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UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
Estudo da imunomarcação da interleucina-6 (IL-6) no
periodonto de ratos submetidos à movimentação
ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade
FRANCISCO ANTONIO DELGADO GRIECO
Orientador: Prof. Dr. Lúcio Frigo
Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia.
SÃO PAULO
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
G863m
Grieco, Francisco Antonio Delgado. Estudo da imunomarcação da interleucina-6 (IL-6) no periodonto
de ratos submetidos à movimentação ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade / Francisco Antonio Delgado Grieco. -- São Paulo; SP: [s.n], 2014.
63 p. : il. ; 30 cm. Orientador: Lúcio Frigo. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Movimentação ortodôntica 2. Laserterapia de baixa
intensidade 3. Inflamação 4. Ratos I. Frigo, Lúcio. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDU: 616.314-089.23(043.2)
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
Estudo da imunomarcação da interleucina-6 (IL-6) no
periodonto de ratos submetidos à movimentação
ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade
Francisco Antonio Delgado Grieco
Tese de doutorado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 09/05/2014.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Lúcio Frigo
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente
Prof. Dr. Maurício Teixeira Duarte
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. Pedro Antonio Fernandes
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. José Cássio de Almeida Magalhães
Universidade Camilo Castelo Branco
Prof. Dr. Artênio José Isper Garbin
UNESP – Araçatuba
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Paulo Grieco (in memorian), e Dalva Apparecida Delgado Grieco,
pelo dom da vida, pela minha educação e por tudo que fizeram por mim durante esta
jornada.
À Flávia Z. P Grieco, minha esposa pela paciência, compreensão da minha
ausência e o apoio nas horas difíceis.
À minha filha Giovanna Grieco, sempre ao meu lado apertando alguma tecla e
tentando me distrair.
Aos meus parceiros de docência Prof. Dr. Artênio José Isper Garbin e Prof. Dr.
Eduardo Guedes Pinto (in memorian), Prof. Marcelo de Gouveia Sahad, Prof.
Joseli Maria Cordeiro Danielli, Prof. Leandro Augusto Pinto e Prof. Rodrigo
Prata Rocha.
Dedico este Trabalho
AGRADECIMENTOS
Agradeço;
À DEUS pela saúde, força e perseverança para cumprir esta
maravilhosa jornada que é a vida.
Ao Professor Lúcio Frigo pela orientação, compreensão, incentivo e
apoio no desenvolvimento deste Trabalho.
Ao Professor Marcelo de Gouveia Sahad pelo seu companheirismo
tanto no nosso mestrado como no doutorado, onde não mediu
esforços para me ajudar na conclusão deste trabalho.
A Professora Joseli Maria Cordeiro Danile pela sua paciência
comigo, por me entender e pela sua amizade.
GRIECO, F. A. D. Estudo da imunomarcação da interleucina-6 (IL-6) no periodonto de ratos submetidos à movimentação ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade. 2014. 63 f. Tese (Doutorado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
RESUMO
Introdução. A laserterapia de baixa intensidade (LTBI) tem ganhado atenção dos
pesquisadores devido aos consistentes resultados encontrados e sua promissora
aplicação clínica. Tal cenário levou diversos autores a investigar a relação entre a
laser terapia de baixa intensidade e a movimentação ortodôntica almejando diminuir
os efeitos adversos do aparelho ortodôntico e melhorar sua eficácia. Os processos
inflamatórios são reconhecidos como ponto chave na movimentação ortodôntica. No
entanto, pouco se sabe sobre os efeitos da LTBI nos marcadores inflamatórios.
Neste contexto, este trabalho teve como foco investigar os níveis da interleucinas-6
na movimentação ortodôntica de ratos submetidos a LTBI. Dois grupos de 15 ratos
(irradiados, não-irradiados) tiveram o primeiro molar tracionado por um aparelho
ortodôntico, sendo que um dos grupos recebeu irradiação por três dias consecutivos
(As-Ga-Al, λ=880nm, 100mW) e densidade de energia de 5J/cm2. Foi acrescentado
um terceiro grupo (5 ratos) sem movimentação dentária, nem irradiação. Os animais
foram sacrificados em 3, 5 e 7 dias e analisados pelas técnicas histológicas HE e
Picrosirius. A quantificação da IL-6 foi realizada por imunohistoquimica no ligamento
periodontal, posteriormente a laminas foram submetidas a analise morfométrica
através da lente CoolSNAP-Procf (Media Cybernetics Inc) acoplada a microscópio
Nikon Eclipse-E800. As analises estatísticas foram performadas pelo programa
GrapgPad Prism versão 3.0 utilizando o teste estatístico não paramétrico de Mann
Whitney. Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes após 3 e 5
dias entre o grupo irradiado e o não irradiado. Nossos dados reafirmam a relevância
da IL-6 para a reabsorção óssea e o papel da inflamação na movimentação
ortodôntica. Os resultados sugerem o potencial da LTBI para aplicação clinica
embora haja necessidade de estabelecimento de protocolos.
Palavras-chave: Laserterapia de baixa intensidade, Movimentação ortodôntica,
Inflamação, IL-6.
GRIECO, F. A. D. Immunohistochemistry study of Interleuketin-6 in rats periodontal tissue after tooth movement and low intensity laser therapy. 2014. 63 f. Tese (Doutorado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
ABSTRACT
Low intensity laser therapy (LILT) has been caching the attention of researchers due
to its consistent study results and promising clinical application. This scenario has
been leading many authors to investigate the relationship between the low intensity
laser therapy and tooth movement in order to decrease its side effects and increase
its efficacy. It is well know that inflammatory process is a key point of regulation in
this process. Nevertheless, little is known about the effects of LILT in the
inflammatory makers levels. In this context, this study focused on investigates the
levels of IL-6 in rats after LILT. Thirty rats were divided in two groups (irradiated, non-
irradiated) and had instaled an orthodontic apparatus to pull rat’s first molar. Laser
irradiation (As-Ga-Al, λ=880nm, 100mW) took place in three consecutive days,
starting immediately after apparatus installation with 5J/cm2 of energy density. It was
added a third group (n=5) non-irradiated and non orthodontic apparatus instaled.
Animals were killed after 3, 5, 7 days (n=5) analyzed by Picrosirius and HE staining
technics. IL-6 was quantified by immunohistochemistry technique in the periodontal
ligament. Then, all slides were analyzed morphologically with CoolSNAP-Procf
(Media Cybernetics Inc) lense associated with the Nikon Eclipse-E800 microscope.
Statistics analyses were performed by GrapgPad Prism software version 3.0 using
the non- parametric test by Mann Whitney. The results showed a statistic difference
after 3 and 5 days of LILT between non-irradiated group and irradiated group. Our
data reaffirms the role of IL-6 in bone reabsorption process and the role of
inflammation in the tooth movement. The results suggest the potential clinical
application of LILT but it still requires the establishment of protocols.
