universidad tÉcnica de machala facultad...
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UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE INGENIERIacuteA AGRONOacuteMICA
TRABAJO DE TITULACIOacuteN
INTERACCIOacuteN DE HORMONAS VEGETALES UTILIZADAS
EN LA FASE DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO EN
EXPLANTES DE PINtildeA (Ananas comosus L) ldquoHIBRIDO MD-2rdquo
GABRIELA EUGENIA AJILA CELI
2014
ii
CERTIFICACIOacuteN
El presente trabajo de tesis de grado ha sido minuciosamente revisado autorizando a quien
corresponda para su aprobacioacuten y ejecucioacuten como requisito parcial para optar el grado de
INGENIERO AGROacuteNOMO
-------------------------------------------------
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc I
Director de la Tesis
-------------------------------------------------
Ing Agr Abrahaacuten Cervantes Aacutelava Mg Sc
Miembro del Tribunal
---------------------------------------------------
Ing Acuac Leonor Rivera Intriago Mg Sc
Miembro del Tribunal
iii
DEDICATORIA
Con todo mi amor a ti Dios por darme la vida y una maravillosa familia por ser mi a amigo
incondicional por permitir cumplir mi suentildeo tan anhelado por darme su amor y ensentildearme el
camino correcto de la vida gracias por permitir cumplir muy exitosamente una de las etapas
de mi vida
A mis amados padres Dalia y Jorge por su apoyo constante por su amor puro y sincero por
estar a mi lado en todo momento por darme una carrera para mi futuro y permitirme
formarme como persona y profesionalmente Tambieacuten quiero decirles que este trabajo con
esfuerzo y dedicacioacuten es para ustedes porque siempre creyeron en miacute gracias los amo
A mis queridos hermanos por estar siempre a mi lado inyectaacutendome fuerzas de superacioacuten en
los buenos y malos momentos
A mis amigas y amigos en especial a Ximena y Karen a mis compantildeeros de curso y al grupo
ldquoNI UN PASO ATRAacuteSrdquo gracias por su amistad y por los lindos momentos que pasamos juntos
siempre estaraacuten en mi corazoacuten los quiero
Gabriela Ajila
iv
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Teacutecnica de Machala a la Facultad de Ciencias Agropecuarias y muy en
especial a la Escuela de Ingenieriacutea Agronoacutemica por darme la oportunidad de formarme como
profesional
A la Ingeniera Anita Castillo por haber sido miacute guiacutea durante el desarrollo de mi tesis por sus
conocimientos apoyo y su capacidad para ordenar mis ideas y llegar a un feliz teacutermino
investigativo
A mi director de tesis el Ingeniero Ivaacuten Villacres y a mis miembros del tribunal de grado el
Ingeniero Abrahaacuten Cervantes y a la Ingeniera Leonor Rivera por haber creiacutedo en miacute
daacutendome las indicaciones necesarias para cumplir y culminar con eacutexito mi tesis
A mis catedraacuteticos compantildeeros y a todos quienes me apoyaron de una u otra forma
brindaacutendome consejos ensentildeanzas a lo largo de mi vida profesional
La Autora
v
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ACTA DE CESIOacuteN DE DERECHOS DE TESIS DE GRADO Y TRABAJOS DE
TITULACIOacuteN
Consigno con el presente escrito la cesioacuten de los Derechos de Tesis de grado Trabajo de
Titulacioacuten de conformidad con las siguientes clausulas
PRIMERA
Por sus propios derechos y en calidad de Director de Tesis el Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles
Mg Sc y la tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi por sus propios derechos en calidad de
Autora de tesis
SEGUNDA
La tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi realizoacute la Tesis Titulada ldquoINTERACCIOacuteN DE
HORMONAS VEGETALES EN LA FASE DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO EN
EXPLANTES DE PINtildeA (Ananas comosusL) DEL ldquoHIacuteBRIDO MD-2rdquordquo para optar por el tiacutetulo
de Ingeniero Agroacutenomo en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica
de Machala bajo direccioacuten del Docente Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc es poliacutetica de
la Universidad que la Tesis de Grado se aplique y materialice en beneficio de la colectividad
Los comparecientes Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc como Director de Tesis y la
tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi como autora de la misma por medio del presente
instrumento tienen a bien ceder en forma gratuita sus derechos de Tesis a la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala y conceden autorizacioacuten para
que la Universidad pueda utilizar esta Tesis en su favor yo de la colectividad sin reserva
alguna
APROBACIOacuteN
Las partes declaran que reconocen expresamente todo lo estipulado en la presente Cesioacuten de
Derechos
vi
Para constancia suscriben la presente Cesioacuten de Derechos en la ciudad de Machala a los 19 diacuteas
del mes de Noviembre del antildeo 2014
______________________________ _______________________________
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi
DIRECTOR DE TESIS AUTORA
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
ii
CERTIFICACIOacuteN
El presente trabajo de tesis de grado ha sido minuciosamente revisado autorizando a quien
corresponda para su aprobacioacuten y ejecucioacuten como requisito parcial para optar el grado de
INGENIERO AGROacuteNOMO
-------------------------------------------------
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc I
Director de la Tesis
-------------------------------------------------
Ing Agr Abrahaacuten Cervantes Aacutelava Mg Sc
Miembro del Tribunal
---------------------------------------------------
Ing Acuac Leonor Rivera Intriago Mg Sc
Miembro del Tribunal
iii
DEDICATORIA
Con todo mi amor a ti Dios por darme la vida y una maravillosa familia por ser mi a amigo
incondicional por permitir cumplir mi suentildeo tan anhelado por darme su amor y ensentildearme el
camino correcto de la vida gracias por permitir cumplir muy exitosamente una de las etapas
de mi vida
A mis amados padres Dalia y Jorge por su apoyo constante por su amor puro y sincero por
estar a mi lado en todo momento por darme una carrera para mi futuro y permitirme
formarme como persona y profesionalmente Tambieacuten quiero decirles que este trabajo con
esfuerzo y dedicacioacuten es para ustedes porque siempre creyeron en miacute gracias los amo
A mis queridos hermanos por estar siempre a mi lado inyectaacutendome fuerzas de superacioacuten en
los buenos y malos momentos
A mis amigas y amigos en especial a Ximena y Karen a mis compantildeeros de curso y al grupo
ldquoNI UN PASO ATRAacuteSrdquo gracias por su amistad y por los lindos momentos que pasamos juntos
siempre estaraacuten en mi corazoacuten los quiero
Gabriela Ajila
iv
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Teacutecnica de Machala a la Facultad de Ciencias Agropecuarias y muy en
especial a la Escuela de Ingenieriacutea Agronoacutemica por darme la oportunidad de formarme como
profesional
A la Ingeniera Anita Castillo por haber sido miacute guiacutea durante el desarrollo de mi tesis por sus
conocimientos apoyo y su capacidad para ordenar mis ideas y llegar a un feliz teacutermino
investigativo
A mi director de tesis el Ingeniero Ivaacuten Villacres y a mis miembros del tribunal de grado el
Ingeniero Abrahaacuten Cervantes y a la Ingeniera Leonor Rivera por haber creiacutedo en miacute
daacutendome las indicaciones necesarias para cumplir y culminar con eacutexito mi tesis
A mis catedraacuteticos compantildeeros y a todos quienes me apoyaron de una u otra forma
brindaacutendome consejos ensentildeanzas a lo largo de mi vida profesional
La Autora
v
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ACTA DE CESIOacuteN DE DERECHOS DE TESIS DE GRADO Y TRABAJOS DE
TITULACIOacuteN
Consigno con el presente escrito la cesioacuten de los Derechos de Tesis de grado Trabajo de
Titulacioacuten de conformidad con las siguientes clausulas
PRIMERA
Por sus propios derechos y en calidad de Director de Tesis el Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles
Mg Sc y la tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi por sus propios derechos en calidad de
Autora de tesis
SEGUNDA
La tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi realizoacute la Tesis Titulada ldquoINTERACCIOacuteN DE
HORMONAS VEGETALES EN LA FASE DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO EN
EXPLANTES DE PINtildeA (Ananas comosusL) DEL ldquoHIacuteBRIDO MD-2rdquordquo para optar por el tiacutetulo
de Ingeniero Agroacutenomo en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica
de Machala bajo direccioacuten del Docente Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc es poliacutetica de
la Universidad que la Tesis de Grado se aplique y materialice en beneficio de la colectividad
Los comparecientes Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc como Director de Tesis y la
tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi como autora de la misma por medio del presente
instrumento tienen a bien ceder en forma gratuita sus derechos de Tesis a la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala y conceden autorizacioacuten para
que la Universidad pueda utilizar esta Tesis en su favor yo de la colectividad sin reserva
alguna
APROBACIOacuteN
Las partes declaran que reconocen expresamente todo lo estipulado en la presente Cesioacuten de
Derechos
vi
Para constancia suscriben la presente Cesioacuten de Derechos en la ciudad de Machala a los 19 diacuteas
