UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE

QUILLABAMBA - CUSCO

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE ING. CIVIL Y CIENCIAS

BASICAS

DIRECCION DE INVESTIGACION

PROYECTO DE INVESTIGACION

COMPUESTOS BIOACTIVOS DE LA CÁSCARA DE CAFÉ POR

ESPECTROSCOPIA UV VIS, FTIR-ATR Y CROMATOGRAFIA HPLC

PRESENTADO POR:

MELQUIADES BARRAGAN CONDORI

CUSCO – PERÚ

2020

I. DATOS GENERALES DEL PROYECTO

TITULO DEL PROYECTO:

COMPUESTOS BIOACTIVOS DE LA CÁSCARA DE CAFÉ POR ESPECTROSCOPIA UV

VIS, FTIR-ATR Y CROMATOGRAFIA HPLC

EQUIPO DE TRABAJO:

RESPONSABLE:

BARRAGAN CONDORI MELQUIADES.

Departamento académico de Ing. Civil y Ciencias Básicas – EAP Industrias Alimentarias.

Universidad Nacional Intercultural de Quillabamba - Cusco

Correo : melquim100@hotmail.com

INVESTIGADORES ASOCIADOS:

RUBEN CASAFRANCA VASQUEZ

Universidad Nacional Intercultural de Quillabamba - Cusco

HILKA MARIELA CARRIÓN SÁNCHEZ

Universidad Nacional Intercultural de Quillabamba - Cusco

ELISEO PUMACALLAHUI SALCEDO

Universidad Nacional Intercultural de Quillabamba – Cusco

ABDON CAHUANA MAMANI

Universidad Nacional Intercultural de Quillabamba – Cusco

LEONCIO SOLIS QUISPE

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

MARIA DEL CARMEN DELGADO LAIME

Universidad Nacional José María Arguedas – Apurímac.

GUADALUPE CHAQUILLA QUILCA

Universidad Nacional Micaela Bastidas de Apurímac

TESISTAS: No corresponde por que la UNIQ aún no cuenta con estudiantes egresados

TIPO DE PROYECTO:

Básico - Descriptivo y explicativo

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN INSTITUCIONAL

Ciencias básicas

Tema de Investigación

Bioactivos del Café y alimentos funcionales

MONTO DE FINANCIAMIENTO

A Determinarse acorde a la modificación del proyecto

PLAZO DE EJECUCIÓN

12 meses (desde octubre del 2019 a octubre del 2022) con cargo a la compra de equipos requeridos

LOCALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

El presente trabajo de investigación se localiza y ejecutará en la UNIQ sito en la Av Arenal s/n

Quillabamba distrito Santa Ana, Provincia de la Convención Cusco – Perú.

II. RESUMEN DEL PROYECTO

El presente trabajo de investigación se desarrollará en el laboratorio de química de la

Universidad Nacional Intercultural de Quillabamba, durante los meses de noviembre del 2019 a

diciembre del 2020 con los siguientes objetivos: Evaluar el análisis fisicoquímico, en cáscaras

frescas y secas del café (Coffea arabica) Posteriormente en extractos de café se realizara la

evaluación de compuestos bioactivos mediante espectroscopia FTIR ATR, espectrofotometria

UV-Visible y cromatografia HPLC, para finalmente evaluar su capacidad antioxidante. Los

resultados que se espera con la evaluación y caracterización de estos frutos es determinar los

compuestos bioactivos que contiene los frutos de este arbusto y su capacidad antioxidante para su

posterior uso como colorantes naturales aplicados a la industria alimentaria y no alimentaria. Los

compuestos bioactivos como las antocianinas en una planta vegetal son considerados

antioxidantes que neutralizan los radicales libres ocasionados por diferentes factores en el ser

humano y también usados como tintes naturales.

III. PALABRAS CLAVE: Bioactivos, antioxidantes, radicales libres, antocianinas,

flavonoides.

IV. PROBLEMA GENERAL

Los compuestos bioactivos de la cascara del café de las variedades caturra y bourbon

(1) que son las variedades cultivadas en el distrito de Santa Ana, Provincia de la Convención -

Cusco (2), de las cuales serán determinadas sus propiedades funcionales, fitoquímicas y capacidad

antioxidante por diferentes métodos como son espectrometría UV Vis, FTIR – ATR y

Cromatografía HPLC durante el año 2019 y 2020.

Bajo este criterio en vista de que no se cuenta con mayor información de las características

fitoquímicas, funcionales bioactivas de la cascara del café es que se estudiará estos parámetros

para su posterior uso especialmente de la cascara de esta planta, que presentan colorantes muy

apreciados en productos naturales como son las antocianinas, los mismos que se usan actualmente

como alimentos funcionales por su gran capacidad antioxidante.

El objetivo de este trabajo de investigación es determinar la composición de compuestos

bioactivos de la cascara del café y de su potencial como colorante de origen natural. Las

antocianinas son pigmentos responsables de la gama de colores que abarcan desde el rojo hasta

el azul de muchas frutas, vegetales y cereales. El interés en estos pigmentos se ha intensificado

gracias a sus posibles efectos terapéuticos y benéficos, dentro de los cuales se encuentran la

reducción de la enfermedad coronaria, los efectos anticancerígenos, antitumorales,

antiinflamatoria y antidiabética; además del mejoramiento de la agudeza visual y del

comportamiento cognitivo. Las propiedades bioactivas de las antocianinas abren una nueva

perspectiva para la obtención de productos coloreados con valor agregado para el consumo

humano. (Wrolstad, 2000; Cevallos-Casals y Cisneros Zeballos, 2004), citado por (3), es por

tanto que se plantean las siguientes interrogantes:

Preguntas de investigación

PG: ¿ Cual es la composicion fisicoquimica, fitoquimica, bioactiva y capacidad antioxidante

de la cáscara del café (Coffea arabica)?