Keywords: Low intensity laser therapy, Tooth movement, Inflammation, IL-6.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Preparado histológico mostrando a estrutura do ligamento
periodontal ........................................................................................... 16
Figura 2 Principais eventos envolvidos na movimentação ortodôntica ....... 19
Figura 3 Espectro eletromegnático, evidenciando onde se encontra a faixa
relacionada ao laser ............................................................................ 30
Figura 4 Caracteristica da luz laser monocromaticidade ............................... 31
Figura 5 Caracteristica de coerência da luz laser. (A) Comprimento de ondas
coerentes no tempo e espaço. (B) Comprimentos de ondas
incoerentes no tempo e espaço ......................................................... 31
Figura 6 Caracteristica da luz laser de unidirecionaliade ou colimação. A luz
natural é divergente e a luz laser é paralela ao tubo onde é
produzida ............................................................................................. 32
Figura 7 Dispositivo ortodôntico instalado e preso no 1º molar e nos
incisivos com resina utilizado neste estudo .................................... 39
Figura 8 Perfuração com motor de alta rotação e broca diamantada na
mesial dos incisivos superiores ........................................................ 40
Figura 9 Amarrilho na região posterior envolvendo molar ............................ 41
Figura 10 Resina utilizada para fixar o amarrilho .............................................. 41
Figura 11 Tensiomêtro calibrado a força aplicada ............................................ 42
Figura 12 Desgaste nos incisivos inferiores para evitar interferências .......... 42
Figura 13 Aparelho utilizado no estudo ............................................................. 43
Figura 14 Níveis de IL-6 observados no grupo controle e nos tempos 3, 5 e 7
dias após tratamento ortodôntico sem laserterapia de baixa
intensidade (72h- TO/ SL, 120h- TO/ SL e 168h- TO/ SL) e com a
laserterapia de baixa intensidade (72h- TO/ L, 120h- TO/ L e 168h-
TO/ L). ................................................................................................... 49
Figura 15 Preparado histológico (método imunohistoquímico) do grupo
controle, no momento zero. Aumento de 200x ................................. 49
Figura 16 Preparado histológico (método imuno-histoquímico) dos grupos
controle e irradiado após diferentes tempos de movimentação
ortodontica. Aumento de 200x (A) Grupo controle após 3 dias (72h-
TO/ SL) ado após 3 dias (72h- TO/ L).. (C) Grup ............................... 49
Tabela 1 Distribuição dos animais utilizados no experimento ....................... 38
Tabela 2 Mostram as diferentes soluções utilizadas para inclusão em
parafina ................................................................................................ 44
Tabela 3 Mostra as diferentes soluções utilizadas para desparafinização ... 45
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AINES Antinflamatórios não- estoroidais
Ar Argônio
AsGa Arseniato de gálio
AsGaAl Arseniato de gálio e alumínio
ATP Adenosina Trifosfato
BSA Albumina de soro bovino
Co Monóxido de carbono
CO2 Dióxido de carbono
COX-2 Cicloxigenase
DAB Diaminobenzina
HCL Cloreto de hidrgênio
HE Hematoxilina e eosina
He-Ne Hélio- Neônio
IHQ Imuno-histoquimica
IL Interleucina
IL-1 Interleucina- 1
IL-10 Interleucina-10
IL-12 Interleucina-12
IL-1B Interleucina-1
IL-2 Interleucina- 2
IL-3 Interleucina-3
IL-4 Interleucina-4
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
INF-γ Interfero-
Krf Krypton Floride Lase
LBI Laser de baixa intensidade
LDP Ligamento Periodontal
LTBI Laserterapia de baixa intensidade
M-CSF Fator estimulador de colônia de macrófagos
MEC Matriz extracelular
MMPs Metaloproteinases da matriz
NAC N-acetilcisteína
NO Óxido nítrico
OPG Osteoprotegerina
PTH Paratormonio
RANK Receptor ativador de fator nuclear-κB
RANKL ligante de RANK
Th0 T- helper 0
Th1 T- helper 1
Th2 T- helper 2
TIMPs Inibidores de tecido de metaloproteinases
TNF-± Fator de necrose tumoral
TNF-α Fator de necrose tumoral-a
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
XeCl Monocloreto de xenon
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 12
2 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................... 14
2.1 Movimentação Ortodôntica ....................................................................... 14
2.1.1 Estrutura e Função do Ligamento Periodontal (LDP) ............................. 15
2.1.2 A Movimentação Ortodôntica: Sequência de Eventos ............................ 17
2.1.3 Forças e Tipos de Movimento Dentário .................................................... 17
2.1.3.1 Modelo Bioelétrico ..................................................................................... 19
2.1.3.2 Teoria da Pressão- Tensão ........................................................................ 20
2.2.1 Citocinas pro-Inflamatórias ....................................................................... 23
2.3 Laserterapia de Baixa Intensidade na Movimentação Ortodôntica ....... 29
2.3.1 Características da Luz Laser ..................................................................... 30
2.4 Citocinas pro-Inflamatórias e Laserterapia de Baixa Intensidade ......... 33
2.4.1 Laserterapia de Baixa Intensidade e IL-6 ................................................. 34
3 OBJETIVOS ................................................................................................. 36
4 METODOLOGIA .......................................................................................... 37
5 RESULTADOS ............................................................................................. 48
6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 50
6.1 Limitações do Estudo .............................................................................. 503
7 CONCLUSÃO .............................................................................................. 53
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 54
ANEXOS ...................................................................................................... 62
12
1 INTRODUÇÃO
Os eventos moleculares envolvidos na movimentação ortodôntica vêm
instigando pesquisadores devido ao seu alto grau de complexidade e grande
potencial clinico. Sabe-se que compreende a remodelação do tecido ósseo alveolar
o qual devido a sua grande plasticidade, responde ao estimulo mecânico.
Os constantes avanços no conhecimento tem sugerido que o movimento
ortodôntico é resultante de um processo de transdução no qual envolve a
transformação de um estimulo físico em biológicos através de robustos processos
bioquímicos e moleculares no tecido ósseo, dentário, periodontal e ligamentar
(MEIKLE, 2006).
Diversos autores tem proposto teorias para explicar tais fatos. Dentre elas, a
teoria da pressão-tensão é uma das mais aceitas atualmente. De acordo com essa
teoria, as células do ligamento periodontal se diferenciam em osteoclastos na
interface de pressão, resultando em reabsorção óssea e em osteoblastos e
fibroblastos na interface de tensão, possibilitando a osteogênese. Assim, a
remodelação óssea alveolar ocorre para que haja alívio da pressão sobre o
ligamento, viabilizando a movimentação dentária. (BECKER DE OLIVEIRA, 2002;
KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; PROFFIT, et al., 2007).
Neste modelo, as forças incidentes acarretam menor perfusão sanguínea na
zona de compressão, quando comparada a de tensão; suscitando o surgimento de
áreas de hipóxia, o que leva ao rompimento da homeostasia celular (MARTYN;
DIBIASE, 2010).
Como consequência, cria-se um estado inflamatório localizado e crônico
com migração leucocitária, liberação de mediares químicos como fatores de
crescimento e citocinas. Diversos estudos tem demonstrado o papel fundamental da
inflamação na movimentação ortodôntica.
No entanto, os eventos do processo inflamatório são aliados a dor, edema e
rubor sintomas os quais geram desconforto a maioria dos pacientes. Neste contexto,
13
diversos autores tem demonstrado o efeito benéfico da terapia com laser de baixa
intensidade na diminuição dos sintomas inflamatórios e na aumento da velocidade
da cicatrização (AIMBRE et al., 2006). Postula-se que os lasers de baixa
intensidade agem por meio da proliferação de fibroblastos e a síntese de colageno,
regeneração nervosa, reparação óssea e analgesia.
Haja vista os resultados preliminares obtidos por diversos pesquisadores, a
LBI vem se destacando como uma ferramenta promissora para o tratamento
ortodôntico. Neste contexto, este estudo insere-se na perspectiva de contribuir
para o entendimento da relação da laserterapia de baixa intensidade e infamação
através do investigação dos níveis de IL-6.
14
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Movimentação Ortodôntica
A palavra ortodontia se define: orthus do grego (direito, reto, posição) e
dontia do grego (dos dentes), porem a Ortodontia é a especialidade da Odontologia
que tem como objetivo o tratamento de dentes mal posicionados podendo alterar até
mesmo o perfil facial em busca de uma melhora estética e funcional.
Um dente mal posicionado para ser corrigido sofre a ação de um
determinado aparelho ortodôntico que aplica uma força pré-determinada a um ou
mais dentes e a partir de então temos a movimentação ortodôntica dentária, é
notório um aumento no número de trabalhos de pesquisas científicas com o intuito
de entendermos melhor os processos biológicos que ocorrem nos tecidos
envolvidos e a otimização dos estímulos aplicados (NEMCOVSKY et al.; CRUZ et
al., 2004; KAWASAKI; SHIMIZU, 2009).
A movimentação ortodôntica dentária é possível devido à grande
capacidade de remodelação do tecido ósseo em resposta as estimulações
mecânicas.
A interface de compressão no ligamento periodontal sofre um processo de
reabsorção da matriz óssea, por outro lado, na interface de tração ocorre um
processo de aposição óssea.
Os osteoclastos têm como precursores os monócitos do sangue. Quando
recrutados, através da sinalização fornecida pelos osteoblastos agregam-se
formando células gigantes multinucleadas, passando a dispor de todo arsenal
bioquímico para desempenhar sua função, os osteoclastos selam uma pequena
região da matriz (lacuna de Howship) e liberam HCl que dissocia o cristal de
hidroxiapatita, a seguir libera colagenase que degrada as fibras colágenas, dessa
maneira reabsorvendo a matriz óssea (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008)
O conhecimento da biologia da movimentação dentária induzida implica em
reconhecer os fenômenos teciduais, celulares e moleculares a cada dia de sua
15
evolução. Assim, poder-se-á interferir de forma segura e consciente com
medicação, procedimentos e intervenções para otimizar o tratamento ortodôntico e o
conforto do paciente, reduzir as reabsorções radiculares ou evitá-las e, ainda,
viabilizar o tratamento ortodôntico para pacientes sistemicamente comprometidos.
O movimento ortodôntico ocorre em resposta à aplicação de uma força
mecânica por meio da remodelação dos tecidos periodontais, sendo que vários
mediadores químicos são sintetizados e liberados para seu início e manutenção.
Dentre esses mediadores, o óxido nítrico (NO) atua como modulador da atividade
de osteoclastos e osteoblastos na remodelação óssea. Interleucina-1 (IL-1),
interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-± (TNF-±) estimulam a reabsorção
óssea e encontram-se aumentados no movimento ortodôntico (NOGUEIRA, 2010).