del mes de Noviembre del antildeo 2014
______________________________ _______________________________
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi
DIRECTOR DE TESIS AUTORA
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
iii
DEDICATORIA
Con todo mi amor a ti Dios por darme la vida y una maravillosa familia por ser mi a amigo
incondicional por permitir cumplir mi suentildeo tan anhelado por darme su amor y ensentildearme el
camino correcto de la vida gracias por permitir cumplir muy exitosamente una de las etapas
de mi vida
A mis amados padres Dalia y Jorge por su apoyo constante por su amor puro y sincero por
estar a mi lado en todo momento por darme una carrera para mi futuro y permitirme
formarme como persona y profesionalmente Tambieacuten quiero decirles que este trabajo con
esfuerzo y dedicacioacuten es para ustedes porque siempre creyeron en miacute gracias los amo
A mis queridos hermanos por estar siempre a mi lado inyectaacutendome fuerzas de superacioacuten en
los buenos y malos momentos
A mis amigas y amigos en especial a Ximena y Karen a mis compantildeeros de curso y al grupo
ldquoNI UN PASO ATRAacuteSrdquo gracias por su amistad y por los lindos momentos que pasamos juntos
siempre estaraacuten en mi corazoacuten los quiero
Gabriela Ajila
iv
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Teacutecnica de Machala a la Facultad de Ciencias Agropecuarias y muy en
especial a la Escuela de Ingenieriacutea Agronoacutemica por darme la oportunidad de formarme como
profesional
A la Ingeniera Anita Castillo por haber sido miacute guiacutea durante el desarrollo de mi tesis por sus
conocimientos apoyo y su capacidad para ordenar mis ideas y llegar a un feliz teacutermino
investigativo
A mi director de tesis el Ingeniero Ivaacuten Villacres y a mis miembros del tribunal de grado el
Ingeniero Abrahaacuten Cervantes y a la Ingeniera Leonor Rivera por haber creiacutedo en miacute
daacutendome las indicaciones necesarias para cumplir y culminar con eacutexito mi tesis
A mis catedraacuteticos compantildeeros y a todos quienes me apoyaron de una u otra forma
brindaacutendome consejos ensentildeanzas a lo largo de mi vida profesional
La Autora
v
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ACTA DE CESIOacuteN DE DERECHOS DE TESIS DE GRADO Y TRABAJOS DE
TITULACIOacuteN
Consigno con el presente escrito la cesioacuten de los Derechos de Tesis de grado Trabajo de
Titulacioacuten de conformidad con las siguientes clausulas
PRIMERA
Por sus propios derechos y en calidad de Director de Tesis el Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles
Mg Sc y la tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi por sus propios derechos en calidad de
Autora de tesis
SEGUNDA
La tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi realizoacute la Tesis Titulada ldquoINTERACCIOacuteN DE
HORMONAS VEGETALES EN LA FASE DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO EN
EXPLANTES DE PINtildeA (Ananas comosusL) DEL ldquoHIacuteBRIDO MD-2rdquordquo para optar por el tiacutetulo
de Ingeniero Agroacutenomo en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica
de Machala bajo direccioacuten del Docente Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc es poliacutetica de
la Universidad que la Tesis de Grado se aplique y materialice en beneficio de la colectividad
Los comparecientes Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc como Director de Tesis y la
tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi como autora de la misma por medio del presente
instrumento tienen a bien ceder en forma gratuita sus derechos de Tesis a la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala y conceden autorizacioacuten para
que la Universidad pueda utilizar esta Tesis en su favor yo de la colectividad sin reserva
alguna
APROBACIOacuteN
Las partes declaran que reconocen expresamente todo lo estipulado en la presente Cesioacuten de
Derechos
vi
Para constancia suscriben la presente Cesioacuten de Derechos en la ciudad de Machala a los 19 diacuteas
del mes de Noviembre del antildeo 2014
______________________________ _______________________________
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi
DIRECTOR DE TESIS AUTORA
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
iv
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Teacutecnica de Machala a la Facultad de Ciencias Agropecuarias y muy en
especial a la Escuela de Ingenieriacutea Agronoacutemica por darme la oportunidad de formarme como
profesional
A la Ingeniera Anita Castillo por haber sido miacute guiacutea durante el desarrollo de mi tesis por sus
conocimientos apoyo y su capacidad para ordenar mis ideas y llegar a un feliz teacutermino
investigativo
A mi director de tesis el Ingeniero Ivaacuten Villacres y a mis miembros del tribunal de grado el
Ingeniero Abrahaacuten Cervantes y a la Ingeniera Leonor Rivera por haber creiacutedo en miacute
daacutendome las indicaciones necesarias para cumplir y culminar con eacutexito mi tesis
A mis catedraacuteticos compantildeeros y a todos quienes me apoyaron de una u otra forma
brindaacutendome consejos ensentildeanzas a lo largo de mi vida profesional
La Autora
v
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ACTA DE CESIOacuteN DE DERECHOS DE TESIS DE GRADO Y TRABAJOS DE
TITULACIOacuteN
Consigno con el presente escrito la cesioacuten de los Derechos de Tesis de grado Trabajo de
Titulacioacuten de conformidad con las siguientes clausulas
PRIMERA
Por sus propios derechos y en calidad de Director de Tesis el Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles
Mg Sc y la tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi por sus propios derechos en calidad de
Autora de tesis
SEGUNDA
La tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi realizoacute la Tesis Titulada ldquoINTERACCIOacuteN DE
HORMONAS VEGETALES EN LA FASE DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO EN
EXPLANTES DE PINtildeA (Ananas comosusL) DEL ldquoHIacuteBRIDO MD-2rdquordquo para optar por el tiacutetulo
de Ingeniero Agroacutenomo en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica
de Machala bajo direccioacuten del Docente Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc es poliacutetica de
la Universidad que la Tesis de Grado se aplique y materialice en beneficio de la colectividad
Los comparecientes Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc como Director de Tesis y la
tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi como autora de la misma por medio del presente
instrumento tienen a bien ceder en forma gratuita sus derechos de Tesis a la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala y conceden autorizacioacuten para
que la Universidad pueda utilizar esta Tesis en su favor yo de la colectividad sin reserva
alguna
APROBACIOacuteN
Las partes declaran que reconocen expresamente todo lo estipulado en la presente Cesioacuten de
Derechos
vi
Para constancia suscriben la presente Cesioacuten de Derechos en la ciudad de Machala a los 19 diacuteas
del mes de Noviembre del antildeo 2014
______________________________ _______________________________
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi
DIRECTOR DE TESIS AUTORA
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
v
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ACTA DE CESIOacuteN DE DERECHOS DE TESIS DE GRADO Y TRABAJOS DE
TITULACIOacuteN
Consigno con el presente escrito la cesioacuten de los Derechos de Tesis de grado Trabajo de
Titulacioacuten de conformidad con las siguientes clausulas
PRIMERA
Por sus propios derechos y en calidad de Director de Tesis el Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles
Mg Sc y la tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi por sus propios derechos en calidad de
Autora de tesis
SEGUNDA
La tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi realizoacute la Tesis Titulada ldquoINTERACCIOacuteN DE
HORMONAS VEGETALES EN LA FASE DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO EN
EXPLANTES DE PINtildeA (Ananas comosusL) DEL ldquoHIacuteBRIDO MD-2rdquordquo para optar por el tiacutetulo
de Ingeniero Agroacutenomo en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica
de Machala bajo direccioacuten del Docente Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc es poliacutetica de
la Universidad que la Tesis de Grado se aplique y materialice en beneficio de la colectividad
Los comparecientes Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc como Director de Tesis y la
tesista Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi como autora de la misma por medio del presente
instrumento tienen a bien ceder en forma gratuita sus derechos de Tesis a la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala y conceden autorizacioacuten para
que la Universidad pueda utilizar esta Tesis en su favor yo de la colectividad sin reserva
alguna
APROBACIOacuteN
Las partes declaran que reconocen expresamente todo lo estipulado en la presente Cesioacuten de
Derechos
vi
Para constancia suscriben la presente Cesioacuten de Derechos en la ciudad de Machala a los 19 diacuteas
del mes de Noviembre del antildeo 2014
______________________________ _______________________________
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi
DIRECTOR DE TESIS AUTORA
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
vi
Para constancia suscriben la presente Cesioacuten de Derechos en la ciudad de Machala a los 19 diacuteas