PE1: ¿Cuáles son los componentes fitoquimicos de la cáscara del café (Coffea arabica)?

PE2: ¿Cuáles son los compuestos bioactivos de la cáscara del café (Coffea arabica)?

PE3: ¿Cuáles es la capacidad antioxidante de la cáscara del café (Coffea arabica)?

V. HIPÓTESIS GENERAL

Los compuestos fitoquímicas y bioactivos determinan la capacidad antioxidante de la cáscara del

café (Coffea arabica)

VI. RESULTADOS ESPERADOS DEL FINANCIAMIENTO.

- Nro. de personas capacitadas en pasantías nacionales e internacionales.

ocho personas

- Nro. de artículos presentados en revista indizada

Un artículo

- Nro. de ponencias realizadas a nivel nacional o internacional

Una ponencia Nacional

- Nro. de publicaciones presentadas para libro de resúmenes de evento nacional o

internacional

Una ponencia

- Nro. de tesis para título profesional presentada y aprobada.

No corresponde por que la UNIQ aún no tiene egresados

- Nro. de convenios firmados

Ninguno

- Nro. de tecnologías generadas del proyecto

Implementación de Tres Métodos de análisis

- Nro. de expertos participantes en el proyecto.

Ninguno

VII. IMPACTOS ESPERADOS DEL PROYECTO

El presente trabajo de investigación tiene como objetivo supremo resolver problemas que

se tiene en el entorno de nuestra Región mediante la investigación, al cual está obligado

el docente Universitario hacia la sociedad y efectuar investigación formativa a

estudiantes de la UNIQ, y además estandarizar métodos de análisis de compuestos

bioactivos en nuestra Universidad, para aplicación de futuros trabajos de investigación en

dicha especialidad siendo nuestra Región un lugar megadiverso en productos naturales.

Además, se espera efectuar ponencias y presentar artículos en revistas indexadas para su

publicación de este trabajo de investigación y de esta manera promover la investigación

formativa en los estudiantes de la UNIQ y promover la Investigación en la Comunidad

Universitaria.

VIII. INTRODUCCIÓN

En los últimos años nos hemos adaptado a un estilo de vida inadecuado, consumiendo

alimentos con baja calidad nutricional, como comida rápida, rica en grasas, azúcares, sodio y alto

contenido de colorantes y saborizantes. Esto ha provocado en la población problemas de salud

como desnutrición, obesidad y diversas enfermedades crónicas degenerativas, entre las que se

encuentran diabetes mellitus, cáncer, enfermedades cardiovasculares, causando incluso la muerte.

Estas patologías en muchas ocasiones son causadas por procesos celulares como el estrés

oxidativo; esto ha conllevado a la búsqueda de nuevos tratamientos para combatirlas que

ciertamente han logrado éxitos terapéuticos, pero también en algunos casos efectos adversos,

generando un gran impacto económico en la población, buscando alternativas como el cambio en

el estilo de vida y el uso de algunas plantas medicinales, en cuyos principios activos contengan

antioxidantes, las cuales disminuyan y neutralicen a los radicales libres protegiendo así a las

células del daño oxidativo (4) y (5).

IX. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

El presente trabajo de investigación se enfocará en el estudio descriptivo de los componentes

Fisicoquímicos y bioactivos de la cáscara del café (Coffea arabica), que crece en gran parte

de su

extensión en Quillabamba, Provincia La Convención y Región Cusco – Perú.

De la misma manera se pretende confirmar la presencia de antocianinas en esta planta de ser

así, cuantificar y aprovechar en la industria alimentaria como pigmento natural en aditivos

como colorantes previamente aislados mediante técnicas de extracción permitida.

Además una vez identificado sus componentes fisicoquímicos será posible diagnosticar

las otras formas de uso de este arbusto de acuerdo a estos contenidos, para de esta manera

hacer una revaloración de nuestra biodiversidad regional, ampliar y preservar la flora

silvestre y preservar el medio ambiente.

Finalmente se pretende demostrar que de acuerdo a los componentes bioactivos que

presente esta planta será posible relacionar la capacidad antioxidante que presenta para

de esta manera usar como alimento funcional, de la misma como colorante natural en la

industria alimentaria o no alimentaria.

X. OBJETIVOS

GENERAL

Evaluar los compuestos bioactivos de la cáscara de café (Coffea arabica) de Quillabamba –

Cusco, por espectroscopia UV Vis, FTIR - ATR y HPLC con fines alimentarios

ESPECIFICOS

A. Determinar los componentes fisicoquímicos de la cáscara de café (Coffea arabica)

Analizar y evaluar las propiedades Fisicoquímicas de la cascara del café

Meta 1. Analisis Fisicoquímico

Cantidad 6 análisis Fisicoquímico

Cronograma en 4 meses

Indicadores: Determinación Fisicoquímica

B. Determinar los compuestos bioactivos de la cáscara de café (Coffea arabica)

Meta 2. Análisis de compuestos bioactivos

Cantidad 6 análisis de compuestos bioactivos

Cronograma en 4 meses

Indicadores: Determinación de compuestos bioactivos

C. Determinar la capacidad antioxidante de la cáscara de café (Coffea arabica)

Meta 3. Análisis de capacidad antioxidante

Cantidad 6 análisis de compuestos bioactivos

Cronograma en 4 meses

Indicadores: Determinación de capacidad antioxidante

XI. ESTADO DEL ARTE

MARCO TEORICO

11.1. Características Botánicas del café (Coffea arabica)

El café (Coffea arabica) es un arbusto de la familia de las rubiáceas nativo de Etiopía, su cultivo

tiene gran importancia económica en África y América; siendo, Costa Rica, Brasil, Vietnam y

Colombia los principales productores mundiales de café. El café alcanza los 12 metros de altura

en estado silvestre, con hojas encontradas, ovales u oblongas de color verde oscuro. Las

inflorescencias son axilares, produce una baya de color rojo brillante, que contiene dos semillas.