IL-6 regula as respostas imunes em locais com inflamação, tem uma
atividade autócrina (quando o sinal age sobre a célula que o emitiu) e parácrina
(Comunicação entre células vizinhas que não utiliza a circulação). Ex: células
endoteliais-musculatura lisa vascular, onde o óxido nítrico atua como modulador do
tônus que estimula a formação de osteoclastos e a atividade de reabsorção óssea.
(ALHASHIMI, 2001)
2.1.1 Estrutura e Função do Ligamento Periodontal (LDP)
A) Estrutura do LDP
O ligamento periodontal (LPD) é um tecido conjuntivo frouxo atravessado
por grossos feixes de fibras colágena que se inserem do cemento ao osso alveolar.
A figura 1 mostra a estrutura do ligamento periodontal
16
Figura 1 – Preparado Histológico Mostrando a Estrutura do Ligamento Periodontal
O ligamento periodontal ocupa o espaço entre a parede do alvéolo e o
cemento, e é o responsável pela articulação dental. É constituído principalmente por
fibras colágenas inseridas de um lado no cemento radicular e do outro no osso
alveolar, sendo entremeadas por vasos sanguíneos, elementos celulares,
terminações nervosas e fluido intersticial. Os vasos sanguíneos são responsáveis
pela nutrição do ligamento periodontal, assim como servirão de via de acesso para
as células responsáveis pela remodelação do osso cortical e ligamentos. As
terminações nervosas ali existentes transmitirão as sensações de pressão e a
noção proprioceptiva. Já as fibras periodontais e o fluido intersticial formam, em
conjunto, um eficiente sistema amortizado r e dissipador das forças fisiológicas
aplicadas por um breve intervalo de tempo, durante as funções oclusais.
(FERREIRA, 2012)
17
O ligamento periodontal é um tecido mole que se encontra interposto entre o
dente e o osso alveolar e mede, frequentemente 0,25mm de espessura, ou menos
(REITAN, 1960; 1985). É responsável pela transmissão de forças in vivo e sua
compressão induz estímulos geradores de inflamação local, favorecendo o
surgimento de um micro-ambiente susceptível à reabsorção óssea (CONSOLARO,
2002; WAGLE et al., 2005).
Segundo Freeman (1985), as funções físicas do ligamento periodontal são:
I) transmissão das forças oclusais ao osso;
2) inserção dos dentes;
3) manutenção da relação adequada entre gengiva e dente;
4) resistência ao impacto das forças oclusais;
5) provisão de um envoltório de tecido mole para proteger os vasos e nervos
de possíveis lesões mecânicas.
2.1.2 A movimentação Ortodôntica: Sequência de Eventos
A movimentação ortodôntica somente é possível devido à propriedade
plástica do osso, adaptando-se as forças funcionais que sobre ele se manifestam.
Ele reage de forma a depositar tecido ósseo nas áreas submetidas às forças de
tração e reabsorver nas áreas onde há pressão. A sequência de eventos que
decorrem da aplicação de uma força ortodôntica contínua produz o deslocamento
horizontal de um dente. Normalmente, uma força aplicada movimenta o dente para
a direção da linha de força, comprimindo o ligamento periodontal (LPD) e o osso
alveolar dessa área é alongando no lado oposto da raiz.
2.1.3 Forças e Tipos de Movimento Dentário
Força e histopatologia. Infelizmente, cortes histopatológicos adequados de
dentes humanos movimentados ortodonticamente e dos tecidos envolvidos são
raros. O estudo liderado por Reitan et al. (1957), entretanto, nos forneceram
algumas informações úteis com relação à natureza da resposta histológica às forças
18
ortodônticas. É possível que possamos correlacionar alguns desses dados com
nossas observações clínicas. Por exemplo, o longo período retardatário após a
aplicação de uma força excessivamente pesada pode estar relacionado à formação
de uma superabundância de tecido conjuntivo hialinizado que impede a reabsorção
direta e respostas apositivas.
Enquanto há poucos ortodontistas que discordam seriamente desses
critérios para a avaliação de força (isto é, a dor, o índice de movimentação dentária,
a mobilidade dentária, a conservação da ancoragem e a histopatologia), há uma
grande variação na interpretação individual e na aplicação em situações clínicas
específicas.
Acredita-se que devemos relacionar esses critérios não à magnitude de
força, em termos de gramas, onças ou libras aplicadas à coroa, mas à distribuição
da pressão no ligamento periodontal. Afinal, estamos utilizando a coroa do dente
apenas como um instrumento com a qual transmitimos forças ao ligamento
periodontal. O conhecimento das forças corretas para se aplicar na região coronal
surgirá apenas por meio da compreensão da resposta biológica às pressões no
ligamento periodontal e sua relação às forças aplicadas sobre a coroa. Há uma
distribuição ideal de pressão no ligamento periodontal para cada tipo de
movimentação dentária, e o trabalho do ortodontista é detectar aquela força ou
conjunto de forças aplicada à coroa que produzirá esta configuração. Embora
algumas tentativas tenham sido realizadas no sentido de solucionar esse problema,
nossas respostas devem ser consideradas apenas como aproximações
simplificadas. No sentido de fornecer, no mínimo, uma resposta á alguns de nossos
questionamentos, consideramos a forma radicular de um dente com uma única raiz
como uma parabolóide.
Os fundamentos da física podem ser utilizados para se estabelecer os
requisitos de equilíbrio a serem detectados a qualquer momento. Além disso, caso
consideremos o ligamento periodontal como sendo uniforme em largura e em suas
propriedades mecânicas (por exemplo, o módulo de elasticidade), torna-se possível
teorizar sobre a posição da raiz quando um determinado conjunto de forças é
aplicado à coroa dentária.
19
A figura 2 abaixo ilustra os principais eventos ocorridos após a colocação do
aparelho ortodôntico.
Figura 2 – Principais eventos envolvidos na movimentação ortodôntica
2.1.3.1 Modelo Bioelétrico
Cochran, Pawluck e Basset (1967), aceitando na hipótese de que, durante a
mastigação e a deglutição, as forças intermitentes geram potenciais elétricos,
acreditaram que estes estariam presentes também no tratamento ortodôntico e
deveriam variar com a mudança da magnitude e direção das forças aplicadas. Os
fatores mostrados pareciam afetar a amplitude da voltagem e a polaridade em seus
experimentos, e também demonstraram estar relacionados a algumas das
mecânicas introduzidas por procedimentos ortodônticos.
Andrew e Basset (1968) definiram a piezeletricidade como sendo a
eletricidade resultante da pressão nos cristais e como sendo um fenômeno que têm
importância crescente na pesquisa dos tecidos mineralizados. Os autores afirmaram
que a energia mecânica gasta nessas estruturas pode produzir potenciais elétricos
de magnitude suficiente para exercer uma ampla variedade de efeitos nos sistemas
vivos. Esses incluem, teoricamente, controle da nutrição celular, controle do pH
local, ativação ou supressão enzimática, orientação de macro moléculas intra e
extracelular, atividade de migração e proliferação das células, capacidade sintética e
funções específicas das células, constrição e permeabilidade da membrana celular
e transferência de energia. Outros autores, concluíram que o mineral ósseo por si só
20
não contribui para o efeito piezelétrico no osso, recebendo as fibras colágenas a
maior responsabilidade pela piezeletricidade. Para Mostafa, Weaks-Dybvig e
Osdoby (1983), a conversão da resposta piezelétrica na atividade bioquímica
proporciona o componente direcional do movimento ortodôntico. Marino e Gross
(1989) compararam as propriedades piezelétricas do cemento, dentina e osso. A
dentina e o cemento demonstraram menor piezeletricidade se comparados com o
osso, o qual possui coeficiente significantemente maior.
Proffit (1995) relatou em seu livro que existem dois elementos de controle
do movimento dentário ortodôntico: a eletricidade biológica ou piezeletricidade e a
pressão-tensão sobre o ligamento periodontal, afetando o fluxo sanguíneo. A Teoria
da Bioeletricidade relaciona o movimento dentário controlado por sinais elétricos
produzidos quando o osso flexiona e se dobra. (PIETRO, 2005)
2.1.3.2 Teoria da Pressão- Tensão
Quando uma força mesiodistal é aplicada sobre a crista óssea interdentária,
a deflexão existe em um determinado nível de intensidade, mas quando a força for
linguovestibulal esta deflexão será muito maior. O deslocamento, a deformação ou a
inclinação da face óssea livre alveolar tenderá, pela sua elasticidade, a gerar
tensão, ou estiramento, ou a esticar algumas estruturas fibrosas, vasculares e
celulares de permeio a uma predominante ação de forças compressivas. Em
modelos matemáticos, como o método do elemento finito utilizado por Cattaneo,
Dastra e Melsen, em 2005, foi possível detectar estas forças de tensão nas áreas de
compressão periodontal, mesmo que pequenas, interrompidas ou em pequenos
espaços ou arcos. O movimento simulado foi no sentido linguovestibular ao nível
cervical das raízes.
