UNIVERSIDAD NACIONALAUTONOMA DE MEXICO

UACPyP del CCH

El estrés oxidativo y la muerte celular durante el desarrollode las extremidades del ratón.

Tesis de posgrado que, para obtener el grado deDoctor en Investigación Biomédica Básica,

presenta:

M. en I.B.B. Enrique Salas Vidal

Director de tesis:

Dr. Luis Covarrubias Robles.Instituto de Biotecnología

Cuernavaca, Morelos Agosto, 1998.

Comité tutorial:

Dr. Luis CovarrubiasDr. Alberto Darszon

Dr. Jesús Aguirre

Jurado de examen de grado:

Presidente: Dr. Luis CovarrubiasSecretario: Dr. Mario ZuritaVocal: Dr. Wilhelm HansbergVocal: Dr. Jesús ChimalVocal: Dr. Luis Felipe JiménezSuplente: Dr. Roberto StockSuplente: Dra. Carmen Beltrán

DEDICATORIAS

A Denhi: Por lo maravilloso que es compartircon ella todos los días de mi vida.

A mis padres: A quienes les debo todo en la vida.

A mis hermanos: Por los grandes momentos quehemos disfrutado y sufrido juntos.

A la memoria de mi abuela Marta: con quienaprendi la magia de la imaginación.

A mis profesores en todos los niveles: que mehan influenciado y de quienes he robado unpoco para mi trabajo.

A la memoria de Rolando Lara, por su amistad yguía en mis primeros años de trabajo en ellaboratorio

AGRADECIMIENTOS

Al Doctor Luis Covarrubias por suasesoría y guía a lo largo del doctorado.

Al comité tutorial y al jurado por suscríticas que me ayudaron a mejorar enormemente,tanto el trabajo experimental como el trabajoescrito.

A las compañeras y los compañeros dellaboratorio (presentes y emigrados) por su apoyo,sus criticas y su amistad.

Al Instituto de Biotecnología, incluyendo atodos, por su apoyo.

Al personal del Bioterio, pero enparticular la Dra. Elizabeth Mata y Dra. GracielaCabeza, por su apoyo y asistencia técnica en elmanejo de los ratones.

A la UNAM.

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RESUMENEn este trabajo se obtuvo evidencia a favor

de que las especies de oxígeno reactivasparticipan en el control de la muerte celularprogramada en el desarrollo embrionario delratón. Se desarrolló un ensayo de cultivo deórganos in vitro , en el cual la individualización delos dígitos ocurre exclusivamente por muertecelular. Probamos el efecto de diferentesantioxidantes (fenol, dimetilsulfóxido y DCDHF-DA) y observamos que con los tratamientos, seevita tanto la muerte celular como la regresión deltejido interdigital. De manera adicional, al teñirextremidades embrionarias de ratón, condiferentes colorantes sensibles a cambios redox(MTT y DCDHF-DA), se observó que algunascélulas interdigitales presentan un estado deestrés oxidativo, precisamente en las etapas enque ocurre la muerte celular. Pocas célulaspresentaron doble tinción para los colorantessensibles a cambios redox y para los indicadoresde muerte celular (anaranjado de acridina yyoduro de propidio), lo cual sugiere que lageneración de especies de oxígeno reactivas y laapoptosis ocurren en etapas diferentes delproceso de muerte. Además, encontramos quemuchas células positivas para la tinción con loscolorantes sensibles a cambios redox no expresanun marcador específico de macrófagos, por lo quelas células en estrés oxidativo podrían ser de tipomesenquimático. Sorprendentemente, muchas delas regiones en donde ocurre la muerte celulardurante el desarrollo del ratón presentan célulasen estrés oxidativo, lo cual sugiere que el aumentoen especies de oxígeno reactivas, es unrequerimiento común para que se lleve a cabo lamuerte celular programada en el desarrolloembrionario del ratón.

Por otro lado, en un intento por encontrarla señal que induce a las células del interdigito aentrar en estrés oxidativo, observamos que elácido retinoico (AR) también participa en el controlde la muerte celular interdigital. Sin embargo,hasta el momento, no ha sido posiblecorrelacionar ambas señales, lo cual se discute enla presente tesis.

Finalmente, se presenta un proyecto enproceso para generar una base de datos deimágenes digitalizadas de la distribución de lamuerte celular programada durante el desarrolloembrionario del ratón. Estos datos sugieren que,los patrones en los que ocurre la muerte celulardurante el desarrollo de las extremidades sondinámicos, se presentan en gradientes que siguenlos principales ejes de las extremidades, antero-posterior, ventro-dorsal y disto-proximal. Por otrolado, analizando algunos modelos generados porcomputadora, bidimensionales y tridimensionalesdel desarrollo de las extremidades, encontramosque la individualización de los dedos se lleva acabo por muerte celular interdigital y porcrecimiento diferencial entre los dígitos y losinterdígitos. Este último resultado parece indicar

que los mecanismos responsables de laseparación de los dedos en mamíferos, sonsemejantes a los que ocurren en anfibios, endonde la individualización de los dedos ocurreexclusivamente por crecimiento diferencial detejidos (Cameron y Fallon, 1977. Dev. Biol. 55).Se discute al final de la tesis la correlación de losresultados obtenidos en esta parte del trabajo, conel estudio del papel del estrés oxidativo y del ARen el control de la muerte celular en el desarrollode las extremidades, y se propone un modelo queintenta integrar los diferentes grupos de datos.

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ABSTRACTEvidence presented in this thesis

supports the notion that the generation of reactiveoxygen species (ROS) is an important event duringthe course of programmed cell death in mousedevelopment. Using an in vitro culture system inwhich digit individualization occurs exclusively byinterdigital cell death, we assayed the effect ofdifferent antioxidants (phenol, dimethylsulfoxideor DCDHF-DA) and found that these treatmentsprevent interdigital cell death and tissueregression. Two ROS-sensitive dyes (MTT andDCDHF-DA) stained interdigits, implying that theycontain cells under oxidative stress. Very fewinterdigital cells were doubly stained with the ROSprobes and the two cell death indicators (acridineorange an propidium iodide), suggesting that theydetect a different stage during the course ofapoptosis. Furthermore, we found cells stainedfor ROS that did not express a specificmacrophage marker, and in few cases were seensurrounded by a macrophage. Surprisingly, manyregions of the midgestation mouse embryo that areundergoing cell death correlated with those thathave a markedly higher level of ROS. Our datasuggest that the generation of oxidative stress is acommon requirement for cell death that occursduring mouse embryonic development.

In an attempt to characterize the signalthat triggers the rise in ROS accumulation in theinterdigital cells, we found that retinoic acid (RA)also participates in the control of programmed celldeath. However we have not yet found evidencecorrelating both signals (RA and ROS) on the samecascade. These results are discussed in thethesis. We present also an ongoing effort togenerate a digital image data-base of the cell deathdistribution during mouse development, using thelimb development as a starting model for theanalysis. We found that cell death patterns aredynamic during limb development, and occur in“waves” that follow the main limb axes, antero-posterior, ventro-dorsal and disto-proximal.Furthermore, using 2D and 3D computergenerated models, we found that digitindividualization occurs by interdigital apoptosisand by digit-interdigit differential growth, whichseems reminiscent to digit individualization inamphibians, where it occurs only by differentialtissue growth (Cameron and Fallon, 1977. Dev.Biol. 55). A model is shown at the end of thethesis, where these results are correlated with thedata related to the ROS and the RA in the controlof embryonic cell death.

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INDICEi.- CARATULA iii.- DEDICATORIAS iiiiii.- AGRADECIMIENTOS iiiiv.- RESUMEN ivv.- ABSTRACT vvi.- INDICE vivii.- INDICE DE FIGURAS viiviii.- INDICE DE TABLAS viiiix.- LISTA DE ABREVIATURAS ix

1.- INTRODUCCION 11.1.- LA MUERTE CELULAR 11.1.1.- La muerte celular por apoptosis y pornecrosis 11.1.2.- Fases de la apoptosis 11.1.3.- La muerte celular en el desarrolloembrionario 21.1.4.- Funciones de la muerte celular en eldesarrollo embrionario 21.1.5.- Control de la MCP 31.1.6.- Algunos métodos utilizados para estudiarla muerte celular 41.2.- EL ESTRES OXIDATIVO 41.2.1 Vías de generación de especies de oxígenoreactivas (EOR) y el estrés oxidativo 41.2.2.- Mecanismos de protección intracelularescontra agentes oxidantes. 51.2.3.- El estrés oxidativo y la muerte celular 51.3.- LOS RETINOIDES 81.3.1.- Estructura y metabolismo de los retinoides1.3.2.- Los retinoides en el control de la muertecelular 81.4.- EL DESARROLLO DE LAS EXTREMIDADES1.4.1.- Estructura general de las extremidades 91.4.2.- Formación de la Cresta Ectodermica Apical(CEA) y su interacción con la zona de progresión.91.4.3.- La muerte celular en el desarrollo de lasextremidades 101.4.4.- El desarrollo embrionario de lasextremidades de ratón como modelo de estudio 10

2.- HIPOTESIS 112.1.- HIPOTESIS GENERAL DEL PROYECTO 11

3.- OBJETIVOS 113.1.- OBJETIVO GENERAL 113.2.- OBJETIVOS PARTICULARES 11

4.- MATERIALES Y METODOS 124.1.- ANIMALES 124.2.- DISECCION DE EXTREMIDADES DEEMBRIONES DE RATON 124.3.- CULTIVO IN VITRO DE EXTREMIDADES DEEMBRION DE RATON 124.4.- ANALISIS DE LA MUERTE CELULARPROGRAMADA 124.4.1.- Tinciones vitales. 124.4.2.- TUNEL 134.4.3.- Análisis histológico 134.5.- HISTOLOGIA, INCLUSION EN PARAFINA 134.6.- TRATAMIENTO DE PORTAOBJETOS CON

POLI L-LISINA 134.7.- MICROSCOPIA ELECTRONICA 134.8.- DETECCION DE EOR IN SITU 134.9.- MICROSCOPIA CONFOCAL 144.10.- SOBREPOSICION DE IMAGENES 144.11.RECONSTRUCCIONES TRIDIMENSIONALESDE IMAGENES 144.12.- HISTOQUIMICA PARA LA DETECCION DECARTILAGO 154.13.- INMUNOHISTOQUIMICA CON ELANTICUERPO F4/80, PARA LA DETECCION DEMACROFAGOS 154.14.- USO DE CELULAS LC3, PARA EL ESTUDIODE LA BIOSINTESIS IN VIVO DE ACIDORETINOICO EN EXTREMIDADES EMBRIONARIASDE RATON 15

5.- RESULTADOS5.1.- EL DESARROLLO DE LAS EXTREMIDADESEN RATON 165.1.1.- Desarrollo in vivo e in vitro de lasextremidades del ratón CD1 165.1.2.- Desarrollo del esqueleto de lasextremidades del ratón in vivo e in vitro 175.1.3.- Patrones de muerte celular durante eldesarrollo de las extremidades del ratón 185.2.- EL ESTRES OXIDATIVO Y LA MUERTECELULAR 205.2.1.- Estudio del efecto de agentes antioxidantesen la apoptosis en el desarrollo de extremidadesdel ratón 205.2.2.- Los interdígitos expresan marcadores decondrogénesis 205.2.3.- Determinación de regiones en estrésoxidativo in situ, durante el desarrollo de lasextremidades del ratón. 215.2.4.- La apoptosis y el estrés oxidativo en eldesarrollo embrionario del ratón CD1 y en eldesarrollo temprano en pollo. 215.2.5.- Identidad de las células en estrésoxidativo. 225.3.- EL ACIDO RETINOICO Y LA MUERTECELULAR 225.3.1.- AR y ROL inducen apoptosis enextremidades de embrión de ratón in vitro. 235.3.2.- Inhibidores de la biosíntesis del ARreducen la muerte celular y la r e g r e s i ó ninterdigital, en extremidades de embrión de ratónin vitro. 235.3.3.- Inhibidores de la biosíntesis del AR,compiten con los efectos provocados por el retinol,pero no con los efectos del AR in vitro. 245.3.4.- Efecto del ácido retinoico sobre el estadode estrés oxidativo en extremidades de ratón endesarrollo in vitro. 25

6.- DISCUSION. 256.1.- EOR EN EL CONTROL DE LA MUERTECELULAR 256.1.1.- El efecto de antioxidantes en el desarrollode las extremidades in vitro. 256.1.2.- Identidad de las células en estrésoxidativo. 26

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6.1.3.- EOR en el control de la muerte celular. 266.1.4.- ¿La evidencia a favor de que las EORparticipan en el control de la muerte celular esconclusiva? 286.1.5.- El papel fundamental de las mitocondriasen el control de la muerte celular. 296.1.6.- EOR en el desarrollo embrionario. 296.1.7.- El control del estado redox en el desarrolloembrionario. 306.1.8.- Diferenciación a cartílago de las célulasinterdigitales sobrevivientes. 316.2.- LOS RETINOIDES EN EL CONTROL DE LAMUERTE CELULAR 316.2.1.- El ácido retinoico en el control de lamuerte celular durante el desarrolloembrionario. 316.2.2.- Mecanismos de inducción de apoptosis porel AR. 326.2.3.- Requerimiento del ectodermo para elcontrol de la muerte celular. 336.2.4.- Requerimiento del ectodermo para laproliferación celular en la zona de progresión. 336.2.5.- La CEA y su interacción con la zona deprogresión. 346.2.6.- Otras señales involucradas en el desarrollode la extremidades. 346.3.- ANALISIS DE IMAGENES Y LAGENERACION DE MODELOS EN EL ESTUDIODEL DESARROLLO EMBRIONARIO DE LASEXTREMIDADES DEL RATON 356.3.1.- Análisis de imágenes y bases de datos. 356.3.2.- Modelos del desarrollo de las extremidadesen vertebrados. 366.3.3.- Inicio de la formación de las extremidades.

366.3.4.- ¿Quien controla los gradientes de muertedisto-proximal y dorso-ventral en el desarrollo delas extremidades? 36

7.- CONCLUSIONES 39

8.- REFERENCIAS 39

9.- PUBLICACIONES

INDICE DE FIGURASFigura 1. Caricatura en la que se representa lasecuencia de los principales cambiosultraestructurales que ocurren, durante laapoptosis y la necrosis.Figura 2. Fases del proceso de apoptosis.Figura 3. Método de TUNEL.Figura 4. Ruta de biosíntesis del ácido retinoico apartir del precursor retinol.Figura 5. Estructura general de la extremidades.Figura 6. Esquema general de la hipótesis delproyecto.Figura 7. Sistema de cultivo in vitro deextremidades de embrión de ratón.Figura 8. Reacción de la sal tetrazolica consuperóxido.Figura 9. Mecanismo de acción de DCDHF-DA.Figura 10. Distribución de la muerte celular en eldesarrollo de las extremidades.Figura 11. Análisis de imágenes de la regresióninterdigital y crecimiento de los dígitos enextremidades de ratón.Figura 12. Desarrollo in vivo del esqueleto enextremidades de ratón.Figura 13. Sobreimposiciones del desarrollo delos elementos esqueléticos (Fig. 12) sobreextremidades teñidas con anaranjado de acridina.Figura 14. Patrones de crecimiento y regresióninterdigital durante el desarrollo de lasextremidades del estadio 8 al 12+.Figura 15. Desarrollo in vitro de los elementosesqueléticos en extremidades teñidas con azulalciano.Figura 16. Patrones de muerte en extremidades deratón de 10, 12, 13 y 14.Figura 17. Cortes ópticos sagitales, generados apartir de las reconstrucciones tridimensionales.Figura 18. Margen distal ventral de extremidadesde embriones de ratón teñidas con anaranjado deacridina.Figura 19. Extremidades incubadas con agentesantioxidantes durante 12h y teñidas con azulalciano.Figura 20. Condrogénesis interdigital enextremidades incubadas 12h in vitro, detectadacon aglutinina de cacahuate fluoresceinada.Figura 21. Embrión de pollo de 11 somitas teñidocon el colorante redox sensible Rodamina 123.Figura 22. Extremidades de ratón, teñidas con AA,incubadas previamente durante 18h in vitro, enmedio control, o en presencia de ácido retinoico oretinolFigura 23. Efecto in vitro de inhibidores dea lcoho l desh idrogenasa y a ldeh ídodeshidrogenasa sobre la muerte celular enextremidades incubadas por 6h. .Figura 24. Competencia de los efectos in vitroentre el acido retinoico y retinol con losinhibidores de alcohol deshidrogenasa y aldehídodeshidrogenasa, sobre la muerte celular enextremidades incubadas por 18h.Figura 25. Inducción de lacZ en células LC3, porretinoides endógenos (A) y producidos por

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conversión de retinol (B) en extremidades deembrión de ratón.Figura 26. Patrones de expresión de alcoholdeshidrogenasa, aldehído deshidrogenasa-2,RARβ y de transglutaminasa, en las extremidadesde ratón.Figura 27. Puntos de inhibición de la síntesis delAR por diferentes agentes.Figura 28. Modelos donde se representa comocontribuyen la muerte y el crecimiento en laseparación de los dígitos.Figura 29. Posible secuencia de eventos einteracciones moleculares que participan en elcontrol de la muerte celular interdigital y elcrecimiento de los dígitos.

INDICE DE TABLASTabla 1. Longitudes de onda de absorción yemisión, de los diferentes fluorógenos utilizadosen el proyecto.Tabla 2. Efecto de los antioxidantes sobre lamuerte interdigital, medida con base en la tincióncon el colorante anaranjado de acridina (AA), y surelación con la formación ectópica de cartílago, enextremidades de embriones de ratón in vitro.Tabla 3. Efecto de diferentes fármacos sobre laactividad de alcohol deshidrogenasa y aldehídodeshidrogenasa.Tabla 4. Efectos sobre la muerte celular enextremidades in vitro, con tratamientos dobles.

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LISTA DE ABREVIATURASAA: Anaranjado de acridina.ADN: Acido desoxirribonucleico.ADH: Alcohol deshidrogenasa.AER: Apical ectodermal ridge.ALDH: Aldehído deshidrogenasa.AR: Acido retinoico.AR9c: Acido retinoico 9 cis.9cAR: Acrónimo en inglés de 9cAR.ARtt: Acido retinoico todo trans.atRA: Acrónimo en inglés de ARtt.BMP: Bone morphogenetic protein (s).BSA: Albúmina de suero bovina.0C: Grados centígrados.CEA: Cresta ectodérmica apical.D C D H F - D A : 5 - ( and-6 ) - ca rboxy -2 ' , 7 ' -dichlorodihydro-fluorescein diacetate.ddAR: 3,4-didehidro ácido retinoico.ddRA: 3,4-didehidro retinoic acid.DMSO: Dimetil sulfóxido.dpc: Días post coito.EOR: Especies de oxígeno reactivas.FGF: Fibroblast growth factors.GPS: Glutamina, penicilina G y estreptomicina.GSH: Glutatión en su forma reducida.hr: Hora (s).H2O2: Peróxido de hidrógeno.HO2.: Radical hiperoxi.IL-beta: Interleucina-1beta.MCP: Muerte celular programada.M: Molar.min: Minutos.mg: Miligramos.ml: Mililitros.µl: Microlitros.µg: Microgramos.mM: Milimolar.µm: Micrometros.NAC: N-acetilcisteína.MTT :3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.NBT: Nitro blue tetrazolium (sal tetrasólica).NGF: Nerve growth factor.nm: Nanómetros.p/v: peso/volumen.O2: Oxígeno molecular.O2.-: Superóxido..OH: Radical hidroxilo.PBS: Amortiguador de fosfatos salino.RAR: Receptores al ácido retinoico. Acrónimo eninglés igual. Hay tres formas α, β y γ.r.p.m.: Revoluciones por minuto.RRX: Receptores de retinoides X (desconocidos).Hay tres formas α, β y γ.RXR: Siglás en Inglés de RRX.ROL: Retinol.ROS: Reactive oxigen species.S : Estadios según Wanek et al (1989). Losestudiados comprenden del S9 al S12.SBF: Suero bovino fetal.SOD: Superóxido dismutasa.

t.a.: Temperatura ambiente.TGFβ: Transforming growth factor beta.TNF: Tumor necrosis factor.TUNEL: Tdt-mediated X-dUTP nick end labeling.YP: Yoduro de propidio.2D: Dos dimenciones.3D: Tres dimenciones.

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Escribí este libro durante las interminables horasque empleé esperando a que mi mujer acabara devestirse para salir. Si hubiera andado siempredesnuda, nunca habría tenido la oportunidad deescribirlo.

Groucho Marx (1976).

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1. INTRODUCCION

LA MUERTE CELULAR

La muerte celular por apoptosis y por necrosisLa muerte celular es un fenómeno

biológico que se ha encontrado en todos losorganismos pluricelulares estudiados, que ocurrede manera natural en el desarrollo embrionario ydurante el recambio celular en animales adultos(Vaux, Haecker y Strasser, 1994; Clarke, 1990).La muerte celular participa además en diferentesprocesos patológicos como: en la disminución delas células T en el síndrome de inmunodeficienciaadquirida, en la degeneración neuronal delsíndrome de Huntington y en la enfermedad deAlzheimer (Mc Conkey y Orrenius, 1994), asícomo en el cáncer, en donde hay una disminuciónen la sensibilidad de las células cancerosas amorir, lo cual favorece la formación de tumores(Fisher, 1994).

La muerte celular puede ocurrir por dosprocesos generales diferentes (Figura 1). Se hapropuesto que la forma natural más común deeliminación celular ocurre por apoptosis (delgriego apo-TEO-sis, que se refiere a la "caidanatural de las hojas en otoño"), la cual depende deun proceso dirigido genéticamente que seencuentra latente en todas las células (Raff et al .,1993). Al segundo tipo de muerte se le conocecomo necrosis (del griego nekrosis, que significamortificación o privar de vitalidad) y se consideraque sólo ocurre de manera patológica por un dañosevero debido a cambios en el ambiente queafectan de manera letal a la célula (Kerr y Harmon,1991; Clarke, 1990).

Figura 1. Diagrama en el cual se representa lasecuencia de los principales cambiosultraestructurales que ocurren, durante laapoptosis (1-4) y la necrosis (5-6). Tomado ymodificado de Tomei y Cope (1991).

La célula que muere por apoptosis secaracteriza inicialmente por que adquiere una

forma redondeada y se separa de las célulascontiguas (Fig. 1.1). A nivel del núcleo, lacromatina se compacta formando "masas",aparentemente de mayor densidad, queincrementan en número (Figura 1.2) hasta que elnúcleo es francamente picnótico (i.e. condensado)(Fig. 1.3) (Clarke, 1990). Durante este proceso, elADN se fragmenta y se observa por electroforésisen geles de acrilamida, un patrón característico de"escalera". Por otro lado, la membrana celularpresenta numerosas convoluciones, que seinternalizan profundamente en el citoplasma (Fig.1.3), que posteriormente provocan lafragmentación de la célula. Cada fragmento poseemembrana e incluso puede contener organitoscelulares que preservan su estructura aúndespués de ser fagocitados (Fig. 1.4). Por suparte, los lisosomas normalmente permanecenintactos, aún después de la fragmentación de lacélula. Durante la muerte por apoptosis, elcontenido celular no es vertido al espacioextracelular y no se genera una respuesta de tipoinflamatoria. En contraste, durante el proceso demuerte por necrosis, la cromatina se condensa enmasas poco definidas, los organelos se hinchan,los lisosomas pierden su continuidad y viertensus componentes al citoplasma (Fig. 1,5).Posteriormente la membrana se rompe y la célulase desintegra, por lo que el citoplasma y losfragmentos de organitos escapan al espacioextracelular (Fig. 1.6), lo que provoca unarespuesta de tipo inflamatoria (Kerr y Harmon,1991). En condiciones naturales la vía más comúnde muerte es la de apoptosis. Sólo en casosextremos de daño celular se lleva a cabo elproceso de necrosis. En lo ulterior se utilizará eltérmino muerte celular y apoptosis de maneraindistinta y, al referirnos a muerte por necrosis,utilizaremos específicamente éste término.