Los frutos de café contienen menos cafeína que otras especies cultivadas comercialmente (6) y

(7).

Figura 1: Frutos del café (Coffea arabica) Fuente:https://www.facebook.com/328867010488955/photos/a.328867210488935/3288674404

88912/?type=3&theater

Figura 2. Cáscara de café fresco (izquierdo), cáscara de café seco (derecho)

Fuente: http://infusionistas.com/del-cafe-hasta-la-cascara/

11.1.1. Clasificación científica

Clase: Equisetopsida

Sub clase: Magnoliidae

Superorden: Asteranae

Orden: Gentianales

Familia: Rubiaceae

Género: Coffea

Especie: Coffea arabica L.

11.1.2. Distribución

Café es el primer producto agrícola peruano de exportación y es el séptimo país exportador de

café a nivel mundial. No solo lidera las exportaciones agrícolas sino está dentro de los 10

principales productos de exportación, después de algunos minerales, petróleo, gas natural, harina

de pescado, entre otros. Perú posee 425,416 hectáreas dedicadas al cultivo de café las cuales

representan 6% del área agrícola nacional. El potencial de crecimiento del café en el país es

alrededor de 2 millones de hectáreas (8).

11.1.5. Pigmentos en plantas tintóreas.

Los pigmentos en plantas vegetales provienen generalmente por diferentes componentes

bioactivos que no necesariamente guarda relación entre el color de la planta y el colorante que

contiene. El hecho de que una molécula biológica este o no coloreada viene determinado por su

estructura y de acuerdo a sus afinidades estructurales y se han clasificado los colorantes orgánicos

en seis grandes grupos en la tintorería tradicional americana son cinco los grupos que interesan,

carotenoides y flavonoides (amarillos anaranjados), antocianas (azules y rojos), quinonas

(purpura escarlata) indigoides (azul y purpura). (9)

11.2. COMPUESTOS FENOLICOS

Son sustancias denominadas metabolitos secundarios de las plantas que son de gran importancia

en la dieta humana y animal por haberse encontrado en investigaciones que contrarrestan la

oxidación generada por radicales libres.

Estos compuestos fenólicos, se agrupan de acuerdo a su estructura química en tres grupos

principales: los ácidos fenólicos, los polifenoles y los flavonoides, siendo este último, el grupo

más común con más de 4000 compuestos identificados. Los flavonoides se dividen en dos grandes

grupos: antoxantinas y antocianinas que se agrupan a su vez en subclases tal como se muestra en

al siguiente figura (10), las antocianinas se componen de antocianidinas que entre las más

representativas figuran la cianidina, pelargonidina, peonidina, petunidina, malvidina, delfinidina,

etc. (11).

Figura 3. Árbol familiar de los compuestos fenólicos.

FUENTE: Adaptado de (11)

11.2.1. FLAVONOIDES

Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de

difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) ligados a través de un

anillo C de pirano (heterocíclico). Los átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 2

al 8, y los del anillo B desde el 1' al 6' (fig. 3) (11).

.

Figura 4. Estructura básica de un flavonoide.

Fuente adaptado de (11)

Las subclases de flavonoides se categorizan generalmente por la estructura del anillo C, como se

observa en la Tabla 3. La mayoría de las subclases se unen al anillo B en la posición 2 del anillo

heterocíclico, exceptuando a las isoflavonas, donde el anillo B ocupa la posición 3. Existen

muchos compuestos individuales en cada una de esas subclases que difieren en el número y la

ubicación de los grupos OH, el grado en que ellos son sustituidos y su arreglo tridimensional. La

siguiente tabla representa la estructura química de los principales tipos de flavonoides (10).

Tabla 1. Estructura de los principales tipos de flavonoides.

Fuente adaptado de (10).

i. ANTOCIANINAS

Las antocianinas son los compuestos químicos responsables de conferir los colores rojo, azul y

violeta (12)en hojas, flores y frutos, y son especialmente importantes en arándano. Estos

compuestos pertenecen a la familia de los flavonoides. Son glucósidos de antocianidinas, es decir,

que están constituidos por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une

un azúcar por medio de un enlace O-glucosídico. La estructura química básica de estas agliconas

es el ion flavilio, también llamado 2-fenil-benzopirilio, que consta de dos grupos aromáticos: un

benzopirilio (A) y un anillo fenólico (B); ambos unidos por una cadena de tres átomos de carbono

(13). Variaciones estructurales del anillo B producen las seis antocianidinas conocidas (Figura 5).

Figura 5. Estructura y sustituyentes de las antocianinas (14).

Figura 6. Estructura más común de la antocianina glucosilada.(15)

Figura 7. (a) Catión flavilio: estructura general y numeración; (b) Pelargonidina (antocianidina);

(c) Pelargonidina-3-O-glucósido (antocianina).

Figura 8. Estructura molecular de algunas antocianidinas comunes.

Fuente. http://ubuscientia.blogspot.pe/2014/01/antocianinas-los-otros-pigmentos-del.html

El color de las antocianinas depende del número y orientación de los grupos hidroxilo y metoxilo

de la molécula. Incrementos en la hidroxilación producen desplazamientos hacia tonalidades

azules mientras que incrementos en las metoxilaciones producen coloraciones rojas.