Na biologia óssea, reconhecidamente, sabe-se que os mediadores indutores
da reabsorção óssea, se em nível elevados, promovem-na. Porém, em níveis
discretamente elevados, induzem fenômenos de neoformação óssea. O nível de
mediadores determina se a resposta será neoformadora ou de reabsorção óssea.
Nas reações ósseas frente a agentes de baixa intensidade e longa duração, a
inflamação e o estresse celular são discretos e moderados e acumulam pequena
quantidade de mediadores difusamente localizados; em decorrência, a região fica
21
com esclerose óssea e cortical mais espessa. Em áreas com inflamação mais
intensa e focalizada, os mediadores se acumulam em grandes níveis e predominam
fenômenos reabsortivos. Nas lesões periapicais crônicas, como o granuloma
periapical, pode-se notar estes dois fenômenos: no centro ele se apresenta
radiolúcido, mas na periferia o osso está denso ou esclerosado.
No lado de tensão, as fibras ficam estiradas, esticadas ou alongadas. Os
vasos se comprimem, porém nem tanto quanto em uma compressão radicular. As
células se deformam, porém nem tanto. Desta forma, o estresse celular mecânico e
bioquímico promove um discreto aumento na concentração de mediadores,
induzindo fenômenos de aposição óssea, predominantemente. Mas, se também
houver rompimento de fibras colágenas, destacamento das mesmas da superfície
óssea ou cementária, isto indica que a força de tensão foi excessiva, que houve
morte celular; compressão excessiva de vasos e áreas hialinas com morte celular
pode ter ocorrido. Nesta situação, mesmo com forças de tensão, haverá, nos
primeiros dias da movimentação, fenômenos predominantemente reabsortivos nas
superfícies ósseas e até dentárias, pois os cementoblastos poderão ser também
afetados.
Para uma maior efetividade da movimentação dentária, o ideal consiste em
desorganizar o ligamento, comprimindo as estruturas periodontais e promover
discreta hipóxia, a ponto de induzir acúmulos de mediadores em nível suficiente
para induzir fenômenos reabsortivos na região, onde se faz a compressão do
ligamento entre o dente e o osso alveolar.Se induzirmos morte celular, áreas de
hialinização extensas e desorganização excessiva podem atrasar o processo de
reabsorção óssea na face periodontal da lâmina dura. Para as unidades
osteorremodeladoras trabalharem requer-se migração celular, mas as áreas hialinas
e de necrose atrapalham. Requer-se, ainda, um mínimo de organização tecidual,
para que ocorram as interações celulares necessárias, e uma boa vascularização
para se obter os nutrientes necessários e energia para o processo. Ao concluir,
pode-se afirmar que é simplista pensar em binômios diretos como pressão-
reabsorção e tensão-aposição óssea, embora sejam didáticos. Com maior precisão,
pode-se afirmar que em áreas onde o ligamento periodontal é comprimido durante a
movimentação dentária, predominam as forças de pressão e os fenômenos
22
reabsortivos decorrentes dos mediadores e eventos celulares. E, nas áreas em que
atuam predominantemente as forças de tensão, a aposição óssea será exuberante,
em função dos mediadores de fenômenos celulares induzidos (CONSOLARO,
2007).
2.2 Inflamação e Movimentação Ortodôntica
Com o avanço das pesquisas de base molecular, os processos inflamatórios
vêm se destacando como ponto chave na regulação dos processos biológicos.
Como por exemplo, a remodelação óssea, resultante da movimentação ortodôntica,
é regulada pela liberação de importantes mediadores inflamatórios (ALHASHIMI et
al., 2001; WELTMAN et al., 2010; CHAE et al., 2011; ELLIAS, 2012; NIKLAS et al.,
2013).
Diversos autores têm sugerido teorias para explicar as bases moleculares
da movimentação ortodôntica. A teoria da pressão-tensão foi primeiramente descrita
por Sandstedt et al. atualmente é uma das mais aceitas para explicar esse
fenômeno (DAVIDOVITCH; KRISHNAM, 2006).
A partir dos estudos histológicos realizados por Sandstedt em 1904 e
aprofundados por Schwarz em 1932, os autores propuseram a formação de zonas
de pressão e zonas de tensão as quais conduziram a alterações biológicas
necessárias para a movimentação ortodôntica (DAVIDOVITCH; KRISHNAM, 2006).
Dentre as alterações, as forças incidentes alteram sua vascularização dentária
resultando em zonas com menor perfusão sanguínea formando microambientes de
hipóxia (PROFFIT; FIELDS, 200; OLIVEIRA 2002).
A desestabilização da homeostasia celular, pelo déficit de oxigênio, é uns
dos principais desencadeantes da cascata de reações inflamatórias
(DAVIDOVITCH; KRISHNAM, 2006; NIKLAS et al., 2013). Ocorre migração
leucocitária, liberação de mediadores químicos como aminas vasoativas, fatores de
crescimento, metabólitos do ácido araquidônico, quimiocinas e citocinas (DE
PAULA, 1988; NIKLAS et al., 2013).
23
2.2.1 Citocinas Pro-Inflamatórias
As Citocinas são polipeptídios produzidos em resposta a microrganismos e
outros antígenos que medeiam e regulam reações imunológicas e inflamatórias. A
secreção de citocinas é transitória sendo iniciada por novas transcrições de genes
resultantes da ativação celular. A produção de citocinas é controlada por
processamento de RNA e por mecanismos pós-transcricionais. Uma vez
sintetizadas, as citocinas são instantaneamente secretadas iniciando uma ação local
ou sistêmica. Após a secreção das citocinas elas se ligam a receptores específicos
de membrana nas células-alvo e agirão de forma antagônica, singérgica,
redundante e/ou pleiotrópica para induzir a expressão gênica em células-alvo
culminando na expressão de novas funções e, algumas vezes, na proliferação de
células alvo (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008).
A importância de citocinas pro-inflamatórias para a movimentação dentária
foi pioneiramente investigada por Saito et al. (SAITO et al., 1991). Estes autores
instigaram a hipóteses de que a remodelação óssea estaria diretamente relacionada
com a inflamação. Desde então, os estudos foram direcionados no sentido de
entender os mecanismos específicos envolvidos no aumento de citocinas pro-
inflamatórias em resposta ao estresse mecânico.
Em uma conferência em 1986, Meikle, et al. já haviam lançado a hipótese
de que os eventos de remodelação do tecido ósseo seriam modulados por citocinas.
Davidovitch, et al. (1988) produziram a primeira evidência experimental, ao
identificar a presença da IL-1 no LPD de gatos submetidos à forças ortodônticas.
Desde então, inúmeros estudos clínicos tem demonstrado a presença de
vários tipos de citocinas, em altas concentrações, no fluido crevicular gengival de
pacientes durante o movimento ortodôntico (GRIEVE et al., 1994; LOWNEY et al.,
1995; UEMATSU; MOGI; DEGUCHI,1996).
Ainda, o estudo conduzido por Viegas (2005) demonstrou que os
osteoblastos sintetizam e secretam diversas citocinas durante o processo de
remodelação óssea, modulando a atividade de outros tipos celulares do tecido
ósseo.
24
As citocinas interagem com receptores celulares de alta afinidade, alterando
as funções da célula-alvo. A ligação no receptor desencadeia uma via de
transdução de sinais, que altera a expressão gênica celular. O efeito produzido
consiste na modulação da atividade imunitária e na regulação da resposta anti e
pró-inflamatória, através da comunicação intercelular. Além de exercer uma ação
autócrina e parácrina, alguns desses mediadores também podem agir em nível
endócrino (ABBAS et al., 2003; SHETTY et al., 2011).
As citocinas podem ter ações pleiotrópicas, redundantes, sinérgicas ou
antagônicas e geralmente participam de um sistema de indução em cascata,
influenciando a homeostasia tecidual (HAMBLIN, 1993; SANDY; FARNDALE;
MEIKLE, 1993; ALHASHIMI et al., 2001; ABBAS et al., 2003).
Monócitos, macrófagos, células endoteliais, fibroblastos e células
mesenquimais, sintetizam citocinas que agem na adesão, quimiotaxia e ativação
leucocitária, além de promoverem o recrutamento, diferenciação e proliferação de
células inflamatórias.