Fases de la apoptosisEn años recientes se ha generado una

gran cantidad de evidencias a favor de que laapoptosis es un proceso activo, regulado a nivelgenético. Debido a que el control del procesoparece estar ampliamente conservado en laevolución (Martin y Green. 1995), se ha obtenidomucha información sobre los mecanismosgenéticos que lo controlan, utilizando modelosanimales como el nemátodo Caenorhabdit iselegans (Hedgecock et al., 1983,) en el cual sehan encontrado genes homólogos funcionales quecontrolan la muerte celular que ocurre en otrosorganismos (Hengartner y Horvitz, 1994). Lamuerte celular se ha dividido en cuatro fasesdiferentes (Fig. 2): a) la fase de activación, endonde la célula decide si va a morir o si seguiráalgún otro proceso como proliferar o diferenciarse;b) la fase de ejecución, que lleva a que la célulapresente los cambios característicos descritos enla Fig. 1; c) la fase de engullimiento, en la que losfragmentos de la célula en proceso de muerte sonfagocitados; d) la fase de degradación, en donde

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Figura 2. Fases delproceso de apoptosis.Tomado y modificadode Steller (1995).

los fragmentos son degradados dentro de lacélula que los fagocitó (Steller, 1995).

Una gran variedad de señales puedenmodular la decisión de iniciar o reprimir la fasede activación de la muerte celular. Incluso, unamisma señal puede tener efectos opuestosdependiendo del tipo celular blanco y de lascondiciones ambientales e intracelulares. Por otrolado, las moléculas involucradas en el control delas otras fases de la muerte (ejecución,engullimiento y degradación) parecen sercomunes e independientes del tipo celular(Steller, 1995).

Algunas moléculas del proceso deejecución que han sido mejor caracterizadas, sehan clasificado en dos familias con base en lahomología que presentan sus secuencias de ADN:

a) La familia de Bcl-2 se divide en dosgrupos. En el primer grupo los genes bcl-2 y bcl-xL(homólogos de CED-9 en C. elegans ), que al sersobreexpresados protegen. En el segundo grupoestán comprendidos bax, bak y bad, que, por elcontrario, matan al ser sobreexpresados. Estasproteínas tienen la capacidad de heterodimerizar yel tipo de dímero formado determina si se llevará acabo el inicio de la apoptosis (Oltvai y Korsmeyer,1994).

b) Caspasas. Dentro de esta familia seencuentran comprendidas las proteínas conactividad de proteasas, particularmente lasrelacionadas con la enzima convertidora de lainterleucina-1beta (IL-1beta). A ellas se atribuyelos cambios morfológicos observados durante laejecución de la muerte. La sobreexpresión de Ice,así como de muchos de sus homólogos, CED-3 (enC. elegans), Nedd2/Ich-1, CPP32/Yama,Tx/Ich2-2 y Mch-2 en diferentes tipos celularesresulta en la muerte de la célula por apoptosis(Martin y Green, 1995).

La muerte celular en el desarrollo embrionarioA mediados del siglo pasado, poco

después del reconocimiento de que losorganismos están formados por células, sedescubrió que la muerte celular ocurre durante eldesarrollo de los animales, tanto en vertebradoscomo en invertebrados (citado en Glucksman,1951). Algunos autores de principios de sigloencontraron difícil aceptar la idea de que algunascélulas mueren normalmente durante laembriogénesis, particularmente en las regiones

que proliferan abundantemente. Interpretaron alos núcleos picnóticos observados, comometabolitos derivados de la mitosis (Glucksman,1951).

La ocurrencia de la muerte celular se haobservado en la mayoría de los tejidos estudiadosen alguna etapa de su desarrollo (Glucksman,1951; Menkes, Litvac e Ilies, 1964; Menkes,Deleanu e Ilies, 1965; Ilies, 1967; Ilies, 1969). Esinteresante el hecho de que desde mediados delpresente siglo se hizo una distinción entre lamuerte necrótica y la muerte celular “natural”.Esta muerte natural se denominó de formasdiferentes: degeneración celular, desintegracióncelular, necrobiosis o muerte celular lenta(Glucksman, 1951). A pesar de lasparticularidades y las formas que se observan enlas células al morir, la mayoría presentancaracterísticas cuya descripción concuerda con laque actualmente reconocemos como muerteapoptótica.

El término de muerte celular programada(MCP) se ha utilizado tradicionalmente paradescribir el hecho de que la muerte durante eldesarrollo embrionario ocurre en regiones y entiempos del desarrollo “predecibles” (Jacobson et.al 1997), lo cual sugiere que es un procesocontrolado y que ocurre en el desarrollo demanera natural.

Funciones de la muerte celular en el desarrolloembrionario.

A la fecha se desconoce la proporción demuerte celular durante el desarrollo embrionarioen la mayoría de los organismos debido, en parte,a que prácticamente todas las células en procesode muerte se encuentran contenidas en lascélulas fagocíticas (Glucksman, 1951; Hammar yMottet, 1971; Rotello et al., 1994; Jacobson et al.,1997). Esto explica que, aún en zonas en lascuales ocurre la muerte a gran escala,normalmente se observen pocas células enproceso de muerte. Las células apoptóticas sonremovidas con gran rapidez, por lo queposiblemente se ha subestimando la cantidad demuerte que ocurre durante el desarrolloembrionario (Jacobson et al., 1997). En algunosorganismos se ha descrito que el proceso deregresión puede ser tan corto como de 1 a 3 horas(Glucksman, 1951).

Los efectos en la deficiencia en la MCP

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varían, dependiendo del organismo en que estoocurre. Por ejemplo, mutantes deficientes demuerte celular en C. elegans, presentan undesarrollo y un lapso de vida normal, aún cuandotienen aproximadamente alrededor de un 15%más de células que los organismos de tiposilvestre (Ellis et al., 1991). Mutantes deD r o s o p h i l a en el gene r eape r , en los quevirtualmente desaparece toda la muerte celulardurante su desarrollo, presentan un númeromayor de células pero no logran eclosionar delestadio de pupa (White et al ., 1994). EnMamíferos no se han descrito mutantes similares alos estudiados en C. elegans o en Drosophila. Sinembargo, los ratones transgénicos sin caspasa 3(CPP32) mueren antes de nacer y presentan unnúmero mayor de células en el cerebrocomparados con el silvestre (Kuida et al ., 1996).Lo anterior parece indicar que, al menos enartrópodos y vertebrados, la muerte celular serequiere para el desarrollo embrionario normal.

La MCP parece jugar varias funcionesdurante el desarrollo embrionario. Algunosautores han clasificado dichas funciones de formadiferente (Glucksman, 1951; Jacobson et al .,1997). Algunas propuestas son las siguientes:

(1) Moldear estructuras o formas. La MCPes importante para dar forma a diferentes órganosy estructuras en el desarrollo, como ocurredurante la individualización de los dígitos(Saunders, 1966), la fusión de estructuras comoel esternón (Saunders, 1966) y del paladar(Glucksman, 1951) y también durante el procesode cavitación para la formación de la oquedadpreamniótica en los embriones de ratón(Coucouvanis y Martin, 1995). Sin embargo, enpoco casos se ha evaluado en detalle laimportancia de la muerte en el desarrollo de losórganos (Milligan et al., 1995; Weil et al., 1997).

(2) Remover estructuras “transitorias”. Enel desarrollo de algunos organismos existenestructuras transitorias que son necesarias en unaetapa pero son removidas conforme avanza eldesarrollo. Por ejemplo, la regresión de la cola ylas branquias en la metamorfosis en los anfibios(Tata, 1994) o en la regresión de los túbulosmesonéfricos en los mamíferos (Gilbert, 1994).

(3) Controlar el número de células. Hayórganos en los cuales se producen una grancantidad de células y posteriormente se reduce elnúmero por muerte celular. En el caso del sistemanervioso, aproximadamente el 50% de las célulasque se producen son eliminadas. Se haconsiderado que sólo sobreviven las célulascapaces de hacer contacto con las células blancoy las demás son eliminadas (Barde, 1989;Oppenheim, 1991).

(4) Eliminar células anormales, malubicadas, no funcionales, o “dañinas”. Esimportante la muerte de células potencialmentepeligrosas para el organismo, como durante eldesarrollo del sistema inmune, en donde seeliminan las células que potencialmente

generarían reacciones auto-inmunes (Golstein,1989). (5) Producir células diferenciadas sinorganitos. Hay algunos tipos celulares en los quela diferenciación terminal requiere que las célulasmueran, como es el caso de los queratinocitos. Enestos la sobreexpresión de bcl -2 inhibe sudiferenciación terminal in vitro (Nataraj et al .,1994).

(6) Suplir deficiencias nutricionales detejidos adyacentes. Algunos autores han sugeridoque durante la gastrulación en el pollo, la muertede las células endodérmicas con vitelo se requierepara que haya una degradación y liberación de losderivados del vitelo y así suplir las deficienciasnutricionales de los tejidos adyacentes(Gluksmann, 1951).

(7) Producir un substrato de fibras paraotras células. Por otro lado, se ha propuesto que lamuerte de algunas células permite la formacióndel substrato requerido por otras células para sumigración o crecimiento (Gluksmann, 1951).

Control de la MCPSe desconocen los mecanismos que

controlan la decisión de cuáles células sonremovidas por la MCP y cuales sobreviven en eldesarrollo embrionario. Existe una gran variedadde factores que participan en la activación de laMCP (Steller, 1995).

Evidencia experimental con la drogaestaurosporina (inhibidor de proteín-cinasas,calcio/fosfolípidos dependiente) y ciclohexamida(inhibidor de la síntesis de proteínas) de manerasimultánea, muestra que todas las célulasanimales, incluso las células embrionarias,expresan de manera constitutiva la maquinariarequerida para que se lleve a cabo la muertecelular (Ishizaki et al ., 1995; Weil et al ., 1996),por lo que, en principio, la muerte celular puedeocurrir de manera autónoma. Estos datos sugierenque las células vivas requieren de factores desobrevivencia que se contrapongan a lamaquinaria de muerte, que se encuentra en estadolatente. Trabajos recientes indican que la MCP esregulada en la fase de activación del proceso porseñales que provienen de otras células. Los tiposde señales propuestas son: (a) señales activadorasque inician al programa de muerte, como sería elcaso del factor de necrosis tumoral (Wong et al ,1989); (b) señales supresoras de la MCP, como elfactor de crecimiento neural, que es secretado porlas células blanco en cantidades limitantes y sólolas neuronas simpáticas, que hacen contacto conellas, pueden sobrevivir (Levi-Montalcini, 1987).

Las señales que regulan la muerte duranteel desarrollo en los diferentes tejidosembrionarios son en su mayoría desconocidas, sinembargo, la combinación así como laconcentración tanto de las señales que activan ylas que reprimen la muerte celular, modulan ladecisión de las células para que sobrevivan omueran (Jacobson et al., 1997).

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Algunos métodos utilizados para estudiar lamuerte celular

Diferentes métodos han sido utilizadospara evidenciar la muerte celular durante eldesarrollo embrionario. Por ejemplo, mediante losmétodos histológicos, reconocen, por microscopíade luz o electrónica, las características de laapoptosis descritas en la figura 1. Los colorantesvitales se utilizan para teñir las células en procesode muerte, como el azul nilo o el anaranjado deacridina (Bowen y Bowen, 1990). El métodoTUNEL se basa en el hecho de que las células enapoptosis presentan cortes en una o dos de lascadenas de su ADN. Así se pueden marcar losextremos 3'-OH libres con nucleótidosmodificados (i.e. fluorescentes, ó biotinilados parateñir posteriormente utilizando la peroxidasaconjugada con avidina) para detectar a las célulasen apoptosis (Figura 3) (Gavrieli, Sherman y Ben-Sasso, 1992). Con estas metodologías se hapodido reconocer que prácticamente en todos losórganos durante su desarrollo ocurre la muertecelular en alguno de sus tejidos de maneranatural (Glucksman, 1951).

Figura 3.- Método deTUNEL. Con este métodoes posible añadirnucleótidos modificadosal ADN en una solacadena o en las dos.Los nucleótidosmodificados serepresentan con loscirculos.

EL ESTRES OXIDATIVOLa gran cantidad de evidencia generada en

años recientes sugiere que las especies deoxígeno reactivas (EOR) participan en el control dela muerte celular, como segundo mensajero de lasseñales que disparan este proceso. A continuaciónse discuten algunas vías reportadas queparticipan en la modulación del estado redoxintracelular y posteriormente se señala parte de laevidencia reciente a favor de que el estrésoxidativo participa en el control de la apoptosis.

Vías de generación de especies de oxígenoreactivas (EOR) y el estrés oxidativo.Vías enzimáticas.

Durante la respiración normal la mayorparte del oxígeno es reducido en las mitocondrias,por la citocromo oxidasa. La reducción parcial deloxígeno en la cadena respiratoria puede darorigen a otras especies de oxígeno reactivas, comoel superóxido (O2.-), el peróxido de hidrógeno(H2O2), el radical hiperoxi (HO2.) y el radicalhidroxilo (.OH) (Fisher, 1987). Aproximadamente

1012 moléculas de O2 son procesadas diariamentepor cada célula de la rata. Se ha calculado quealrededor de un 2% de moléculas de oxígenoparcialmente reducidas escapan de la rutametabólica normal (Ames, Shigenaga y Hagen,1993). Estas moléculas que escapan podríanllegar a generar un estado de estrés oxidativo.

Existen otras vías enzimáticas descritasque pueden llevar a la producción de oxígenoparcialmente reducido en otros compartimentoscelulares. En el retículo endoplásmatico lacitocromo P450 genera superóxido; en losperoxisomas, la urato oxidasa y la D-aminoácidooxidasa generan peróxido de hidrógeno; en lamembrana nuclear y en el citoplasma, la xantinaoxidasa y aldehído oxidasa, generan tantosuperóxido como peróxido de hidrógeno; en lamembrana plasmática de los leucocitos y de losmacrófagos la NADPH oxidasa genera superóxido(Fisher, 1987). Esta última vía participa en lasetapas tempranas del desarrollo en el erizo de mar(Heinecke y Shapiro, 1989) y en los embriones deratones postimplantación (Gagioti et al., 1995).Sin embargo, no se ha caracterizado a detalle si laactividad de la NADPH oxidasa ocurre endiferentes tipos celulares durante el desarrolloembrionario en el ratón. Otra vía de generación deEOR descrita es la oxidación de las poliaminas porlas amino oxidasas, que generan peróxido dehidrógeno y aldehidos (Gramzinski et al., 1990).

Vías no enzimáticas.La autooxidación de di ferentes

componentes celulares puede llegar a ser unafuente importante de producción de EOR. En lasmitocondrias, el transporte de electrones en lacadena respiratoria implica la reducciónsecuencial de flavoproteínas, ubiquinona y loscitocromos mitocondriales. La ubiquinona esreducida por un electrón para generarubisemiquinona, la cual es normalmentereoxidada por el complejo de la citocromo b, perotambién puede reaccionar con el oxígenomolecular para generar superóxido. También en elretículo endoplasmático, la autoxidación de laflavina parcialmente reducida que interviene en eltransporte electrónico a la citocromo P450, puedegenerar superóxido (Fisher, 1987).

El superóxido puede reaccionar con elperóxido de hidrógeno, en presencia de metalesde transición y generar radicales hidroxilo queson más tóxicos que las EOR que los originan(Wong et al., 1989).

Otra forma que puede participar en laacumulación de EOR es la inhibición de lasenzimas encargadas de metabolizar EOR, como lassuperóxido dismutasas y la catalasa (descritas amayor detalle más adelante), ya que se hareportado que el superóxido puede inhibir tanto alas catalasas como a las peroxidasas y el peróxidoa la CuZnSOD y la FeSOD (Fridovich, 1987).

Se ha considerado que la generación deEOR por la respiración, tiene una importancia

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menor debido a que normalmente las enzimasparticipantes se encuentran saturadas a lapresión normal del oxígeno (Fisher, 1987). Sinembargo el dos por ciento de EOR que escapa dela cadena respiratoria (Ames, Shigenaga y Hagen,1993) puede tener un efecto considerable bajociertas condiciones. Al aumentar la presiónparcial del oxígeno, la generación de EOR porautoxidación puede provocar un aumento de EORproporcional al incremento de la concentración deoxígeno (Fisher, 1987).

Mecanismos de protección intracelulares contraagentes oxidantes.Defensas naturales intracelulares.

1. Mecanismos de secuestro. Uno de losmecanismos de defensa, que utilizan las célulaspara prevenir el efecto de las EOR, es el secuestrode las enzimas y las moléculas que forman EOR,para que no se generen libremente en toda lacélula. Por ejemplo, se secuestran algunas de lasenzimas que generan peróxido de hidrógeno en losperoxisomas. El otro mecanismo de secuestro esquelar el hierro y el cobre mediante proteínascomo la transferrina y la ferritina o laceruloplasmina, para así evitar que estos metaleslibres lleven a cabo la reacción de Fenton en elcitoplasma (Ames et al, 1993).

2. Antioxidantes:Por otro lado, existen mecanismos

antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos)encargados de evitar que los EOR reaccionen conlas diferentes macromoléculas celulares. Lascatalasas, previenen la acumulación de peróxidode hidrógeno por la dismutación del H2O2 en aguay oxígeno molecular, se encuentra localizadasprincipalmente en los peroxisomas pero seencuentra también en el citosol (Fridovich, 1987).Otras enzimas importantes son las superóxidodismutasas (SOD), que son metaloproteínasencargadas de la conversión de superóxido enperóxido de hidrógeno y oxígeno molecular. Sehan descrito SODs que presentan unadistribución característica y una asociación conmetales particulares: la SOD que presenta cobre yzinc (CuZnSOD) que se encuentra principalmenteen el citosol de las células eucariotas, la SOD quecontiene manganeso (MnSOD), que se haencontrado, tanto en procariotas como en lasmitocondrias de eucariotas, y la SOD con fierro(FeSOD), que se ha reportado en procariotas(Wong et al, 1989), así como la SOD extracelular(Fridovich, 1995). Otro grupo de enzimasencargadas de la destoxificación por peróxido aagua y oxígeno molecular, son lascatalasas/peroxidasas, que de manera adicionalpueden reducir peróxidos de lípidos a susalcoholes correspondientes (Toussaint et al. ,1993), que se encuentra localizado enmitocondrias, lisosomas, peroxisomas y en elcitoplasma (Singh et al., 1994).

Una de las principales vías antioxidantes

no ezimáticas descrita es la de la cisteína, quepuede ser tomada del medio extracelular víasistema de transporte preferente para la alanína,serína y la cisteína para convertirlo a glutatión(Sandstrom et al , 1994; Meister , 1983). Elglutatión funciona como un amortiguador redoxintracelular y, en conjunción con la glutatiónperoxidasa, como un atrapador de EOR(Sandstrom et al, 1994). La cisteína per se tienetambién un papel como agente antioxidante,aunque es menos eficaz que el glutatión, al reducirdirectamente los radicales libres, o al actuar comoprecursor de proteínas antioxidantes, ricas encisteína, como la metalotioneina (Ratan et al ,1994). El glutatión es un tripéptido (gama-glutamil-L-cisteín-glicina) que se encuentraampliamente distribuido en diversos tejidos y esmantenido (99%) en su forma reducida (GSH) pormedios enzimáticos. Se considera que el glutatiónpreserva la integridad celular debido a queincrementa el poder antioxidante de la célula y escapaz de reducir peróxidos y radicales libres, asícomo de mantener las uniones disulfuro de lasproteínas en su estado reducido (Ratan et al ,1994). La glutatión peroxidasa cataliza lareducción del peróxido de hidrógeno y deperóxidos orgánicos por el glutatión (Greenlund,1995).

Otras moléculas que funcionan comoantioxidantes intracelulares son la vitamina A(retinal), la vitamina C (ascorbato), la vitamina E(tocoferol) (Ames et al, 1993) y los carotenos, quepueden ser ingeridos en la dieta y tienen unaactividad antioxidante particularmente contra eloxígeno en singulete. Muchos carotenos puedenser metabolizados para dar origen a la vitamina A(retinal) (Ames et al, 1993).

3. Inhibición de la síntesis de proteínas.La inhibición de la síntesis de proteínas bajocondiciones de estrés oxidativo, pueden provocaruna redistribución de la cisteína, llevando a suvez a un incremento de las posas de glutatión.Algunos autores han considerado éste como unmecanismo que genera poder reductor intracelular(Ratan et al, 1994)

A pesar de que el metabolismo de las EORse ha caracterizado ampliamente, aún sedesconoce en detalle como se lleva a cabo elcontrol del balance redox durante el desarrolloembrionario. El trabajo expuesto en la presentetesis llama la atención sobre la posibilidad de quedurante el desarrollo en vertebrados, existanmecanismos muy finos en el control del estadoredox celular, que participan en el proceso de lamuerte. En el siguiente apartado se da unpanorama general de la evidencia a favor de que laproducción de EOR participa en el control de lamuerte celular.

El estrés oxidativo y la muerte celularSe sabe que el oxígeno y algunos de sus

derivados son capaces de provocar daño a losdiferentes componentes celulares por medio de la

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oxidación de sus macromoléculas, como el ADN,las proteínas y las membranas lipídicas. Además,se ha reportado que el oxígeno es capaz deinactivar a algunas enzimas, por lo que seconsidera el oxígeno y las EOR como altamentetóxicos (Halliwell y Gutteridge, 1989). A pesar delo anterior, se tiene evidencia de que las EORfuncionan de manera natural como segundosmensajeros en la transducción de señales alinterior de las células (Khan y Wilson, 1995).

Hay diferentes señales extracelulares queinician el proceso de muerte. Por ejemplo, lamuerte celular puede ser inducida por factoresproteicos, como el factor de necrosis tumoral(TNF) (Wong et al, 1989). por la proteína betaamiloide (Behl et al , 1994), por la acción defactores de crecimiento como el BMP-4 (Graham eta l ., 1993), por la ausencia de factores decrecimiento como el factor de crecimiento neural(NGF) (Greenlund et al , 1995), por el aumento enla presión parcial de oxígeno en la atmósfera(Enokido y Hatanaka 1993) o por la privación deprecursores de glutatión (Ratan et al ., 1994). Apesar de la gran diversidad de estímulos o a lacarencia de factores de sobrevivencia queprovocan como respuesta la muerte celular, enalgunos casos se ha propuesto que la muerte esmediada por la acción de especies de oxígenoreactivas (ver más abajo).

Por lo anterior se ha sugerido que uno delos mecanismos que activan el proceso apoptótico,es la acumulación de especies de oxígenoreactivas, lo que provoca un estado de "estrésoxidativo" intracelular (McConkey y Orrenius,1994) .

Existen tres grupos principales deevidencia a favor de que el estrés oxidativo puedeestar involucrado en el proceso de activación de lamuerte celular.

1. Evidencia por incremento del estrésoxidativo. Se han utilizado diferentes estrategiaspara someter a diversos tipos o a líneas celularesa un incremento del estrés oxidativo, para asíverificar su efecto sobre la muerte celular. Porejemplo, se ha utilizado sistemas para lageneración de EOR, como la xantina oxidasa enconjunción con su substrato la xantina que, invitro, provocan la reabsorción del hueso (Garrettet al ., 1990). También el tratamiento in vitro decélulas, como la línea celular linfoide murinaFL5.12, con peróxido de hidrógeno induceapoptosis en una forma dosis dependiente(Hockenbery et al., 1993). Incluso se haobservado en otro modelo experimental que, alincrementar la presión parcial de oxígeno de laatmósfera en los cultivos de neuronas derivadasdel hipocampo de ratas, se induce la muerte porapoptosis (Enokido y Hatanaka, 1993).