del mes de Noviembre del antildeo 2014
______________________________ _______________________________
Ing Agr Ivaacuten Villacres Mieles Mg Sc Srta Gabriela Eugenia Ajila Celi
DIRECTOR DE TESIS AUTORA
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
vii
La responsabilidad de esta investigacioacuten resultados y
conclusiones del presente trabajo pertenecen
exclusivamente a su autor
___________________________
Ajila Celi Gabriela Eugenia
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
viii
IacuteNDICE DE CONTENIDO
TEMA PAGIacuteNA
1 INTRODUCCIOacuteN 1
Objetivos 1
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA 3
21 Cultivo De Pintildea 3
212 Caracteriacutesticas generales de la pintildea 3
213 Propagacioacuten vegetativa de la pintildea 3
22 Reguladores 4
221 Auxinas 5
222 Citocininas 5
23 Medio de cultivo 6
231 Organogenesis del cultivo 7
24 Propagacion in vitro 7
241 Micropropacacioacuten 8
242 Meacutetodos de propagacioacuten in vitro 8
243 Fases de la propagacioacuten in vitro 8
244 Explante 9
245 Factores limitantes del cultivo in vitro 9
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS 11
31 Materiales 11
311 Localizacioacuten y ubicacioacuten del ensayo 11
312 Materiales de laboratorio 11
313 Material Geneacutetico 12
314 Tratamientos 12
315 Variables a medir 12
315 Medicioacuten de las variables 13
32 Metodologiacutea 13
321 Trabajo de campo 13
322 Trabajo de laboratorio 13
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
ix
323 Disentildeo experimental 15
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 17
5 CONCLUSIONES 26
6 RESUMEN 27
7 SUMMARY 29
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA 31
APEacuteNDICE
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
x
IacuteNDICE DE CUADROS
Figura Paacutegina
1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de
establecimiento in vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido
MD-2
2 Anaacutelisis de Varianza
3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA
y BAP
4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por
tratamiento Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios
foliares en explantes de pintildea hibrido MD-2
6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
7 Porcentaje de contaminacioacuten
8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
10 Nuacutemero de primordios (acumulados) en 9 fechas de evaluacioacuten
11 Anaacutelisis de varianza para la frecuencias acumuladas de primordios
de pintildea procedentes de hijos y chupones
12
16
17
18
19
21
22
23
24
35
35
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
xi
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2
Laboratorio de Biotecnologiacutea UTmach 2014
2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea
del hibrido MD-2
3 Porcentajes de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y
chupones del hibrido MD-2
4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
18
20
22
24
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
xii
IacuteNDICE DE FOTOGRAFIacuteAS
Figura Paacutegina
1 Explantes de pintildea hijos y chupones
2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+05) el mejor tratamiento
que obtuve de la investigacioacuten
6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos
tratamientos dentro del cuarto de cultivo
36
36
36
37
37
37
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
1 INTRODUCCIOacuteN
La pintildea es una fruta tropical de origen sudamericano (Brasil Argentina y Paraguay) es de
gran importancia econoacutemica se ha colocado en los primeros lugares de la produccioacuten a nivel
mundial La importancia por este cultivo es debido a su gran demanda de mercado de fruta
fresca
En Ecuador el hibrido que ha dado mejores resultados en adaptacioacuten aumentado sus
extensiones de siembra es el cultivar Gold ldquoExtra Sweetrdquo MD-2 que por sus grados Brix
aroma y color ha sido preferida por esta razoacuten se ha mantenido como la nuacutemero uno en los
mercados mundiales
La reproduccioacuten de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae) es vegetativo y la tasa de
crecimiento y multiplicacioacuten es lenta poco rentable Ademaacutes los paiacuteses productores de pintildea
comparten el problema de deficiencia de material de propagacioacuten porque para obtener
semillas se requiere de mucho tiempo y son poco resistentes al ataque de plagas y
enfermedades afectando negativamente la produccioacuten comercial del fruto
Por tal motivo la biotecnologiacutea da alternativas tanto para el abastecimiento de material de
siembra suficiente como para mejorar la calidad de los frutos Las teacutecnicas de cultivos in
vitro bajo laboratorio son importantes porque se obtienen plantas sanas libres de plagas y
enfermedades en menor tiempo Utilizando medios de Murashige y fitoreguladores que le
daraacute a la planta soporte y todos los nutrientes que esta necesite para su crecimiento
Mediante este trabajo se obtuvo una buena respuesta de la pintildea in vitro con la dosificacioacuten de
auxinas y citocininas para la obtencioacuten de primordios foliares y la adquisicioacuten de material
vegetal sano
Para este trabajo de investigacioacuten se formuloacute los siguientes objetivos
Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos fitoreguladores aacutecido indolaceacutetico
(AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y Skoog (MS) soacutelido para
la fase de iniciacioacuten
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
2
Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del Hiacutebrido MD-2
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
3
2 REVISIOacuteN DE LITERATURA
21 CULTIVO DE PINtildeA
212 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PINtildeA
Cientiacuteficamente la pintildea es conocida como Ananas comosus (L) Merr pertenece a la familia
Bromeliaceae al geacutenero Ananas Todas las Bromeliaceas son originarias de Ameacuterica y maacutes
exactamente de Ameacuterica del Sur (Wesley 1983)
La pintildea solo se propaga por viacutea vegetativa para lo cual se dispone de tres clases de materiales
de siembra la corona de hojas que hay encima del fruto que rara vez se usa los bulbillos que
brotan en la mayoriacutea de los cultivares en la base de la fruta y que forman plantas que
fructifican entre 18 y 22 meses y los brotes basales que nacen en las axilas de las hojas que
fructifican entre 15 y 18 meses (Leoacuten 2000)
Las variedades de pintildea (Ananas) producidas en Ecuador para la exportacioacuten son las
siguientes
La Cayena Lisa maacutes conocida como Champaca o Hawaiana utilizada mayormente en
la agroindustria
La Golden Sweet o tambieacuten conocida como MD2 la cual se caracteriza por su sabor
dulce tamantildeo y aroma Esta variedad es la maacutes exportada en Ecuador
La fruta se caracteriza por el color dorado de la caacutescara sabor extra dulce alto contenido de
vitamina C sabor tropical exoacutetico y bajo nivel de acidez (PROEC 2011)
213 PROPAGACIOacuteN VEGETATIVA
2131 GENERALIDADES
La reproduccioacuten asexual o vegetativa implica que la descendencia sea ideacutentica a su uacutenico
progenitor En las plantas hay una amplia variedad de tipos de reproduccioacuten asexual desde el
desarrollo de una ovoceacutelula no fecundada hasta las divisiones del organismo original en
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
4
varias partes separadas En todos estos casos sin embrago las nuevas plantas son el producto
de las mitosis y por lo tanto son geneacuteticamente ideacutenticas a su padre La reproduccioacuten
vegetativa representa una alternativa (Peter H et al1992)
La multiplicacioacuten vegetativa tiene 3 variantes
Multiplicacioacuten por partes vegetativas (estacas rizomas bulbos etc)
Multiplicacioacuten por injertos donde una parte de la planta se une a otra abierta
resistente o de excelentes propiedades geneacuteticas
Multiplicacioacuten in vitro se utiliza pequentildeos tejidos u oacuterganos de una planta que son
sembrados en condiciones vigiladas en el laboratorio (Rojas et al 2004)
2132 VENTAJAS
Con la propagacioacuten vegetativa se pretende
1 Valorar geneacuteticamente el material botaacutenico interaccioacuten genotipo ambiente
manifestaciones joacutevenes y maduras de similares cualidades
2 Salvar genotipos y complejos geneacuteticos en bancos cloacutenales
3 Disminuir tiempos reproductivos para aligerar teacutecnicas de cruzamiento
4 Guardar genotipos superiores que determinan caracteriacutesticas geneacuteticas propias
(resistencia a plagas y enfermedades crecimiento produccioacuten calidad de frutos
tolerancia a condiciones extremas de humedad o sequiacutea etc) Estos rasgos se pueden
ldquoperderrdquo por el cruzamiento geneacutetico en la propagacioacuten sexual
5 Ser maacutes eficiente cuando la reproduccioacuten sexual no es el meacutetodo maacutes viable o eficaz
6 Propagar especies que sus semillas presentan problemas de germinacioacuten o de
almacenamiento o que son de ciclo reproductivo largo
7 Aprovechar las caracteriacutesticas geneacuteticas favorables de dos plantas en una sola planta
8 Manejar las diferentes fases del desarrollo de las plantas
9 Conseguir plantiacuteos uniformes o la obtencioacuten de un gran nuacutemero de individuos con
igualdad geneacutetica (Rojas et al 2004)
22 REGULADORES
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
5
Las hormonas son compuestos orgaacutenicos sintetizados por las plantas que ayudan al