No LPD, além das células endoteliais, os fibroblastos e osteoblastos
sintetizam o VEGF, promovendo a angiogênese na interface de tensão (Figura 2),
enquanto que na interface oposta (Figura 3), as células mesenquimais secretam o
M-CSF, promovendo a sobrevivência, proliferação e diferenciação de células
hematopoiéticas das séries monócito-macrófago. A Figura 4 mostra a seqüência de
eventos orquestrada por M-CSF, RANKL e osteoprotegerina (OPG) na regulação da
maturação e função dos osteoclastos por osteoblastos (MEIKLE, 2002).
25
Figura 2 – Sequencia de eventos desencadeados pelas citocinas produzidas na interface de tensão do LPD (MEIKLE, 2006).
Na Figura 2, os fibroblastos sob tensão (1), sintetizam várias citocinas (IL-1
e IL-6) que, por sua vez, estimulam as metaloproteinases de matriz (MMPs) e
desativam os inibidores de tecido de metaloproteinases (TIMPs). As MMPs
degradam o colágeno e as glicosaminaglicanas (2), enquanto que o VEGF promove
a angiogênese (3). A degradação da matriz extracelular (MEC) por MMPs facilita a
proliferação celular e o crescimento capilar. Os fibroblastos (4) remodelam a matriz,
sintetizando mais MEC, enquanto que os osteoblastos (5) sintetizam o osteóide,
fase inicial da aposição óssea.
Já na interface de pressão, há intensa atividade reabsortiva, conforme
mostra a figura abaixo.
26
Figura 3 – Sequencia de eventos desencadeados pelas citocinas produzidas na interface de pressão do LPD (MEIKLE, 2006).
As células do LPD na interface de pressão (Figura 3), sintetizam IL-1 e IL-6
(1), que atuam de forma autócrina e parácrina, ativando o RANKL (2) e as MMPs
(3). Os osteoblastos liberam as MMPs que degradam o osteóide, enquanto que as
MMPs produzidas pelos fibroblastos degradam a MEC (4). O RANKL estimula a
osteoclastogênese a partir de células predecessoras. Os osteoclastos diferenciados
degradam a matriz óssea mineralizada (5). Os osteócitos da superfície óssea
regulam a deformação do osso alveolar modulando a expressão de MMPs
Os promotores da reabsorção óssea (Figura 4), tais como a vitamina D
[1,25(OH2)D3], o paratormônio (PTH) e a interleucina-1 (IL-1) aumentam a formação
dos osteoclastos, estimulando a expressão de RANKL por osteoblastos e células
mesenquimais, enquanto que a OPG faz a contra-regulação, atuando como um
inibidor da osteoclastogenese, ao competir com o RANKL pelo receptor de
membrana dos osteoblastos e células predecessoras. O M- CSF age diretamente
sobre as células precursoras dos osteoclastos, regulando sua proliferação e
diferenciação.
27
Figura 4 – Regulação da ativação de osteoclastos por osteoblastos na interface de pressão do LPD (MEIKLE, 2002).
No tecido periodontal os macrófagos sintetizam e liberam TNF-α, citocina
que estimula a diferenciação e atividade dos osteoclastos, estimulando a
reabsorção óssea (DI DOMENICO et al., 2012).
Conforme o processo inflamatório evolui, os linfócitos T ativados chegam à
interface de pressão e sintetizam o interferon tipo II (INF-γ) citocina que aumenta a
atividade fagocítica dos osteoclastos e assim como os leucotrienos, também
estimula a sua diferenciação, consistindo em exemplos de ações sinérgicas e
redundantes (ASSUMA et al., 1998; KUBY et al., 1999; ALHASHIMI et al., 2000;
BINGHAM, 2002; MALE et al., 2006).
A comunicação entre os linfócitos é orquestrada pelas interleucinas,
também conhecidas como linfocinas.
O termo interleucina (IL) refere-se às citocinas produzidas, majoritariamente,
por linfócitos T ativados, embora algumas delas sejam sintetizadas também por
outros tipos celulares. As interleucinas possuem várias funções, mas a maioria está
envolvida na ativação, diferenciação e promoção do crescimento de linfócitos e na
indução da proliferação de outras células. Entre os principais alvos destes
mediadores estão os próprios linfócitos T, os linfócitos B, os fibroblastos,
osteoblastos, osteoclastos e as células endoteliais (ABBAS et al., 2003).
Vários estudos têm apontado a presença de interleucinas no fluido gengival
de pacientes submetidos à movimentação ortodôntica, como a IL-1, IL-2, IL-3, IL-6,
28
IL-8, IL-10 e IL-12, entre outras citocinas (ALHASHIMI et al., 2000; MEIKLE, 2002;
IWASAKI et al., 2005; GARLET et al., 2007; REN et al., 2007).
Na resposta inflamatória aguda há a participação de interleucinas que
participam da imunidade inata, como a IL-1, que é a primeira a ser secretada pelos
macrófagos. A IL-1 ativa os fibroblastos, aumentando a proliferação e produção da
matriz extracelular, além de promover a osteoclastogênese. Logo os fagócitos
passam a liberar IL-6, que age em sinergia com a IL-1, amplificando a resposta
inflamatória imediata (GLANTSCHNIG H, et al., 2003; SEIDENBERG e AN, 2004;
KUMAR et al., 2008; YAO et al., 2008).
A IL-1 também atua na ativação dos linfócitos T, dando início a ação da
imunidade adaptativa (GOWEN et al., 1983; HEATH et al., 1985).Com o
recrutamento e ativação dos linfócitos T, inicia-se uma fase de limpeza e reparação
tecidual, na qual são sintetizadas e liberadas outras interleucinas, conforme a
resposta inflamatória progride para a resolução do processo.
A célula T diretamente implicada nos processos inflamatórios é o linfócito T-
helper (Th) por sua estreita interação com os macrófagos. As células Th são
mensageiras fundamentais, propiciando a intercomunicação de todo o sistema
imune. Há dois subtipos de linfócito T-helper: Th1 e Th2; sendo que cada subtipo
sintetiza interleucinas específicas.
As células Th não ativadas permanecem em estado de quiescência, sendo
denominadas linfócitos Th0. A diferenciação destes nos subtipos 1 ou 2 depende da
interleucina presente no microambiente tecidual no momento. Os Th0 serão
diferenciados em Th1 na presença da IL-12, mantendo a resposta inflamatória;
porém, se a IL-4 estiver presente, os Th0 se diferenciarão no subtipo Th2, que
determinam uma resposta antiinflamatória.
A revisão conduzida por Vandevaska-Radunovic et al. a presença de
mediadores inflamatórios pode ser evidenciado em todo o tecido periodontal de
suporte durante a reação inflamatória produzida pela movimentação ortodondica.
O estudo liderado por Alhashimi et al. foi pioneiro em quantificar a
expressão de RNA mensageiro de citocinas pro-inflamatórias como IL-1B, IL-6 e
29
TNF- em 3, 7 e 10 dias após a aplicação de força ortodôntica no primeiro molar de
12 ratos. Esses autores observaram um pico de expressão de IL-6 e Il-1b no tempo
6 e uma redução constante nos tempos 7 e 10 dias. O fator de necrose tumoral não
foi detectado nas conduções metodológicas empregadas. Com esses resultados, os
autores sugerem que as citocinas pro-inflamatórias podem exercer papel central na
reabsorção óssea.
Outro estudo conduzido por Chae et al. investigou a produção de citocinas
pro inflamatórias na movimentação ortodôntica de ratos. Consistente com outros
estudos, os níveis desses marcadores inflamatórios estavam aumentados no
ligamento periodontal nos fibroblastos (CHAE et al., 2011). Ainda, quando os
mesmos autores administraram resveratrol e N-acetilcisteina (NAC) na população
de estudo, tanto os níveis de citocinas pro-inflamatórias quanto a movimentação
ortodôntica estavam diminuídos quando comparados ao grupo controle. Chae et al.
(2011) discutiram os efeitos anti-inflamatório do revesveratol e NAC e sugerem que
antioxidantes podem retardar a movimentação ortodôntica uma vez que as citocinas
pro-inflamatórias são fatores essenciais para o tratamento ortodôntico (CHAE et al.,
2011).
Outros autores têm sugerido mecanismos para explicar a relação da
inflamação com e a movimentação ortodôntica (OLIVEIRA 2002; CHAE et al., 2011).
De Carlos et al. encontraram uma diminuição estatisticamente significante na
movimentação dentária após administrar diferentes classes de inibidor da
ciclooxigenase (COX-2) em ratos (n=7) (CARLOS et al., 2006). Não obstante, é
consenso na literatura o papel das citocinas pro-inflamatórias em estimular a
secreção de prostaglandinas. Assim, esses estudos reafirmam o papel das citocinas
pro-inflamatórios na movimentação ortodôntica embora os mecanismos ainda
permaneçam obscuros (CARLOS et al., 2006).