2. Evidencia correlativa. Se han utilizadomoléculas que son capaces de reaccionar con lasEOR para demostrar su formación en diferentessistemas. Algunas moléculas incoloras soncapaces de reaccionar con las EOR y esta reacción

genera productos fluorescentes, como eld ic loro f luorece in (DCDHF-DA) o ladihidrorhodamina 123 (Keston y Brandt, 1965;Black y Brandt, 1974; Cathcart et al ., 1983;Emmendorffer et al., 1990; Rothe, 1991;Henderson y Chappell, 1993; Royal eIschiropoulos, 1993; Royal y Harry, 1993). Existeademás otro grupo de colorantes sensibles acambios redox como las sales tetrazólicas, lascuales reaccionan con el superóxido y forman unprecipitado insoluble, que se denomina formazán,el cual es visible por microscopía de luz, ya quepresenta una coloración púrpura (Halliwell yGutteridge, 1989; Garrett et al., 1990). Por mediode estos colorantes sensibles a cambios redox,diferentes grupos han encontrado evidencia deque previa a la aparición de las modificacionesmorfológicas características asociadas a la muertecelular, se generan picos de formación de EOR.Por ejemplo, durante la reabsorción del hueso invitro antes mencionada, utilizaron la sal tetrazólicaNBT verificando así la generación de EOR en lasregiones donde ocurre la regresión de este tejido(Garrett et al., 1990). Se ha verificado tambiénque la muerte inducida en células L929, por elfactor de necrosis tumoral o TNF es mediado porla producción de EOR, utilizando la tinción con elcolorante dihidrorhodamina 123. La tinción coneste colorante se observó previa a que ocurrieranlos cambios característicos del proceso de muerte(Goossens et al., 1995). Esta estrategia se hautilizado también en los siguientes modelosexperimentales: durante la privación del NGF encélulas simpáticas, in vitro, con el coloranteDCDHF-DA (Greenlund et al , 1995), en lacitotoxicidad por la proteína β amiloide en cultivosprimarios de células del sistema nervioso centralde rata, con DCDHF-DA (Behl et al , 1994),durante la muerte celular, in vitro, en cultivosprimarios de células neurales obtenidas depacientes con síndrome de Down, utilizando elcolorante DCDHF-DA (Busciglio y Yankner, 1995)y en la muerte celular que ocurre en diferentesórganos durante el desarrollo embrionario deratones, utilizando tanto al colorante DCDHF-DAcomo a la sal tetrazólica MTT (Publicación 1,Salas-Vidal et al ., 1998). Se ha observadotambién que, durante la muerte inducida por elfactor de transcripción p53 (el cual se discutemás adelante) hay un incremento de laconcentración de EOR, verificado con el colorantesensible a cambios redox, DCDHF-DA (Johnson etal., 1996) o con una variante de este colorante(Polyak et al., 1997).

3. Evidencia por inactivación de EOR.Posiblemente la evidencia más convincente de laimportancia de las especies de oxígeno reactivasen el control de la muerte celular, es eltratamiento con agentes antioxidantes que evitanla muerte celular. Por ejemplo, al quitar el factorde sobrevivencia NGF, a cultivos de neuronassimpáticas, in vitro , se induce muerte celular. Sise inyecta superóxido dismutasa (SOD) Cu/Zn o

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se sobreexpresa esta enzima previo a la aparicióndel pico de producción de EOR, se evita la muertecelular. De manera adicional, al añadir el factorNGF al cultivo, poco después del pico máximo deproducción de EOR, se previene la muerte celular.En conjunto, estos reportes sugieren que laproducción de EOR, funciona como una señaltemprana del programa de muerte, y no como unagente ejecutor del proceso (Greenlund et al .,1995). Esta estrategia de proteger de muertecelular al tratar con antioxidantes ha probado serefectiva en otros sistemas:

a) En líneas celulares. En hibridomas decélulas T, se induce la apoptosis por tratamientoscon la proteína mielina básica o bien al cultivarlasen presencia de células irradiadas, presentadorasde antígenos esplácnicas. Las células T quenormalmente mueren en estas condiciones, sonprotegidas al ser incubadas con N-acetilcisteína(NAC), el cual es un precursor del glutatión(Sandstrom et al. 1994). Otro ejemplo es la líneacelular L929 de fibrosarcoma de murino, en la quese induce muerte el TNF, y puede ser inhibidapor tratamientos con glutatión (Goossens et al .,1995). Por otro lado, en la línea celular DLD-1, lasobreexpresión de p53 induce apoptosis. En estesistema se observa un pico de producción de EORprevio a la muerte y ésta se bloquea por la adicióndel antioxidantes (Polyak et al., 1997). Se haobservado algo similar en células de músculo lisode humano y de rata, en donde la sobreexpresiónde p53 que induce muerte celular, se evita portratamientos con NAC (Johnson et al. 1996).

b) En cultivos primarios de célulasprovenientes de pacientes con diferentespatologías. Por ejemplo, la proteína β amiloide escitotóxica para células nerviosas y se ha asociadocomo una de las moléculas causantes de elsíndrome de Alzheimer. En cultivos primarios decélulas nerviosas de la corteza cerebral deembriones de rata, se induce la muerte celular portratamientos con la proteína β amiloide; estamuerte se bloquea por la adición de antioxidantescomo la vitamina E (Behl et al ., 1994). Por otrolado, la degeneración, in vitro, de células de lacorteza en cultivos primarios de tejidos depacientes con el síndrome de Down, se evita porla adición de catalasa, de vitamina E o de NAC(Busciglio y Yanker, 1995), Se ha asociadotambién, al estrés oxidativo provocado pormutaciones en la enzima superóxido dismutasaCu/Zn (CuZnSOD), con el síndrome de laesclerosis amiotrófica lateral, la cual se caracterizapor la degeneración de las neuronas motoras. Encultivos de estas células mutantes, se evita lamuerte celular por la sobreexpresión de CuZnSOD(Wiedau-Pazos, et al., 1996).

c) En el desarrollo embrionario. Utilizandoa células troncales derivadas de la masa celularinterna de embriones de ratón, se encontró que elácido retinoico, induce apoptosis in vitro. Lamuerte se evita por la adición de agentes

antioxidantes como la catalasa, la SOD o el fenol(Castro-Obregón y Covarrubias, 1996). Estosresultados sugieren que durante el desarrolloembrionario la muerte celular puede ser reguladapor EOR.

d) Células vegetales. Plantas mutantes deArabidopsis, como la lsd1, al ser expuestas acompuestos químicos que provocan estrésoxidativo, presentan una muerte celular acelerada,comparadas con plantas con genotipo silvestre, Elincremento en la muerte puede ser evitado por lainoculación con SOD (Jabs et al., 1996).

Por otro lado, existe evidencia adicional deque el estrés oxidativo juega un papelfundamental en el control de la muerte celular.Algunas moléculas implicadas en el control de lamuerte celular in vivo, se ha encontrado queparticipan en la regulación del estado redoxintracelular. Por ejemplo, el proto-oncogene bcl-2se conoce ampliamente por su actividadantiapoptótica en diferentes tipos celulares(Korsmeyer, 1992). La sobreexpresión de laproteína Bcl-2 en animales transgénicos, provocala acumulación de células debido a unadisminución en la muerte (McDonnell et al. ,1989). Por el contrario, en ratones deficientes delgen bcl-x, que es un miembro de la familia de bcl-2presentan muerte masiva de células de la líneahematopoiética y de neuronas (Motoyama et al.,1995). Sin embargo, la evidencia más importantea favor de que posiblemente Bcl-2 participa enuna vía antioxidante es aportada por la disrupcióngénica de bcl-2, en donde los ratones tenían pelogris, lo que parece explicarse por un aumento enla oxidación de los precursores de la melanina delpelo (Nakayama et al., 1994). Algunos grupos hanpropuesto que la actividad antiapoptótica de Bcl-2, reside parcialmente en que tiene actividadantioxidante, ya que protege a linfocitos pro-B demurino FL5.12 in vitro del los efectos letales delperóxido de hidrógeno, y evita la peroxidación delípidos (Hockenbery et al ., 1993a). De maneraadicional, la sobreexpresión bcl-2, en célulasneurales provoca un cambio en su potencial redoxhacia un estado más reducido, sin afectarmayormente la actividad de las principalesenzimas antioxidantes celulares, pero si demoléculas como los piridin nucleótidos y de lasposas de glutatión (Ellerby et al., 1996). Por otrolado, otros grupos han propuesto que Bcl-2 es enrealidad una molécula prooxidante, que generaestados constitutivos de estrés oxidativo, que noson suficientes para activar la apoptosis, pero sipara inducir la expresión de moléculasantioxidantes como catalasas/peroxidasa oCuZnSOD (Steinman, 1995). Independientementedel mecanismo por medio del cual Bcl-2 provocaun cambio en el estado redox intracelular, losreportes antes mencionados, apoyan la hipótesisde que, el estado redox y/o las EOR, participan enel control de la apoptosis de manera natural.

Otro grupo de evidencia a favor del papelque juegan las EOR en la muerte celular, son los

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reportes de los mecanismos mediante los cualesp53 media la muerte celular. La proteína p53 estácodificada por el gen que se encuentra mutadocon más frecuencia en el mayor número de tiposde cánceres que ocurren en humanos. De los 6.5millones de personas a las cuales se lesdiagnostica algún tipo de cáncer anualmente,aproximadamente la mitad presenta mutaciones enp53 (Harris, 1993). p53 es una proteína que seune al ADN y funciona como un activador de latranscripción (Jayaraman et al., 1997). Lacapacidad de unión al ADN puede ser alterada portratamientos con agentes oxidantes quedisminuyen su unión al ADN, o por agentesreductores que incrementan su capacidad deunión, característica que parece mediada por elestado redox de residuos de cisteína que regulanla actividad de la proteína (Rainwater et al .,1995). De manera adicional utilizando extractosde células HeLa, se encontró que Ref-1 estimula laactividad de p53 y su capacidad de unión al ADN.Ref-1 es un factor con doble función; por un lado,es una enzima reparadora del ADN con actividadde endonucleasa (A/P) y por el otro lado, funcionacomo una proteína que regula el estado redox dediferentes proteínas, lo cual reforza el hecho deque la actividad de p53 es regulada por su estadoredox (Jayaraman et al., 1997).

Por otro lado se sabe que p53 intervieneen el control de la muerte celular (Culotta yKoshland, 1993). Recientemente se ha reportadoque las EOR median la muerte regulada por p53(Johnson et al., 1996) posiblemente por que p53induce la transcripción de una gran cantidad deenzimas relacionadas con la regulación del estadoredox intracelular y con la producción de EOR(Polyak et al., 1997).

A pesar de que se conocen gran cantidadde modelos experimentales en los que el controlde la muerte celular parecen estar involucradaslas EOR, en la presente tesis se exploró el posiblepapel que juegan en el control de la muertecelular durante el desarrollo embrionario delratón, ya que esta posibilidad no se ha exploradoa detalle anteriormente.

LOS RETINOIDESLos derivados naturales de la vitamina A

(retinol), se les conoce como retinoides, ycomprenden a un grupo de moléculas importantesen la señalización de diferentes procesoscelulares. Inicialmente se conocieron por susefectos teratogénicos sobre el desarrolloembrionario, cuando se encontraban tanto endeficiencia como en exceso (Scott et al., 1994;Alles y Sulik, 1989), es importante indicar queexiste evidencia a favor de que estas moléculasson sintetizadas in vivo a partir de al menos unprecursor, el retinol (Thaller y Eichele, 1987;McCaffery y Drager, 1994; Colbert et al., 1993).Existen dos familias de receptores nucleares pormedio de los cuales los derivados activos delretinol, ejercen sus efectos: los receptores al ácido

retinoico (RAR) y los receptores de retinoides delos que anteriormente se desconocía su ligando yse denominaron originalmente como X (RRX). Cadafamilia de receptores consisten en tres tipos dereceptores α , β y γ, los cuales modulan laactividad transcripcional de genes blancoespecíficos (Leid et al., 1992).

Estructura y metabolismo de los retinoidesLos retinoides naturales tienen en su

estructura básica un isoprenoide de 20 carbonesde longitud, con un anillo de ionilideno-beta, yuna cadena adyacente con enlaces doblesconjugados, lo cual permite un número aún nodeterminado de configuraciones isoméricasposibles. Poseen además un grupo terminal queexiste en tres estados de oxidación posibles: comoalcohol, como aldehído o como ácido (Ross, 1993).

La vitamina A (retinol) debe ser consumidapor un organismo en la dieta, ya que no puede sersintetizada en los mamíferos. En el interior de lacélula el retinol es metabolizado al menos a trestipos diferentes de retinoides: el ácido retinoicotodo trans (ARtt), el 3,4-didehidro ácido retinoico(ddAR) o el ácido retinoico 9-cis (AR9c). La ruta debiosíntesis principal de ARtt, es a partir de dosoxidaciones subsecuentes del retinol. La primeraoxidación, de retinol al retinal es una oxidaciónrevers ib le , cata l i zada por a lcoholesdeshidrogenasas (ADH), mientras que la segundaoxidación de retinal al ácido retinoico, es de tipoirreversible, y es catalizada por las aldehídosdeshidrogenasas (Fig. 4) (Duester et al., 1991). ElddAR parece que se genera a partir del retinol,primero por una deshidrogenación del retinol, locual forma al 3,4-didehidroretinol, seguida pordos oxidaciones subsecuentes similares a las queocurren en la biosíntesis del ARtt. Por su parte, elAR9c es un estereoisómero natural del ARtt, esgenerado probablemente por una isomerizacióncatalizada enzimáticamente; sin embargo, se handescrito en la literatura otros precursoresnaturales al AR9c en algas y peces, por lo queparecen existir rutas metabólicas alternativas enla biosíntesis del AR9c (Leid et al., 1992).

Los retinoides en el control de la muerte celularEn el presente trabajo nos interesó el

estudio de los retinoides, debido a queposiblemente se encuentra relacionado con elcontrol de la muerte celular durante el desarrolloembrionario. Se ha reportado que algunos de losefectos teratogénicos del AR en el desarrolloembrionario del ratón, se deben al incremento dela muerte en diferentes tejidos; el patrón de

Retinol <=> Retinal => Acido retinoico(ADH) (ALDH)

Figura 4.- Ruta de biosíntesis del ácido retinoico apartir del precursor retinol. ADH, alcoholdeshidrogenasa. ALDH, aldehído deshidrogenasa.La flecha doble indica una reacción reversible.

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muerte inducido depende del estadio deldesarrollo de los embriones (Sulik et al., 1988;Alles y Sulik 1989).

Evidencia reciente sugiere que elmecanismo de control de la muerte mediada porretinoides, es a través de la interacción de estosligandos con sus receptores. A pesar de que elreceptor RARβ se expresa ampliamente en el tejidointerdigital durante el desarrollo de lasextremidades del ratón, precisamente en lasregiones en que ocurre la muerte celular enabundancia (Dollé et al ., 1989), la expresión deeste receptor obedece más a que el receptor RARβ,presenta en su promotor, regiones responsivas alácido retinoico y es posible que el ácido retinoicosea producido localmente, no parece estarrelacionado con el control de la muerte en estetejido (Niederreither et al ., 1997). Particularmenteinteresante es el hecho de que in vitro, losretinoides que activan preferentemente a losreceptores RARα y el RARγ, inducen apoptosis yen los ratones que tienen mutados ambosreceptores así como al receptor RRXα, presentanuna regresión interdigital y muerte celular muylimitada, que provoca una deficiente separaciónde los dedos (Kastner et al., 1997; Nagy et al.,1998).

Por otro lado, estudios previos en ellaboratorio, utilizando como modelo a las célulastroncales embrionarias, en condiciones de cultivoque inducen la formación de cuerpos embrioides,mostraron que al incubarlas en presencia de ARttse induce un incremento en la muerte. La muerteobservada esta asociada a un incremento en laformación de EOR, además, la muerte inducidapor ARtt puede ser prevenida por la adición deagentes antioxidantes (Castro-Obregón yCovarrubias, 1996). Estos resultados nos llevó aproponer que la muerte celular que ocurre demanera natural durante el desarrollo embrionario,es inducida por el ácido retinoico, y que las EORfuncionan como un mediador de la señal del ARpara iniciar el programa de muerte.

EL DESARROLLO DE LAS EXTREMIDADESEstructura general de las extremidades.

Las extremidades en el embrión de ratón,se forman a partir de protuberancias que seproyectan de los costados de la pared lateral delcuerpo. Consisten básicamente de célulasmesenquimáticas envueltas por una capa deectodermo. En esta estructura básica, existenregiones que regulan tanto el crecimiento, como ladiferenciación, la muerte y la formación depatrones de las extremidades. Las regiones mejorcaracterizadas se han denominado como, la crestaectodermica apical, la zona de progresión y la zonacon actividad polarizante (Figura 5a) (Tickle yEichele 1994).

En la inducción de la formación de lasextremidades participan varias señales, como elácido retinoico (Stratford et al., 1996) y diferentes

miembros de la familia de factores de crecimientofibroblásticos (FGF). Inicialmente se reportó queFGF-1, FGF-2 y FGF-4 al ser administrados pormedio de implantes en el flanco de embriones depollo generan extremidades extras (Cohn et al,1995). Parece sin embargo que los miembros delos FGFs involucrados en la inducción de laformación del miembro, tanto en pollos y como enratones son el FGF-8 (Mahmood et al., 1995;Crosley y Martin, 1995) y el FGF-10 (Ohuchi etal., 1997), y los que mantienen el crecimientoproximo-distal son el FGF-8 (Mahmood et al .,1995; Crosley y Martin, 1995) y el FGF-4(Niswander et al., 1993).

Cabe resaltar el hecho de que el ácidoretinoico parece participar en diferentes eventosdurante el desarrollo embrionario, no solo durantela inducción de la formación de las extremidadesy la muerte interdigital como se mencionóanteriormente. Parece participar además en eldesarrollo de los elementos esqueléticos mediadopor la interacción con diferentes RARs y RRXs(Kastner et al., 1997).

Formación de la Cresta Ectodermica Apical (CEA)y su interacción con la zona de progresión.

El mesodermo de la región en que seformarán las extremidades, induce la formación dela estructura denominada CEA (Saunders y Reuss,1974; Carrington y Fallon, 1984) (Fig. 5), la cualesta formada por un epitelio engrosado (Todt yFallon, 1984). Existen dos "compartimentos"ectodérmicos en la región en que se formarán lasextremidades, uno dorsal y otro ventral; ambos

A)

B)

Figura 5.- a) Estructura general de laextremidades. Se muestran los tres ejes quepresenta, las principales regiones que regulan elcrecimiento, la diferenciación y la formación depatrones de las extremidades, y los elementosesqueléticos que presentan las extremidadesanteriores. b) Principales regiones de muertedescritas por otros autores (citado en Gilbert,1994). Se cambió el nombre de zonas “necróticas”por zonas apoptóticas.

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"compartimentos" contribuyen a la formación de laCEA, con células que migran a partir de ellos paraoriginar la cresta (Altabef et al ., 1997). Laexistencia de los compartimentos dorsal y ventral,sugieren que existe una región límite en la cual seforma la CEA (Laufer et al., 1997b, Rodriguez-Esteban et al., 1997).

Existe una interdependencia entre la CEAy la zona de progresión. Si la CEA es removida, elmesodermo subyacente (o zona de progresión),deja de proliferar y no se determinan loscomponentes distales de las extremidades (Rowe,Cairns y Fallon, 1982). Sin embargo, estainteracción es recíproca, debido a que las célulasde la CEA mueren cuando un mesodermo quenormalmente no da origen a las extremidades, esimplantado debajo de la cresta o la CEA escultivada en ausencia de mesodermo deextremidades (Searls y Zwilling, 1964; Zwilling,1964).

La muerte celular en el desarrollo de lasextremidades

La muerte celular juega un papelfundamental durante la morfogénesis deestructuras embrionarias (Saunders, 1966). Enparticular el desarrollo de las extremidades entetrápodos, es un modelo clásico para el estudiode la muerte. Este proceso se ha observado en lasextremidades en las siguientes regiones: las zonas"necróticas" anterior y posterior, la zona "necrotica"interna y las zonas "necróticas" interdigitales(Gilbert, 1994) (Fig. 5b). El término de zonasnecróticas se respetó solo por motivos históricos,ya que recientemente varios grupos han verificadoque la muerte que ocurre en estas regiones es porapoptosis y no por necrosis (Zakeri et al., 1994;Mori et al., 1995).

A pesar de que se conocen a detalle lasregiones en que ocurre la muerte celular en lasextremidades, se sabe poco de los mecanismosque controlan a este proceso durante el desarrolloembrionario. Se ha observado en lasextremidades, que la CEA de la región de losinterdígitos degenera, precisamente cuandocomienza la muerte celular en los interdígitos, sinembargo, permanece durante más tiempo en laregión de los dígitos durante la formación de loselementos más distales de los dedos (Mendelsohnet al., 1992).

A continuación se detal la lascaracterísticas que presentan las extremidadesque lo hacen un modelo adecuado para el estudiode los mecanismos que controlan el proceso de lamuerte celular.

El desarrollo embrionario de las extremidades deratón como modelo de estudio

La morfogénesis de las extremidades delratón, es un modelo que presenta característicasideales para el estudio de los mecanismos quecontrolan procesos celulares como la muerte. Enprimer lugar, se puede acceder a ellas con gran

facilidad, lo cual permite su manipulaciónexperimental (Zwilling, 1972). En segundo lugar,presentan una regionalización conspicua, ademásde que se conoce en gran parte los patrones deexpresión de diferentes genes, tanto en el espaciocomo en el tiempo, por lo que los procesoscelulares pueden correlacionarse con la expresiónde genes específicos (Tabin, 1991). En tercerlugar, se pueden obtener una buena cantidad detejidos, ya que son cuatro por cada embrión.Finalmente tienen un desarrollo in vitrocomparable al desarrollo in vivo (Salas-Vidal etal., 1998; la presente tesis). Debido a lo anteriorse ha seleccionado a este órgano como modelobásico en el presente trabajo, para estudiar elpapel de las especies de oxígeno reactivas y elácido retinoico en el desarrollo embrionario de lasextremidades del ratón.

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2. HIPOTESIS

HIPOTESIS GENERAL DEL PROYECTO

La gran cantidad de evidencia a favor deque las EOR participan en la regulación de lamuerte celular (mencionada en la introducción), yen particular el trabajo iniciado en el laboratoriodel Dr. Luis Covarrubias por la Dra. SusanaCastro, en donde se encontró que el programa demuerte en células troncales in vitro, es inducidopor el ácido retinoico, y la activación es mediadapor un incremento en EOR (Castro-Obregón yCovarrubias, 1996). En el presente proyecto sepropone que las especies de oxígeno reactivasparticipan en el proceso de activación de laapoptosis que ocurre en las regiones interdigitalesde las extremidades del ratón durante sudesarrollo embrionario. Proponemos además, queel ácido retinoico inicia el proceso de muertecelular y posiblemente las EOR funcionan comosegundo mensajero para transducir su señal paradisparar el proceso de apoptosis (Fig. 6).

RETINOL

RETINAL

ACIDORETINOICO

EOR APOPTOSIS

Figura 6.- Esquema general de la hipótesis delproyecto. Las flechas no se presentan con un trazosólido debido a que se desconoce si las víasseñaladas ocurren in vivo durante la regresión ymuerte en el tejido interdigital.

3. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

El objetivo del proyecto es, determinar siel incremento en EOR participa en el control de laMCP que ocurre en las regiones interdigitalesdurante el desarrollo embrionario de lasextremidades del ratón. Por otro lado, esimportante determinar si los retinoides participanen el control de la muerte interdigital, y su señales mediada por las EOR.