En la naturaleza, las antocianinas siempre presentan sustituciones glicosídicas en las posiciones

3 y/o 5 con mono, di o trisacáridos que incrementan su solubilidad. Dentro de los sacáridos

glicosilantes se encuentran la glucosa, galactosa, xilosa, ramnosa, arabinosa, rutinosa, soforosa,

sambubiosa y gentobiosa. Otra posible variación en la estructura es la acilación de los residuos

de azúcares de la molécula con ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos pueden ser alifáticos, tales

como: malónico, acético, málico, succínico u oxálico; o aromáticos: p-coumárico, caféico,

ferúlico, sinápico, gálico, o p-hidroxibenzóico. (16), demostraron que el tipo de sustitución

glicosídica y de acilación producen efectos en el tono de las antocianinas; es así como

sustituciones glicosídicas en la posición 5 al igual que acilaciones aromáticas, producen un

desplazamiento hacia las tonalidades púrpura (17).

11.2.3. ESTABILIDAD DE ANTOCIANINAS

A pesar de las ventajas que las antocianinas ofrecen como posibles sustitutos de los colorantes

artificiales, su incorporación a matrices alimenticias o productos farmacéuticos y cosméticos son

limitadas debido a su baja estabilidad durante el procesamiento y el almacenamiento (17), (18),

(19). Factores como su misma estructura química, pH, temperatura, presencia de oxígeno y ácido

ascórbico, concentración y actividad de agua de la matriz determinan la estabilidad del pigmento.

Efecto del pH.

El pH tiene efecto en la estructura y la estabilidad de las antocianinas. La acidez tiene un efecto

protector sobre la molécula. Las antocianinas pueden encontrarse en diferentes formas químicas

dependiendo del pH (Figura 7). A pH 1 predomina el catión flavilio que es de color rojo y es la

forma más estable de las antocianinas (Figura A), a valores de pH entre 2 y 4 ocurre la pérdida de

un protón y adición de agua, encontrándose las antocianinas preferentemente bajo la formas

quinoidales (Figura B. C y D) de color azul. A pH entre 5 y 6 se observan las especies pseudobase

carbinol, que es incolora (Figura E), y chalcona, de color amarillo (Figura F), ambas bastante

inestables. A pH superiores a 7 se produce la degradación rápida de las antocianinas por oxidación

con el aire.(20), (21).

Figura 7. Estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH. Dónde R1= H o glúcido, R2

y R3= H o metilo (20).

Efecto de la temperatura.

Incrementos de temperatura resultan en pérdida del azúcar glicosilante en la posición 3 de la

molécula y apertura de anillo con la consecuente producción de chalconas incoloras (22). Por lo

tanto las antocianinas altamente hidroxiladas son menos estables térmicamente que las metiladas,

glicosidadas o acetiladas (23). Incrementos de temperatura provocan pérdidas del azúcar

glicosilante en la posición 3 de la molécula y apertura de anillo, con la consecuente producción

de chalconas incoloras (17).

Efecto del Agua

El agua puede actuar como nucleófilo y atacar el catión flavilio en el C-2 formando la base

carbinol incolora según el mecanismo explicado anteriormente, sin embargo, esta degradación

puede variar, dependiendo de la concentración de azúcares Cuando los azúcares se encuentran a

altas concentraciones, la actividad de agua es baja, por lo que las moléculas de agua tienen

menores posibilidades de atacar el catión flavilio para formar la base carbinol. Sin embargo,

cuando los azúcares están en bajas concentraciones la actividad de agua no se ve afectada, por lo

que sus productos de degradación (hidroximetilfurfural y furfural) aceleran la degradación de las

antocianinas (24), (21), (25).

Efecto del oxígeno

Las antocianinas pueden oxidarse por reacción directa con oxígeno, o bien a través de una

oxidación indirecta en la que éstas reaccionan con compuestos que han sido previamente

oxidados, dando lugar a la formación de productos de color marrón o incoloro. También, pueden

reaccionar con radicales de oxígeno actuando como antioxidantes. Estos mecanismos de

oxidación se ven favorecidos cuando se eleva la temperatura (26).

Efecto de la luz

La luz afecta a las antocianinas de dos formas diferentes. La luz es esencial para la biosíntesis de

las antocianinas, pero también acelera la degradación de antocianinas (27). Preservan mejor su

color cuando se mantienen en la oscuridad La pérdida de antocianina más vigorosa (70%) se

observó bajo luz fluorescente con ligera temperatura elevada de almacenamiento.

11.2.4. RADICALES LIBRES.

Desde el punto de vista químico los radicales libres son todas aquellas especies químicas, cargadas

o no, que en su estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar en el orbital externo,

dándole una configuración espacial que genera gran inestabilidad, señalizado por el punto situado

a la derecha del símbolo. Poseen una estructura birradicálica, son muy reactivos, tienen una vida

media corta, por lo que actúan cercano al sitio en que se forman y son difíciles de dosificar.

