ATCC 8042 afirmando que es capaz de producir enzimas líticas de amplio espectro, una
cantidad reducida de ácido láctico e inclusive posee una actividad extracelular de peptidoglicano
hidrolasa. En el caso de los desafíos realizados con cultivos completos de Pediococcus acidilactici
ATCC 8042 en contra de E. coli O157:H7 se pudo observar que el efecto inhibitorio depende del
momento de inoculación, la presencia de las células de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 en
estrecho contacto con las células de E. coli O157:H7.
Una de las desventajas que han encontrado los investigadores cuando se aplican cultivos iniciadores
como alternativas de bioconservación en contra de patógenos Gram negativos es la incapacidad de
algunas sustancias producidas por las BAL de acceder fácilmente a la célula bacteriana, esto debido
a la diferencia en la composición del soma bacteriano que aparte de contener peptidoglicano tiene
56
moléculas de glicerofosfolípidos y lipopolisacáridos adosadas a su membrana celular externa que le
confieren resistencia contra algunas de esas sustancias (Belfiore y col., 2007). Ellos sugieren el uso
de agentes queladores que permitan la desestabilización de la estructura de la membrana externa de
las bacterias Gram negativas y alteren su permeabilidad para que agentes como la Nisina puedan
llegar a su sitio de acción. Entre estos agentes se encuentra el citrato, el cual como se mencionó
anteriormente está presente como citrato de amonio en el medio MRSm y puede ser la explicación
de la aparente actividad inhibitoria en las pruebas de co-cultivo en este medio.
La separación de compartimientos del co-cultivo por parte del dispositivo permitió evidenciar que
la inhibición sólo se puede dar cuando las células están en contacto cercano, aparte de demostrar
que sustancias producidas por cualquiera de las dos cepas que presenten pesos moleculares de
menos de 12 kDa no influyen en los efectos observados en las pruebas realizadas sin dicha
separación.
Este hallazgo permitió descartar la participación de inductores de bajo peso molecular como lo son
las acil homoserin lactonas o los péptidos autoinductores (para Gram negativas y Gram positivas
respectivamente) como aquellos que median los mecanismos de comunicación y regulación
intercelular del quorum sensing (Brelles-Mariño, 2001; Di Cagno, 2010) debido a que dichas
moléculas se encuentran muy por debajo del tamaño molecular que la membrana de diálisis
permitió difundir entre los compartimientos del co-cultivo y, al no observarse ningún efecto para
cualquiera de las cepas en esa determinación; se descarta su participación en el efecto observado.
Adicionalmente a los conteos celulares en las pruebas de desafío en co-cultivo, se realizaron frotis
para tinción de Gram de las placas de agar que se utilizaron en dichos conteos. En estos frotis
fueron frecuentes los hallazgos de células de E. coli O157:H7 (bacilos gram negativos) con un
elongamiento notable que no corresponde a la morfología característica para dicho microorganismo.
Las bacterias cuentan con mecanismos de adaptación y compensación para superar algunas
condiciones y estímulos que sean desfavorables para su supervivencia. Uno de estos sistemas es el
denominado sistema SOS. Este sistema es responsable de la activación de genes que le permiten a
la célula bacteriana contrarrestar efectos nocivos presentes en el medio aunque también causa el
bloqueo de otros que normalmente, bajo condiciones favorables, se expresarían continuamente. La
finalidad de estos mecanismos es el tratar de sobrellevar y superar las condiciones que de otra forma
llevarían a la muerte de la bacteria, permitiéndole sobrevivir bajo diferentes estímulos adversos. Las
funciones reguladas mediante estos sistemas incluyen la reparación del daño al ADN, mutagénesis,
57
inhibición de la división celular, el regreso a las funciones normales una vez que el daño ha sido
superado e inclusive desencadenar la muerte celular en caso de un daño mayor (D’Ari, 1985).
La explicación del hallazgo de células elongadas en los conteos de E. coli O57:H7 tras el desafío in
vitro se puede deber a la activación de dichos mecanismos que al bloquear el mecanismo normal de
la división celular para contrarrestar los efectos dañinos presentes en el medio de cultivo, provocó
que las células bacterianas adoptaran las formas filamentosas y alargadas. Esto puede ser indicativo
de un efecto dañino sobre E. coli O157:H7 y confirma que el patógeno es capaz de iniciar
mecanismos que contrarrestan los daños ocasionados en cierta medida, pero bajo circunstancias
puntuales el daño puede ser fatal.