OBJETIVOS PARTICULARES

Con base en el objetivo general se plantea cumplirlos siguientes objetivos particulares:

a) Hacer en un estudio morfológicodetallado del patrón de desarrollo que presentanlas extremidades del ratón CD1.

b) Determinar el patrón del desarrollo delesqueleto de las extremidades del ratón.

c) Determinar los patrones de muertecelular programada durante el desarrollo de lasextremidades del ratón, en imágenesbidimensionales y tridimensionales.

d) Determinar las regiones en estrésoxidativo in situ, durante el desarrollo de lasextremidades del ratón.

e) Estudiar el efecto de diferentes agentesantioxidantes en la apoptosis y en el desarrollo delas extremidades del ratón.

f) Estudiar si existe una correlación entrela apoptosis y el estrés oxidativo durante eldesarrollo embrionario del ratón CD1, en otrasregiones en donde ocurre MCP aparte de lasextremidades.

g) Estudiar el efecto del ácido retinoico ysu precursor el retinol en la apoptosis en eldesarrollo de extremidades del ratón.

h) Determinar el efecto de diferentesinhibidores de la biosíntesis del ácido retinoico,sobre la muerte y el desarrollo de lasextremidades in vitro.

i) Determinar si los retinoides alteran lospatrones de estrés oxidativo durante el desarrollode extremidades del ratón.

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4. MATERIALES Y METODOSANIMALES

Ratones de la cepa CD1 fueron utilizadosen el presente trabajo. Los ratones se mantuvieronen un cuarto con fotoperíodo controlado de 10hrde luz y 14hr de obscuridad, recibiendo agua ycomida ad libitum.

Para las cruzas, se puso un ratón hembracon un ratón macho por caja toda la noche. A lamañana siguiente se revisaron a las hembras y lasque presentaron un tapón de coito, fueronseparadas en cajas etiquetadas para tener controlde la fecha de cruza. El día en que se encontró eltapón de cruza fue tomado como día 0.5 postcoito(dpc).

DISECCION DE EXTREMIDADES DE EMBRIONESDE RATON

Las ratonas preñadas fueron sacrificadaspor dislocación cervical a los dpc requeridos. Losúteros de las hembras fueron disecados, y losembriones junto con sus membranasextraembrionarias, fueron puestos en medio L15(Microlab, México) o bien en solución de fosfatossalina (PBS: 0.02% KH2PO4, 0.115% NA2HPO4,0.8% NaCl, 0.02% KCl, pH 7.4). Las extremidadesfueron removidas de los embriones bajo unmicroscopio estereoscopico (Nikon, Japón) yclasificadas con base en su morfología de acuerdoa la tabla de desarrollo de Wanek et al. (1989).

CULTIVO IN VITRO DE EXTREMIDADES DEEMBRION DE RATON

El protocolo de cultivo in vitro deextremidades de ratón, fue tomado y modificadodel protocolo originalmente descrito por Taketo yKoide (1981) para el cultivo organotípico degónadas.

Las extremidades embrionar iasseleccionadas fueron cultivadas in vitro (Fig. 7)sobre filtros Durapore (Millipore) con un diámetrode poro de 0.45 µm, flotando sobre medio McCoy5a modificado (Microlab) sin suero, ysuplementado con GPS (2 mM de glutamina, 200UI/ml de penicilina G de sodio y 200 mg/ml deestreptomicina) (GIBCO, U.S.A.). Dependiendo delprocedimiento experimental, a este medio se leagregaron los reactivos correspondientes adiferentes concentraciones que serán aclaradas enel texto: Fenol saturado en agua (BoehringerMannheim, Alemania), dimetil sulfóxido gradocultivo (DMSO, Sigma, U.S.A.), 2',7'-diclorodihidroflourescein diacetato (DCDHF-DA;Molecular Probes, U.S.A.), citral, nerol, 4-metilpirazol, etanol, paraformaldehído, ácidoretinoico, o retinol (Sigma, USA). Los reactivoscorrespondientes fueron agregados previo a loscultivos, los cuales fueron mantenidos pordiferentes intervalos de tiempo, 6, 12, 18, 24, 48,72 y 96 hr, en incubadoras con humedadsaturada, con CO2 al 5% y aire al 95%, a unatemperatura de 37oC.

Figura 7.- Sistema de cultivo in vitro deextremidades de embrión de ratón.

ANALISIS DE LA MUERTE CELULARPROGRAMADA

Se utilizaron diferentes técnicas paradeterminar la muerte celular en tejidos reciéndisecados, o en tejidos cultivados in vitro con losdiferentes tratamientos señalados.

Tinciones vitales.Se utilizó la tinción con el fluorógeno

anaranjado de acridina (AA, Sigma) para detectarlas células en proceso de muerte por la técnicadescrita previamente por Abrahams et al. (1993).Las extremidades a analizar fueron lavadas enPBS y posteriormente teñidas en una solución deAA a una concentración de 5 µg/ml en PBS,durante 30 minutos a 37oC, y observados enmicroscopía de fluorescencia convencional, conun filtro para rodamina, para detectar regiones demuerte. Para estudios más detallados y generarlas figuras presentadas en este trabajo, lasmuestras fueron analizadas por microscopíaconfocal (ver más abajo). De manera alternativa lostejidos fueron teñidos con otro fluorógeno, elyoduro de propidio (YP) en una solución a 2.5mg/ml en PBS durante 30 minutos a 37oC(Nicoletti et al., 1991). Esta ultima tinción fue degran ayuda debido a que se pudo realizar unadoble tinción junto con el fluorógeno redox

Fluorógeno Abs. max. Em. max.Anaranjado de acridina 490nm 520nmYoduro de propidio 536nm 617nmDCDHF-DA 503nm 525nmRodamina 123 505nm 534nmFluoresceína 492nm 516nm

Tabla 1.- Longitudes de onda de absorción yemisión, de los diferentes fluorógenos utilizadosen el proyecto. Abs. max., longitud de onda deabsorción máxima. Em. max., longitud de onda deemisión máxima.

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sensible que será descrito más adelante, paravisualizar en una misma preparación a las célulasque están muriendo y las que se encontraban enestrés oxidativo. En la tabla 1 se muestran laslongitudes de onda de absorción y de emisión delos diferentes fluorógenos.

TUNEL.Como se describió en la introducción, en

las células que están muriendo el ADN nuclear sefragmenta, la cual puede ser visualizada por latécnica de TUNEL (Gavrieli et al., 1992).

Extremidades de ratón control o tratadas,fueron previamente procesadas para su inclusiónen parafina (Técnica que se describe a detalle másabajo). Se obtuvieron cortes de histológicos de 10µm. y la técnica fue realizada con un módulo deTUNEL de Boehringer Mannheim, en la cualfundamentalmente lo que se hizo fue adicionardUTP fluoresceinado, en los extremos del ADNfragmentado, utilizando terminal transferasa (Fig.3). Los controles de la reacción se realizan con laenzima o la dUTP fluoresceinada sola.Análisis histológico.

Sobre tejidos procesados para histologíade parafina o microscopía de alta resolución(incluidas en EPON) se realizó un análisis paradetectar las células en proceso de muerte, alutilizar los criterios morfológicos descritos en laintroducción. Las técnicas de tinción utilizadasson descritas en los apartados correspondientes.

HISTOLOGIA, INCLUSION EN PARAFINALos tej idos fueron f i jados en

paraformaldehído al 4% en PBS durante 1 hr a4oC. Se lavaron en agua corriente 30 min y fuerondeshidratados en alcoholes graduales (50, 70, 80,90 y 100%) 30 min cada uno. Posteriormente lostejidos se pasaron por las soluciones siguientes:alcohol:xilol (1:1) durante 1 hr, xilol puro 1 hr,xilol:parafina (1:1) 1 hr a 60oC (los siguientespasos son a esta temperatura), xilol:parafina (1:2)1 hr, parafina pura toda la noche. Posteriormentefueron incluidos en parafina y se obtuvieroncortes seriados en un microtomo Reichert (atemperatura ambiente), y se montaron sobreportaobjetos tratados con poli-L-lisina. Laslaminillas con cortes fueron desparafinadas a60oC, con dos cambios de xilol de 10 min cadauno. Fueron rehidratados con alcoholesdecrecientes (100, 90, 80, 70, 50%) 10 min cadauno, y el tratamiento posterior dependió de latécnica de análisis que se utilizó, TUNEL o tinciónhematoxilina eosina.

TRATAMIENTO DE PORTAOBJETOS CON POLI L-LISINA

1. Se disolvieron 25 mg de hidrobromurode poli-L-lisina (PM 350,000, Sigma, P-1524) en5 ml de agua tratada con DEPC. Se hicieronalícuotas de 1 ml de solución y se guardaron a

-20oC.2. Al utilizar cada alicuota, se descongeló

y se diluyó en 50 ml de agua tratada con DEPC,para obtener una solución al 0.1%.

3. Se sumergieron los portaobjetospreviamente horneados de 4 a 12 hr a 180oC, enla solución. Se dejaron secar las laminillas enposición vertical. Posteriormente las laminillastratadas se almacenaron a 4oC o a -20oC, hastaque fueron utilizadas.

MICROSCOPIA ELECTRONICALos tejidos fueron fijados en solución de

Karnovsky (1965), postfijados en una solución detetróxido de osmio al 1% en buffer Zetterqvist(1956) y posteriormente incluidos en EPON 812.Se obtuvieron cortes semifinos en unultramicrotomo III 8800LKB, fueron teñidos enazul de toluidina al 0.5%, se lavaron en aguadestilada y se destiñó el exceso en etanolabsoluto, para después ser montados enportaobjetos y analizados por microscopía de luzconvencional. Los cortes finos fueron montados enrejillas de cobre, contrastados 5 minutos conacetato de uranilo al 2.5% en agua destilada y 1minuto con citrato de plomo alcalino. Las rejillasse observaron en un microscopio electrónico(EM900, Zeiss, Alemania) y el análisis de losresultados se realizó sobre las micrografíaselectrónicas tomadas.

DETECCION DE EOR IN SITUPara la detección de especies de oxígeno

reactivas (EOR) in situ, las extremidades deembriones de ratón, o bien, embriones completosde diferentes dpc, fueron incubados con doscolorantes redox sensibles diferentes, inmersosen la solución de tinción o bien flotando sobre unfiltro de policarbonatos (Costar, U.S.A.), encondiciones de cultivo de tejidos. Se utilizó la saltetrazolica MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma] a unaconcentración de 50 µg/ml en medio de cultivoMcCoy 5a modificado durante 2 a 8hr deincubación. El MTT ha sido utilizado para ladetección de superóxido (Burdon et al., 1993), yaque genera un precipitado de color púrpura,denominado formazán. La reacción de una saltetrazólica con el superóxido para dar elprecipitado formazán se presenta en la figura 8.

Se utilizó por otro lado, la tinción con otrocolorante redox sensible que da un productofluorogénico detectable por microscopía defluorescencia, y también con microscopio confocal(descrito más abajo), el DCDHF-DA y el 5-(and-6)-carboxy-2 ' ,7 ' - d i chlorod ihyd ro- f luoresce indiacetate bis9 acetoxymethyl) éster (MolecularProbes) (Figura 9). Estos fluorógenos se utilizarona una concentración de 1 µg/ml de PBS durante45 min en condiciones de cultivo de tejidos.

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MICROSCOPIA CONFOCALLas extremidades de ratón en desarrollo,

teñidas con los colorantes fluorogenicos, fueronobservadas con un sistema de microscopíaconfocal por escaneo con rayo láser, marca Bio-Rad, modelo MRC-600, equipado con un láser dekriptón/argón y acoplado a un microscopioAxioscope (Zeiss), con objetivos de tipoPlanNeofluar 5X (apertura 0.15), 10X (apertura0.30 y 20X (apertura 0.5). Los tejidos teñidos conAA o bien con DCDHF-DA fueron excitados con luzazul (488nm). Se utilizó el filtro de altasensibilidad al rojo (RHS) para la detección de laseñal del AA, o un filtro de alta sensibilidad alazul (BHS) para la detección de DCDHF-DAoxidado. La apertura del iris del confocal fuemantenida en 0.3. Se obtuvieron series deimágenes de cortes ópticos a intervalos de 15µm(aumentos 5X y 10X) o de 6µm (aumento 20X) enel eje Z, en los resultados reportados en lapublicación 1, Salas-Vidal et al (1998), y en lapublicación 2. Para el trabajo del efecto del ácidoretinoico en el desarrollo de la s extremidades losintervalos en el eje Z fueron de 30.06 µm.

Para el análisis realizando las doblestinciones simultáneas, con DCDHF-DA y YP, seutilizaron el juego de filtros K1-K2 para observarlas señales del DCDHF-DA en verde y del YP enrojo, haciendo sobreposiciones de las imágenesutilizando el software COMOS que viene incluidocon el sistema de microscopía confocal.

Figura 8.- Reacción de una sal tetrazólica con elsuperóxido, para la generación del precipitadocolor púrpura, el formazan (Tomado y modificadode Halliwell y Gutteridge, 1989).

Figura 9.- Esquema que representa la reacción deuna molécula similar al DCDHF-DA con peróxidode hidrógeno, y mediada por peroxidasa. (Tomadoy modificado de Black y Brandt, 1974).

SOBREPOSICION DE IMAGENESLas imágenes obtenidas en el microscopio

confocal fueron desplegadas en el programa NIHIMAGE 1.6 obtenido en el Web sitehttp://rsb.info.nih.gov/nih-image/, para cambiarlas imágenes, de formato "pic" a formato "tif".Posteriormente, las imágenes fueron desplegadasen el programa Adobe Photoshop 3.02. Se marcóel contorno de una imagen con una linea negracontinua, y sobre esta imagen se sobrepuso otrade interés; se redujo la opacidad al 50% para quese viera la imagen subyacente, y se alinearonmoviendo la imagen lateral, y verticalmente,además de rotar la imagen superior hasta queconcordaron la base de la mano (equivalente a lamuñeca). Finalmente se marcó con linea punteadael contorno de la imagen sobrepuesta.

Para facilitar el análisis de varias etapasdel desarrollo, se utilizaron diferentes colorespara marcar los contornos, y se utilizó ladiferenciación de los elementos esqueléticos comoun criterio adicional para realizar la alineación delas imágenes.

RECONSTRUCCIONES TRIDIMENSIONALES DEIMAGENES

Las series de imágenes obtenidas en elmicroscopio confocal fueron desplegadas en unacomputadora Silicon Graphics modelo HighImpact, utilizando un software de prueba delpaquete VoxelView, proporcionado por lacompañía Vital Images. Las series de imágenesfueron utilizadas para realizar reconstruccionestridimensionales en despliegues de volumen,además de realizar modelos de contornos enniveles de grises y en colores falsos, resaltandolas regiones de muerte en color rojo.Adicionalmente se hicieron animaciones enformato QuickTime en las que se rotaban lasimágenes reconstruidas para tener una mejorrepresentación tr idimensional de lasreconstrucciones. Se adjuntan pocos ejemplos deestas animaciones y simulaciones en los diskettesadjuntos.

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HISTOQUIMICA PARA LA DETECCION DECARTILAGO

Se utilizó una aglutinina de cacahuatepara la detección de formación de precartílago porla técnica previamente descrita por Hurle et al.(1989). Brevemente, los tejidos fueron fijados enuna solución de ácido acético:etanol (1:1) durante1 hr a 4oC. Posteriormente, fueron deshidratadose incluidos en parafina por la técnica previamentedescrita. Los cortes de tejido de 16µm de grosor,obtenidos en microtomo, fueron desparafinados yposteriormente se incubaron en una solución deaglutinina de cacahuate acoplada a isotiocianatode fluoresceina, a una concentración de 20 µg/mlen solución amortiguadora de HEPES, pH 7.5,NaCl 0.15 M. Posteriormente las laminillas fueronlavadas en PBS y montadas en glicerol al 50% enPBS. Las muestras fueron analizadas almicroscopio confocal por la técnica descrita.

También se utilizó una técnica paraanalizar la formación de cartílago en "whole mount"por la técnica previamente descrita por Wallin etal. (1994). Las extremidades de ratón fueronfijadas en etanol absoluto durante 24 hr.Posteriormente fueron tratadas en acetona por 24hr con agitación constante. Una vez que lasmuestras fueron fijadas y permeabilizadas, fueronteñidas en una solución de: 1 volumen de azulalciano (Sigma) al 0.3% (p/v) en etanol al 70%, 1volumen de rojo alizarín S (Sigma) al 0.1% enetanol al 96%, 1 volumen de ácido acético glacialy 17 volúmenes de etanol al 70%. Se incubó enesta solución a 37oC durante 4 hr con agitaciónconstante y posteriormente a temperaturaambiente durante una noche, también conagitación constante. Debe tenerse precaución deque la agitación sea suave para evitar que sedestruya o maltrate el tejido que se está tiñendo.Finalmente las muestras fueron lavadas en aguadestilada y aclaradas en una solución dehidróxido de potasio al 1% en glicerol al 20% enagua, durante 24 hr a temperatura ambiente. Si sedesea almacenar los tejidos por largo tiempo sepueden deshidratar en gliceroles crecientes al50%, 80% y 100%.

INMUNOHISTOQUIMICA CON EL ANTICUERPOF4/80, PARA LA DETECCION DE MACROFAGOS

Tejidos teñidos con el colorante redoxsensible MTT, por la técnica anteriormentedescrita, fueron congelados inmediatamentedespués de terminar la tinción, en medio deinclusión CRYO-M-BED (Bright, England) en hieloseco. Posteriormente los bloques fueron cortadosen un crióstato a -20oC y las secciones montadasen portaobjetos tratados con poli-L-lisina. Loscortes se dejaron secar 30 min. a temperaturaambiente (t.a.) y si no eran utilizados el mismodía, se guardaron a -20oC. Las laminillas sedejaron a t.a. y se rehidrataron con PBS. Sefijaron los cortes durante un minuto con

paraformaldehído al 4% en PBS (preparar fresco)y se lavaron 3X con PBS. Se incubaronposteriormente 30 min. con peróxido de hidrógenoal 0.25% en PBS a t.a. y se lavaron 3X con PBS.Se bloquearon con albúmina de suero bovino(BSA) al 1% en PBS o con leche 5% en PBS unahora a t.a. Se incubaron 2 hr a t.a. con elanticuerpo primario rata-anti antígeno de ratónF4/80 (MCAP497, Serotec, England), diluido1/100 en PBS. Antes de poner el anticuerpo secentrifugó a 14,000 r.p.m. en una centrífugaeppendorf. Se puso como control cortes sinanticuerpo primario. Se lavaron 3x 10 min conPBS. Se incubaron con anticuerpo secundariodiluido 1/100 en solución de bloqueo duranteuna hora. Nuevamente se lavaron 3X durante 10min. c/u. Se reveló durante 2 hr. en una soluciónde diaminobenzidina 6mg, en 10 ml deamortiguador Tris 0.05 M (pH 7.6) con peróxidode hidrógeno al 3%. Se detuvo la reacción en PBSy se montaron las laminillas en glicerol al 50% enPBS y se revisaron al microscopio de luz.

USO DE CELULAS LC3, PARA EL ESTUDIO DE LABIOSINTESIS IN VIVO DE ACIDO RETINOICO ENEXTREMIDADES EMBRIONARIAS DE RATON

Las células LC3 congeladas que contienenal gene reportero lacZ bajo un promotor induciblepor ácido retinoico, (amablemente proporcionadaspor el Dr. LaMantia), congeladas y contenidas enun vial de criopreservación, fueron puestas en unvaso de precipitado de 50ml, con aguapreviamente calentada a una temperatura entre 39y 40oC. La alícuota descongelada, fue diluida en9ml de medio de cultivo completo [D-MEM(GIBCO, USA) con suero bovino fetal (SBF) al10%, l-glutamina y penicilina estreptomicina].

Fueron posteriormente centrifugadas 5min a 4,000 r.p.m. en una centrífuga clínica. Elpelet se resuspendio en 5ml de medio de cultivocompleto. Se verificó la viabilidad con azul tripany se calculó la densidad para hacer el cultivocorrespondiente. Las células LC3 fueron crecidas en mediode cultivo completo con selección del genereportero, con G418 a una concentración final de40 mg/ml, se subcultivaron al llegar a confluenciapor los métodos convencionales.

Las células fueron sembradas en altadensidad durante 24h en el medio de cultivodescrito, solo que el SBF fue tratado previamentecon carbón activado por 30 min en un baño Maríaa 45oC.

Explantes de extremidades embrionariasfueron puestas sobre la monocapa de células LC3,e incubadas por 20 a 24 hr, en el tratamientocorrespondiente: medio control, medio con citral,medio con nerol, medio con retinol, medio concitral-retinol, medio con nerol-retinol.

Las cajas con células fueron fijadas conparaformaldehído al 2%, glutaraldehído al 0.1%en PBS, 30 min sobre hielo. Posteriormente

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fueron lavadas con PBS 3X.Los tejidos fueron incubados en una

solución que se prepara así: 10 ml de PBS, 20 µlde MgCl2 200 mM, 200 µl KFerroCN 200 mM,200 µl KFerriCN 200 mM y 40 µl de X-gal 100mg/ml. La reacción se detuvo lavando lasmuestras 3X con PBS y se postfijaron con lasolución fijadora. Las muestras se mantuvieron enetanol al 70% en agua y fueron fotografiadas.

5. RESULTADOS

EL DESARROLLO DE LAS EXTREMIDADES ENRATON

Desarrollo in vivo e in vitro de las extremidadesdel ratón CD1.

El presente trabajo se inic iócaracterizando el desarrollo de las extremidadesde ratones de la cepa CD1. Encontramos que lamayor parte de la regresión de los interdígitosocurre a los 13 días post coito (dpc) y, a los 14dpc, los dígitos están completamenteindividualizados. Observamos que el utilizarextremidades basándose solo en la edad en dpc,puede dificultar la interpretación de losresultados, como fue señalado previamente porWanek y col. (1989), debido a que: 1) Losembriones de una misma camada generalmente seencuentran con diferentes grados de desarrolloembrionario; 2) Diferentes líneas de ratonestienen tiempos de gestación ligeramente diferentesy característicos de cada línea; 3) Lasextremidades anteriores y posteriores de unmismo embrión se encuentran con diferentesgrados de desarrollo. Por lo anterior se decidióutilizar una tabla del desarrollo de lasextremidades, lo más completa posible perofuncional, para así poder clasificar a lasextremidades en desarrollo, y utilizarlas en lasdiferentes manipulaciones experimentales. Seutilizó la tabla publicada por Wanek y col. (1989),debido a que se basa exclusivamente en lamorfología de las extremidades vivas, sin tenerningún tratamiento previo. En este esquema declasificación, las etapas propuestas son fácilmentedistinguibles, no omiten eventos importantes en eldesarrollo, y no es excesivamente detallista; latabla incluye a todo el desarrollo de lasextremidades, desde el inicio a los 9 dpc, hastalos 5 días postnatales. En el presente trabajo solose utilizaron las etapas en las cuales se llevaacabo los eventos morfogenéticos mas notables delas extremidades, esto quiere decir loscomprendidos entre los estadios (S) S1 al S12.Otros esquemas descritos por diferentes autores(McLaren y Buehr, 1990; Martin, 1990), fuerondescartados debido a que presentaban carenciasen alguna de las características utilizadas para laclasificación.

Debido a que en los estadios S9 y S10temprano, comienza la muerte interdigital, seutilizaron extremidades en estas etapas para lasmanipulaciones experimentales. Adicionalmentesolo se utilizaron extremidades anteriores debidoa que el desarrollo de las extremidadesposter iores va atrasado l igeramente,aproximadamente por una etapa (Fig. 10), y porque además, difieren ligeramente en su desarrollo,lo que podría incrementar la variabilidad en losresultados.

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Figura 10.- Distribución de la muerte celular en eldesarrollo de las extremidades. 7 al 12+, estadiosdel desarrollo según Wanek et al (1989). ED,extremidad delantera. ET, extremidad trasera. D,vista dorsal. V, vista ventral. A, anterior. P,posterior. Filas horizontales son de un mismoembrión.