Desde el punto de vista molecular son pequeñas moléculas ubicuitarias y difusibles que se

producen por diferentes mecanismos entre los que se encuentran la cadena respiratoria

mitocondrial, la cadena de transporte de electrones a nivel microsomal y en los cloroplastos, y las

reacciones de oxidación, por lo que producen daño celular (oxidativo), al interactuar con las

principales biomoléculas del organismo. No obstante lo expresado anteriormente, los radicales

libres del oxígeno tienen una función fisiológica en el organismo como la de que participan en la

fagocitosis, favorecen la síntesis de colágeno, favorecen la síntesis de prostaglandinas, activan

enzimas de la membrana celular, disminuyen la síntesis de catecolaminas por las glándulas

suprarrenales, modifican la biomembrana y favorecen la quimiotaxis. (13)

No obstante lo expresado anteriormente, los radicales libres del oxígeno tienen una función

fisiológica en el organismo como la de que participan en la fagocitosis, favorecen la síntesis de

colágeno, favorecen la síntesis de prostaglandinas, activan enzimas de la membrana celular,

disminuyen la síntesis de catecolaminas por las glándulas suprarrenales, modifican la

biomembrana y favorecen la quimiotaxis.

Existe un término que incluye a los radicales libres y a otras especies no radicálicas, pero que

pueden participar en reacciones que llevan a la elevación de los agentes prooxidantes y son las

especies reactivas del oxígeno (EROS). (28) Las principales especies reactivas del oxígeno o

sustancias prooxidantes son:

Radical hidroxilo ( HO) .

Peróxido de hidrógeno (H2O2)

Anión superóxido (O2. -)

Oxígeno singlete ( 1O 2 )

Oxígeno nítrico (NO . )

Peróxido (ROO . )

Semiquinona (Q)

Ozono ( O3 )

11.2.5. COMPUESTOS ANTIOXIDANTES.

Un antioxidante es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de un sustrato oxidable,

actuando como donador de electrones (agente reductor) Todos los seres vivos que utilizan el

oxígeno para obtener energía, liberan radicales libres, lo cual es incompatible con la vida a menos

que existan mecanismos celulares de defensa que los neutralice. A estas defensas se las denomina

Antioxidantes. Los niveles bajos de los mismos, o la inhibición de las enzimas antioxidantes

causan estrés oxidativo y pueden dañar o matar las células. Se clasifican de la siguiente manera:

Endógenos (son normalmente bio-sintetizados por el organismo)

Exógenos (a través de la dieta)

Endógenos: enzimas: catalasa, superoxido dismutasa y la glutatión peroxidasa,glutatión S-

transferasas,tioredoxina-reductasas y sulfoci-metionina-reductasas.

Exógenos: no enzimáticos, las vitaminas: vit.E y C, los betacarotenos, los flavonoides y los

licopenos, fitoestrógenos polifenoles, glutatión, ácido úrico, ubiquinol (Co-enzima Q),

melatonina. Además de las vitaminas, los oligoelementos como el cobre, el zinc, el manganeso,

el selenio y el hierro son necesarios incorporarlos al organismo a través de la dieta, porque

conforman la parte activa del núcleo de las enzimas antioxidantes.

11.2.6. ESTRÉS OXIDATIVO.

El Estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del

oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rápidamente los reactivos

intermedios o reparar el daño resultante. En términos químicos, es un gran aumento en la

reducción del potencial celular o una disminución en la capacidad reductora de los pares redox

celulares como el glutatión. Un aspecto “destructivo” del estrés oxidativo es la producción de

especies reactivas derivadas del oxígeno (ERO), incluyen los radicales libres y los peróxidos. La

fuente más importante de oxígeno reactivo en condiciones normales en organismos aeróbicos y

probablemente la pérdida de oxígeno activado de las mitocondrias durante el funcionamiento

normal de la respiración oxidativa. Ante el peligro que representa el daño oxidativo, las células

se encuentran preparadas con mecanismos de protección: los antioxidantes celulares, las enzimas:

-superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa. (29).

(30), define el estrés oxidativo como una” alteración del equilibrio prooxidante/antioxidante, a

favor del primero.” (29), mencionan que el aumento del estrés oxidativo que tiene lugar al

envejecer se acompaña de un progresivo descenso en los niveles tisulares de glutatión reducido

(necesario para la síntesis de DNA y proteínas, actividades enzimáticas, liberación de

neurotransmisores y detoxificación de compuestos carcinógenos).

El estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas. Por esta

razón la farmacología estudia de forma intensiva el uso de antioxidantes, especialmente los

flavonoides (antocianina) que demuestran su capacidad antioxidante y su significativa

contribución en la dieta, así como su efecto en la prevención de diversas enfermedades tales como:

enfermedades cardiovasculares, cancerígenas y enfermedades neurológicas (31) (32) (33).Sin

embargo, se desconoce si el estrés oxidativo es la causa o la consecuencia de tales

enfermedades. (34). Numerosos trabajos han estudiado la implicancia de las especies reactivas de

oxigeno ( ERO´s) en el desarrollo de patologías humanas, especialmente en relación a

enfermedades cardiovasculares, neurológicas, inflamatorias, cáncer y en los procesos de

envejecimiento (35) (36).

11.2.7. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.

La actividad antioxidante es la capacidad de una sustancia para inhibir la degradación oxidativa

(la peroxidación lipídica), de tal manera que un antioxidante actúa, principalmente, gracias a su

capacidad para reaccionar con radicales libres (37).

Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se basan en comprobar cómo un

agente oxidante induce daño oxidativo a un sustrato oxidable, daño que es inhibido o reducido en

presencia de un antioxidante. Esta inhibición es proporcional a la actividad antioxidante del

compuesto o la muestra. Por otra parte, hay ensayos que se basan en la cuantificación de los

productos formados tras el proceso oxidativo. Los distintos métodos difieren en el agente

oxidante, en el sustrato empleado, en la medida del punto final, en la técnica instrumental utilizada

y en las posibles interacciones de la muestra con el medio de reacción (38).