crecimiento y desarrollo se encuentran en muy reducidas cantidades
En cultivos in vitro de plantas los reguladores de auxinas y citocininas son esenciales para su
desarrollo los cultivos in vitro son imposibles sin la presencia de reguladores porque no
habriacutea divisioacuten celular (Pierik 1990)
221 AUXINAS
Son usadas de una manera extensa en micro propagaciones fomentan el crecimiento del callo
de las suspensiones celulares de oacuterganos (meristemos y aacutepices) Normalizan la morfogeacutenesis
especialmente en asociacioacuten con las citocininas
La seleccioacuten de una auxina y su contraccioacuten en el medio va depender de
La clase de crecimiento o desarrollo necesario
Los niveles naturales dentro del explante del inicio de su cultivo
La capacidad de los tejidos de sintetizar auxina naturalmente
La interaccioacuten entre auxinas sinteacuteticas (aplicadas) y las auxinas naturales endoacutegenas
(IICA 1987)
Las auxinas se han usado comercialmente en agricultura y horticultura desde hace maacutes de 50
antildeos Los primeros usos comerciales fueron la prevencioacuten de la caiacuteda de frutos y hojas la
estimulacioacuten de la floracioacuten la induccioacuten de frutos parternocaacuterpicos el engorde de la fruta y
el enraizamiento de esquejes para la propagacioacuten de la planta (Taiacutez y Seieger 2006)
Pierik (1990) menciona que las auxinas AIA IBA o 24-D son repetidamente usados en los
medios alimenticios del cultivo el AIA se crea de forma natural en las plantas y se antildeade en
concentraciones de 001-10 mglminus1
El mismo autor comenta que las auxinas generan elongacioacuten celular y expansioacuten de los
tejidos divisioacuten celular formacioacuten de raiacuteces adventicias inhibicioacuten de la creacioacuten de vaacutestagos
axilares y adventicios y repetidamente embriogeacutenesis en los cultivos en suspensioacuten
222 CITOCININAS
Las citocinas son hormonas vegetales naturales que estimulan la divisioacuten celular en tejidos no
meristemaacuteticos Inicialmente fueron llamadas quininas sin embargo debido al uso anterior
del nombre para un grupo de compuestos de la fisiologiacutea animal se adaptoacute el termino
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
6
citoquina Son elaborados en zonas de crecimiento como los meristemas en la punta de las
raiacuteces (Infojardin 2008)
Sustancia que en presencia de una concentracioacuten oacuteptima de auxina induce divisioacuten celular en
cultivos in vitro de meacutedula de tabaco (Saborio 2013)
Las citocinas maacutes utilizadas y comunes son kinetina BA 2iP y BAP las cuales estimulan
crecimiento y desarrollo cuando van acompantildeadas por auxinas generan divisioacuten celular
Tambieacuten las citocininas impulsan la formacioacuten de vaacutestagos axilares disminuyen la
dominancia apical y retardan el envejecimiento (Pierik 1990)
23 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es el sustrato donde se va a poner al explante clasificado se compone de
una combinacioacuten de sales minerales vitaminas reguladores de crecimiento azuacutecar agua y
agar Su estructura depende de la especie vegetal con la que se trabaje edad de la planta edad
del oacutergano o tejido tipo de oacutergano o tejido que se cultiva y de la etapa del proceso de
micropropagacioacuten
Las funciones principales del medio es proporcionar soporte fiacutesico y todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo del explante (Lucero 2013)
El medio de cultivo estaacute compuesto por macroelemento microelementos azuacutecar agar y
hormonas de crecimiento La foacutermula a utilizarse es el medio de Murashige y Skoog
El medio de Murashige y Skoog es el que maacutes se utiliza por tener un alto contenido de
nitroacutegeno (60 meql aproximadamente) y por tener un concentracioacuten muy elevada de potasio
(Margara 1988)
Componentes del medio
Agua se debe utilizar agua bydestilada el medio estaacute constituido por el 95 de agua
no usar agua corriente
Agar es un derivado de algas marinas y se usa como agente gelificante es un
polisacaacuterido con elevada masa molecular Es muy importante porque retiene el agua y
le da firmeza a las plantas
Azuacutecar es empleada como fuente de carbono se usa en concentraciones de 1-5 de
sacarosa este azuacutecar se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
7
Nutricioacuten mineral es el grupo maacutes importante de las sustancias nutritivas en el cultivo
in vitro estaacute constituida por macro y micro elementos
Vitaminas una o varias vitaminas se usan en algunas ocasiones como la tiamina y el
mio inositol (Pierik 1990)
231 ORGANOGENESIS DEL CULTIVO
Lucero (2013) menciona que la organogeacutenesis estaacute siendo amenazado por los siguientes
factores luz temperatura humedad relativa y pH
El mismo autor dice que la luz en los cultivos in vitro es proporcionada por laacutemparas
fluorescentes que dan entre 1000 y 4000 lux de iluminacioacuten Margara (1988) aclara que la
organogeacutenesis (rizogeacutenesis caulogeacutenesis) se observa con iluminaciones bajas o deacutebiles y que
algunas especies necesitan de mucha luz para la formacioacuten de yemas y otras solo necesitan
oscuridad
Pierik (1990) explica que para los cultivos in vitro generalmente se seleccionan de 14 a 16
horas la duracioacuten del diacutea y que algunos tambieacuten usan la luz continua
Margara (1988) indica que en la mayoriacutea de caacutemaras de cultivo la temperatura es constante
permanecieacutendose entre 22 y 25degC dependiendo de la especie a cultivarse Los controles de
temperatura se realizan con sistemas de aires acondicionados controles y alarmas (Roca y
Mroginski 1991)
La humedad relativa dentro del cuarto de crecimiento debe ser de 70 a 80 (Toro 2004) una
elevada humedad en la caacutemara produce una cantidad muy alta de infecciones (Pierik 1990)
El pH juega un papel muy importante dentro del desarrollo y crecimiento de los cultivos in
vitro por esta razoacuten es recomendable utilizar pH entre 55 y 58 pH bajos provocan
inconsistencia del AIA etc (Toro 2004)
24 PROPAGACION IN VITRO
Se basa en aislar una porcioacuten de la planta a la cual se le llamaraacute explante o propaacutegulo y
proporcionarle artificialmente en un laboratorio en condiciones fiacutesicas y quiacutemicas que
requiera para que las ceacutelulas expresen su potencial exclusivo Para ello se requiere ante todo
de procedimientos de asepsia para mantenerlos libres de contaminacioacuten microbiana
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
8
Los principios en los que se fundamenta la aplicabilidad de la teacutecnica son el de
totipotencialidad y regulacioacuten hormonal que explican con mayor fundamento los modelos
bioloacutegicos de morfogeacutenesis in vitro (Rojas et al 2004)
241 MICROPROPACACIOacuteN
La micropropagacioacuten o propagacioacuten clonal es una de los manejos maacutes generalizadas del
cultivo in vitro a traveacutes del cual un fragmento (explante) de una planta madre produce una
descendencia uniforme con plantas geneacuteticamente ideacutenticas denominadas clones (Lucero
2013)
242 MEacuteTODOS DE PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Existen distintos meacutetodos de propagacioacuten vegetativa in vitro entre eacutestos se incluyen
Esquejes de segmentos nodales ramas axilares generacioacuten de oacuterganos adventicios (raiacuteces o
vaacutestagos) sobre explantes formacioacuten de embriones somaacuteticos sobre callo y regeneracioacuten de
plantas a partir de suspensiones celulares y protoplastos
En los oacuterganos adventicios se comprenden dos procesos
Organogeacutenesis directa en la que del explante se originan directamente brotes o raiacuteces y
Organogeacutenesis indirecta en la que hay formacioacuten de callo a partir del explante y de este
tejido calloso se originan los brotes y raiacuteces (Lucero 2013)
La multiplicacioacuten in vitro es un meacutetodo de propagacioacuten raacutepida que accede obtener muchas
plantas libres de enfermedades en poco tiempo Consta de cinco fases
243 FASES DE LA PROPAGACIOacuteN IN VITRO
Fase 0 Mantenimiento de la planta madre en condiciones sanitarias eficientes con nutrientes
oacuteptimos y adecuado riego para que el crecimiento sea fuerte y libre de enfermedades
Fase 1 En la fase de iniciacioacuten se hace el aislamiento esteacuteril de los explantes descartando los
contaminantes externos hongos y bacterias que se encuentran en el ambiente De tal forma se
puede realizar y establecer el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro sin contaminacioacuten
Fase 2 Es en donde se efectuacutea la multiplicacioacuten y la meta es la propagacioacuten masiva
manteniendo la geneacutetica de su progenitor
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
9
Fase 3 Enraizamiento de las vitro plantas obtenidas de la fase de multiplicacioacuten para
posteriormente ser sembradas al suelo
Fase 4 Es el traslado de las vitro plantas para su respectiva aclimatacioacuten en el suelo en
condiciones naturales bajo invernadero (Ruiz 2000)
244 EXPLANTE
Es el tejido oacutergano o embrioacuten que se va a cultivar para adquirir una planta semejante a la
planta madre Dependeraacute de la especie y del sitio de la planta puede provenir de raiacuteces hojas
meristemos vegetativos o reproductivos semillas tallos aacutepices o yemas laterales
inflorescencias joacutevenes tejido ovular o embriones anteras o granos de polen etc
En la mayoriacutea los meristemos apicales florales o las yemas apicales son los maacutes usados como