2.3 Laserterapia de Baixa Intensidade na Movimentação Ortodôntica
A palavra laser é uma abreviatura para "Light Amplification of Stimulated
Emission of Radiation" que na Língua Portuguesa significa Amplificação da Luz por
Emissão Estimulada de Radiação. O laser é uma radiação que se encontra no
30
espectro de luz que varia do infravermelho ao ultravioleta, passando pelo espectro
visível (Figura 3).
Figura 3 – Espectro eletromegnático, evidenciando onde se encontra a faixa relacionada ao laser
A utilização terapêutica da energia luminosa vem desde os primórdios da
civilização, e em 1903, o prêmio Nobel de medicina foi destinado ao Dr. Nielo
Ryberg Finsen pelo tratamento realizado com a luz solar em um paciente que
apresentava um tipo de tuberculose de pele.
Albert Einstein, em 1916, formulou os princípios da amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação, quando percebeu em seu experimento que a
emissão induzida poderia existir e a radiação eletromagnética seria produzida por
um processo atômico. No ano de 1960, Theodoro H. Maiman desenvolveu o
primeiro aparelho emissor de laser, a cristal de rubi, que passou a ser
comercializado. No ano seguinte foi realizada a primeira intervenção cirúrgica com o
laser, no Hospital Presbiteriano de Nova York, para a retirada de um pequeno tumor
de retina que impedia a visão. Em 1965, Sinclair e Knoll desenvolveram o laser
terapêutico, não mais com efeito de corte, mas de bioestimulação dos tecidos.
2.3.1 Características da Luz Laser
A luz laser oferece uma segurança relevante ao ser utilizada, e difere das
outras formas de luz devido principalmente a três características:
31
A monocromaticidade a luz laser é composta de fótons, todos da mesma cor
e com o mesmo comprimento de onda. É, portanto, uma luz pura. Essa
característica é importante devido à absorção seletiva do tecido humano.
Figura 4 – Característica da luz laser monocromaticidade
A coerência (as ondas viajam ordenadamente em relação ao tempo e suas
amplitudes são iguais. A coerência mantém-se ao longo do tempo e espaço).
Figura 5 – Característica de coerência da luz laser. (A) Comprimento de ondas coerentes no tempo e espaço. (B) Comprimentos de ondas incoerentes no tempo e espaço
A unidirecionalidade ou colimação (o feixe de fótons é paralelo ao eixo do
tubo que produz este tipo de energia; a luz laser possui divergência angular muito
pequena, toda a energia do laser concentra-se precisamente em um ponto focal).
32
Figura 6 – Característica da luz laser de unidirecionaliade ou colimação. A luz natural é divergente e a luz laser é paralela ao tubo onde é produzida
2.3.2 Classificação dos Lasers e Modo de Ação
Os aparelhos de laser são constituídos por um meio ativo, que pode ser
sólido (Rubi), gasoso (mais comuns, como exemplo o CO2, He-Ne, Ar),
semicondutor (Diodo - AsGaAl, AsGa), semi-sólido (Nd-YAG, Er-YAG, YAP),
Excímero (KrF, XeCl) ou líquido (pouco usado, como exemplo, rodamine e cumarina
- Dy laser).
Os lasers são classificados de acordo com a potência de emissão da
radiação, podendo ser: laser de alta, média e baixa intensidade.
Os lasers de alta intensidade, também conhecidos como laser cirúrgico,
laser quente, laser duro ou hard laser emitem radiação de alta potência, o que
propicia um potencial destrutivo, sendo utilizados para viabilizar cirurgias ou
remoção de tecido cariado, ou seja, possui uma ação fototérmica de corte,
vaporização, coagulação e esterilização dos tecidos. Os principais lasers de alta
intensidade são o Excimer, Argônio, Kripton, Dye, Rubi, Família YAG (ítrio-alumínio-
granada) e CO2.
Os lasers de média intensidade ou mid-laser emitem radiações com
potências medianas, sem poder destrutivo, sendo mais utilizados em fisioterapia.
Entre eles se encontram o laser de Hélio-Neônio (He-Ne) e o Arseniato de gálio
(AsGa).
Os lasers de baixa intensidade, também denominados laser mole, laser frio,
laser terapêutico ou "soft-laser", emitem radiações de baixas potências, sem
33
potencial destrutivo, e possuem uma ação fotoquímica de analgesia, anti-
inflamatória e de bioestimulação tecidual. Entre os lasers de baixa intensidade
encontra-se os lasers: He-Ne (Hélio-Neônio), diodo (Arseniato de gálio - AsGa e
Arseniato de gálio e alumínio - AsGaAl).
A técnica a laser é eficaz em muitos procedimentos cirúrgicos e durante a
terapia ortodôntica. Mais estudos são necessários para definir os protocolos de
tratamento em bioestimulação ortodôntica.
2.4 Citocinas Pro-Inflamatórias e Laserterapia de Baixa Intensidade
A cascata de reações inflamatórias geram simplificadamente três sintomas:
calor, rubor e dor. A dor durante a terapia ortodôntica foi relatada por Krishinan et al.
como um dos efeitos colaterais mais incidentes nas publicações da área
(KRISHNAN, 2007). Os dados apontam que 90% dos pacientes relatam algum grau
de dor e, em torno de 30% encerram o tratamento mais cedo por esse motivo.
Desde a década de 60 os estudos acerca dos benefícios da laserterapia de baixa
intensidade (LBI) na ortodontia vêm crescendo (KRISHNAN, 2007).
Os benefícios biológicos da LBI nos tratamentos musculo-esqueletais,
neuro-musculares, citogênicos e condições traumática são coletivamente
conhecidos por fotobioestimulação. A utilização da luz vermelha e infra-vermelho
somado a sua interação com os tecidos biológicos, estimulam e melhoram a
cicatrização e reduzem a dor. Postula-se que a LBI é capaz de modular o
metabolismo celular e estimular a respiração mitocondrial na produção de oxigênio e
síntese de ATP. Tais efeitos produziriam um aumento no DNA, RNA e síntese
proteica regulatória do ciclo celular que estimula a proliferação celular (PERON,
2010).
LBI trata-se de um tratamento não-invasivo, rápido, embora o custo ainda
seja um desafio para a disseminação na pratica clínica. Ao contrário de medicações
via oral ou injetável, estudos apontam que a LBI não tem efeito sistêmico como as
drogas anti-inflamatórias de não-esteroidais (AINES) (BIRD; WILLIANS; KULA,
2007; PERON, 2010). Além disso, AINES diminuem a produção de prostaglandinas
34
e diminuem a movimentação ortodôntica (BRADLEY et al., 2007; YOUSSEF et al.,
2008; PERON, 2010).
Os benefícios da LBI na ortodontia foi documentado por diversos autores
(KREISLER et al., 2004; KIM et al., 2007; FUJITA et al., 2008; PINHEIRO et al.,
2008; YOUSSEF et al., 2008; PERON, 2010). A literatura aponta benefícios para a
cicatrização de feridas, como úlceras orais provocadas pela ortodontia, proliferação
mais rápida de fibroblastos, síntese de colágeno, regeneração óssea e nervosa, e
aumento da atividade enzimática (PERON, 2010). Adicionalmente, foram relatados
efeitos analgésicos pela estimulação de células nervosas e do processo aeróbico
dos linfócitos, estabilização do potencial de membrana, liberação de
neurotransmissores no tecido inflamatório, aumento da síntese de endorfinas,
bradicininas e limiar de dor. No entanto, embora haja estudos que apontam
resultados satisfatórios da LBI para analgesia em pacientes (KIM et al., 2007;
FUJITA et al., 2008; TORTAMANO et al., 2009; PERON, 2010), outros estudos
encontraram resultados pouco satisfatórios na redução na dor de pacientes durante
o tratamento ortodôntico (KREISLER et al., 2004; PINHEIRO et al., 2008; PERON,
2010).
2.4.1 Laserterapia de Baixa Intensidade e IL-6
A Interleucina-6 (IL-6) foi descrita em 1986 como fator de diferenciação das
células B essencial para produção de imunoglobulinas (Hirano, 1986). No entanto,
foi demonstrada a produção de IL-6 por células T, monócitos, fibroblastos,
keratócitos, células endoteliais, adipócitos e células tumorais. A revisão liderada por
Mihara discorre uma série de doenças relacionadas ao aumento da produção de IL-
6 com repercussão sistêmica (MIHARA et al., 2012). Por exemplo, foi demonstrada
uma estreita correlação entre o aumento de IL-6 e a angiogênese.
A importância da IL-6 para a ortodontia tem sido alvo de debates por sua
ação autócrina/ parácrina estimulando à formação de osteoblastos e a reabsorção
óssea de osteoclastos pré-formados. Nesse contexto, diversos autores estudaram
os níveis de IL-6 após força ortodôntica (LIHN et al., 2003; BAŞARAN et al., 2006;
MIHARA et al., 2012).