Existen varias aproximaciones para la clasificación de métodos para medir actividad antioxidante,

una de ellas se basa en clasificar los métodos como directos e indirectos. Los métodos directos

están basados en el estudio del efecto de un antioxidante sobre la degradación oxidativa de un

sistema, de los cuales los más usados han sido: proteínas, ácidos nucleicos, plasma sanguíneo,

grasas, lipoproteínas, membranas biológicas, entre otros. En los métodos indirectos se estudia la

habilidad del antioxidante para estabilizar algún radical libre, de hecho, se ha popularizado el uso

de algunos radicales libres metaestables, coloreados, con fuerte absorción en el espectro visible,

como herramienta para determinar la actividad estabilizadora de radicales libres, estos son por

ejemplo DPPH• y ABTS•+ (37). Los métodos ABTS•+ y DPPH• presentan una excelente

estabilidad durante las reacciones (39).

ANTECEDENTES

Se realizaron estudios sobre el “Contenido de fenoles, cafeína y capacidad antioxidante de granos

de café verdes y tostados de diferentes estados de México”. Los granos de café verde procedentes

de diferentes regiones presentaron un intervalo de 11,17 a 3,83 g de ácido clorogénico/100g. Esto

indicó que en el grano verde la cafeína no se encuentra disponible por la presencia de algunos

ácidos fenólicos. Los compuestos fenólicos en los granos de café disminuyeron conforme

aumentó el nivel de tostado, presentando valores de alrededor 5,79 - 2,67 en tostados ligeros y de

1,04 - 0,14 g de ácido clorogénico/100g en tostado oscuro. En cuanto a la actividad antioxidante

disminuyó conforme aumento el grado de tostado, siendo el contenido de cafeína para los granos

con tostado ligero de 0,49 – 0,37, con tostado medio de 0,66 – 0,29, tostado alto 0,70 – 0,31 y

tostado oscuro 0,52 – 0,32 g de cafeína/100 g de café respectivamente; por lo que se concluyó

que los granos de café verde mostraron una clara influencia de contenido de fenoles y cafeína,

mientras que el tostado afectó la composición química de los granos de café, aumentando el

contenido de fenoles, pero disminuyendo la actividad antioxidante (40).

Estudios de “Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales en café y subproductos del

café producido y comercializado en norte de Santander (Colombia)”, se evaluaron la capacidad

antioxidante por los métodos: 2,2’-azobis-3-etilbenzotiazolino-6-ácido sulfónico (ABTS) y

Energía Antioxidante Reductora Férrica (FRAP), así como el contenido de fenoles totales por

método Folin-Ciocalteau (FC); encontrándose 1129 y 2582 mg EAG/g café (mg de equivalentes

de ácido gálico/g de café) para las muestras tostadas y entre 52,57 y 1904 para las muestras

comerciales y sin tostar. Por lo que llegaron a concluir que todas las muestras presentaron

capacidad antioxidante y fenoles totales, incluidos los residuos del procesamiento del café tales

como el pergamino, la cáscara y la pulpa (41).

XII. METODOLOGÍA

MATERIALES Y METODOS

A continuación se describen los materiales e instalaciones necesarias para el desarrollo de esta

investigación.

12.1. UBICACIÓN. Los ensayos se realizarán en el Laboratorio de Química de la UNIQ, sito

en el Campus Universitario.

12.1.1. MATERIAL VEGETAL. Se analizaran muestras de la cáscara de café (Coffea arabica)

12.2. MATERIALES Y METODOS.

A continuación, se describen los materiales e instalaciones necesarias para el desarrollo de esta

investigación.

12.3. UBICACIÓN. Los ensayos se realizarán en el Laboratorio de Química de la UNIQ, ubicado

en El Arenal s/n ciudad de Quillabamba distrito Santa Ana Provincia La Convención – Cusco

Perú.

12.3.1. MATERIAL VEGETAL. Se analizaran muestras de la cáscara de café (Coffea arabica)

provenientes de las distintas zonas geográficas del entorno de la ciudad de Quillabamba, Cusco

Perú.

12.3.2 DESCRIPCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL. A continuación, se describe cada uno

de los materiales a utilizarse en la investigación, según características del material vegetal.

Se seleccionarán la cáscara de café (Coffea arabica) y serán trasladadas al laboratorio de Química

UNIQ, donde serán seleccionadas, lavadas y almacenados para ser caracterizadas

fisicoquímicamente, posteriormente se realizaron los análisis proximales.

12.3.3. MATERIALES DE LABORATORIO. Los equipos y materiales de laboratorio usados

para llevar a cabo el trabajo de investigación son los siguientes:

MATERIALES Y EQUIPOS.

Balanza analítica Ohaus Adventure (Parsippany, New Jersey).

Baño termostático Memmert GmbH & Co (Schwabach, Alemania).

Espectrómetro Infrarrojo de Transformada de Fourier FTIR, Thermo Scientific Nicolet

iS10 equipado con diamante ATR (Massachusetts, USA).

HPLC Analítico Agilent 1200 con inyección manual y automática, acoplado a Detector

de Masas de simple cuadrupolo, detector de arreglo de diodos y detector de índice de

refracción series (Santa Clara, California).

Micropipetas marca BOECO de volúmenes de 0,1-10 μL; 10-100 μL, 100-1000 μL

(Hamburgo, Alemania).

Refrigerador para almacenamiento de productos químicos, Whirlpool (Benton Harbor,

Michigan).

Rotaevaporador Buchi R - 215, ( Flawil, Suiza)

REACTIVOS

Los solventes de extracción, Acetona, Cloroformo, Metanol (reactivos analíticos

Fermont, distrito Federal Mexico).

Solventes para Cromatografia de Columna y ensayos antioxidante grado analítico

Metanol, etanol absoluto, Isopropanol, acetato de etilo (Sigma-Aldrich, Saint Louis,

Missouri).