material vegetal de origen Se debe persistir que al ser un meacutetodo de clonacioacuten la planta
madre debe reunir caracteriacutesticas deseables y sobresalientes (produccioacuten calidad tolerancia a
plagas o ambientes extremos etc (Rojas et al 2004)
Pierik (1990) dice que para el establecimiento del cultivo in vitro se debe tomar en cuenta los
siguientes factores
Genotipo
Edad de la planta
Edad del oacutergano o tejido
Estado fisioloacutegico
Estado sanitario
Efecto del tiempo atmosfeacuterico
Condiciones de crecimiento
Posicioacuten del explante dentro de la planta
Tamantildeo del explante
Meacutetodo de inoculacioacuten
Efecto nodriza
Preparacioacuten
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
10
245 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVOS IN VITRO
Fenolizacioacuten- La fenolizacioacuten es producida por accioacuten de enzimas oxidasas que contienen
cobre como las polifenoloxidasas y las tirosinasas esto sucede cuando lesionamos los
tejidos proporcionando como resultado final compuestos quinoacutenicos muy toacutexicos para los
explantes (Toro 2004)
Contaminacioacuten- La contaminacioacuten se presenta de forma exoacutegena por una mala
esterilizacioacuten del material vegetal y tambieacuten de manera endoacutegena cuando hay contaminantes
sisteacutemicas muy difiacuteciles de eliminar Los contaminadores provienen del explante el medio el
aire y de la persona que realiza la investigacioacuten por no haber tomado todas las precauciones
necesarias
Contaminacioacuten exoacutegena- Es cuando el explante lleva la contaminacioacuten en la
superficie y para eliminar se necesita un protocolo de desinfeccioacuten habitualmente se
usa soluciones de hipoclorito de sodio en diferentes concentraciones de 1 al 3
Tambieacuten se puede se puede utilizar desinfectantes tales como el yodo fungicidas y
otros bactericidas quiacutemicos
Contaminacioacuten endoacutegena- Pasa cuando la infeccioacuten estaacute dentro del tejido y es muy
difiacutecil de descartar para eso se debe usar fungistaacuteticos y bacteriostaacuteticos en el medio
asimismo se aplica gentamicina penicilina y sulfato de estreptomicina de 10 mg a 50
mgl (Salgado 2007)
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
11
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
31 MATERIALES
311 LOCALIZACIOacuteN Y UBICACIOacuteN DEL ENSAYO
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes
ubicada en el Kiloacutemetro 6 viacutea Machala-Pasaje de El Oro Ecuador regioacuten 7
Con las siguientes coordenadas
Latitud 03deg 17acute16acuteacuteS 0622056 UTM
Longitud 79deg57acute05acuteacuteW 9636531 UTM
Altitud 6 msnm
312 MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave destilador de agua balanza de precisioacuten caacutemara de flujo pehachiacutemetro frascos de
vidrio de 250 ml botellas de vidrio vasos tequileros bisturiacute pinzas probeta pipetas
(graduadas y volumeacutetrica) embudos vasos de precipitacioacuten erlenmeyer balones (aforados)
varilla agitadora pisetas mechero atomizador y tijeras
Reactivos usados en el ensayo Cloruro de calcio Fosfato monobaacutesico de potasio Nitrato de
potasio Nitrato de amonio Sulfato de magnesio Aacutecido boacuterico Cloruro de cobalto Sulfato de
cobre Yoduro de potasio Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Sulfato de zinc Sulfato
de hierro Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
Insumos utilizados explantes de pintildea benlate cisteiacutena machete guantes mascarillas
mandil papel reciclado papel aluminio parafilm fundas plaacutesticas etiquetas cinta masking
piola de algodoacuten papel toalla marcadores jaboacuten liacutequido antibacterial cloro alcohol
detergente agua destilada y amarre de caramelos
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
12
313 MATERIAL GENEacuteTICO
El material geneacutetico de pintildea (Ananas comosus) fue recolectado en la hacienda ldquoLA COCHArdquo
ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde en la provincia de Santo Domingo de los
Tsaacutechilas
Para esta investigacioacuten se utilizaron los retontildeos de la planta de pintildea del hibrido MD-2 Hijos y
chupones
314 TRATAMIENTOS
Cuadro 1 Concentraciones de auxinas y citocininas utilizadas en la fase de establecimiento in
vitro de pintildea (Ananas comosus) del hiacutebrido MD-2
Tratamientos Explantes
AIA
(Auxinas)
mgl
BAP
( Citocininas)
mgl
Medio de
cultivo
T1 (Testigo) Hijo 0 0
MEDIO
SOLIDO
T2 Hijo 05 05
T3 Hijo 10 10
T4 Hijo 05 10
T5 Hijo 10 05
T6 (Testigo) Chupoacuten 0 0
T7 Chupoacuten 05 o5
T8 Chupoacuten 10 10
T9 Chupoacuten 05 10
T10 Chupoacuten 10 05
315 VARIABLES A MEDIR
Numero de primordios foliares a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizaraacute a los 5 10 15 20 25 30
35 40 45 50 55 60 diacuteas
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes se realizara a los 60 diacuteas
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
13
315 MEDICIOacuteN DE LAS VARIABLES
Nuacutemero de primordios foliares se contoacute a los 7 14 21 28 35 42 49 56 63 diacuteas La
evaluacioacuten se realizoacute cada 7 diacuteas de forma visual se contoacute el nuacutemero de primordios foliares
por tratamiento
Porcentaje de contaminacioacuten de los explantes se realizoacute a los 5 10 15 20 25 30 35 40
50 55 60 diacuteas se evaluoacute visualmente la contaminacioacuten bacteriana y la contaminacioacuten
fuacutengica del total de explantes introducidos se evaluoacute el nuacutemero de explantes contaminados
por tratamiento
Porcentaje de sobrevivencia de los explantes a los 60 diacuteas se contoacute el nuacutemero de explantes
introducidos y se sacoacute la diferencia con el nuacutemero de explantes que han sobrevivido por
tratamiento que tuvo una duracioacuten de 2 meses
32 METODOLOGIacuteA
321 TRABAJO DE CAMPO
3211 Identificacioacuten del material
El material fue recolectado de la hacienda ldquoLA COCHArdquo en la provincia de Santo Domingo
de los Tsaacutechilas se seleccionoacute los hijos y chupones de las mejores plantas de pintildea (Ananas
comosus) del hiacutebrido MD-2 que sean vigorosas y esteacuten en buen estado fitosanitario
322 TRABAJO DE LABORATORIO
3221 Preparacioacuten de los medios de cultivo
El medio empleado para la fase de establecimiento de pintildea fue el de Murashige y Skoog
antildeadido con hormonas como el AIA y BAP tambieacuten se le agrego elementos como agar
azuacutecar y tiamina con un pH ajustado a 58 dosificaacutendose a 15 ml por vaso Los medios
fueron esterilizados en autoclave a 120degC durante 20 minutos
3222 Preparacioacuten del material vegetal
Una vez traiacutedo el material vegetal se realizoacute una limpieza para cada uno de los tratamientos
(hijos y chupones) para luego ser sumergidos en dos tanques de 200 lt cada uno en el que
conteniacutea un fungicida con amplio espectro de control de enfermedades (Benlate) por 6 horas
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
14
Posteriormente fueron sacadas y se les dejo escurrir el liacutequido por 2 horas en unos pallet
luego fueron cortadas para reducir su tamantildeo a 20 cm de largo y se llevaron al laboratorio
En el Laboratorio en el aacuterea no aseacuteptica se lavoacute el material vegetal por separado los hijos y
chupones con abundante agua de la llave para eliminar los restos de tierra Se realizoacute un corte
basal para eliminar la zona de unioacuten con la planta madre y otro corte apical aproximadamente
a 6cm de la base volvieacutendose a lavar para luego eliminar de 2 a 3 hojas de la zona basal
Posteriormente el mismo seraacute lavado con una solucioacuten de agua con detergente comercial
(6gl) en continua agitacioacuten durante 20 minutos despueacutes se deben enjuagar los explantes con
abundante agua para eliminar los restos de detergente
Luego se procedioacute a deshojar la yema apical hasta que quede con tres hojas inmediatamente
se lavoacute con una solucioacuten de jaboacuten liacutequido (5ccl) auxiliaacutendome de una esponja con el objetivo
de eliminar residuos que se adhieren en las partes donde estaban insertadas las hojas El
siguiente paso fue lavar con abundante agua corriente esto se repite por 4 veces
Seguidamente se cortaron los explantes hasta reducirlos a un tamantildeo de 2x2 cm alrededor de
la yema al instante se lavaron con jaboacuten liacutequido de manos y froteacute con la ayuda de un cepillo
de dientes limpie con agua potable y puse en un recipiente limpio con agua que conteniacutea un
antioxidante (cisteiacutena 30mgl) que fueron llevados los explantes al cuarto de siembra hasta el
momento de la desinfeccioacuten dentro de la caacutemara
3223 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Dentro de la caacutemara de flujo laminar se efectuoacute otra desinfeccioacuten el cual se atomizoacute
previamente con alcohol al 70 y fenol al 2 Los explantes de hijos y chupones de pintildea se
sumergieron luego en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2 durante 20 minutos
Consecutivamente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteacuteril y colocamos en agua con
antioxidante
Inmediatamente con la ayuda de escalpelos y pinzas se procedioacute a disminuir el tamantildeo del
explante hasta obtener un cubo de 1x1 cm tomando en cuenta que nos quede medio
centiacutemetro de aacutepice y medio cm de cormo
Ulteriormente realice una uacuteltima desinfeccioacuten usando la misma concentracioacuten de hipoclorito
de sodio al 05 durante 10 minutos con 4 lavados de 5 minutos cada uno con agua destilada