En el presente proyecto se adaptó unsistema de cultivo organotípico previamentedescrito por Taketo y Koide (1981), con ligerasmodificaciones, para realizar las manipulacionesexperimentales. La razón principal por la que sedecidió realizar los experimentos in vitro , es porque en éstas condiciones se pueden controlar demanera muy estricta, tanto el desarrollo de lasextremidades que se utilizan (que sean de lamisma etapa), como las concentraciones de losfármacos que se aplican.

En las extremidades incubadas in vitro, seencontró que el desarrollo es más lento (Fig. 1,publicación 1) pero muy similar al desarrollonormal que sucede in vivo (comparar la Fig. 1, dela publicación 1, con la Fig. 10). Es importantehacer notar, que in vitro la regresión delinterdígito ocurre normalmente, pero la elongaciónde los dígitos es limitada (Fig. 1, publicación 1), adiferencia de lo que ocurre in vivo, en donde tantola regresión como la elongación de los dígitos,participan en la separación de los dedos (Fig. 11y 14).

Figura 11.- Análisis de imágenes de la regresióninterdigital y crecimiento de los dígitos enextremidades de ratón. Imágenes del estadioseñalado (izquierda) fueron sobrepuestas por latécnica descrita (Salas-Vidal et al., 1998), enimágenes de edad más avanzada (arriba), y laopacidad de la imagen sobrepuesta fue reducidaal 50% para poder observar la imagen subyacente.

Figura 12.- Desarrollo in vivo del esqueleto enextremidades de ratón. Extremidades teñidas conazul alciano.

Desarrollo del esqueleto de las extremidades delratón in vivo e in vitro .

Se realizó adicionalmente un estudio deldesarrollo de los elementos esqueléticos, y sucorrelación con la regresión del interdígito (Fig.12 y 13). Se utilizó el colorante azul alciano elcual es afín a proteoglicanos altamente sulfatados,los cuales son abundantes en el cartílago(Leonard, et al., 1989). Se verificó la identidad delcartílago, al realizar algunos controles de tinción

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Figura 13.-Sobreimposiciones del desarrollo delos elementos esqueléticos (Fig. 12) (azul) sobreextremidades teñidas con anaranjado de acridina(rojo). M, metacarpales. P, falanges 1 a la 3.

Figura 14.- Patrones de crecimiento y regresióninterdigital durante el desarrollo de lasextremidades del estadio 8 al 12+, cada estadiopresentado en colores diferentes. Originales, sincorrección tomando en cuenta el desarrollo delesqueleto. Corregidos, se tomo en cuenta para laalineación de las imágenes los contornos de loselementos esqueléticos. Solo se muestrancontornos de los estadios estudiados.

en condiciones ácidas (pH. 2.5), lo cual hace quela tinción con azul alciano sea específica paragrupos sulfatos característicos del cartílago (Lev ySpicer, 1964). Utilizando estas tinciones comoreferencia de la ubicación de la regresión ymuerte con respecto a la formación del esqueleto(Fig. 13), se encontró que la separación de losdedos ocurre por dos procesos, a) muerte celularque provoca la regresión del interdígito, quecontribuye a la separación de las zonas más

Figura 15.- Desarrollo in vitro de los elementosesqueléticos en extremidades teñidas con azulalciano. a) extremidad al inicio de la incubación.b) extremidad a las 12 hr de incubación. Di,distal. Pr, proximal. A, anterior. P, posterior.

proximales, son a nivel medio de la falange 2; b)por crecimiento en el eje proximo-distal, queparticipa en la separación de los dígitos en locorrespondiente al nivel medio de la falange 2 ytoda la falange 3 (Fig. 13 y 14).

In vitro se observó que a pesar de que lasextremidades incubadas son de menor longitud enel eje proximo-distal que las extremidades in vivo,todos los elementos esqueléticos se formancorrectamente (Fig. 15); incluso en cultivos largosde 96 h, las extremidades que inicialmente seencontraban en S9 o S10 de su desarrollo, llegana presentar un desarrollo del esqueleto y unadiferenciación de las falanges, equivalente a laobservada para una extremidad en estadio S13 invivo (datos no mostrados). Lo anterior indica queel sistema de cultivo in vitro que utilizamos, esadecuado para los propósitos del presenteproyecto. Adicionalmente los patrones dedesarrollo normales, sirvieron como referenciaspara caracterizar el efecto que tienen losdiferentes fármacos utilizados, sobre lamorfogénesis del cartílago de las extremidadesincubadas in vitro.

Patrones de muerte celular durante el desarrollode las extremidades del ratón. Se ha descrito previamente que con elfluorógeno anaranjado de acridina (AA), se puedendetectar específicamente a las células en procesode apoptosis en embriones completos deDrosophila (Abrams et al ., 1993). Se utilizó estatécnica de tinción, para detectar las principalesregiones en donde ocurre la muerte celulardurante el desarrollo de las extremidades delratón (Fig. 10, Fig. 3 y 4 publicación 2), y severificó que las zonas teñidas con el AA realmente

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estaban en proceso de muerte, utilizando criterioshistológicos y de fragmentacion del ADN (Fig. 2 y3, publicación 1).

El análisis de los resultados obtenidos apartir de los diferentes modelos analizadosmostraron lo siguiente:

1) Los patrones de muerte celular cambiandurante el desarrollo, y parecen seguir gradientesorientados con respecto a los ejes principales delcuerpo: antero-posterior, dorso-ventral y disto-proximal (Fig. 10 y 16). El patrón de algunosgradientes semejan las llamadas "olas" descritasprev iamente por Saunders (1966 ) .Particularmente notoria durante la regresión delos interdígitos entre los 13-14 dpc, comenzandoen la región más distal del mesénquima,extendiéndose conforme avanza el desarrollo azonas más proximales (Fig. 10, 13 y 14) .

Figura 16.- Patrones de muerte en extremidadesde ratón de 10 (S3), 13 (S9, S10 y S11) y 14(S12) dpc. I, izquierda. D, derecha. ED,extremidad delantera. ET, extremidad trasera. DO,vista dorsal. VE, vista ventral.

Figura 17.- Cortes ópticos sagitales, generados apartir de las reconstrucciones tridimensionalespresentadas en la figura 4, publicación 2.Sorprendentemente se observa que lasinterdigitaciones son más marcadas en el ladodorsal que en el lado ventral, a pesar de que lamuerte es más abundante en el lado ventral, verfig. 10.

2) Nuevas regiones de muerteaparentemente no descritas anteriormente fuerondetectadas, dos bandas ventrales y proximales enforma en delta en extremidades de embriones de10 dpc (Fig. 16). Regiones anteriores y posterioresde la base de las extremidades que persisten a lolargo del desarrollo de las extremidades hasta los13-14 dpc (datos no mostrados).

3) En etapas tempranas del desarrollo delas extremidades (10 dpc) la primera región demuerte aparece en la región anterior más proximalde la base de la extremidad y más adelante en eldesarrollo en la región posterior más proximal dela base de la extremidad (datos no mostrados).Son interesantes estos resultados puesto quedurante el desarrollo de otros órganos, como elrombencéfalo, la muerte ocurre primero enregiones más anteriores (el rombómero 3) y másadelante en el desarrollo en regiones posteriores(rombómero 5) (Graham, et al ., 1993). Este patrónantero-posterior de muerte ocurre tambiéndurante el desarrollo tardío de los somitas y lasarrugas del paladar (Salas-Vidal, Cuervo yCovarrubias resultados sin publicar).

4) No se encontraron diferencias notablesen el desarrollo y patrón de muerte al compararlas extremidades del lado izquierdo con el derecho(Fig. 16).

5) La separación de los dígitos, no solo esdebida a la muerte que ocurre en el tejidointerdigital entre los 13 y 14 dpc. Buenporcentaje de esta separación ocurre tambiéndebido a que los dígitos se elongan en el ejeproximo-distal a diferencia del interdígito que dejade crecer desde el S9 previo al inicio de la muerte

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masiva en el interdígito (Fig. 14).6) Con respecto a la muerte que ocurre en

el eje dorso-ventral, es interesante el hecho deque ocurre en mayor proporción en el lado ventralcomparado con el lado dorsal (Fig. 10), sinembargo el lado dorsal se encuentra separado porinterdigitaciones más pronunciadas que el ladoventral (Fig. 17), lo cual sugiere que la separaciónpronunciada en el lado dorsal se debeprimordialmente a un crecimiento mayor de losdedos en el lado dorsal, más que a la muerte queocurre en el tejido interdigital.

7) Las regiones de muerte observadas conlas tinciones con el anaranjado de acridina,muestran patrones similares a los reportadospreviamente por otros autores, que utilizaron otroscriterios en los estadios correspondientes(Saunders 1966; van der Hoeven et al ., 1994;Fernández-Terán y Hurle, 1984; Martin, 1990;Zakeri et al ., 1993; Mori et al ., 1995), sinembargo, el presente estudio incluye etapas nocaracterizadas previamente en el ratón.

8) Los patrones de muerte incluyen a lasregiones marginales de la palma anteriores yposteriores previamente señaladas por otrosautores (Mori et al., 1995).

9) Es interesante el que se observó quetodo el margen distal de las extremidades en S8,presentó muerte, la cual se vuelve más abundanteen estadios posteriores en la zona interdigital, sindejar de presentarse en el margen distal de losdígitos. Adicionalmente la tinción con AA sevuelve muy abundante en la punta de los dígitosen S12 y desaparece para S12+ (Fig. 18). Estosdetalles serán discutidos al final de la tesiscuando se presente un modelo general del controlde la muerte celular en el desarrollo de lasextremidades.

EL ESTRES OXIDATIVO Y LA MUERTE CELULAR

Estudio del efecto de agentes antioxidantes en laapoptosis en el desarrollo de extremidades delratón.

Los resultados arriba presentadosmostraron que el desarrollo de las extremidades,es un modelo adecuado para el estudio de lamuerte celular. Además, debido a que se puedenmanipular in vitro , potencialmente nos permiteestudiar si el estrés oxidativo participa en elcontrol de la muerte.

Se ha reportado que agentes antioxidantesson capaces de proteger de la muerte celular endiferentes sistemas de cultivo (ver introducción),lo cual se ha interpretado como una evidenciaindirecta de que el estrés oxidativo inicia alproceso de muerte (McConkey y Orrenius, 1994;Buttke y Sanstrom, 1994). Debido a lo anterior, serealizaron cultivos organtípicos en presencia dediferentes agentes antioxidantes como: fenol,DMSO y DCDHF-DA. Se utilizaron extremidadesen las etapas en que el tejido interdigital aúnestaba presente, pero la muerte comenzaba a serprominente, esto quiere decir en extremidades deetapa S9 y S10 temprano.

Se encontró que en las extremidadestratadas con diferentes agentes antioxidantes(fenol, DMSO y DCDHF-DA), se protegieron lasregiones interdigitales de muerte, y de maneraadicional este tejido no llevo a cabo regresióninterdigital comparado con los controles (Fig. 1,artículo 1). Utilizando técnicas alternativas alanaranjado de acridina, como el TUNEL ymicroscopía de alta resolución (Fig. 2 y 3, artículo1), verificamos que se evitó la apoptosis, ya queexistía la posibilidad de que los agentesantioxidantes evitaran la tinción con AA y que porartificios en la metodología, no fuera posibledetectar la muerte interdigital. Otra posibilidadera que los agentes antioxidantes hubieranprovocado necrosis, y como la tinción con AA noes capaz de detectar células en necrosis, debido aque pierden la integridad de sus membranas(Abrahams et al , 1993, Fig. 1 esta tesis), eraposible que el patrón de tinción se viera alterado;solo con el análisis con histología de altaresolución se descartó esta posibilidad (Fig. 3,artículo 1).

Los interdígitos expresan marcadores decondrogénesis.

A las 12 hr de cultivo en presencia deantioxidantes (Fenol y DMSO), el desarrollo delesqueleto no presentó alteraciones notorias (Fig.19 c y d). Sin embargo, en cultivos másprolongados de 96 hr, todos los elementosesqueléticos se formaron excepto las falanges másdistales (resultados no mostrados). La ausensia dela tercera falange, se debe posiblemente a lamuerte que se observó en las regiones másdistales de los dígitos descrito anteriormente.

Figura 18.- Margen distal-ventral de extremidades deembriones de ratónteñidas con anaranjado deacridina. Las flechas indican las regiones demuerte en la punta de los dígitos en el estadio 12.

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Figura 19.- Extremidades incubadas con agentesantioxidantes durante 12hr y teñidas con azulalciano. a, Esqueleto al inicio del cultivo. b,Esqueleto a las 12hr de cultivo en medio control.c, Esqueleto incubado con fenol al 0.075%. d,Esqueleto incubado en presencia de DMSO al 3%.Condrogénesis interdigital, flechas obscuras.

Figura 20.- Condrogénesis interdigital (flechasobscuras) en extremidades incubadas 12hr invitro, detectada con aglutinina de cacahuatefluoresceinada. A, Tejido control. B, Incubadas enmedio con DMSO al 3%.

Es interesante que en cultivos más cortos de 12hren presencia de fenol o de DMSO, se observó latinción de los tejidos interdigitales tanto con elcolorante azul alciano (Fig. 19c y d) como con laaglutinina de cacahuate (Fig. 20). Datos similaresse observaron al hacer las tinciones en órganoscultivados a las 24hr, pero no se observaron entejidos incubados por solo 6 hr (Tabla 2).

A pesar de el tejido interdigital fuepositivo con los dos marcadores decondrogénesis, azul alciano y aglutinina decacahuate, este tejido no presentó otro marcadorde condrogénesis típico de cartílago, la colágenade tipo II, ya que al hacer hibridación in situ , solose observó señal en las falanges y metacarpales(datos no mostrados).

Los resultados anteriores son indicativosdel potencial condrogénico del tejido interdigital,que sobrevivió al ser tratado con los agentesantioxidantes. Como se menciona en el artículo 1,el epitelio no se observó alterado con lostratamientos, por lo que la sobrevivencia y lacondrogénesis observada en el tejido interdigital,no se debió a la ausencia de este tejido, el cual esfundamental para que se lleve a cabo la regresión(Hurle y Gañán, 1986).

Concentración de AA/# extremidades Permanencia Condrogénesis antioxidante (v/v) (***) teñidas interdígito interdigital

Horas de cultivo 6hr 12hr 24hr 6hr 12hr 24hr in vitro.0 (Control) *** 12/12 * 8/8 0/3 0/3 0/3 0/30.075% (Fenol) * 12/12 ** 6/6 3/3 0/3 2/3 2/3 3% (DMSO) ** 11/12 *** 7/8 3/3 0/3 3/3 3/3

Tabla 2. Efecto de los antioxidantes sobre lamuerte interdigital, medida con base en la tincióncon el colorante anaranjado de acridina (AA), ysu relación con la formación ectópica de cartílago,en extremidades de embriones de ratón in vitro. *,abundancia relativa.

Determinación de regiones en estrés oxidativo insitu, durante el desarrollo de las extremidadesdel ratón.

Los resultados obtenidos con lostratamientos con antioxidantes, son evidencia queapunta a favor, de que la muerte celular estáregulada por EOR durante la regresión delinterdígito. Sin embargo, obtuvimos evidenciaadicional de su participación.

Se realizó, un análisis del incremento deespecies de oxígeno reactivas in toto, utilizando lasal de tetrazolica redox-sensible MTT, para teñir aextremidades en diferentes etapas del desarrollo.El MTT es un colorante soluble en agua de coloramarillento, que es reducido intracelularmente aformazán, el cual es un precipitado de colorpúrpura (Freshney, 1994); el formazán se generaprincipalmente al reaccionar con el superóxido(Burdon et al., 1993) (Fig. 8). También utilizamosel colorante DCDHF-DA que es convertido alfluorógeno dichlorofluoresceina (DCF) enpresencia de EOR (Haughland, 1996). Se encontróque las extremidades teñidas con estos colorantespresentaron patrones similares a los que seobservaron con la tinción con el indicador demuerte, el AA (Fig. 5, artículo 1), lo cual es unaevidencia correlativa, de que el estrés oxidativoparticipa en el control de la muerte interdigital.

La apoptosis y el estrés oxidativo en eldesarrollo embrionario del ratón CD1 y en eldesarrollo temprano en pollo.

Por otro lado, nos interesó saber si elestrés oxidativo participa en el control de lamuerte que ocurre en otras regiones embrionarias.Así que se estudiaron los patrones de tinción conlos colorantes redox sensibles en embrionescompletos de ratón, y su coincidencia con elpatrón de muerte celular. Se encontró una altacoincidencia entre los dos procesos a lo largo deldesarrollo del ratón (Fig. 7, artículo 1). Esinteresante que esta evidencia correlativa seencontró en otros sistemas de estudio como laDrosophila (datos no mostrados) y en el desarrollotemprano del pollo.

En el pollo (Fig. 21) es interesante que elcolorante redox sensible Rodamina 123, tiñe toda

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Figura 21.- Embrión de pollo de 11 somitas teñidocon el colorante redox sensible Rodamina 123. A,Tinción con Rodamina 123. B, El mismo embriónde pollo visto por microscopía de transferencia.

la línea media dorsal en donde se lleva a cabo lafusión del tubo neural, fusión que depende demuerte celular (Weil et al., 1997). También seobservó la tinción en los rombómeros 3 y 5, asícomo en buena parte de la línea de fusión a niveldel encéfalo en formación (Fig. 21). Estos últimosexperimentos fueron realizaron en parte, duranteuna estancia en el laboratorio del Dr. Ivor Masonen Guy's Hospital en Londres, Inglaterra.

Identidad de las células en estrés oxidativo.Debido a que los macrófagos tienen la

capacidad de generar grandes cantidades de EROpor el proceso denominado "explosiónrespiratoria" (Morel et al., 1991; Rice-Evans et al.,1991), existe la posibilidad de que las células enestado de estrés oxidativo detectadas con loscolorantes redox sensibles eran macrófagos, y quesean éstas las que respondieran a los tratamientoscon los diferentes antioxidantes. Además, reportesrecientes sugieren que la apoptosis que ocurredurante la remodelación del tejido ocular, en eldesarrollo de ratones, es inducida por macrófagos(Lang y Bishop, 1993; Lang et al ., 1994). Por loanterior decidimos realizar dobles tinciones paraverificar en que tipos celulares se presentó elestrés oxidativo. Utilizamos el anticuerpomonoclonal descrito por Austyn y Gordon (1981),el cual reconoce específicamente a los macrófagosde ratón. Asimismo, este anticuerpo tenía laventaja de que ha permitido identificar a losmacrófagos que son reclutados, durante la muertecelular que ocurre en las células mesenquimáticasdel tejido interdigital, precisamente en el intervalode las etapas del desarrollo de las extremidadesque fueron utilizadas en el presente trabajo, eincluso presentan patrones de distribución de laexpresión del marcador, complementarios a los demuerte celular (Hopkinson-Woolley, et al., 1994).

Se utilizó la tinción con el colorante redoxsensible MTT, debido a que genera un precipitadode color púrpura, el formazán (Fig. 8), el cualpermanece en los tejidos aún después de ser

fijados o congelados (Fig. 6, artículo 1), adiferencia con el DCDHF-DA, el cual solo puedeser visualizado en tejidos vivos. Primeramente sehicieron intentos de incluir en parafinaextremidades teñidas con MTT, sin embargo,durante el proceso de deshidratación de lostejidos, la señal del formazán desaparecía confacilidad, por lo que se decidió realizar lahistología en tejido incluido por congelación, y encortes obtenidos en un criostato. Se verificó queera posible observar el formazán en los cortes porcongelación. Se decidió real izar lainmunohistoquímica en las regiones anterior yposterior de la palma de las extremidades, debidoa que en esas regiones se encontró que la señalera lo suficientemente fuerte, y resistía los lavadosrequeridos durante el proceso de lainmunohistoquímica. Se encontraron diferentespoblaciones de células con la doble detecciónpara macrófagos y estrés oxidativo (Fig. 6, artículo1): a) Células que solo presentaron coloraciónpúrpura, esto quiere decir que fueron MTTpositivas, que claramente eran célulasindividuales. También se observaron regionesextensas de tejido con una tinción intensa, peroen las cuales fue difícil cuantificar el número decélulas. b) Células positivas para el anticuerpoF4/80, es decir que presentaban los antígenos desuperficie específicos de macrófagos. c) Célulasque presentaron claramente ambos marcadores, yfueron F4/80 y MTT positivas. d) Células MTTpositivas, rodeadas por células F4/80 positivas.Estos resultados sugieren que existen macrófagosen la regiones en donde ocurre la muerte celular,que se encuentran en estrés oxidativo, perotambién células mesenquimáticas en estrésoxidativo, de manera individual o bien que sonfagocitadas por los macrófagos. Estos resultadosserán discutidos a detalle en la sección dediscusión.

EL ACIDO RETINOICO Y LA MUERTE CELULARLos resultados arriba expuestos, son la

primera evidencia en la literatura, a favor de queel estrés oxidativo participa en el control delproceso de apoptosis, durante el desarrolloembrionario del ratón (Salas-Vidal et al., 1998).Sin embargo estos resultados nos llevan a lasiguiente pregunta: ¿cual es la señal que induceque las células mesenquimáticas interdigitalesentren en un estado de estrés oxidativo?. En untrabajo previo realizado en el laboratorio, Castro-Obregón y Covarrubias (1996), encontraron que elácido retinoico es capaz de inducir estrésoxidativo y muerte en cuerpos embrioides;además, encontraron que esta muerte puede serinhibida por la adición de diferentes agentesantioxidantes. Debido a que los cuerposembrioides se generan a partir de célulastroncales, provenientes de embriones de ratón, esposible que el ácido retinoico participe en elcontrol de la muerte que ocurre durante eldesarrollo embrionario del ratón. De manera

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Figura 22.- Extremidades de ratón, teñidas conAA, incubadas previamente durante 18hr in vitro ,en medio control, o en presencia de ácidoretinoico (AR) o retinol (ROL).

adicional el trabajo de Castro-Obregón yCovarrubias (1996), sugiere que la señal generadapor el ácido retinoico, induce la formación deERO, y por medio de estas moléculas induce lamuerte celular. Con base en este reporte sepropuso estudiar si el ácido retinoico participa enel control de la muerte celular que ocurre en eltejido interdigital en extremidades de ratón.

AR y ROL inducen apoptosis en extremidades deembrión de ratón in vitro.

Reportes previos han demostrado que elAR es capaz de inducir un incremento en muertecelular en ratones en desarrollo, tanto in vivocomo in vitro (Sulik et al ., 1988; Alles y Sulik1989).

Por lo anterior primero verificamos si elácido retinoico incrementa la muerte en lasextremidades en desarrollo in vitro. Ademásestudiamos también si el precursor natural del ARel retinol (ROL), también incrementa la muerte enextremidades en desarrollo in vitro . Encontramosque el patrón de la distribución de la muertecelular inducida por estos tratamientos, es similaren ambos casos (Fig. 22), lo cual indica que: 1) enlas extremidades en desarrollo existe las rutasmetabólicas necesarias para convertir el ROL enAR; 2) los tejidos blancos son los mismos para elácido retinoico, como para el producto delmetabolismo del ROL (presumiblemente el AR); 3)ambas moléculas son capaces de inducir muerteen extremidades en desarrollo in vitro.

El incremento en la muerte provocado porlos tratamientos con AR, se encontró que fueronmuy marcados a concentraciones entre 0.1 y 1µM, el efecto más notorio fue a 1 µM, desde las 6hr de cultivo. En cambio los tratamientos conretinol, requirieron realizarse a concentracionesmás altas, entre 50 y 100 µM, además de que losefectos en la muerte fueron observados claramentehasta las 16 o 18 hr de cultivo in vitro (Fig. 22).

Inhibidores de la biosíntesis del AR reducen lamuerte celular y la regresión interdigital, enextremidades de embrión de ratón in vitro.