Ácido gálico PARA SINTESIS, Reactivo del fenol según Folin-Ciocalteu, Metanol p.a.

ACS.ISO. Reag. Ph Eur, HIDROQUINONA PARA SINTESIS, Potasio peroxodisulfato

p.a. Sinónimo: Potasio persulfato, (Merck, Darmstadt, Alemania).

2,2-Difenil-1-picrilhidrazil DPPH, LIBRE DE RADICAL, Trolox, Ácido 2,2′-Azino-

bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) ABTS Cromoforo - sal diamonio, (Merck

millipore, Darmstadt, Alemania).

Cromatofolios Sílica Gel 20 x 20 cm (Merck, Darmstadt, Alemania). Solventes para

cromatografía grado HPLC Metanol, Isopropanol, Acetonitrilo (Sigma-Aldrich, Saint

Louis, Missouri).

Soportes cromatográficos DIAION HP-20 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japón).

12.4. ANÁLISIS PROXIMAL

Teniendo 1000 g de la cáscara de café (Coffea arabica) 200 g se congelara a -20°C para

posteriores análisis y los otros 800 g serán sometidos a los diferentes tipos de análisis como son:

el análisis proximal, antocianinas, polifenoles totales y actividad antioxidante en los laboratorios

de Química, de la UNIQ.

El análisis proximal es uno de los métodos más usados para efectuar la composición global de

nutrientes de una muestra vegetal; presentando seis de sus componentes principales tales como

son el contenido de humedad, proteína bruta, fibra cruda, cenizas, grasa y los elementos libres de

nitrógeno que son en forma indirecta el contenido total de carbohidratos que resultan de restar a

100 los porcentajes calculados para cada nutriente.

12.5. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

12.5.1. EXTRACCIÓN DE ANTOCIANINAS

La extracción del pigmento de antocianinas se desarrollara de acuerdo al método de (42), con

algunas modificaciones, con este método se usara como solvente la acetona y el cloroformo, la

acetona que extrae las antocianinas y el cloroformo además de aislar purifica parcialmente el

pigmento. Con la adición del cloroformo al extracto acetónico, provocando una separación en

dos fases, la fase superior acuosa contiene antocianinas, fenólicos, azucares, ácidos orgánicos y

otros componentes polares y la mayor fase en la parte inferior contiene solventes inmiscibles,

lípidos, carotenoides, pigmentos clorofílicos y otros compuestos no polares (43). Este método es

usado por tener la ventaja de producir un extracto sin contaminantes lipofílicos.

PROCEDIMIENTO

1. Las muestras del material vegetal serán triturados en una licuadora usando una solución

acuosa de acetona (70 % v/v) en una proporción 1:1 de (muestra: solvente).

2. El extracto obtenido se filtra a través de papel whatman usando un embudo Buchner y

una bomba de vacío a presión reducida, se efectuará una segunda re-extracción con el

mismo solvente hasta obtener una solución incolora de cada muestra.

3. Los filtrados se trasvasan a una pera de decantación, añadiéndose dos volúmenes de

cloroformo con agitaciones suaves de arriba hacia abajo varias veces, luego se dejó en

reposo durante media hora hasta que se formó dos fases bien definidas.

4. La porción acuosa (fase superior) será colectada y colocada en un rotavapor a 40°C para

efectuar concentración del pigmento a presión reducida.

5. El extracto concentrado se afora a un volumen conocido con agua destilada acidulada al

0,01%, para posteriores análisis.

12.5.2. PURIFICACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS EXTRAIDAS USANDO C – 18.

PROCEDIMIENTO. -

Se activa el cartucho C- 18 con metanol acidificado (44), haciendo pasar dos volúmenes

del mismo (10 ml).

Se retira el metanol residual haciendo pasar a través del cartucho, tres volúmenes de agua

acidulada (15 ml)

Se hace pasar 10 ml del extracto acuoso acidificado de antocianina de papas nativas

pigmentadas a través del cartucho C-18, donde la fase solida del cartucho se torna

coloreada, en el caso de que los pigmentos fueran muy coloreados se toma 5 ml del

extracto según sea al caso.

Luego se hace pasar acetato de etilo una cantidad necesaria para arrastrar las impurezas.

Se lava el cartucho con dos volúmenes de agua acidulada para remover las sustancias que

no son adsorbidas como por ejemplo azucares, ácidos orgánicos.

Luego se recolectará la muestra con metanol acidificado, en unos viales resistentes al

calor cubiertos con papel aluminio.

Se retirará el metanol en un baño isotérmico a 40 °C de 5 a 10 minutos.

Los pigmentos purificados se colocan en los viales de HPLC para ser analizados en

HPLC, el análisis será realizado en dos horas siendo conservadas las muestras en

refrigeradora a 4°C, que también son usados para determinar el perfil de antocianinas por

espectrofotometría UV-Vis y espectrómetro FTIR (43).

XIII. PRESUPUESTO

Detalle de equipos y presupuesto para la realización de la investigación propuesta.