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
15
esteacuteril Los explantes se mantienen en agua destilada esteacuteril con antioxidante hasta el
momento de la siembra
3224 Siembra del explante a condiciones in vitro
El meristemo una vez que fue reducido al tamantildeo deseado se colocoacute con una pinza al
explante en papel absorbente previamente esterilizado para evitar que queden residuos de
liacutequido Posteriormente se procedioacute a introducir el explante a condiciones in vitro en vasos
tequileros de 5 onzas de capacidad con 15 ml de medio de cultivo de iniciacioacuten por
tratamiento
3225 Condiciones del cultivo
Se utilizoacute un medio solido con diferentes concentraciones para cada tratamiento a una
temperatura de 25 plusmn 2degC de 70 a 80 de humedad relativa con una intensidad lumiacutenica de
1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
323 DISENtildeO EXPERIMENTAL
3231 Modelo matemaacutetico
El modelo matemaacutetico fue representado por la ecuacioacuten lineal siguiente
Yij = micro + 120591119894 +120576119894119895
Donde
Yij Representa la variable dependiente sobrevivencia etc
micro Promedio general del ensayo en cada una de las variables evaluadas
120591119894 Efecto de los tratamientos
ξij = Error experimental
3232 Anaacutelisis de la hipoacutetesis
Nula Ho
Las concentraciones oacuteptimas de los fitorreguladores no influyeron en la emisioacuten de
primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
16
Alternativa Ha
Se espera que al menos uno de los tratamientos si seraacute superior que los testigos en la
obtencioacuten de primordios foliares en la fase de iniciacioacuten in vitro y reduccioacuten significativa de
la sobrevivencia de los explantes
3233 Especificaciones del disentildeo
Unidad experimental
1
Nuacutemero de tratamientos
10
Nuacutemero de reacuteplicas
10
Nuacutemero de plantasensayo
100
3234 Anaacutelisis de varianza
Cuadro 2 Anaacutelisis de Varianza
Coacutedigo gl
Tratamientos t-1 9
Error experimental (t-1)(r-1) 81
TOTAL rt-1 99
3234 Anaacutelisis estadiacutestico
Las variables evaluadas del ensayo son expresadas en porcentajes y analizadas sin ninguna
trasformacioacuten moralizante
Las tasas de los tratamientos se analizaron mediante la teacutecnica de regresioacuten lineal y el
ANOVA de una viacutea para obtener la formacioacuten de primordios foliares
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
17
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 NUacuteMERO DE PRIMORDIOS SEGUacuteN EL TIPO DE EXPLANTE
En el cuadro 11 (ver cuadro en apeacutendice) se presenta el nuacutemero de primordios formados en el
periodo de 9 semanas de observacioacuten Los valores corresponden a una frecuencia acumulada
que permita realizar el anaacutelisis estadiacutestico en base a la tendencia de las variables en el tiempo
con los dos tipos de material Hijos y chupones
Cuadro 3 Nuacutemero de primordios formados por efecto de las hormonas AIA y BAP
TRATAMIENTOS
HORMONAS TOTAL FACTOR SIG
AIA BAP EXPLANTE PRIMORDIOS A
T1 TESTIGO HIJO 24 b
T2 05 05 HIJO 33 b
T3 10 10 HIJO 18 b 278 a
T4 05 10 HIJO 18 b
T5 10 05 HIJO 46 a
T6 TESTIGO CHUPON 18 b
T7 05 05 CHUPOacuteN 19 b 20 b
T8 10 10 CHUPOacuteN 18 b
T9 05 10 CHUPOacuteN 12 b
T10 10 05 CHUPOacuteN 33 b
DLS α= 001 GL 70 721
Seguacuten el anaacutelisis de varianza (cuadro 4) para tratamientos el cuadrado medio de tratamientos
fue significativo con el nivel de significacioacuten 120572 119889119890 001 evidenciando la composicioacuten de los
medios de cultivo en los que variaron la concentracioacuten de las hormonas AIA y BAP fueron
importantes en el proceso de la formacioacuten de los primordios foliares en los tratamientos
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
18
Cuadro 4 Anaacutelisis de varianza para el nuacutemero acumulado de primordios por tratamiento
Laboratorio Biotecnologiacutea UTmach
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 197 197 259
ERROR EXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
En el cuadro 3 y figura 1 se visualiza el nuacutemero de primordios contabilizados en la uacuteltima
evaluacioacuten correspondiendo el mayor nuacutemero de primordios con el tratamiento al T5 10 +
05 (AIA+BAP) empleando explantes de hijos con un total de 46 primordios el mismo que
fue superior que el tratamiento T10 10 + 05 (AIA+BAP)- Chupoacuten 33 primordios foliares
Con respecto a los dos tipos de explantes los procedentes de hijos sus tejidos meristemaacuteticos
respondieron con mayor eficiencia a las hormonas AIA y BAP incorporados al medio de
cultivo in vitro
Figura 1 Nuacutemero de primordios formados en explantes de pintildea hibrido MD-2 Laboratorio
de Biotecnologiacutea UTmach 2014
0
10
20
30
40
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
24
33
18 18
46
18 19 18
12
33
NU
ME
RO
DE
PR
IMO
RD
IOS
TRATAMIENTOS
TOTAL DE PRIMORDIOS FOLIARES
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
19
El establecimiento del desarrollo de pintildea involucra el rompimiento de la latencia de los
meristemos hecho que se ve favorecido con la presencia de sustancias inductoras como
auxinas y citocininas (Rodriacuteguez et al 1999) Un balance apropiado entre auxinas y
citocininas en el medio de cultivo es necesario para la formacioacuten de plantas a partir de
meristemos aacutepices y yemas
42 TENDENCIA EN LA FORMACIOacuteN DE PRIMORDIOS EN
EXPLANTES PINtildeA HIBRIDO MD-2
Cuadro 5 Estimacioacuten de los paraacutemetros de la formacioacuten de primordios foliares en explantes
de pintildea hibrido MD-2
Semanas Dias x Primordios y XY
1 7 12 84
2 14 53 742
3 21 87 1827
4 28 125 350
5 35 163 5705
6 42 19 798
7 49 201 9849
8 56 227 12712
9 63 229 14427
total 315 1287 56826
promedio 3500 1430
sumacuadrados 13965 233187
sumacuadradoscorregidos 2940 49146 11781
Indicede de regresion Bi 0400714286
Intercepto 0275
r 098008649 Rsup2 096056953
En el cuadro 5 se analiza la tendencia en el tiempo hasta los 63 diacuteas de observacioacuten a
intervalos regulares de una semana mediante el meacutetodo de Miacutenimos cuadrados que
condujeron a estimar la tasa de crecimiento de los explantes sembrados en cinco medios que
difieren en la dosis de las fito hormonas aacutecido indol aceacutetico AIA y Bencil amino purina BAP
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
20
En base a las entradas de las variables independiente X (tiempo) y la dependiente Y
(promedio de primordios) para todo el conjunto de observaciones independientemente de
los tipos de explantes y los niveles en mgl de hormonas AIA y BAP se determinoacute que el
modelo lineal se ajusta para determinar las tasas de crecimiento en condiciones de contar con
registros secuenciales de datos que no estaacuten dentro de un Disentildeo Claacutesico al azar
Figura 2 Tendencia de la emisioacuten de promordios foliares en explantes de pintildea del
hibrido MD-2
En la figura 2 se presenta la tendencia general del ensayo en la cual se encontroacute que la
formacioacuten de primordios se produce a razoacuten de 040 primordiosdia iacutendice validado por el
alto iacutendice de determinacioacuten r2 de 09605
Los protocolos de desinfeccioacuten quiacutemica aplicados por Pierik (1990) Roca y Mroginski (1991)
y utilizados en el material vegetal procedente del campo fue erraacutetica en la activacioacuten de los
meristemos de pintildea debido a un alto porcentaje de contaminacioacuten con esto se verifica lo
expresado por Pierick (1990) que un alto porcentaje de infeccioacuten se obtiene de plantas
cultivadas en el exterior
43 TASAS DE FORMACIOacuteN DE LOS PRIMORDIOS FOLIARES EN
EXPLANTES DE PINtildeA HIBRIDO MD-2
y = 04007x + 0275Rsup2 = 096O5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
PR
OM
ED
IO D
E P
RIM
OR
DIO
S
TIEMPO
TENDENCIA GENERAL DE LA
EMISION DE PRIMORDIOS
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
21
En el cuadro 6 se presenta los estimados que corresponden a las tasas de emisioacuten de
primordios ajustados a las lecturas semanales de este evento fisioloacutegico como respuesta de los
explantes la accioacuten de los medios de cultivo in vitro enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP
De acuerdo con estos resultados en todos los tratamientos los iacutendices en determinacioacuten
fueron significativos variando dentro del rango de 0894 a 0984 En este contexto los
tratamientos de los explantes de pintildea MD-2 produjeron entre 02 a 097 primordiossemana
Cuadro 6 Tasas de formacioacuten de primordios foliares en pintildea hibrido MD-2
Tratamientos
AIA - BAP Explantes A B R2
TESTIGO 1 HIJO -121 042 0947
05 + 05 HIJO 409 046 0984
10 + 10 HIJO 009 030 0961
05 + 10 HIJO 009 030 0960
10 + 05 HIJO 402 097 0971
TESTIGO 2 CHUPON -022 030 0960
05 + 05 CHUPON 084 030 0968
10 + 10 CHUPON 011 096 0963
05 + 10 CHUPON -033 020 0978
10 + 05 CHUPON 353 044 0894
Promedio 110083 043615 095852
La presencia de citoquininas es sustancial porque funcionan en interaccioacuten con las auxinas
seguacuten Rojas et al (2004) ademaacutes actuacutean en la diferenciacioacuten y divisioacuten celular comprobando
esta investigacioacuten las auxinas y citocininas originan la creacioacuten de primordios en propagacioacuten
a partir de meristemos por esta razoacuten el T5 (10 ndash 05) AIA y BAP se obtuvo un mayor
nuacutemero de primordios foliares
44 CONTAMINACIOacuteN
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
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6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