35
IL-6 é uma interleucina que age como uma citocina pro-inflamatória e anti-
inflamatória. É secretada por células T e macrófagos para estimular a resposta
imune ao trauma, especialmente queimaduras ou outro dano ao tecido levando a
inflamação (SILVA, 2012).
O estímulo mecânico gera uma resposta inflamatória asséptica e transitória
nos tecidos periodontais. Mediadores de sinalização são então produzidos para
desencadear uma resposta biológica associada à remodelação do ligamento
periodontal (PDL) e osso alveolar. Há desta forma, reabsorção óssea nas áreas de
compressão do PDL e aposição nas áreas de tensão (SILVA, 2012)
As citocinas são mediadores chave envolvidos no turnover fisiológico do
osso alveolar e movimento dentário. A citocina interleucina-6 (IL-6) interage
diretamente com as células ósseas, regulando localmente o processo de
remodelação, particularmente a reabsorção óssea. A aplicação de força ortodôntica
é capaz de aumentar a expressão de IL-6 nos tecidos periodontais humanos
(SILVA, 2012).
O estudo conduzido por Ryuiichi et al. mensurou os níveis de IL-6 em 15
pacientes submetidos a tratamento ortodôntico (KUNII et al., 2013). Os resultados
mostraram níveis aumentados de IL-6 no fluido gengival crevicular com uma relação
dose dependente (KUNII et al., 2013). Não obstante, esses resultados corroboram
com os dados obtidos por Mihara et al. (MIHARA et al., 2012) e Lihn et al. (LIHN et
al., 2003) sugerindo envolvimento da IL-6 na movimentação ortodôntica.
Neste contexto, este trabalho se insere na perspectiva de investigar o
impacto da LBI nos níveis de IL-6 como biomarcador inflamatório a fim de contribuir
para o esclarecimento dos mecanismos moleculares da LBI no tratamento
ortodôntico.
36
3 OBJETIVOS
Quantificar a imunomarcação da Interleucina 6 (IL-6) no ligamento
periodontontal de dentes de ratos frente à estimulação ortodôntica e aplicação da
laserterapia de baixa intensidade.
37
4 METODOLOGIA
4.1 Animais Experimentais
O projeto foi avaliado e aprovado pela Comissão de Ética para Análise de
Projetos de Pesquisa, na Universidade Cruzeiro do Sul (protocolo 011/07).
Foram utilizados 35 ratos machos, da linhagem Wistar (Rattus norvegicus),
fornecidos pelo biotério da Universidade Cruzeiro do Sul, pesando de 200 a 300
gramas.
Durante o período experimental, os animais foram mantidos no biotério da
Universidade Cruzeiro do Sul, em gaiolas específicas para este fim. Estas
permaneceram forradas com raspas de madeira seca, fornecendo condições de
higiene necessárias ao bem-estar e à saúde dos animais.
Suprimento constante de água mineral foi garantido aos animais por
dispensadores apropriados, com bico de aço inoxidável e capacidade para 1000 ml,
disponível permanentemente na gaiola. Os animais receberam ração comercial
(Labina Purina®), pulverizada e umidificada com água mineral, para evitar danos ao
dispositivo ortodôntico durante a mastigação. Com a finalidade de evitar a formação
e proliferação de fungos, por exposição prolongada do alimento, a troca da ração foi
efetuada diariamente.
A temperatura ambiente foi mantida entre 21 e 23ºC, considerada ideal para
o crescimento e desenvolvimento dos animais, segundo o Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA).
Os animais foram divididos aleatoriamente, em dois grupos experimentais:
grupo não-irradiado (TO/SL), composto de 15 animais submetidos à movimentação
dentária ortodôntica; e grupo-irradiado (TO/L), com 15 animais submetidos à
movimentação dentária ortodôntica e à irradiação pelo laser de baixa potência. E um
grupo de 05 animais foi utilizado como controle sem laser e sem movimentação
ortodôntica. Os animais dos grupos NI e IR foram divididos em três subgrupos,
38
compostos, por sua vez, de cinco animais, divididos de acordo com o momento do
sacrifício (72hs, 120hs, 168hs).
Tabela 1 - Distribuição dos animais utilizados no experimento
Grupo Sacrifício N° de Animais
Não-Irradiado (TO/SL)
72 horas (3 dias) 5
120 horas (5 dias) 5
168 horas (7 dias) 5
Irradiado (TO/SL)
72 horas (3 dias) 5
120 horas (5 dias) 5
168 horas (7 dias) 5
Controle (STO/SL) 5
Os animais do grupo (S/L) caracterizam os aspectos clínicos e histológicos
da movimentação dentária sem a influência do laser, servindo como parâmetro para
comparação com animais do grupo (L) e (Co), da mesma forma que o grupo (Co)
serve de parâmetro para comparação com (L) e (S/L).
4.2 Procedimentos Experimentais
O dispositivo ortodôntico utilizado consistiu de uma mola helicoidal de
níquel-titânio de tração com 7mm de comprimento (ref. 35.20.064 - Morelli),
distendida entre os incisivos superiores e o primeiro molar superior direito para
promover a mesialização do molar (Figura 7), criando áreas de pressão e de tração
no ligamento periodontal.
39
Figura 7 - Dispositivo ortodôntico instalado e preso no 1º molar e nos
incisivos com resina utilizado neste estudo
Os animais foram anestesiados em todos os procedimentos com risco de
resultar em ansiedade e/ou dor com cloridrato de ketamina e Xilasina (2:1) 1,5 cc
por 100 gramas por animal, administrada por via intramuscular com agulha
hipodérmica descartável, acoplada à seringa de 1cc.
Iniciou-se a montagem do dispositivo e o animal foi posicionado em decúbito
dorsal e mantido em mesa operatória apropriada. Realizou-se uma perfuração na
mesial dos incisivos superiores com uma broca diamantada n°1090 (KG.Sorensen)
e com um motor de alta rotação (Kavo), (Figura 8).
40
Figura 8 - Perfuração com motor de alta rotação e broca diamantada na mesial
dos incisivos superiores
Essa perfuração serviu para passar o fio de amarrilho 0,25mm (Morelli), que
envolveu o incisivo superior e, nesse amarrilho, fixou-se a extremidade anterior da
mola.
Com o objetivo de aumentar a retenção do amarrilho, impedindo seu
deslocamento, este foi recoberto com resina composta (Fill Magic ortodôntico) e
fotopolimerizada com um aparelho fotopolimerizador (Gnatus Opty 600). A adição
de resina foi precedida pelo preparo da superfície dentária, o qual inclui: profilaxia,
lavagem, secagem, condicionamento da superfície (ácido ortofosfórico a 37%), nova
lavagem e secagem (de acordo com o fabricante).
Na região posterior utilizou-se fio de amarrilho 0,25mm para envolver o
molar que passou por baixo do ponto de contato desse dente com o segundo molar,
fixando a extremidade posterior da mola utilizando-se uma pinça Mathiew (Figura 4).
Depois de cortado o excesso de fio, a ponta foi dobrada de modo a não causar
trauma ou desconforto para o animal; logo em seguida realizou-se o preparo da
superfície dentária, o qual inclui: profilaxia, lavagem, secagem, condicionamento da
superfície (ácido ortofosfórico a 37%), nova lavagem e secagem (de acordo com o
fabricante); para aumentar a retenção do amarrilho, impedindo seu deslocamento,
41
este foi recoberto com resina composta (Fill Magic ortodôntico) e fotopolimerizada
com aparelho fotopolimerizador (Gnatus 600) (Figura 10).
Figura 9 - Amarrilho na região posterior envolvendo molar
Figura 10 - Resina utilizada para fixar o amarrilho
A mola foi ativada para liberar uma força de 250mg, calibrada por um
tensiomêtro (Morelli) (Figura 11). Não foram realizadas reativações.
42
Figura 11 - Tensiomêtro calibrado a força aplicada
Por fim, as bordas dos incisivos inferiores foram reduzidas com brocas
diamantadas nº1090 (K.G.Sorensen) para evitar possíveis interferências oclusais
com o dispositivo instalado.
Figura 12 - Desgaste nos incisivos inferiores para evitar interferências
Em seguida, foi realizada a aplicação do laser de baixa intensidade Ar-Ga-Al
(PHOTON LASE III - DMC), tensão de operação: 90 a 230V, potência elétrica: 1,2W,
emissor invisível de luz em comprimento de onda: 808nm (típico) na potência de
43
100mW, emissão contínua na região do molar com uma densidade de energia de
5J/cm2 (Figura 13).