García-Cano y colaboradores (2011) reportaron actividades de peptidoglicano hidrolasa en bandas
con pesos de 96 y 110 kDa en zimogramas realizados con sobrenadantes de Pediococcus
acidilactici ATCC 8042. Sus desafíos realizados en contra de E. coli (cepa no toxigénica) revelan
un efecto inhibitorio después de 24 horas. Además, demostraron que estas fracciones protéicas se
encuentran adosados a la pared celular de la bacteria acido láctica. La actividad encontrada en el
presente estudio puede explicarse si se toma en cuenta este trabajo, unido a que el efecto de
inhibición en todos los casos se logró solamente cuando las células de Pediococcus acidilactici
ATCC 8042 se encontraban en estrecho contacto con las de E. coli O157:H7.
Este último punto quedó demostrado con el co-cultivo separado por membrana millipore, ya que la
separación fue tal que permitió el paso de cualquier sustancia menor a 0.22 µm e impidió que se
diera un contacto estrecho entre ambas bacterias. Los microorganismos crecieron de manera normal
cada uno en su compartimiento y aunque existió el intercambio del medio de cultivo entre los
compartimientos, ninguna sustancia que fuera capaz de atravesar el filtro millipore provocó
alteraciones en el crecimiento de ninguna de las bacterias como se aprecia en sus cinéticas de
crecimiento.
8.5 Aplicaciones y sugerencias a posterior
8.5.1 Fraccionamiento y purificación de sobrenadante
Otras cepas de Pediococcus acidilactici aisladas de productos cárnicos madurados han sido
utilizadas y probadas en medios de cultivo como posibles cultivos iniciadores que logren un
producto inocuo a la vez que garantizan su calidad. Ruiz-Montayo y colaboradores en 2010
utilizaron 11 cepas aisladas de productos madurados y una aislada de heces de cerdo de las cuales
58
ninguna fue capaz de inhibir a E. coli O157:H7 ni a otros Gram negativos y el efecto inhibitorio que
encontraron en contra de Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus se veía mermado cuando
se daba tratamiento proteolítico al sobrenadante. Esto puede indicar la naturaleza de los compuestos
responsables de la actividad inhibitoria en estos casos; es decir, son de naturaleza protéica.
Los trabajos de Rivera (2005), Llorente (1998 y 2008) y Martinez (2011) confirman que la cepa
8042 es capaz de ejercer actividades de inhibición en contra mesófilos de la carne, Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, L. inocua y Pseudomona aeruginosa siendo este último Gram
negativo.
Llorente en el 2008 señaló que las distintas fracciones del sobrenadante de Pediococcus acidilactici
ATCC 8042 ejercen el efecto inhibitorio frente a cepas cercanamente emparentadas y otros géneros
bacterianos, llegando a la conclusión de que el efecto tiene un espectro amplio. La purificación y
caracterización de las fracciones que componen al sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC
8042 podría permitir un estudio detallado de los efectos y la aplicabilidad del uso del sobrenadante
como agente de conservación en alimentos e inclusive como auxiliar en el control de
contaminaciones o infecciones por patógenos. Con dichos estudios, podría probarse de una manera
más directa el efecto que estas sustancias pudieran tener sobre patógenos específicos como E. coli
O157:H7
8.5.2 Pruebas enzimáticas
Ya que también reporta actividades de peptidoglicano hidrolasa, gelatinasa y elastasa, se propone
realizar pruebas a futuro en donde se utilice como sustrato la pared celular de E. coli O157:H7 para
probar el efecto de estas y otras actividades enzimáticas que pudiera tener el sobrenadante de
Pediococcus acidilactici ATCC 8042 sobre ese sustrato en específico.
Otra sugerencia a para evaluar en un futuro este efecto encontrado es el diseño y la utilización de
medios de cultivo que simulen las condiciones de la producción de un producto fermentado, lo que
incluiría ingredientes como nitratos, especias y otros empleados en la elaboración de embutidos
madurados, así como la posibilidad de reducir el pH del medio para asemejar las condiciones de un
producto terminado, esto unido a la actividad del cultivo iniciador, podría dilucidar un
comportamiento más real de la interacción de ambos microorganismos.