A pesar de que el AR así como suprecursor el ROL, incrementan in vitro la muerte

celular, estos resultados no demuestran si losretinoides endógenos participan en el control dela muerte de manera natural.

Se ha descrito que la ruta de biosíntesisprevaleciente in vivo , del AR y de otros retinoides,es a través de la bioconversión de la vitamina A oROL a retinal, mediada por la enzima alcoholdeshidrogenasa (ADH), y posteriormente por laconversión de retinal al AR por una aldehídodeshidrogenasa (ALDH), (Fig. 4) (Connor y Smith,1987; Connor 1988).

Por otro lado, se conocen diferentesfármacos que bloquean la biosíntesis del ácidoretinoico, y que afectan la actividad de alguna dela enzimas mencionadas, como se muestra en laTabla 3.

El 4-metilpirazol es un inhibidorcompet i t ivo de todas las a lcoholesdeshidrogenasas descritas (Rognstad y Grunnet,1979). El citral por su parte, es un aldehído queinhibe tanto a la ADH como a la ALDH (Connor,1988), y el nerol es un compuesto control delcitral, ya que tiene la misma estructura, pero elgrupo aldehído fue modificado por un grupoalcohol y su actividad inhibidora aconcentraciones equimolares con respecto al citrales prácticamente despreciable (Schuh, et al .,1993) (Tabla 3). Se encontró que tanto el 4-metilpirazol como el citral, redujeron la cantidadde muerte que ocurre en el tejido interdigital, asícomo en las regiones anterior y posterior de laspalmas, sin embargo, el compuesto control, elnerol, a concentraciones equimolares no tuvoefecto notable sobre la muerte (Fig. 23). Debido aque tanto el citral como el nerol son aceitesesenciales (Diliberto et al., 1988), fuerondisueltos previamente en etanol absoluto, por loque se probó el efecto del etanol a laconcentración final utilizada cuando se disolvió elcitral y el nerol. De manera adicional se incluyóun control del efecto de un aldehído aconcentraciones equimolares a las utilizadas de elcitral y no se encontraron efectos de estostratamientos en la muerte celular (Fig. 23).

Figura 23.- Efecto in vitro de inhibidores de ADHy ALDH sobre la muerte celular en extremidadesincubadas por 6hr.

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Compuesto ADH ALDH4-metilpirazol - =Citral - -Nerol = =

Tabla 3.- Efecto de diferentes fármacos sobre laactividad de alcohol deshidrogenasa (ADH) yaldehído deshidrogenasa (ALDH). - inhibidor, =sin efecto.

Inhibidores de la biosíntesis del AR, compitencon los efectos provocados por el retinol, perono con los efectos del AR in vitro.

Para verificar que el efecto de lostratamientos con los inhibidores de la biosíntesisdel AR fueron específicos, realizamos dos pruebasadicionales.

En primer lugar realizamos competenciasentre tratamientos con retinol y ácido retinoico,contra citral y nerol (Fig. 24). Encontramos que encultivos por 18 hr en el medio control (McCoy), lamayor parte de la regresión y la muerte interdigitalse lleva a cabo en este tiempo de incubación.Observamos que en el compuesto control Nerol, lamuerte interdigital es más notoria que cuando lasextremidades son tratadas con el inhibidor citral,con el cual se encontró que la muerte interdigitalaún a estos tiempos prolongados de cultivo, sereduce. El efecto sobre la muerte se va perdiendoconforme se utilizaron concentraciones más bajasde citral. Tanto el AR como el retinolincrementaron la muerte y presentaron un patrónsimilar. En ambos tratamientos, tanto con el ARcomo con el retinol, al incubarlos en presencia denerol (compuesto control) el efecto de losretinoides no fue inhibido por lo que la muerte seincrementó. Sin embargo, cuando se realizaronincubaciones en presencia de retinol y de citral,se observó un descenso en el efecto sobre lamuerte dado por el retinol, lo que indica que elcitral está afectando la conversión de retinol alácido retinoico. Como es de esperarse en unefecto específico, el citral no redujo la muerteinducida por el AR, el cual se espera que tenga unefecto directo sobre la muerte y no requiera de su

Figura 24.- Competencia delos efectos in vitro entreel AR y ROL con losinhibidores de ADH yALDH, sobre la muertecelular en extremidadesincubadas por 18hr.

Control Nerol CitralControl = = -AR + + +Retinol + + -

Tabla 4. Efectos sobre la muerte celular enextremidades in vitro, con tratamientos dobles. =,sin efecto. +, incremento en la muerte. -,decremento en la muerte.

bioconversión dependiente de ADH o de ALDH. Seobservaron resultados equivalentes en dosexperimentos independientes, con un total de 7repeticiones en ambos experimentos (imagenesrepresentativas se muestran en la Fig. 24).

Los efectos observados en losexperimentos de competencia descritos sonresumidos en la tabla 4. Por otro lado se utilizó una línea celularLC3, que expresa al gen reportero beta-galactosidasa, bajo un promotor que contieneregiones responsivas al AR, por lo que laexpresión del gene reportero es dependiente de lapresencia de AR en el medio de cultivo. Este tipode construcciones han permitido en trabajosprevios, demostrar la biosíntesis de ácidoretinoico de manera tejido específica durante eldesarrollo embrionario en ratón (Colbert et al.,1993). Encontramos que al incubar extremidadesde embriones de ratón sobre la línea celular LC3,se genera un halo de expresión del genereportero, en las regiones distales de lasextremidades, y este patrón de expresión se vemuy incrementado cuando se incuban enpresencia de retinol (Fig. 25). Estos resultadosreforzan la idea de que en las extremidades endesarrollo, se encuentran las enzimas necesariaspara realizar la conversión del retinol, al productoel ácido retinoico.

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Figura 25.- Inducción de lacZ en células LC3,por retinoides endógenos (A) y producidos porconversión de retinol (B) en extremidades deembrión de ratón.

Efecto del ácido retinoico sobre el estado deestrés oxidativo en extremidades de ratón endesarrollo in vitro.

Consideramos importante el intentarverificar si el tratamiento in vitro de extremidadescon ácido retinoico, es capaz de inducir la muertecelular mediada por estrés oxidativo. Sin embargo,ha sido más difícil de lo que originalmente seprevió el obtener resultados convincentes en esteaspecto. Desafortunadamente, al incubar lasextremidades in vitro, aún sin dar ningúntratamiento, la tinción con cualquiera de loscolorantes redox sensibles disminuye, por lo queno fue posible evaluar con certeza si el AR escapaz o no, de alterar el estado redox celular. Apesar de lo anterior, los resultados obtenidossobre el efecto de los inhibidores de la biosíntesisdel ácido retinoico en la muerte interdigital, son laprimera evidencia experimental de que el ácidoretinoico endógeno participa en el control de lamuerte en el desarrollo embrionario. Queda parael futuro el continuar explorando si el estrés

6. DISCUSION.

Trabajos previos han demostrado que elestrés oxidativo participa en el control de lamuerte de diferentes tipos celulares (verintroducción). Sin embargo, en la presente tesis yen el artículo incluido (Salas-Vidal et al ., 1998),se presenta la primera evidencia a favor de que elestrés oxidativo participa de manera natural, en lafase de activación del proceso de la muerte celularprogramada que ocurre durante el desarrolloembrionario en el ratón,

EOR EN EL CONTROL DE LA MUERTE CELULAR

El efecto de antioxidantes en el desarrollo de lasextremidades in vitro.

Los efectos teratogénicos del coloranteverde Janus sobre el desarrollo embrionario en elpollo, se conocen desde hace muchos años(Saunders, 1966; Pautou, 1976; Fernández-Terany Hurle 1984). Principalmente nos interesó saberpor que altera el desarrollo de las extremidadesposteriores, e inducir malformaciones. Los efectosdel verde Janus se han dividido en dos fasesdiferentes. En la primera fase, que es temprana,se disminuye la muerte celular y la regresión deltejido interdigital causando sindactilia (i.e. dígitosno individualizados). En la segunda fase, la cuales de efecto tardío, se bloquea el crecimientoapical de los dígitos por lo que se producehipofalangia (reducción en el número de falanges)(Pautou, 1976). Los resultados obtenidos con lostratamientos in vitro con los antioxidantesDCDHF-DA, fenol y DMSO muestran similitudesmuy notorias. A las 6 hr in vitro, se observó unefecto temprano que se caracteriza por unadisminución en la muerte interdigital, lo que trajocomo consecuencia, que se observaran diferentesgrados de sindactilia en las extremidades tratadas(Fig. 1 a 4, artículo 1). La fase tardía previamentereportada para el verde Janus (hipofalangia), fueobservada a las 96 hr de los tratamientos en lapresente tesis, y se caracterizó por la ausencia dela falange 3 (datos no mostrados). Interpretamos lafalta de la falange 3 como resultado delincremento en muerte observado en las regionesdistales de los dígitos desde las 12 hr de cultivo(Fig. 1, artículo 1).

El verde Janus es un colorante vital, quees redox sensible (Bowen y Bowen, 1990).Anteriormente se ha utilizado para observargradientes redox durante el desarrolloembrionario en erizos de mar (Horstadius, 1952).Por lo que es muy posible que el verde Janusactúe como antioxidante y disminuya la muertepor un mecanismo similar a los antioxidantesutilizados en la presente tesis.

El efecto de los antioxidantes sonevidencia a favor de que el estrés oxidativoparticipa en la inducción de la muerte interdigital.De manera adicional obtuvimos evidenciacorrelativa de que existen estados redox diferentes

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entre las regiones digitales e interdigitales (Fig. 5,artículo 1): las células mesenquimáticas delinterdígito y de las regiones anterior y posteriormostraron un estado de estrés oxidativo (Fig. 6,artículo 1). Los resultados tomados en conjunto,sugieren que los efectos observados con lostratamientos con fenol, DMSO y DCDHF-DA, sonmediados por su capacidad como antioxidantes,posiblemente reaccionando con diferentes EOR obien bloqueando sus efectos sobre las moléculasblanco. Más adelante en la discusión semencionaran otras estrategias que se estánrealizando en el laboratorio y algunas propuestasadicionales, para evaluar el papel de las EOR enla apoptosis que ocurre en el desarrolloembrionario.

Identidad de las células en estrés oxidativo.Los datos presentados en el artículo

adjunto, muestran que las células en estrésoxidativo son por lo menos de dos tiposdiferentes: células mesenquimáticas y macrófagos(Fig. 6c, artículo 1). Los patrones de tinción conlos colorantes redox sensibles (Figuras 5 y 6,Tabla 1; Artículo 1) en conjunto con la proteccióncontra la muerte celular observada por lostratamientos con antioxidantes sugieren que lascélulas mesenquimáticas destinadas a morir,presentan un estado de estrés oxidativo temporalprevio al inicio del proceso de muerte, de locontrario no serían protegidos por los agentesantioxidantes. Sin embargo, estos resultados nodescartan la posibilidad de que los macrófagosactivados que entran en estado de estrésoxidativo, puedan participar en la inducción delproceso apoptótico. Se ha reportado que losmacrófagos son necesarios para iniciar la muertecelular que ocurre en el desarrollo embrionariodel ojo (Lang y Bishop, 1993; Lang et al . 1994),sin embargo, en este sistema no se ha exploradosi el estrés oxidativo participa en el control de lamuerte. Una posibilidad sería utilizar unaestrategia similar a la reportada en estos trabajos,en los cuales se eliminaron los macrófagos enembriones de ratón. Esto se logró al generarratones transgénicos que expresaban en lascélulas blanco, en este caso macrófagos, la cadenaA de la toxina de difteria, dirigiendo su expresiónbajo un promotor específico de esta línea celular,en particular utilizaron al promotor del factorestimulador de la formación de colonias degranulocitos y de macrófagos (Lang y Bishop,1993). Una estrategia de este tipo, podríafuncionar para eliminar a los macrófagos o bien asus precursores en el desarrollo embrionariotemprano, para verificar si aún en ausencia demacrófagos, ocurre la muerte celular en elmesénquima de los interdígitos, así como en otrasregiones en donde ocurre la muerte. Sin embargo,esta estrategia presenta algunos posiblesproblemas que deben señalarse. La toxina podríaser tóxica para otros tipos celulares que no laexpresan, por lo que se ha optado por reducir su

expresión al modificar el promotor bajo el cual sedirige su expresión (Lang y Bishop, 1993). Otroproblema muy importante es que este promotor nose expresa en precursores de estas lineascelulares (Lang et al., 1987). Por lo tanto, seríaadecuado poder encontrar un promotor que seexprese en precursores de macrófagos durante eldesarrollo embrionario.

Es importante señalar que observamostambién células en estrés oxidativo en otrasregiones en donde ocurre apoptosis, tanto enembriones de pollo (Fig. 21) como de ratón (8.5dpc y Fig. 7, artículo 1), en etapas en las que seha reportado que todavía no se diferencianmacrófagos, los cuales son claramentedistinguibles entre los 9 y 11 dpc en ratón(Dzierzak y Medinsky, 1995; Takahashi et al. ,1989). Sin embargo, existe la posibilidad de quelas células observadas en estrés oxidativo, nopresenten inmunoreactividad con el anticuerpoF4/80, que sean macrófagos embrionarios, o biensean macrófagos inmaduros que todavía no tienentodos los antígenos de superficie, que sediferencian completamente al avanzar eldesarrollo. Esta posibilidad queda aún porexplorar.

EOR en el control de la muerte celular.La reducción de las sales tetrazólicas como

el MTT o el NBT, forman un precipitado de colorpúrpura denominado formazán (Fig. 8). Estareacción se ha utilizado ampliamente como unindicador de sobrevivencia celular o como unindicador de actividad metabólica. Como unindicador de sobrevivencia se ha utilizado porquesólo las células vivas, son capaces de reducir elcolorante (Freshney, 1994). Como indicadormetabólico se ha utilizado para mostrar actividadde las deshidrogenasas in vivo (Hammar y Mottet,1971), o bien para medir la llamada explosiónrespiratoria en fagocitos (neutrófilos y enmonocitos/macrófagos) (Rice-Evans, Diploc ySymons, 1991).

Por lo tanto, es de esperarse un nivelbasal de tinción (precipitación de formazán) con elcolorante MTT, debido a que la mayoría de lascélulas de las extremidades en desarrollo y deotras regiones en el embrión, están vivas (Fig. 5 y7, artículo 1). Sin embargo, fue muy sorprendenteel encontrar a células con un marcaje muy intensoy fácilmente reconocibles (Fig. 5 a 7, artículo 1).Como ya fue mencionado las células muertas noson capaces de reducir el MTT (Freshney, 1994),por lo que el incremento en tinción no se debe a lamuerte de estas células, y el incremento en EORno parece ocurrir como consecuencia del procesode muerte, de lo contrario se acumularía elprecipitado en las células que presentarontambién marcaje para muerte con el coloranteanaranjado de acridina, lo cual no ocurrió (Tabla1, artículo 1). Por otro lado, la intensidad de laseñal observada en los interdígitos con loscolorantes redox sensibles, así como en las

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regiones anteriores y posteriores de lasextremidades, parece que no se debe a unincremento en la act iv idad de lasdeshidrogenasas, ya que otros autores hanreportado una mayor actividad por lo menos de lasuccinato deshidrogenasa en los dígitos,comparada con los interdígitos, utilizando en subioensayo al NBT y succinato de sodio comosubstrato para la reacción en el medio deincubación (Hammar y Mottet, 1971).

A pesar de que la reducción del MTT o delNBT no son marcadores específicos de laproducción de superóxido, la generación delprecipitado formazán, se ha reportado que segenera preferentemente por la presencia desuperóxido (Rice-Evans, et al., 1991). Así que lafuerte tinción que observamos en el tejidointerdigital, y en otras regiones en donde ocurre lamuerte celular, claramente indican que las célulasen estos tejidos se encuentran en un estadometabólico diferente, el cual nosotrosinterpretamos como un estado de estrés oxidativo.Esta interpretación se ve reforzada por lospatrones de tinción observados con otro coloranteredox sensible el C-DCDHF-DA (Fig. 5, 6 y 7,artículo 1), y por la protección de la muerte en elinterdígito por los tratamientos con los diferentesantioxidantes (Fig. 1, 2 y 3, artículo 1).

Parecería entonces que el estrés oxidativoparticipa en la fase de activación de la apoptosis.Las EOR no parecen participar como parte de lamaquinaria de ejecución, ya que si la muerte fueradebida a un daño provocado por la oxidación delos diferentes componentes celulares, muyprobablemente este proceso sería irreversible y nosería posible proteger de la muerte por lostratamientos con antioxidantes.

Queda aún por estudiar cual o cuales sonlos blancos de las EOR y por medio de quémecanismos modulan la muerte celular. DiferentesEOR se han reportado que funcionan comosegundos mensajeros en la transducción de lasseñales (Khan y Wilson, 1995) responsables dediferentes procesos, no solo durante la muertecelular, sino también parecen participar en ladiferenciación celular (Suda et al., 1993; Clair etal., 1994), en la quimiótaxis, en la proliferación(Sundaresan et al ., 1995) y en el envejecimiento(Edgington, 1994).

Otros mecanismos por medio de los cualesparecen también modular las EOR sus efectos, sonla fosforilación de las tirosinas en las vías detransducción de las señales dependientes de esteproceso (Lander et al., 1995; Monteiro y Stern,1996). De manera adicional afectan la afinidad deunión al ADN de diferentes activadorestranscripcionales (Sun y Oberley, 1996). Enparticular es interesante el factor de transcripciónp53; residuos de cisteína participan en laregulación de la capacidad de unión al ADN porparte de la proteína p53, y la regulación se debe acambios conformacionales que son redoxdependientes (Rainwater et al., 1995). La

actividad in vitro de p53 parece ser moduladatanto por la tiorredoxina (Pearson y Merrill, 1998)como por la proteína Ref-1 (Jayaraman, et al. ,1997), por vías redox dependientes. Ref-1 catalizala reparación de lesiones oxidativas en el ADN,pero adicionalmente estimula la actividad deunión al ADN de factores de transcripción comoAP-1 y p53 por cambios en el estado redox decisteínas específicas (Jayaraman, et al., 1997).Estos reportes pueden sugerir variasposibilidades de mecanismos de regulación: a)que p53 es un posible blanco de las EOR, loscuales modifiquen directamente el estado oxidadoo reducido de las cisteínas redox sensibles; b)que las EOR disminuyan las posas de glutatiónreducido que dan poder reductor a la célula ymodifiquen el estado redox intracelular, ymediante este mecanismo indirecto, alteren laactividad de moléculas como las tiorredoxinas oRef-1; y los cambios redox en estas moléculas asu vez podrían afectar la actividad de p53; estoimplicaría una especie de cascada deoxidorreducción iniciada por las EOR que alteranla afinidad de factores de transcripción y de estamanera podrían modificar los patrones deexpresión de genes participantes en el control dela muerte.

Sin embargo, existe aún otra posibilidad yes que las EOR se encuentren debajo de lacascada de activación de p53. Se sabe que p53regula la transcripción de varios genes queparticipan en el control del estado redoxintracelular (Johnson et al ., 1996; Polyak et al .,1997), algunas de las proteínas que codificanparticipan en la formación de EOR. Es posible queestas EOR producidas tengan otro blanco sobre elcual actúen y así modulen el proceso de muerte.

Sin embargo es importante señalar queratones deficientes en la expresión de p53, sedesarrollan normalmente, y solo son mássuceptibles en la formación de tumoresespontáneos (Donehover et al., 1992)

De manera adicional se ha reportado queel incremento en la expresión de ref-1 en elcerebro correlaciona con las regiones en donde seexpresan tanto f os como j un (revisado enJayaraman, et al ., 1997). Debido a que al menosla expresión de fos se estimula por el estrésoxidativo (Cerutti et al., 1989; Shibanuma et al.,1990), es posible que la correlación en laexpresión entre ref-1 y fos quiera decir que en lasregiones en que se expresan se encuentran enestado de estrés oxidativo, y estos genes seexpresan en respuesta a este proceso.

Sería muy interesante verificar a detalle elorden que sigue la cascada de regulación p53 oalguno de sus homólogos, ref-1, EOR y la muertecelular in vivo durante el desarrollo embrionario;como p53 tiene la capacidad de regular latranscripción de genes relacionados en laproducción de EOR, y además su actividad deunión al ADN es regulada por el estado redox decisteínas presentes en la proteína, posiblemente

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existe un circuito de regulación, en donde p53induce la producción de EOR, estos a su vezmodifican el estado redox de p53 y así provocanque ya no se produzcan más EOR. Este podría serel mecanismo responsable de que ocurran picostransitorios de acumulación de EOR al inicio delproceso de muerte, ya que si la acumulacióncontinuara aún después de la fase de activación,esto potencialmente tendría la capacidad deinhibir la muerte, ya que parte de las moléculasefectoras, las caspasas, de los cambios queocurren durante la apoptosis, son sensibles alestado redox de las cisteínas que se encuentranen su sitio activo, que cuando se encuentran enestado oxidado pierden actividad (Nobel et al.,1997).

¿La evidencia a favor de que las EOR participanen el control de la muerte celular es conclusiva?

La evidencia presentada a favor de que lasEOR participan en la muerte celular no escompletamente concluyente. Esta afirmación sebasa en que algunos autores (como Slack, 1995)han propuesto que para tener una evidencia claraa favor de que un factor inductor es responsabledel proceso biológico que se estudia, se necesitacumplir al menos con tres grupos de criterios, loscuales se discuten a continuación:

1) El criterio de expresión: el factor debeexpresarse o estar presente en el lugar en dondeocurre el evento que se estudia. En este casotenemos evidencia de una producción de EORacentuada en las regiones interdigitales en dondeocurre la muerte; faltarían definir los mecanismosque promueven su síntesis o acumulación (vermás adelante).

2) El criterio de inhibición: en donde lainhibición específica del factor, debe prevenir queocurra el proceso que presuntamente induce invivo. En este sentido tenemos evidencia parcial,debido a que los tratamientos con antioxidantesdisminuyeron la muerte celular. En el laboratoriose están siguiendo alternativas experimentalespara verificar estos resultados. Se pretende dirigirla expresión de diferentes enzimas como SOD ocatalasa, que metabolizan EOR, o bien la expresiónde Bcl-2 la cual como se mencionó anteriormente,altera el potencial redox intracelular volviéndolomás reductor (Hockenbery, 1993) a tejidos endonde ocurre la muerte. Se piensa dirigir laexpresión al tejido interdigital utilizando parte delpromotor del receptor del ácido retinoico RARβ, elcual se expresa en este tejido de manera muyabundante (Dollé et al ., 1989). Por otro lado, sepretende hacer un estudio del patrón deexpresión y la actividad de algunas de las enzimasque intervienen en el metabolismo de las EORmejor conocidas como la catalasa, la SOD y lasperoxidasas.