22
Cuadro 7 Porcentaje de contaminacioacuten
Tratamientos
Tiempo en
diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 5 10 15 20
Total Unidades Promedio
T1 TESTIGO HIJO 30 60 60 150 3 50
T2 05 05 HIJO 10 30 30 50 120 4 30
T3 10 10 HIJO 30 60 60 70 220 4 55
T4 05 10 HIJO 20 60 60 70 210 4 525
T5 10 05 HIJO 0 20 20 30 70 4 175
T6 TESTIGO CHUPON 30 70 100 2 50
T7 05 05 CHUPON 20 70 90 2 45
T8 10 10 CHUPON 20 60 60 70 210 4 525
T9 05 10 CHUPON 30 80 80 190 3 633
T10 10 05 CHUPON 20 50 50 120 3 40
1480 33 4485
En el cuadro 7 se presenta los porcentaje de contaminacioacuten de los explantes de hijos y
Chupones del hibrido MD-2 cultivados en medios enriquecidos con fitohormonas AIA y
BAP con dosis que variaron entre 05 y 10 mgl de medio de cultivo
Figura 3 Promedio de contaminacioacuten de los explantes de pintildea de hijos y chupones del hibrido
MD-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
50
30
55 525
175
5045
525
633
40
PR
OM
ED
IO
TRATAMIENTOS
CONTAMINACIOacuteN DE LOS
EXPLANTES DE PINtildeA
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
23
La contaminacioacuten causada por bacterias y hongos alcanzoacute los niveles maacutes altos a los 20 diacuteas
tiempo despueacutes del cual no se registroacute nuevos casos de este evento en estudio
La menor contaminacioacuten con 30 a los 20 diacuteas le correspondioacute al tratamiento T5 AIA-BAP
(10-05)-Hijo En los restantes tratamientos la contaminacioacuten alcanzo mayor nivel hasta un
80 en los tratamientos T9AIA+BAP (05-10 mgl)-chupoacuten
Los promedios de tratamiento no difirieron significativamente al haberse obtenido en el
anaacutelisis de varianza un cuadrado medio de tratamientos no significativo (cuadro 8)
Cuadro 8 Anaacutelisis de varianza para los porcentajes de contaminacioacuten
Fuentes variacioacuten gl sc cm fc Probabilidad
Tratamientos 9 598257 66473 152ns 01987
Error exprimental 23 1004166 43659
Total 32 1602423
Coeficiente de variacioacuten 4659
La existencia de hogos y bacterias en la fase 1 de iniciacioacuten fue debido a la contaminacioacuten al
manipular los explantes dentro de la caacutemara por una inapropiada esterilizacioacuten del material
vegetal aclara Toro (2004) para Roca y Mroginski (1991) el origen de la presencia de los
contaminadores son del explante el medio el aire y del investigador con esto se confirma la
causa de la infeccioacuten de los explantes
45 SOBREVIVENCIA DE LOS EXPLANTES
En el cuadro 9 se presenta las estimaciones puntuales de la sobrevivencia de los explantes de
pintildea MD-2 en el ensayo seguacuten estos resultados que contiene la informacioacuten correspondiente
al periodo de 60 diacuteas se evidencia que la mayor sobrevivencia fue del 70 con el tratamiento
T5 AIA- BAP (10-05 mgl)- Hijo mientras que en el otro extremo tenemos al tratamiento
T6- con hormonas y explante tomado de Chupoacuten
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
24
Cuadro 9 Porcentajes de sobrevivencia de explantes de pintildea md-2
Tratamientos Tiempo en diacuteas
AIA + BAP EXPLANTES 60
T1 TESTIGO HIJO
40
T2 05 05 HIJO 50
T3 10 10 HIJO 30
T4 05 10 HIJO 30
T5 10 05 HIJO 70
T6 TESTIGO CHUPON 30
T7 05 05 CHUPON 30
T8 10 10 CHUPON 30
T9 05 10 CHUPON 20
T10 10 05 CHUPON 50
El mayor promedio de explantes vivos hasta los 60 diacuteas de evaluacioacuten correspondioacute al
tratamiento T5 AIA-BAP (10-05 mgl)-Hijo con un promedio puntual de 70 el mismo
que fue superior que el resto de tratamientos en la figura 4 podemos observar claramente lo
expuesto
Figura 4 Porcentaje de sobrevivencia de explantes de pintildea DM-2
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
40
50
30 30
70
30 30 30
20
50
TRATAMIENTOS
PORCENTAJE DE SOBREVIVENCIA
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
25
El T5 con explantes de hijos se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia del 70 y el
menor fue el T9 con explantes de chupones con un 20 a partir de los 40 diacuteas se estabilizo la
sobrevivencia de los explantes de pintildea
Para obtener un alto indice de sobrevivencia se debe tomar en cuenta cada uno de los detalles
en la desinfeccioacuten de los explantes por este motivo Ruiz (2004) dice que la planta madre debe
ser cuidada en condiciones optimas sanitarias ya que de esto depende la iniciacioacuten de los
cultivos in vitro libre de plagas y enfermedades
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
26
5 CONCLUSIONES
De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de AIA
y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo
La seleccioacuten de explantes de hijos y chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la
formacioacuten de primordios foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor
de los explantes tomados de ldquohijosrdquo
La tendencia a la emisioacuten de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un
modelo lineal aun trataacutendose de una variable discreta
La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos como de
chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl)
La contaminacioacuten de los explantes en el laboratorio fueron de media a alto
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
27
6 RESUMEN
La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Teacutecnica de Machala en la granja Santa Ineacutes se
trabajoacute en la conduccioacuten del trabajo experimental relativo a la multiplicacioacuten in vitro de pintildea a
partir de Hijos y chupones empleando hormonas AIA y BAP como variable del ensayo Los
objetivos planteados fueron 1 Determinar las concentraciones oacuteptimas de dos Fito
reguladores aacutecido indo aceacutetico (AIA) y bencilaminopurina (BAP) en medio de Murashige y
Skoog (MS) soacutelido para la fase de iniciacioacuten 2 Establecer el explante oacuteptimo de pintildea del
Hiacutebrido MD-2
Se utilizoacute Autoclave y materiales propios de la teacutecnica de multiplicacioacuten in vitro entre otros
Sodio EDTA Myo-inositol Tiamina Azuacutecar Agar AIA y BAP
El material geneacutetico retontildeos del hibrido de pintildea MD-2 se obtuvo en la hacienda ldquoLA
COCHArdquo ubicada en Valle Hermoso Km 25 viacutea Quininde Los tratamientos consistieron dos
tipos de Explantes de ldquohijosrdquo y ldquochuponesrdquo dos hormonas AIA (aacutecido indol aceacutetico) BAP
(Bencil amino purina) en dosis 05 y 10 mglt de medio de propagacioacuten in vitro con 10
tratamientos 8 correspondieron a 4 arreglos de las dos hormonas y dos tipos de explantes
como testigos absolutos Las variables fueron Numero de primordios foliares- Porcentaje de
contaminacioacuten y sobrevivencia El material hijos y chupones se sumergieron por 6 horas
suspensiones de Benlate luego seccionarlos hasta 6cm de longitud Los explantes de 2x2
cm alrededor de la yema Estos se lavaron con agua maacutes antioxidante Cisteiacutena 30 mglitro
Los explantes se desinfectaron en una caacutemara de flujo laminar con alcohol y fenol
hipoclorito de sodio Los explantes finales de 1x 1 cm con aacutepice y cormo los cuales se
sembraron las unidades de propagacioacuten Se utilizoacute un medio solido con diferentes
concentraciones para cada tratamiento se ajustoacute el medio a un pH de 58 con una temperatura
de 25 plusmn 2degC con una intensidad lumiacutenica de 1000 lux y fotoperiodo de 14 plusmn 2 horas
Los tratamientos se analizaron mediante el ANOVA de una viacutea y la teacutecnica de regresioacuten lineal
para obtener estimados de la tasas de formacioacuten de primordios foliares La seleccioacuten de
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
28
explantes de hijos o chupones en cuanto se refiere al efecto sobre la formacioacuten de primordios
foliares dio diferencias en teacuterminos relativos de 39 a favor de los explantes tomados de
ldquohijosrdquo De la mezcla de las fitohormonas AIA y BAP la combinacioacuten de 10-05 mgl de
AIA y BAP fue la maacutes conveniente en las condiciones del ensayo La tendencia a la emisioacuten
de primordios crecimiento y sobrevivencia se ajustoacute a un modelo lineal aun trataacutendose de
una variable discreta La mayor sobrevivencia de los explantes tanto los procedentes de hijos
como de chupones se logroacute en el tratamiento con AIA-BAP (10-05 mgl) y la contaminacioacuten
de los explantes en el laboratorio fueron media a alto
Palabras claves in vitro explante esterilizacioacuten fitohormonas
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
29
7 SUMMARY
The research was conducted in the laboratory of Plant Biotechnology Faculty of Agricultural
Sciences at the Technical University of Machala in Santa Ines worked farm in conducting
experimental work on the in vitro propagation of pineapple from son and pacifiers using
hormones IAA and BAP as endpoint of the trial The objectives were 1 Determine the
optimal concentrations of two Indo Phyto regulators acetic acid (IAA) and benzylaminopurine
(BAP) on Murashige and Skoog (MS) solid to the initiation phase 2Establish the optimum
explant hybrid pineapple MD-2 Autoclave materials from the in vitro multiplication
technique including Sodium EDTA Myo-inositol thiamine Sugar Agar IAA and BAP
were used and The genetic material the hybrid offspring pineapple MD-2 was obtained at
the ranch COCHA located in Valle Hermoso Km 25 way Quininde Treatments consisted of
two types of explants of children and suckers two hormones IAA (indole acetic acid)
BAP (Benzyl amino purine) at doses 05 and 10 mg l of medium invitro propagation 10