8.5.3 Proyección a futuro como alternativa de Bioconservación
Con los resultados obtenidos en el presente estudio, se evidenció la buena adaptabilidad de E. coli
O157:H7 a condiciones adversas de crecimiento. En primera instancia el medio de cultivo utilizado
59
para los desafíos (MRSm) presenta un obstáculo para el crecimiento óptimo del patógeno y aún con
la presencia de P. acidilactici en el mismo medio de cultivo, este logra sobrevivir en la mayoría de
los casos. Es importante señalar que el nivel de contaminación de la materia prima es un factor
fundamental a la hora de elaborar los productos madurados.
Clavero y colaboradores (1996) realizaron pruebas de supervivencia de E. coli O157:H7 en salamis
madurados utilizando diferentes cantidades de inóculo. Concluyeron que un nivel inicial de 100
UFC/g es incapaz de sobrevivir en el producto terminado si se almacena a 5°C durante 32 días, por
otra parte si existieran niveles de contaminación de entre 4 y 5 Log de UFC/g el panorama no es tan
prometedor, pero esto de entrada va en contra de todas las buenas prácticas de manufactura con el
hecho de que no se debe utilizar materia prima con esos niveles de contaminación, esto aunado al
buen uso de HACCP en las plantas de elaboración de alimentos permite que niveles tan altos de
contaminación sean evitados por adelantado si se tiene un monitoreo adecuado de la materia prima
que será utilizada. Con los resultados obtenidos en el presente trabajo, no se puede afirmar que P.
acidilactici sea una buena alternativa de Bioconservación en contra de E. coli O157:H7. Aún así, el
efecto de inhibición logrado en uno de los experimentos realizados ponen de manifiesto la
necesidad de una mejor caracterización de los productos metabólicos de las bacterias acidolácticas
como Pediococcus acidilactici.
60
9. CO"CLUSIO"ES
• El sobrenadante de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 no fué capaz de ejercer un efecto
inhibitorio sobre E. coli O157:H7.
• Existió un efecto adverso contra E. coli O157:H7 al estar presente Pediococcus acidilactici
ATCC 8042 solamente cuando se inocularon al mismo tiempo en caldo MRSm y teniendo
un contacto estrecho.
• El efecto observado no puede ser atribuido solamente a la presencia de Pediococcus
acidilactici ATCC 8042.
• El posible efecto inhibitorio de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 sobre E. coli O157:H7
depende del contacto directo entre ambos microorganismos y no dependería de productos
que se liberen al medio sino de sustancias adosadas a su pared celular.
• La producción de toxina de shiga por parte de E. coli O157:H7 no se ve afectada al estar en
contacto con Pediococcus acidilactici ATCC 8042 ni con sus productos metabólicos.
61
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Apéndice 1
Composición del medio MRS modificado (Llorente, 2008)
Por cada 1000mL
Extracto de carne 10 g
Peptona Proteosa No.3 10 g
Extracto de Levadura 5 g
Citrato de Amonio 2 g
Tween 80 1 mL
Sulfato de Manganeso 0.25 g
Sulfato de Magnesio 0.1 g
Fosfato Dipotásico 2 g
Acetato de Sodio 5 g
Llevar a 950 mL de agua destilada. Agregar 40 mL de solución de Sacarosa (25 g en 100 mL) y 10 mL de solución
de ácido ascórbico (3 g en 30 mL) después de esterilizar.
Sacarosa 10 g
Ácido ascórbico 1 g
66
Apéndice 2 .- Perfil de Fermentación de Carbohidratos de Pediococcus acidilactici ATCC 8042.
Prueba Resultado Prueba Resultado
Testigo - Esculina +
Glicerol - Salicina -
Eritritol - D-celobiosa +
D-arabinosa - D-maltosa -
L-arabinosa + D-lactosa -
Ribosa + D-melibiosa -
D-xilosa + D-sacarosa -
L-xilosa - D-trehalosa +
D-adonitol - Inulina -
Metil ßD-xilopiranosida - D-melezitosa -
D-galactosa + D-rafinosa -
D-glucosa + Almidón -
D-fructosa + Glicógeno -
D-manosa + Xilitol -
L-sorbosa - Gentiobiosa +
L-rhamanosa - D-turanosa -
Dulcitol - D-lixosa -
Inositol - D-tagatosa +
D-manitol - D-fucosa -
D-sorbitol - L-fucosa -
α Metil-D-manopiranosida - D-arabitol -
α Metil-D-glucopiranosida - L-arabitol -
N-acetilglucosamida + Gluconato -
Amigdalina - 2-ceto-gluconato -
Arbutina - 5-ceto-gluconato -