3) El criterio de activación: en este criteriose propone que al provocar la síntesis o al añadiral presunto factor inductor se debe iniciar elproceso biológico esperado. En este sentido en

parte de la tesis se intentaron 2 estrategias:a) Adicionar peróxido de hidrógeno en el

medio de cultivo de extremidades ya que se hareportado que promueve la muerte en otrossistemas (Hockenbery et al., 1993). Se encontróque la adición de peróxido de hidrógeno, no fuecapaz de incrementar la muerte interdigital,incluso lo que se observó fue una disminución, yen los interdígitos se formaron condensaciones decartílago que se asemejan mucho a falanges extras(resultados no mostrados). Estos resultadospueden interpretarse de varias formas. Por unlado pueden ser evidencia en contra de que lasEOR participan en el control de la muerte. Sinembargo, consideramos que este no es el caso,principalmente debido a los resultados en que seobservó una tinción intensa en los interdígitos conlos colorantes redox sensibles y por la proteccióncontra la muerte por los antioxidantes argumentana favor del papel de las EOR en el control de lamuerte. Sin embargo, no se puede descartarcompletamente esta posibilidad. Consideramosotras explicaciones alternativas al efecto delperóxido de hidrógeno sobre la muerte y ladiferenciación interdigital. Por un lado, en la tesishemos hablado de manera genérica, refiriéndonosa las EOR, debido a que desconocemos si existeuna EOR particular o bien si son un conjunto deEOR las responsables del control de la muerte, yaque in vivo muchas de estas moléculas seinterconvierten rápidamente a otras y sumetabolismo es muy complejo (Ullah y Wilson,1995), lo que dificulta la identificación de la EORresponsable de un proceso determinado. Por otrolado, como se mencionó anteriormente las EOR sehan relacionado con el control de otros procesoscelulares, así que todavía queda por explorar sidiferentes EOR intervienen en procesosespecíficos (muerte, diferenciación, migración,etc.), o bien si las mismas moléculas son capacesde inducir procesos diferentes, pero que estodependa de la concentración de la EORresponsable y que la respuesta sea iniciada alrebasar concentraciones críticas. Además, puedenafectar otro tipo de señales que recibe la célulay/o el estado metabólico y fisiológico de ésta; éstopuede provocar que la célula integre lainformación con respuestas diferentes.

b) El AR incrementa la producción de EORy es capaz de inducir muerte celular en cuerposembrioides, pero esta muerte puede ser prevenidapor tratamientos con diferentes antioxidantes(Castro-Obregón y Covarrubias, 1996). Se haintentado verificar si el AR participa en la vía deinducción de la muerte, y si ésta es EORdependiente. Este punto se discutirá a fondo másadelante en el apartado correspondiente al AR.

A pesar de que la evidencia presentada noes completamente concluyente sobre la función delas EOR en el control de la muerte, los resultadosjustifican el continuar explorando por medio deestrategias alternativas si las EOR cumplen lostres criterios para afirmar que son factores que

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participan en los mecanismos que activan laapoptosis en el desarrollo embrionario.

El papel fundamental de las mitocondrias en elcontrol de la muerte celular.

Las EOR pueden producirse no sólo en lacadena respiratoria de las mitocondrias, existenvías enzimáticas descritas en otroscompartimentos celulares que provocan unareducción parcial del oxígeno, como en el retículoendoplasmático, en los peroxisomas, en lamembrana nuclear, en el citoplasma y en lamembrana plasmática (Fisher, 1987). Sinembargo, se piensa que las mitocondrias son elsitio principal en el que se producen la mayorcantidad de EOR.

Se ha observado en varios modelos demuerte celular dependientes de EOR, que tanto suacumulación como el proceso de apoptosis,requieren de la cadena respiratoria mitocondrialfuncional para que se lleve a cabo la muerte(Schulze-Osthoff et al., 1993; Quillet-Mary et al.,1997). Utilizando a la ceramida como inductor demuerte, en la linea celular U937 de leucemiahumana, se ha observado un incremento en lageneración de EOR, así como de la muerte. Alutilizar una linea U937 modificada que esdeficiente en la cadena respiratoria, ya quepresentan una eliminación de ADN mitocondrial yuna actividad muy disminuida del complejo III dela cadena respiratoria, y ser tratada con ceramidano se observa la producción de EOR, lo cualsugiere un papel fundamental del complejo III enla producción de EOR en la muerte inducida porceramida. De manera adicional tratamientos coninhibidores de la cadena respiratoria, como larotenona que inhibe al complejo I, el TTFA queinhibe al complejo II, se provoca una inhibicióncasi completa de la formación de EOR inducidapor ceramida, pero si los tratamientos conceramida son simultáneos con un inhibidor delcomplejo III, la antimicina A, se incrementa laproducción de EOR en más de 2 veces. Esimportante señalar que de manera adicional seobservo una disminución en la cantidad decélulas apoptóticas, inducidas por la ceramida,con los inhibidores de los complejos I y II, perouna clara potenciación del efecto de la ceramidaen la muerte, con el inhibidor del complejo III(Quillet-Mary et al., 1997). Estos resultadossugieren que cambios en la transferencia deelectrones cercanos o a nivel del complejo IIIpodrían ser las responsables de la generación deEOR y del inicio del proceso de muerte. En estesentido estudios recientes sugieren que laliberación del citocromo c de la mitocondria alcitoplasma induce las fases iniciales de la muerte(Liu et al., 1996), parece que el citocromo c lo quefavorece es la unión de Apaf-1 (presunto homólogode CED-4 de C. elegans en mamíferos) con lacaspasa-9, lo que provoca la activación de lacaspasa-9, la cual a su vez activa a la caspasa-3.Esto implicaría que la liberación del citocromo c al

citoplasma participa en la activación de lacaspasa-9 y en el inicio de la cascada de lasproteasas que provocan la muerte celular (Li et al.,1997). Diferentes tipos de estudios handemostrado que la mayor parte de la proteína Bcl-2 se encuentra principalmente localizada en lamembrana de mitocondrias (Hockenbery et al. ,1990) así como en otras membranas como elretículo endoplasmático y la membrana nuclear(Chen-Levy et al., 1989; Monaghan et al., 1992).Se ha reportado que Bcl-2 actúa en lasmitocondrias y evita que el citocromo c sealiberado al citoplasma y que éste a su vez inicie laactivación de las caspasas (Yang et al., 1997;Kluck et al ., 1997). Potencialmente la mismaliberación del citocromo c (que transfiereelectrones al complejo III) de la mitocondria, debeprovocar un rompimiento del flujo electrónico enla cadena respiratoria, debajo de la ubiquinona, locual en principio puede ser la responsable delincremento en la producción de EOR (Mignotte yVayssiere, 1998). Esto sugiere que de algunamanera el citocromo c es una de los blancos delas señales que inducen la muerte celular, por loque deberían caracterizarse los mecanismos queprovocan que Bcl-2 libere al citocromo de lasmitocondrias.

Quedaría por demostrar si un procesosimilar ocurre durante la muerte celular en eldesarrollo embrionario, y ésta no es únicamenteuna respuesta que ocurre en sistemas in vitro. Asímismo queda aún por contestar si las EOR tienenblancos específicos por medio de los cualesregulan su actividad proapoptótica, o bien siactúan de manera indirecta, como por ejemplobajando las posas de agentes reductores como elglutatión, y si esta disminución es la que modificael estado redox de diferentes componentes, comofactores de transcripción, promoviendo así elproceso de muerte celular.

EOR en el desarrollo embrionario.El estado redox intracelular y/o las EOR

podrían participar en otros procesos además de lamuerte celular durante el desarrollo embrionario.En algunos modelos in vitro se ha observado quelas EOR, además de participar en el control de lamuerte celular (Greenlund et al ., 1995; Goossenset al ., 1995; Castro-Obregón y Covarrubias,1996; Jabs et al ., 1996), participan en ladiferenciación celular (Suda et al., 1993; Clair etal., 1994), en la quimiotáxis, en la proliferación(Sundaresan et al ., 1995) y en el envejecimiento(Edgington, 1994) de diferentes tipos celulares.Por otro lado, se han reportado cambios en elestado redox en el desarrollo embrionariotemprano en diferentes organismos, como es elcaso de la fertilización en erizos de mar, en dondese producen grandes cantidades de peróxido dehidrógeno por una actividad de tipooxidorreductasa. El peróxido de hidrógenofunciona como substrato para la ovoperoxidasapara formar parte de la envoltura de fertilización,

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la cual es una barrera que participa en evitar lapoliespermia durante la fertilización (Heinecke yShapiro, 1989). Es interesante que en embrionesde ratón se han reportado también actividad deoxidasas (NADH)-dependientes, en células deltrofoblasto durante la implantación del embrión enel útero (Gagioti et al., 1995). Estos reportessugieren entonces que el estrés oxidativo participapotencialmente en la regulación de otrasrespuestas celulares aparte de la muerte duranteel desarrollo embrionario. De ser así se puedepredecir que al modificar el estado redox seencontrarían efectos en diferentes procesos comola proliferación, la diferenciación, la migración yel envejecimiento. Aun cuando no evaluamosninguno de estos procesos en las extremidadesincubadas con antioxidantes sería interesantebuscar los métodos más adecuados para estudiara fondo sus efectos. Sin embargo, los resultadosobtenidos con el tratamiento con el peróxido dehidrógeno sobre las extremidades embrionarias deratón, arriba mencionados, podrían representarun caso en el cual las EOR inducen ladiferenciación del interdígito. Faltaría caracterizareste efecto a fondo para definir que mecanismosestán disparándose al hacer los tratamientos conel peróxido de hidrógeno.

El control del estado redox en el desarrolloembrionario.

Los reportes mencionados en el apartadoanterior, así como las tinciones de embriones deratón con los colorantes redox sensibles (Fig. 5 ala 7, artículo 1), sugieren que durante eldesarrollo embrionario, ocurre un control muy finode los patrones espaciales y temporales degeneración/degradación de EOR in vivo . Es muyposible que durante el desarrollo embrionario seregule el estado redox intracelular, tanto a nivelde la producción y el metabolismo de las EOR, asícomo de la síntesis de otras moléculasparticipantes en el control redox intracelular(glutatión, tiorredoxina, Ref-1), en donde elbalance neto de estas actividades, darían comoresultado estados redox específicos para cadalinaje celular, que adicionalmente generaríanrespuestas diferentes dependiendo del tipocelular en el que ocurra, de la intensidad en elcambio en el estado redox y de otras señales queeste recibiendo la célula blanco en ese momento.

Con respecto a la generación de EORparecen existir mecanismos especializados parasu producción. La explosión respiratoria mejorcaracterizada es la que ocurre en macrófagos(Morel et al., 1991; Rice-Evans et al., 1991), sinembargo durante el desarrollo embrionariotambién parecen ocurrir eventos de explosiónrespiratoria, como los mencionados en el apartadoanterior. Sería muy interesante caracterizar afuturo si en las células mesenquimáticasobservadas en estrés oxidativo (Fig. 6, artículo), lavía responsable de los cambios redox observadoses por medio de oxidasas (NADH)-dependientes o

bien se debe a un incremento en la producción deEOR dependiente de la actividad mitocondrial.

Por otro lado varios mecanismos parecenparticipar en el metabolismo de EOR durante eldesarrollo embrionario. Se ha reportado que enembriones de ratón previo al nacimiento, ocurreun incremento en la actividad de enzimasantioxidantes en los pulmones, lo cual se hainterpretado como una preparación de este tejidopara enfrentar a la respiración. Sin embargo,reportes recientes muestran que ocurre unincremento en la actividad de superóxidodismutasa Cu/Zn y de la glutatión peroxidasaprevia al nacimiento en otros órganos, y noúnicamente en los pulmones como se habíareportado (de Haan et al ., 1994). De maneraadicional resultados obtenidos en el laboratoriopor el Dr. Luis Covarrubias, la Dra. Hilda Lomelí,Denhí Schnabel y Rodrigo Cuervo (resultados sinpublicar), sugieren cambios en los patrones deactividad de peroxidasas en el desarrollo de lasextremidades de ratón, precisamente hanencontrado actividad de este tipo en el tejidocorrespondiente a los dígitos, en los momentos enque los interdígitos presentan una fuerte tincióncon los colorantes redox sensibles. Por su parte laproteína Bcl-2 se ha reportado que se expresapreferentemente en los dígitos durante eldesarrollo de las extremidades del ratón (Novak yKorsmeyer, 1994). Estos reportes y los resultadosde la presente tesis sugieren varias cosas. Enprimer lugar que durante el desarrollo tardío (S8-S12) de las extremidades, las diferencias en laactividad antioxidante de las peroxidasas yposiblemente la actividad antioxidante de Bcl-2,participan en reducir las EOR en los dígitos, y quela ausencia de estas actividades en losinterdígitos podría ser en parte responsable de laacumulación de EOR. Adicionalmente, si en losinterdígitos existe una actividad generadora deEOR (podría ser NADH oxidasa dependiente o bienmediado por la liberación del citocromo c de lacadena respiratoria), la cual no sea activa en losdígitos, esta actividad combinada potenciaría lasdiferencias en estados redox entre dígitos einterdígitos. Otra posibilidad es que exista unaactividad generadora de EOR homogénea en todala extremidad, pero que la actividad antioxidantediferencial sea la única responsable de generarlos patrones dígito-interdígito en las extremidadesy los patrones redox complejos observados enotros órganos (Fig. 7, artículo 1). En este sentidoresulta muy importante caracterizar si existenpatrones de expresión diferenciales de enzimasantioxidantes (SOD, catalasa, peroxidasas) y delas moléculas que regulan el estado redoxintracelular como glutatión, tiorredoxina, Ref-1,Bcl-2, etc., y el como se relaciona la expresión delos genes de estas moléculas, así como lasactividades, con los estados redox en diferentestejidos. Los resultados preliminares obtenidos porcompañeros del laboratorio son muy prometedoresy son buenos argumentos a favor de caracterizar

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con mayor detalle esta posibilidad. Nuevamente eldesarrollo de las extremidades podría ser unmodelo adecuado para comenzar estacaracterización.

Diferenciación a cartílago de las célulasinterdigitales sobrevivientes.

Algunos de los componentes de la matrizextracelular que son sintetizados por el cartílago,son las colágenas (como la tipo II) y losproteoglicanos (Chen et al., 1995). La expresiónde sus ARNs mensajeros o la acumulación de lasproteínas codificadas por estos mensajeros, sehan utilizado como marcadores para la deteccióndel proceso de condrogénesis (Hurle et al., 1989;Fernandez-Teran y Hurle, 1984). Los resultadosobtenidos en la presente tesis, muestran quecuando la muerte interdigital es inhibida por laadición de agentes antioxidantes, las células“rescatadas” inician aparentemente el proceso decondrogénesis en el interdígito (determinado porla tinción con azul alciano y por el marcaje conaglutinina de cacahuate fluoresceinada, Fig. 19 y20). Sin embargo, cabe mencionar que ladiferenciación hacia cartílago no es completa,debido a la ausencia de expresión de ARNmensajero de la colagena tipo II (datos nomostrados). Es posible que algunos factores nopresentes en los interdígitos, son requeridos paraque se forme cartílago maduro; o bien algunaactividad inhibidora en esta región bloquea lasfases finales de la condrogénesis. Algunos gruposde investigación han sugerido que el ectodermointerdigital, tiene actividad inhibidora de lacondrogénesis sobre el mesénquima delinterdígito (Hurle et al., 1989). Es importanteseñalar que aún después de la incubación de lasextremidades con los antioxidantes el epiteliopermanece histológicamente intacto en nuestrosexperimentos, por lo que la disminución en lacantidad de muerte interdigital no se debe a laausencia del ectodermo (Fig. 3, artículo 1), apesar de esto, es posible que la condrogénesis nose complete debido a que los factores quenaturalmente inhiben este proceso, en el tejidointerdigital, continuaron evitando la diferenciacióncompleta de las células localizadas en estasregiones.

En el nemátodo C. elegans, las mutacionesen los genes ced-3 o ced-4 permiten sobrevivir alas células que normalmente están destinadas amorir (Ellis y Horvitz, 1986). Las células quesobreviven se diferencian en los fenotipospredecidos para los linajes celulares a los quepertenecen. Incluso se ha observado en otrostipos celulares en los cuales se ha prevenido lamuerte, que son capaces de diferenciarse(Fairbairn et al., 1993; Howard et al., 1993). Laexpresión de diferentes marcadores decondrogénesis en el tejido interdigitalsobreviviente en los tratamientos conantioxidantes, revela el potencial condrogénico enesta línea celular, normalmente comprometida a

morir. Acorde con estos resultados, otros gruposhan observado el potencial condrogénico deltejido interdigital, cuando se cultivan in vitroexplantes de estas regiones (Lee et al., 1994) y eninterdígitos de extremidades traseras de pollo, alas cuales se les ha removido el tejido epitelial(Hurle y Gañán, 1986). Es interesante el hecho deque en los embriones de pollo tratados con verdeJanus, también se ha reportado que ocurrecondrogénesis interdigital (Fernandez-Teran yHurle, 1984), sin embargo en estos reporte sólo seha verificado la condrogénesis por tincionessimilares a las que utilizamos en la presente tesis(como el azul alciano), y no utilizaron otrosmarcadores moleculares como el de la colágenatipo II.

Es posible que antes de que se definan lasregiones que formarán a los dígitos y de quecomience la regresión interdigital, el mesénquimade las regiones digitales e interdigitales seanhasta cierto punto equivalentes, y la muertecelular que ocurre en el interdígito es el resultadode la acción de señales que promueven lasobrevivencia de las células digitales y de lasseñales que promueven la muerte en las regionesinterdigitales, posiblemente por alguno de losmecanismos propuestos en secciones anterioresde la tesis.

LOS RETINOIDES EN EL CONTROL DE LAMUERTE CELULAR

El ácido retinoico en el control de la muertecelular durante el desarrollo embrionario.

Se ha reportado que el ácido retinoico esun agente teratogénico muy potente, ya que al seradministrado por vías diversas a ratones hembrasgestantes, induce malformaciones en losembriones; además, algunos grupos hanobservado un marcado incremento en la muertecelular en diferentes órganos dependiendo delestadio embrionario en el que fueron expuestos alAR (Sulik et al., 1988). Particularmenteinteresante es el hecho de que en los apéndicesde embriones tratados, se incrementa la muertecelular (Alles y Sulik, 1989). Por otro lado,diferentes grupos han reportado expresión delreceptor de ácido retinoico RARβ en losinterdígitos en las etapas en que ocurre muertecelular (Fig. 26) (Dollé et al ., 1989), lo que hallevado a proponer que el ácido retinoicoposiblemente es una de las moléculasinvolucradas en el control de la muerte que ocurreen los interdígitos. Sin embargo, no existeevidencia experimental directa de que el ARendógeno participa de manera natural en elcontrol de este proceso.

En la literatura hemos encontradoreportado que las enzimas que participan en labiosíntesis del ácido retinoico, se expresan en lasextremidades en desarrollo, precisamente en lasetapas en que ocurre la muerte celular (Fig. 26).Se ha observado que, con el uso de genes

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reporteros cuya expresión se encuentra reguladabajo el promotor de la alcohol deshidrogenasa 3de humano, se puede dirigir su expresión alectodermo apical distal en las etapas en que seinicia el proceso de muerte (Zgombic-Knight,1994). Por otro lado, la enzima aldehídodeshidrogenasa tipo 2 se ha reportadorecientemente que se expresa en los interdígitosprevio a la expresión del RARβ (Niederreither etal., 1997), precisamente en las mismas etapas.Los resultados presentados en las figuras 22 a 24y en la tabla 3, son la primera evidenciaexperimental in vivo de que el ácido retinoico quese produce endógenamente en las extremidades,participa en el control de la muerte interdigital. Secomprobó la especificidad de este efecto sobre lamuerte, de lo contrario las competenciasmostradas en la fig. 24, hubieran mostrado unefecto inhibidor de la muerte por citral, aún enpresencia del ácido retinoico. Como era deesperarse en un efecto específico, el citral redujola muerte provocada solo por el retinol y no por elácido retinoico (ver Fig. 24 y 27).

Mecanismos de inducción de apoptosis por elAR.

Se planteó como hipótesis (Fig. 6 y Fig.27) la posibilidad de que la muerte inducida porel AR fuera mediado por EOR. Principalmente esto

Fig. 26.- Patrones de expresión de ADH (líneaazul), ALDH-2 (morado claro), RARβ (puntos azulclaro) y de transglutaminasa (morado claro ypuntos azul claro).

Figura 27.- Puntos de inhibición de la síntesis delAR por diferentes agentes.

se basó en los resultados reportados previamenteen el laboratorio, en donde se encontró que lamuerte celular puede ser inducida por AR encuerpos embrioides, y esta es precedida por unincremento en EOR; de manera adicional seobservó que la muerte podía ser evitada por eltratamiento simultáneo con agentes antioxidantes(Castro-Obregón y Covarrubias, 1996). Sinembargo en la presente tesis no ha sido posibledemostrar si las EOR median la muerte inducidapor el AR en las extremidades en desarrollo.Existe la posibilidad de que a los tiemposobservados (6 y 12 hr) no se sean los adecuadospara detectar picos de producción de EOR, y queestos se generen a tiempos de incubación máscortos, debido a que en otros sistemas el estrésoxidativo ocurre alrededor de las 3 h de la señalque induce la muerte celular. Esta posibilidadsigue abierta para ser explorada a fondo. Demanera adicional sería interesante poner acompetir el efecto del AR con antioxidantes y versi de esta forma se evita la muerte.

Sin embargo, existe otra posibilidad, y esel que la vía de muerte inducida por el AR seaindependiente de la generación de EOR, y queestas moléculas funcionen in vivo, como un eventoque refuerza al proceso de inicio de la apoptosisen conjunción con la vía del AR, como fuesugerido en la discusión de la publicación 1.

El AR es capaz de inducir la expresión dela transglutaminasa (Zhang et al., 1995), la cualse ha reportado que su sobreexpresión incrementala muerte celular en una línea de neuroblastomade humanos (Melino et al ., 1994), por lo que éstapodría ser una vía que inicia la muerte y norequiera de manera directa la formación de EOR; amenos de que los derivados del oxígeno aparezcano funcionen debajo de la cascada iniciada por latransglutaminasa. También se ha observado que elAR es capas de suprimir la expresión de bcl-2(Okazawa et al ., 1996), lo cual sugiere que estasería una forma de aumentar la sensibilidad a lamuerte por el AR, y quedaría por definir si estadisminución en la síntesis de bcl-2 afecta a lamuerte por una vía redox dependiente oindependiente. Sería muy interesante verificar siesto ocurre durante los tratamientos con el AR enlas extremidades del ratón, o bien si los retinoidesendógenos regulan de manera natural la expresiónde bcl-2.

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Finalmente, la muerte inducida por el ARpuede ser regulada a nivel de la transcripción demuchos genes, aparte de los ya mencionadosarriba. La regulación transcripcional mediada porlos diferentes receptores a retinoides es muycompleja (Nagy et al., 1998). Sólo algunosreceptores están relacionados con el control de lamuerte en el desarrollo de las extremidades, comolos receptores RARα y el RARγ, que al hacer“knock out” de sus genes, se provoca sindactiliaparcial, solo al combinar las mutaciones seprovoca un fenotipo más penetrante (Kastner et

al., 1997). El RARβ a pesar de que se expresaespecíficamente en los interdígitos (Dollé et al.,1989), la disrupción génica de este receptor, noprovoca efectos sobre la muerte o regresión deltejido interdigital (Mendelsohn et al., 1994). Solotiene efectos la disrupción génica de RARβ encombinación con la mutación de otros receptores,RARγ, y la combinación de ARα y RARγ (Kastner etal., 1997). Sin embargo queda aún mucho porexplorar sobre el papel de los receptores y losgenes blanco, en la regulación de la muerteinducida por el AR.

Requerimiento del ectodermo para el control dela muerte celular.

Se ha propuesto que el tejido ectodérmicoproduce factores difundibles que inhiben lacondrogénesis (Solursh, 1984). Cuando seremueve el ectodermo de los espaciosinterdigitales en ciertas etapas del desarrollo delas extremidades en pollo, se generan formacionesectópicas de cartílago o dígitos extras en losespacios interdigitales, aunque de tamaño muyreducido (Hurle, et al ., 1989). En lasextremidades de ratón de etapas del desarrolloequivalentes, hemos observado un efecto similar(datos no mostrados, generados por nosotros). Seha determinado que en parte el efecto en elinterdígito se debe a la disminución en apoptosisde este tejido (Hurle y Gañán, 1986). Sinembargo, si la remoción del ectodermo se realizaen etapas del desarrollo posteriores, cuandocomienza de manera notoria la muerte celularinterdigital, no se llega a formar estascondensaciones (Hurle et al., 1989). Lo anteriorsugiere que el ectodermo en etapas críticas deldesarrollo interviene en dirigir la regresión deltejido interdigital; proponemos que este procesoes mediado porque en la parte del ectodermocorrespondiente a la CEA se lleva a cabo laprimera etapa de la biosíntesis del AR, laconversión del retinol al retinal. Sería muyinteresante verificar esta posibilidad de lasiguiente manera. Si la ADH responsable de laconversión del retinol a retinal se encuentra en laregión correspondiente a la CEA que se remueve,entonces al quitar la CEA, si el efecto del retinolañadido al cultivo es específico, no debería elretinol de incrementar la muerte en lasextremidades en cultivo, y se observaría la

formación de condensaciones de cartílagointerdigital. Por el contrario sus derivados como elretinal y el AR deberían provocar la regresión delinterdígito y evitar la formación de cartílagointerdigital. Solo si el epitelio aporta factores oseñales adicionales estrictamente indispensablespara que se lleve a cabo la muerte, seguiríanformándose las condensaciones de cartílago.