treatments 8 corresponded to 4 arrangements of the two hormones and two types of explants
as absolute controls The variables were number of leaf primordia Percentage of
contamination and survival The material kids and suckers were immersed for 6 hours
Benlate suspensions then cut them up to 6 cm long Explants 2 x 2 cm around the yolk These
were washed with water more antioxidant Cysteine 30 mg liter The explants were
disinfected in a laminar flow chamber with alcohol and phenol sodium hypochlorite
Explants final 1 x 1 cm with apex and corm which units were seeded propagation A solid
medium was used with different concentrations for each treatment the medium was adjusted
to a pH of 58 with a temperature of 25 plusmn 2 deg C with a light intensity of 1000 light and
photoperiod of 14 plusmn 2 hours Treatments were analyzed by one-way ANOVA and linear
regression technique to obtain estimates of the rates of formation of leaf primordia Selection
of explants children or pacifiers as regards the effect on the formation of leaf primordia gave
differences in relative terms from 39 in favor of the explants taken from children Mixture
of IAA and BAP phyto hormones combining 10-05 mg l BAP IAA and was the most
convenient in the assay conditions The trend of emission primordia growth and survival was
adjusted to a linear model even for a discrete variable The higher survival of explants from
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
v=onepageampq=que20son20las20auxinasampf=false
LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
0publcacionampf=false
PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
EwAAv=onepageampq=como20funcionan20las20auxinasampf=false
TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
ource=gbs_ge_summary_rampcad=0v=onepageampqampf=false
34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
30
both son and pacifiers was achieved on treatment with IAA-BAP (10-05 mg l) and
contaminations of the explants in the laboratory were medium to high
Keywords in vitro explant sterilization phytohormones
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
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LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
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PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
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ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
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TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
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34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
31
8 BILIOGRAFIacuteA CITADA
INFOJARDIN 2008 Giberelinas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httpesscribdcomdoc5512655Giberelina
IICA 1987 Memoria II curso de cultivo de tejidos Catie Turrialba Costa Rica P 67- 68
Consultado el 6 de mayo del 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=DOMNAQAAIAAJamppg=PA68ampdq=que+son+la
s+auxinasamphl=esampsa=Xampei=_pJMU62UEMrE0QGzkICgAwampved=0CDQQ6AEwAQ
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LEOacuteN J 2000 Botaacutenica de los cultivos tropicales 3ra Edicioacuten Editorial IICA LME 84 San
Joseacute Costa Rica P 456
LUCERO J 2013 Establecimiento de tres medios de cultivo para la fase de enraizamiento in
vitro de anturio (anthurium andreanum) Laboratorio de Biotecnologia dela Universidad
Tecnica de Machala Machala Ecuador P 5-7
MARGARA J 1988 Multiplicacioacuten Vegetativa y Cultivo In Vitro Los Meristemos y la
Organogeacutenesis Laboratorio de Morfogeacutenesis Instut National de la Recherche
Agronomique Francia P 171-194
PETER H et al 1992 Biologiacutea de la plantas Volumen 2 Editorial Reverteacute S A Barcelona
Espantildea 570 p Consultado el 9 de abril de 2014 Disponible en
httpbooksgooglecomecbookshl=esampid=xvNd3udrh1YCampdq=REPRODUCCION+
VEGETATIVAampq=aC3B1o+de+publcacionv=onepageampq=aC3B1o20de2
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PIERIK RLM1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores Department of Horticulture
Agricultural University Wageningen The Nethelands Palermo Madrid Espantildea P 40-
126
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ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
enhttpswwwgooglecomecsearchq=citoquininas+pdfampoq=citoquininasampaqs=chro
me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
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SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
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TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
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34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
32
ROCA W Y MROGINSKI L1991 Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de
tejidos vegetales in Cultivo de tejidos en la agricultura Eds Roca y Mroginski Centro
Internacional de Agricultura Cali Colombia P 3-9
ROJAS S et al 2004 Propagacioacuten asexual de plantas Bogotaacute Colombia P 7 Consultado el
2 de abril del 2014 Disponible en
httpecojardinesfileswordpresscom201312propagacinasexualdeplantaspdf
RUIZ B 2000 Efectos del BAP y 24-D en la induccioacuten de organogeacutenesis indirecta in vitro
de AnthuriumandreanumL (en liacutenea) El Zamorano Honduras Consultado el 8 de mayo
del 2014 Disponible en httpzamo-oti-02zamoranoedutesis_infolib2000T1220pdf
SABORIO F 2013 Citoquininas Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible
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me169i57j0l57214j0j4ampsourceid=chromeampes_sm=93ampie=UTF-8
SAKAKIBARA H 2006 Las Citosininas actividad la biosiacutentesis y traslocacion Revisioacuten
anual de la bilogiacutea natural RIKEN Plant Science Center Tsurumi Yokohama 230-
0045 Japoacuten Consultado el 8 de mayo del 2014 Disponible en
httptranslategooglecomectranslatehl=esampsl=enamptl=esampu=http3A2F2Fwww
ncbinlmnihgov2Fpubmed2F16669769ampanno=2
SALGADO J 2007 Cultivo in invitro Anthuriumandreanum Universidad tecnoloacutegica de
Pereira Facultad de Tecnologiacutea Quiacutemica Consultado el 22 de julio del 2014
Disponible en httpbibliotecautpeducotesisdigitalestexto5810724S164pdf
TAIacuteZ L SEIGER E 2006 Fisiologiacutea Vegetal Volumen II Coleccioacuten ciencias
experimentales EdIII Publicado Universitat Jaume P 864 Consultado el 6 de mayo
del 2014 Disponible
enhttpbooksgooglecomecbooksid=1PRucJTuVrQCamppg=PA865ampdq=como+func
ionan+las+auxinasamphl=esampsa=Xampei=wIJpU76MIZHqoATi9IKwBQampved=0CC4Q6w
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TORO M 2004 Establecimiento de protocolos para regeneracioacuten in vitro de cerezo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
httpbooksgooglecomecbooksid=9n8OAQAAIAAJampprintsec=frontcoveramphl=esamps
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APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
33
dulce (Prunusavium) var lambert TesisIngeniero Agroacutenomo Facultad de Ciencias
Agropecuarias y Forestales de la Universidad Catoacutelica de Temuco Temuco Chile P 17
- 26
WESLEY J 1983 La pintildea IICA PM 443 Nicaragua P 4 Disponible en
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34
APEacuteNDICE
35
Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
36
Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
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APEacuteNDICE
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Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
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Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
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Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
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Cuadro 11 NUMERO DE PRIMORDIOS (ACUMULADOS) EN 9 FECHAS DE
EVACIOacuteN
TRATAMIENTOS HORMONAS DIacuteAS
AIA + BAP EXPLANTE 7 14 21 28 35 49 56 63 Total
TESTIGO HIJO 0 1 8 12 16 20 24 24 105
05 05 HIJO 4 11 13 18 23 28 30 33 160
10 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
05 10 HIJO 0 4 6 9 12 15 18 18 82
10 05 HIJO 4 12 18 25 32 39 42 46 218
TESTIGO CHUPON 0 3 6 9 12 15 18 18 81
05 05 CHUPON 1 4 7 10 13 16 18 19 88
10 10 CHUPON 0 4 6 9 12 15 17 18 81
05 10 CHUPON 0 2 4 6 8 10 12 12 54
10 05 CHUPON 3 8 13 18 23 28 30 33 156
total por fechas 1107
Cuadro 12 ANALISIS DE VARIANZA PARA LA FRECUENCIAS ACUMULADAS DE
PRIMORDIOS DE PINtildeA PROCEDENTES DE HIJOS Y CHUPONES
ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM Fc F005 F001
TRATAMIENTOS 9 231701 25745 7618 197 259
ERROREXPERIMENTAL 70 91215 13031
TOTAL 79 1143851
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Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
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Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
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Fotografiacutea 1 Explantes de pintildea hijos y chupones
Fotografiacutea 2 Desinfeccioacuten de los explantes dentro de la caacutemara
Fotografiacutea 3 Reduccioacuten y siembre del explante de pintildea por tratamiento
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo
37
Fotografiacutea 4 Plantas contaminadas por hongos y bacterias
Fotografiacutea 5 Plantas de pintildea del T5 AIA y BAP (10+059) el mejor tratamiento que obtuve
de la investigacioacuten
Fotografiacutea 6 Explantes de pintildea hijos y chupones con sus respectivos tratamientos dentro del
cuarto de cultivo