N°

ORDEN

CANTI

DAD

DESCRIPCIÓN DE EQUIPO TOTAL

1

1

CROMATOGRAFO HPLC CON ACCESORIOS Y

EQUIPOS AUXILIARES

Comprado

2019

2

1

ESPECTROMETRO INFRAROJO FTIR ATR

RAMAN CERCANO MEDIO Y LEJANO

Comprado

2019

3 1 ESPECTROFOTOMETRO UV VISIBLE DIGITAL

Comprado

2019

4 1

ROTAEVAPORADOR VERTICAL CON MOTOR DE

VACIO 35000

5 1 CENTRIFUGA DE MESA CON ROTORES 24000

6 1 PURIFICADOR DE AGUA ULTRA PURA TIPO I 46000

7 1 BALANZA ANALITICA 0.0001 G 17000

8 1 BALANZA TECNICA O.O1 G 4000

9 1 EQUIPO DE FILTRACION CON BOMBA DE VACÍO 7000

10 3

PLANCHA CALEFACTORA CON AGITADOR

MAGNETICO 15000

11 1 CONDUCTIMETRO DE MESA 15000

12 1 HORNO MUFLA 34000

13 2 PH METRO DIGITAL DE MESA 15000

14 12

MICROPIPETAS CON ORGANIZADOR CARRRUSEL,

TIPS Y RACK 27000

15 2 TERMÓMETRO DIGITAL INFRAROJO LASER 10000

16 1 ESTUFA POR CONVECCION 30000

17 1 BAÑO ULTRASONIDO CON CALENTAMIENTO 25000

18 1 PLANCHA CALEFACTORA 15000

19 1 AGITADOR VORTEX 2500

20 1

DESTILADOR DE AGUA CON TANQUE

INCORPORADO 4 LT/H 15000

21 1 BAÑO MARÍA DIGITAL CON TAPA 17000

22 1 REFRACTOMETRO ABBE DIGITAL 49000

23 1

BALANZA PARA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD

CON IR, CAP. 100G 20000

24 1

COLORÍMETRO DIGITAL CIELAB CON

ACCESORIOS 22000

25 1 RECIRCULADOR DE REFRIGERACIÓN CHILLERS 16000

26

1

JUEGO DE TAMICES CON AGITACIÓN (JUEGO DE

MALLAS NºS. 10, 16, 35, 80, 100, 120, 170, 230, 400,

FONDO Y TAPA)

10000

27 1

MICROSCOPIO DE BARRIDO ELECTRONICO

MBE CON METALIZADOR 830000

28 1 TURBIDIMETRO - MEDIDOR DE TURBIDEZ 12000

29 1 MULTIPARÁMETRO DE MESA 32000

30 1 MULTIPARAMETRO DE CAMPO PORTATIL 24000

31 1 MOLINO PARA ALIMENTOS 34000

32 1 MOLINO ULTRACENTRIFUGO 62000

33 1 COLORIMETRO PORTATIL CON ACCESORIOS 9000

34 1 PENETROMETRO DIGITAL PARA FRUTAS 6000

TOTAL

A

determinar

XIV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Cuadro 5. Cronograma de Actividades de la investigación propuesta.

Actividad

2020 2021 - 2022

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0 N D E F M A M J J A S

Objetivo específico 1: Análisis fisicoquímico de la cascara del café

1.1 Análisis fisicoquímico de la cáscara de café (Coffea arabica)

x x x x

Objetivo especifico2: Determinación de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante de la

cascara del cafe

2.1 Evaluación de compuestos bioactivos de la cáscara de café (Coffea arabica)

x x x x

2.2

Determinación del Contenido de

Antocianinas Totales en la cáscara de café

(Coffea arabica) x x x x

2.3

Determinación del Contenido de Polifenoles

Totales en la cáscara de café (Coffea

arabica) x x x x

2.4

Determinación de capacidad antioxidante en

frutos de la cáscara de café (Coffea

arabica) x x x x

2.5 Procesamiento de datos x x x x x x x x

2.6

Elaboración y presentación del informe final

de resultados , y sustentación de proyecto de

investigacion

x x x x x x x x x x x x

XV. MATRIZ DE CONSISTENCIA

Problemas Objetivos Justificación Hipótesis Variables Indicadores Índices Método

Problema

principal

Control de

calidad de aguas

de rios de La Convencion

Problema

específico Nº1

Aguas sin evaluación

Fisicoquímica ni

microbiologica

Problema

específico Nº 2 Aguas sin

evaluación de

análisis especiales

Objetivo

general Evaluar

composición

fisicoquimica

microbiologica y analisis

especiales

Objetivo

específico

Nº 1

Evaluar composición

fisicoquímica

microbiologic

a

Objetivo

específico

Nº 2 Evaluar

análisis

especiales de metales

pesados

Tipo de Justificación.

Siendo la

cascara de café

sin estudios previos de su

caracterización

fisicoquímica, ni

determinación

de compuestos bioactivos, es

necesario

investigar

dichos compuestos

para su mejor

aplicación de en el campo

alimentario y

no alimentario

Hipótesis

general Si los frutos

de la cascara

del café

contienen compuestos

bioactivos

Hipótesis

especifica

Nº 1

La cascara de café

contienen

compuestos

bioactivos

Hipótesis

especifica

Nº 2 La cascara

de café

posee capacidad

antiox.

De la Hipótesis

específica

Nº 1 V.I.

V.D.

Indicadores de la V.I. de la H.S.*** Nº 1

a) ……………...

b) ……………...

Indicadores de la VD de

la HS Nº 1

a) ……………… b) ………………

c) .

a) …………..

b) …………..

a) …………. b) ………….

- Universo: Variedades de

la cáscara del café. - Muestra: Cáscara del

café

- Tipo de Investigación: Basico, descriptivo,

explicativo y univariable

y experimental

- Instrumentos a) Rotavapor

b) Espectrometro

FTIR

c) Espectrofotometro UV Vis

d) HPLC

De la

Hipótesis específica

Nº 2

VI.

VD.

No presenta

variables por ser un trabajo de

investigación

univariable y descriptivo

Leyenda: VI = Variable independiente. VD = Variable dependiente. He = Hipótesis específica.

XVI REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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