Requerimiento del ectodermo para laproliferación celular en la zona de progresión.

El epitelio correspondiente a la CEAademás de jugar un papel en la regresión delinterdígito, en etapas más tempranas tambiénparticipa en la proliferación del mesénquimasubyacente (llamado zona de progresión, Fig. 4) loque permite el crecimiento de las extremidades enel eje proximo-distal (Rowe, et al., 1982), estaproliferación es promovida por factores decrecimiento como el FGF8 y FGF4 (Crossley yMartin 1995, Mahmood et al., 1995) que seexpresan en la CEA. Diferentes FGFs puedensustituir la deficiencia de la CEA en la promocióndel crecimiento en el eje proximo-distal en lasextremidades (Niswander et al., 1993; Mahmoodet al ., 1995). Se ha observado además que losFGFs regulan también la expresión de dos genescon caja homeótica Msx-1 y Msx-2 (Robert et al.,1991; Sumoy et al., 1995; Wang y Sassoon,1995), los cuales se ha propuesto que participanen la proliferación y en procesos de regeneraciónen las extremidades del ratón (Reginelli et al.,1995). Al menos se ha comprobado que losfactores de crecimiento FGF-2 y FGF4 mantienenla expresión de Msx-1 en extremidades de ratón yde pollo en desarrollo (Watanabe e Ide, 1993;Fallon et al ., 1994; Wang y Sasson, 1995).Evidencia adicional en sistemas in vitro muestranque al provocar la sobreexpresión de Msx-1 en lalínea celular de mioblastos F3, se induce latransformación y se evita la diferenciación de estalinea celular (Song et al., 1992).

Curiosamente la expresión de los genesM s x , se ha correlacionado también con laapoptosis que ocurre en el desarrollo delrombencéfalo (Graham et al , 1993) y en losinterdígitos (Davidson, 1995). Por otro lado, elproto-oncogene c-fos , que codifica para unaproteína reguladora de la expresión génica, alsobreexpresarse en algunos tipos celularesprovoca su proliferación (Sylvester et al., 1998).Sin embargo, durante el desarrollo embrionariodel ratón, se ha reportado que su expresióncorrelaciona con regiones donde ocurre apoptosis(Smeyne et al ., 1993) aún cuando la muertecelular puede ocurrir en su ausencia (Gajate etal., 1996). Finalmente ya se mencionó que laexpresión de c-fos es alterada dependiendo delestado redox intracelular (Shibanuma et al., 1990;Cerutti et al., 1989), lo cual sugiere que suexpresión, al menos en las zonas de muerte en eldesarrollo de las extremidades, responde alestado redox de esta región, pero no participa en

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el mecanismo de control de la muerte celular. Esentonces importante a futuro, el determinar comointeraccionan estas diferentes señales para darorigen a cada una de las respuestas (proliferar omorir), dependiendo del tipo celular y sulocalización espacial y temporal; o bien seríaimportante determinar si cada una de estasseñales actúa de manera independiente,simplemente al reforzar el proceso en el queparticipan. Sin embargo, parecería que estosprocesos interactuan debido a que por lo generalcuando se inhibe la muerte celular interdigitaltambién se ha observado que se afecta elcrecimiento de los dígitos y en ocasiones seprovoca hipofalangia (Yokouchi et al., 1996; Zou yNiswander 1996; Salas-Vidal et al., 1998).

La CEA y su interacción con la zona deprogresión.

Existe una interdependencia entre losdiferentes componentes de las extremidades, si laCEA es removida, el mesodermo subyacente dejade proliferar y ya no se determinan loscomponentes distales de las extremidades (Rowe,Cairns y Fallon, 1982), sin embargo es recíprocaesta interacción, debido a que las células de laCEA mueren cuando mesodermo que normalmenteno da origen a extremidades es implantado debajode la cresta o la CEA es cultivada en ausencia demesodermo (Searls y Zwilling, 1964; Zwilling,1964).

La CEA aparece en el desarrollo de lasextremidades de ratones hasta el estadio 3, ycomienza la regresión, a partir del estadio 7 ydesaparece en su mayor parte en el estadio 8,según Wanek et al (1989), es precisamente en elestadio 9, en que comienza la muerte celular enlas regiones interdigitales. Sin embargo, esimportante hacer notar que estudios previos hansugerido que la CEA desaparece primero de losinterdígitos y permanece mayor tiempo presenteen la región correspondiente a los dígitos (Milairey Rooze, 1983). De manera adicional, se haobservado que la expresión de los genes Msx-2 y4 continúa en el mesénquima de los dedosmientras que en el interdigito ocurre la regresióndel tejido (Reginelli et al ., 1995) lo que podría enparte explicar el que sigan creciendo los dígitos.Sería interesante el verificar que los marcadoresmoleculares que participan en la promoción de laproliferación de la zona de progresión como FGF-8y FGF-4, se expresan en el remanente de la CEAque permanece en la punta de los dígitos, en lasetapas en que ocurre la regresión los interdígitos,lo que indicaría que la CEA continúa activa en lapromoción del crecimiento de la punta de losdígitos.

Otras señales involucradas en el desarrollo de laextremidades.

Otras señales que participan en eldesarrollo de las extremidades son la generadaspor los genes B m p . Los Bmp codifican para

proteínas que originalmente fueron identificadasen extractos de huesos de bovinos, los cuales soncapaces de inducir la formación de cartílagoectópico al ser implantados subcutaneamente enratas. Existen reportados al menos quinceproteínas BMP diferentes, que por la secuenciaque presentan se han clasificado como miembrosde la superfamilia de los factores de crecimientoTGF-β. Unicamente la proteína BMP-1, presentauna estructura diferente y se ha propuesto queesta proteína posiblemente participa en laactivación proteolítica de las otras BMPs (Reddi,1998).

Por lo menos BMP-2 y BMP-4 se expresandesde muy temprano en el desarrollo de lasextremidades de pollo, desde el estadio deHamburger y Hamilton (H-H) 16-17 . El BMP-4 seexpresa en todo el mesénquima como en electodermo, y posteriormente en la CEA. Enestadios más avanzados SH-H 20-24, se expresatanto en el mesénquima anterior y posterior demanera pronunciada, y en el mesénquimasubyacente a la CEA (Francis et al ., 1994).Algunas regiones de expresión de BMP-4 en estasetapas, coinciden con regiones en donde hemosobservado muerte celular en las extremidades deratón de estadios equivalentes del desarrollo,como en las regiones anterior y posterior (Fig. 10).Por su parte el BMP-2 se expresa también en laCEA (SH-H 16-17) pero en el mesénquima en laregión más posterior, y así se mantiene hasta elestadio SH-H 25. Ya en etapas más avanzadas seobservan tanto BMP-2 como BMP-4 en lasregiones interdigitales, así como en las regionesanterior y posterior del margen de la palma de laspatas, precisamente en las regiones en las queocurre la muerte celular (Francis et al., 1994).

Estos patrones de expresión soninteresantes debido a que en el desarrollo en elrombencéfalo se ha correlacionado la expresión deBMP-4 con el control de la muerte en las célulasde la cresta neural, como se mencionóanteriormente (Graham et al., 1994).

En las extremidades recientemente se haobtenido evidencia de que la muerte interdigitaltambién es mediada por los BMPs. Se hareportado que BMP-2 y BMP-4, son capaces deinteractuar con los receptores a BMPs tipo I y tipoII. El receptor tipo I forma un complejo con elligando BMP-2 o BMP-4, este se asocia al receptortipo II, el cual tiene actividad de cinasaconstitutiva, por lo que fosforila al receptor tipo I,activando su función como cinasa, iniciando así latransducción de la señal. Utilizando un receptorBMP-2/-4 tipo Ia o tipo Ib dominante negativo(dn), se encontró que estos receptores dn reducenla muerte que ocurre en la zonas "necroticas"anterior, posterior, interna e interdigitales en eldesarrollo de las extremidades en pollos(Yokouchi et al ., 1996; Zou y Niswander, 1996).Incluso la disminución de la actividad de estosreceptores, cambia la expresión de diferentesgenes, y depende del tipo de receptor utilizado.

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En el receptor dn tipo Ia encontraron que seincrementa la expresión de Bmp-4 en las célulassobrevivientes, pero no cambia la expresión deMsx-1 ni Msx-2 (Yokouchi et al., 1996). Sinembargo, en el dn Ib encontraron en las célulassobrevivientes expresión tanto de Bmp-4 como deMsx-2 (Zou y Niswander, 1996). Es importante elhecho de que en ambos trabajos encontraron quelos tratamientos con los receptores dn, truncan laformación de los elementos más distales de lasextremidades. Además en las extremidades depatos en donde la muerte celular es muy limitada(Zou y Niswander, 1996), se ha reportado que seexpresan de manera significativa los Bmp, por loque la ausencia de muerte en las extremidadesposteriores de estos organismos no se debe a laausencia de expresión de estas señales y debenresponder a la ausencia de otra señal (Laufer etal ., 1997a). Por otro lado implantes en lasregiones interdigitales con TGFβ-1 y TGFβ-2,disminuyen la proliferación y la muerte en estetejido; se induce la formación de cartílagoectópico, solo si se realiza en la etapa inmediataprevia a la muerte masiva en el interdígito enpollos (SH-H 29). En este último caso se altera laexpresión de diferentes genes; por ejemplo seinduce la expresión de uno de los marcadores decondrogénesis reportados ck-erg, y se disminuyela expresión de Msx-1, Msx-2 y Bmp-4 (Gañán etal ., 1996). Es interesante la inducción decondrogénesis promovida por TGFβs debido a quela condrogénesis in vitro, e interdigital in vivosolo puede ocurrir si existe una cantidad críticade células precursoras (Cottrill et al ., 1987;Hurle, Gañan y Macias, 1989). Por el contrario alimplantar esferas con BMP-4 se aumenta lamuerte interdigital solo en las célulasindiferenciadas, las que ya presentan unadiferenciación hacia cartílago no son afectadas. Demanera adicional los implantes con BMP-4inducen la expresión de los genes Msx-1 y Msx-2(Gañán et al., 1996).

Finalmente al implantar esferas quecontienen FGF-2 se observó que se inhibió elefecto en la inducción de condrogénesis por elTGFβ, y se inhibió el aumento en la muerteinducido por el BMP-4 (Gañán et al., 1996).

Los BMPs parecen promover la expresiónMsx-1 y Msx-2 y a su vez la muerte celular,posiblemente de manera similar a como espromovida la muerte en el desarrollo delrombencéfalo. Por su parte, los FGFs funcionancomo una señal que promueven también laexpresión de Msx-1 y Msx-2, pero en este casoesta expresión, participa en promover laproliferación celular en el mesénquima. Entoncessolo cuando se encuentra presente los FGFs seevitaría la muerte celular, por lo que estaríanfuncionando como factores de sobrevivencia. Esposible que el ectodermo distal en los dígitosmantengan actividad de CEA, y promueva laproliferación y la elongación en el eje próximo-

distal de los dígitos; como la CEA desapareceprimero en los interdígitos la ausencia de losFGFs, sería en parte la responsable de iniciar elproceso apoptótico masivo en los interdígitos.Factores adicionales, como el estrés oxidativo y lasíntesis de AR, promoverían la muerte celular, sinembargo falta estudiar a fondo como interactúanestos factores entre sí para dar como resultado lamuerte celular. Sería importante definir sifuncionan como señales independientes, quesimplemente refuerzan el proceso de muerte, obien existe una interacción entre estos factorespara que se lleve a cabo el proceso. De maneraadicional es importante recordar que hay factorespresentes exclusivamente en los dígitos, quepromueven la supervivencia de estas células,como podrían ser la actividad de bcl-2, el cual seexpresa en los dígitos precisamente cuando estaocurriendo la muerte interdigital (Novak yKorsmeyer, 1994).

ANALISIS DE IMAGENES Y LA GENERACION DEMODELOS EN EL ESTUDIO DEL DESARROLLOEMBRIONARIO DE LAS EXTREMIDADES DELRATON

Análisis de imágenes y bases de datos.El desarrollo embrionario es un proceso

altamente complejo, durante el cual ocurreninteracciones dinámicas a nivel molecular ycelular. El lograr comprender como se coordinanestas actividades, para dar lugar al organismoadulto, parece una tarea prácticamente imposiblede lograr. Sin embargo, en años recientes se hanpropuesto nuevas alternativas para integrar todala información que se genera de los proceso deldesarrollo que se estudian. Estas alternativas sebasan en el uso de herramientas computacionalesde análisis de imágenes, por medio de las cualesse pueden generar bases de datos de la estructurahistológica, de los patrones de expresión génica(de los patrones de síntesis de proteínas) y de lospatrones de diferenciación celular. Así hansurgido varios proyectos que intentan definir ladistribución de estos procesos tomando comomodelos el desarrollo embrionario en diferentesorganismos, como el ratón y la mosca de la fruta(Ringwald et al., 1994; Hartenstein et al., 1995).Estas bases de datos permitirán llevar el análisisdel desarrollo embrionario a simulaciones delproceso, más cercanas a la forma natural en queocurre el desarrollo, y no como normalmente seestudia, utilizando estadios discretos y enimágenes bidimensionales. Lo anterior quieredecir que se generarán simulaciones de losprocesos en tres dimensiones y de maneradinámica, ya que la estructura cambiaconstantemente durante el desarrollo y parece noocurrir de manera cuántica o equivalente a laexistencia de estadios discretos.

Por otro lado, es importante señalar quelos proyectos del desarrollo embrionariomencionados, no han considerado aún el incluir

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otros procesos, que aún cuando aumentarán elnivel de complejidad del análisis, llevarán a quelos modelos del desarrollo propuestos, sean máscercanos a la realidad. Así se han dejado a unlado los patrones de eventos celulares como lamigración, la proliferación y la muerte celular, asícomo la caracterización de las vías metabólicas yestados fisiológicos que se presentan endiferentes tejidos. Los primeros procesos(migración, proliferación y muerte) sonrelativamente más fáciles de caracterizar, debido aque existen herramientas experimentalesconvencionales para su análisis. Sin embargo,para definir los estados metabólicos y fisiológicosque ocurren en los diferentes linajes celulares, serequiere hacer un análisis muchos más complejo,que simples patrones de expresión de genesaislados; se requieren caracterizar cadenasmetabólicas, y cómo se integran éstas durante eldesarrollo embrionario. Por otro lado, seríaimportante definir los estados fisiológicosdiferentes que potencialmente se puedenencontrar en diferentes tipos celulares, unejemplo importante es el estado redox intracelular.Estas definiciones y las herramientasexperimentales quedan como propuestas aexplorar en el futuro.

Modelos del desarrollo de las extremidades envertebrados.

A continuación se presentará un resumendel desarrollo de las extremidades del ratón, en elcual se incluye la información obtenida a partir dela revisión bibliográfica así como los resultadosgenerados en la presente tesis. A partir de estainformación, surgió la idea de realizar un mapa dela distribución de la muerte celular durante eldesarrollo embrionario, el cual ayudará a iniciarun proceso de integración de la información quese tiene del desarrollo a diferentes niveles. Sepropone además, iniciar este mapa de muerteutilizando como modelo de estudio el desarrollo delas extremidades del ratón. La primeradescripción del proyecto formal se presenta en laPublicación 2 que se anexa al final de la tesis.Esta información nos permite sugerir algunosmodelos de como se lleva a cabo el desarrollo delas extremidades y como se controlan algunosprocesos implicados.

Esta información se integrará no solo paraseñalar lo que se conoce, sino para proponerestrategias experimentales a seguir en trabajosfuturos del proceso del desarrollo embrionario delas extremidades del ratón.

Inicio de la formación de las extremidades.Como se mencionó en la introducción, las

extremidades en el embrión de ratón se forman apartir protuberancias que se proyectan de loscostados de la pared lateral del cuerpo, ycons i s t en bás i camente de cé lu lasmesenquimáticas envueltas por una capa deectodermo (Tickle y Eichele 1994).

Es interesante el hecho de que laprotrución inicial de la extremidad en formación,no se debe a un incremento en la proliferacióncelular de estas regiones, si no a una disminuciónselectiva de la proliferación de los tejidos querodean a las futuras extremidades (Searls yJanners, 1971), este mecanismo posiblementeparticipa también en el proceso más tardío de ladefinición de las regiones que dan origen a losdígitos e interdígitos. Nosotros observamos queparte de la separación de los dedos en el ejeproximo-distal, se debe a un crecimiento en losdígitos (Fig. 11 y 14), y solo aproximadamente lamitad de la separación se debe a la muerte queocurre en el interdígito (Fig. 13 y 14). Estemecanismo parece ser similar en el eje dorso-ventral (Fig. 17). Los resultados se resumen en losmodelos presentados en la figura 28. Esinteresante el hecho de que el crecimiento deja deocurrir en los interdígitos en el estadio 9 (vercontornos Fig. 14), precisamente cuando comienzala muerte en el margen más distal (se veclaramente en la Fig. 13). En cambio en los dígitosel crecimiento continúa ocurriendo hasta elestadio 12 (Fig. 11 a 14). Mori y colaboradores(1995) reportaron que las células de losinterdígitos, dejan de proliferar previo a laaparición de muerte intensa, utilizando la técnicade marcaje con 5-bromodesoxiuridina, y que enlos dígitos continúan la proliferación celular, loque permite su crecimiento en tamaño. Es muyinteresante el hecho de que la muerte celular en laseparación de los dígitos, solo ocurre en reptiles,aves y mamíferos (Fallon y Cameron, 1977), enanfibios no ocurre, y la formación de dedosindividualizados solo se debe a una tasa decrecimiento y proliferación diferencial entre laregión de los dígitos contra los interdígitos(Cameron y Fallon, 1977). Los resultadospresentados en las figuras 11 a 14 y 17, sugierenque un mecanismo similar opera en la formaciónde los dedos en el desarrollo de las extremidadesen mamíferos, y la muerte celular solo participa enla regresión del interdígitos de forma parcial.Queda entonces abierta la pregunta de por quésurgió la muerte interdigital como un mecanismoque participa en la separación de los dígitos enlos amniotas, si potencialmente puede ocurrir porcrecimiento diferencial de tejidos.

¿Quién controla los gradientes de muerte disto-proximal y dorso-ventral en el desarrollo de lasextremidades?

A pesar de la discusión presentada en elapartado anterior, es un hecho el que la muerte esaltamente controlada durante la regresión delinterdígito. Como se muestra en la figura 10 y 13,la muerte se inicia en la parte más distal de lasextremidades en el estadio 9, y se extiendeproximalmente hacia las regiones más profundasde los interdígitos (Fig. 10 y 13). Este gradiente essimilar al que se observa de estrés oxidativo, yaque al teñir con los colorantes redox sensibles

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encontramos, que se presentaron primero célulasen estrés, en las regiones más distales yposteriormente en el desarrollo se observaron enregiones más proximales (Fig. 5, artículo 1).Pensamos que posiblemente el gradiente disto-proximal puede ser establecido en parte, por laforma en que se lleva a cabo la biosíntesis delácido retinoico. Como ya se mencionó parece quela actividad de alcohol deshidrogenasa seencuentra en la región más distal del epitelio,correspondiente a la CEA (Zgombic-Knight et al.,1994), en cambio la enzima aldehídodeshidrogenasa en la región correspondiente a losinterdígitos (Niederreither et al., 1997) (vermodelo Fig. 26 y 29). Conforme a los patrones deexpresión de estas enzimas, se puede proponerque el retinol, llega a la extremidad en desarrollovía sanguínea. Ya en la extremidad se convertiríaa retinal, en la región que expresa a la alcoholdeshidrogenasa. El retinal difundiría formando ungradiente disto-proximal de esta molécula, y comoen el interdígito se expresa la aldehídodeshidrogenasa, el retinal se convertiría a ácidoretinoico en esta región, pero con un patrón engradiente debido a que su precursor, el retinal seencuentra potencialmente en gradiente (Fig. 29).El ácido retinoico induciría la muerte por víasredox dependientes o bien por otras como lainducción de la transglutaminasa. Posiblemente elAR provocaría la disminución de la transcripciónde bcl-2, lo que haría más sensibles a las célulasde los interdígitos a los inductores de muerte, obien la ausencia de Bcl-2 provocaría quedisminuyera el poder reductor en esta región.Sería interesante ver si existe además algúnmecanismo de regulación de la transcripción delos genes de enzimas antioxidantes comoperoxidasas, catalasas o SODs, y que esta fueravía AR. La presencia más prolongada de la CEA enlos dígitos y posiblemente de la expresión deFGF-8, podrían participar como factores desobrevivencia que su vez pueden participar enpromover el crecimiento de los dedos que seobserva en etapas posteriores (ver modelopresentado en la fig. 29).

Es importante el llegar a caracterizar comointeractúan estas diferentes señales y como estainformación es integrada por las células que seencuentran localizadas en las diferentes regionesde la extremidad, para provocar su proliferación,su diferenciación o su muerte. Consideramos quealgunas de las estrategias experimentalesmencionadas en la presente tesis, aunado con lapropuesta de generar una base de datos de lospatrones de muerte celular en el desarrolloembrionario mencionada en la publicación 2,podrán permitir en el futuro, llegar a tener unnivel de comprensión más profundo de losmecanismos que controlan el desarrolloembrionario no solo de las extremidades, si no deotros órganos en el embrión del ratón.

Figura 28.- Modelos donde se representa comocontribuyen la muerte y el crecimiento en laseparación de los dígitos. Los triángulosrepresentan los gradientes observados de estosprocesos (muerte, rojo; crecimiento, verde). ladirección de las flechas representan la direccióndel gradiente, y su tamaño representa laintensidad relativa. Dorsal, vista dorsal. Ventral,vista ventral. A, anterior. P, posterior.

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Figura 29.- Posible secuencia de eventos einteracciones moleculares que participan en elcontrol de la muerte celular interdigital y elcrecimiento de los dígitos.

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7. CONCLUSIONES

1.- En conjunto los datos presentados,apoyan la hipótesis de que las especies deoxígeno reactivas y el ácido retinoico, participanen la maquinaria, que de manera natural, regula elproceso de muerte celular durante el desarrolloembrionario de las extremidades de ratón. Demanera adicional parece que estas moléculasparticipan de una forma más general en controlareste proceso a lo largo del desarrollo embrionario.Queda aún por explorar como se regula susíntesis y los blancos sobre los que actúan estasmoléculas durante el proceso de muerte celular.

2.- Se encontró evidencia a favor de queen las extremidades en desarrollo existen lasrutas metabólicas necesarias para la biosíntesisde ácido retinoico y además se encontró que losretinoides endógenos participan en el control dela muerte celular interdigital.

3.- El análisis de los modelosbidimensionales y tridimensionales sugieren quedurante el desarrollo embrionario de lasextremidades en ratón, se presentan patronescomplejos de muerte celular. De manera adicionalse observó que tanto la apoptosis como elcrecimiento diferencial de tejidos participan en elproceso de individualización de los dígitos.

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C. Castaneda (Mateos, 1998):

La muerte es el mayor de los placeres, por eso se la guarda uno para el final.