Figura 13 - Aparelho utilizado no estudo
A aplicação do laser baseou-se no protocolo estabelecido por Genovese
(2000). Três dias consecutivos assim, foi iniciada imediatamente após a instalação
do aparelho ortodôntico, 24horas e 48horas após. As irradiações foram feitas
através de fibra óptica utilizando-se o método direto e pontual sobre a região
vestibular e lingual do primeiro molar permanente superior direito. O tempo de
aplicação foi de 50 segundos, totalizando um período de 1 minuto e quarenta
segundos de aplicação por animal.
No grupo controle foi utilizado o mesmo procedimento para preparar os
molares e o incisivo, mas não foi aplicado o laser de baixa intensidade.
Após os períodos de 3, 5 e 7dias os animais foram sacrificados com
overdose de anestésico (Hidrato de cloral) 1ml/100grs do animal. Após o sacrifício,
as maxilas dos animais foram e submetidas ao processamento histológico.
44
4.3 Preparação das Peças Anatopatológicas
As maxilas permaneceram imersas em solução de formol (10%) por 48h
para a fixação dos tecidos e, em seguida, descalcificadas em solução de ácido
fórmico (25%) por 7 dias.
As peças foram incluídas em parafina paralelamente em relação à superfície
da mandíbula e a seguir os cortes histológicos foram cortados transversalmente
com 5m de espessura em micrótomo manual (Leica-RM2145), para coloração com
Picrossírus e Hematoxilina Eosina (HE).
Os cortes foram desidratados em banhos sucessivos de etanol em
concentrações crescentes (70 a 100%) e diafanizados em xilol. Três banhos de
duas horas em xilol precederam a inclusão em bloco em parafina, como mostrado
na tabela 2.
Tabela 2 - Mostram as diferentes soluções utilizadas para inclusão em parafina
Solução Tempo
Álcool 70% 1 hora
Álcool 95% 1 hora
Álcool absoluto 6 horas
Xilol 3 horas
Parafina 6 horas
Os cortes, uma vez coletados em lâminas, foram desparafinizados. Tendo
as lâminas passadas pela sequência de imersões descritas na Quadro 3, foram
coradas pela Hematoxilina de Harris e Eosina de Lison.
Para a coloração Picrosirius os cortes histológicos receberam, inicialmente,
dois banhos de xilol (20 min. cada) e reidratados em banhos de álcoois em
concentração decrescente (100 a 70%) e, finalmente, lavados em água corrente. A
seguir, os cortes foram banhados por 15 a 30 min. em solução de picrosirius (1%),
45
lavados em água corrente, secos e contra-corados com solução de azul de metileno
(3%).
Tabela 3 - Mostra as diferentes soluções utilizadas para desparafinização
Solução Tempo
Xilol I 10 min
Xilol II 10 min
Álcool absoluto 5 min
Álcool 95% 5 min
Álcool 70% 5 min
Lavar em áqua corrente 3 min
Hematoxilina 5 min
Diferenciador passagem instantânea
Eosina 1 min
Lavagem rápida
Álcool 70% 30 s
Álcool 95% 30 s
Álcool absoluto 3 min
Álcool absoluto 5 min
Àlcool /xilol (1:1) 5 min
Xilol 5 min
Xilol 5 min
4.4 Imunohistoquímica
Cortes de 4µm de espessura foram colocados em lâminas silanizadas (3-
Aminopropil-trietoxi-silano-Sigma Chemical Co.; St. Louis, Missouri, EUA) em
suporte adequado. O processo de desparanifinização foi feito ao colocar as lâminas
em xilol quente, em estufa a 60 – 65º C, durante 5 minutos e passadas rapidamente
em 3 banhos de xilol frio. Para hidratação dos cortes as lâminas foram colocadas
em dois banhos de álcool absoluto, um banho de álcool 95° e um banho de álcool
46
70°. Em seguida, foram lavadas em água corrente, água deionizada e deixadas em
tampão fosfato pH 7,4. O próximo passo foi a recuperação dos sítios antigênicos
realizada em alta temperatura em solução de ácido cítrico 10 mM PH 6. O bloqueio
da peroxidase endógena presente nas hemácias foi feito com água oxigenada 10v
(3%).O bloqueio das proteínas inespecíficas foi feito com imersão das lâminas em
com caseína diluída em tampão fosfato pH 7,4 (Synth, São Paulo, Brasil) por 5
minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas com o anticorpo
primário para IL-6 diluidos 1:100 e, incubados em 1% de albumina de soro bovino
(BSA) por 24 horas à 4ºC e posteriormente incubados com o anticorpo secundário
ABC Kit Vectastain (Vector LabCA) e utilizado como cromógeno Diaminobenzidina
(DAB) (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Alemanha). Posteriormente ocorreu a
contra-coloração com Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha) para
todos os casos.
4.5 Análise Morfométrica – Imunohistoquímica para Interleucina 6
O efeito dos tratamentos, sobre a expressão da interleucina 6 (IL-6),
observado na reação de imunohistoquímica foi analisado pela quantificação da área
marcada positivamente para esta proteína. Toda a região correspondente ao
ligamento periodontal foi fotografada em aumento de 200x (objetiva de 20x), pela
câmera CoolSNAP-Procf (Media Cybernetics Inc) acoplada a microscópio Nikon
Eclipse-E800. Após a obtenção das imagens, a área marcada foi identificada por
ferramenta de reconhecimento colorimétrico, com auxílio do sistema
computadorizado de imagens Image-ProPlus, versão 4.5 (Media Cybernetics Inc).
Esta ferramenta possibilita que o usuário forneça para o sistema a cor
correspondente à marcação positiva para o colágeno de interesse, e a partir desta
padronização, o sistema reconhece e quantifica a área. Em seguida, as áreas
marcadas foram somadas individualmente por lâmina; e calculada a porcentagem
de IL-6 em relação à área total analisada. Os resultados foram expressos em
porcentagem média e desvio padrão.
4.6 Análise Estatística
47
As áreas percentuais obtidas com a análise da marcação da interleucina 6
(IL-6) foram submetidas ao teste estatístico não paramétrico de Mann Whitney, com
auxílio do programa GraphPad Prism, versão 3.0. As comparações foram realizadas
entre os pares de grupos, dentro de cada período experimental. Foram
consideradas estatisticamente significativas as diferenças onde p<0,05.
48
5 RESULTADOS
Foram avaliados os níveis de IL-6 no início do estudo, após 3 dias, 5 dias, e
7 dias de experimentação para os grupos controle, sem a terapia LBI, e para o
grupo teste o qual foi submetido a terapia com laser de baixa intensidade.
Após 3 dias de estudo, foram encontrados valores médios de 7,27% com
desvio padrão de 2,96% e 6,68% com desvio padrão 1,52% de área relativa
referente a IL-6 para o grupos controle e irradiados respectivamente. No grupo
submetido a 5 dias de experimentação, a expressão de IL-6 no grupo controle foi
aproximadamente três vezes maior do que a expressão de IL-6 no grupo submetido
a terapia com laser de baixa intensidade (média de 19,59% no grupo controle com
desvio de 2,11 e média de 7,02 no grupo irradiado com desvio padrão de 0,63,
respectivamente). Não obstante, após 7 dias de experimentação os resultados
demonstram que a expressão de IL-6 referente ao grupo controle foi
aproximadamente duas vezes maior quando comparada ao grupo irradiado (média
de 16,23% com desvio padrão de 2,08´para o grupo controle e média de 7,86% e
desvio padrão de 1,08 para grupo irradiado respectivamente).
Ainda, a análise estatística revela diferenças significativas entre os dois
grupos. Primeiro, após 5 dias a diferença numérica encontrada entre o grupo
controle e o grupo teste foi confirmada estatisticamente (p< 0,01). Similarmente, o
grupo com 7 dias de experimentação apresentou diferença significante entre o
grupo controle e teste (p< 0,01) (Tabela 4).
49
Figura 14 - Níveis de IL-6 observados no grupo controle e nos tempos 3, 5 e 7 dias após tratamento ortodôntico sem laserterapia de baixa intensidade (72h- TO/ SL, 120h- TO/ SL e 168h- TO/ SL) e com a laserterapia de baixa intensidade (72h- TO/ L, 120h- TO/ L e 168h- TO/ L).
Abaixo seguem fotomicrografias dos cortes histológicos preparados por
método imunohistoquímico, nos diferentes momentos do experimento. A primeira
imagem (Figura 14) é a fotomicrografia de lâmina do grupo controle, em aumento de
200 vezes, no momento zero do experimento.
A figura 15 ilustra os padrões histológicos encontrados após tratamento
ortodôntico nos tempos 3, 5 e 7 dias com seus respectivos controles.
1.01
7.27
6.68
19.59
7.02
16.23
7.86
0
5
10
15
20
25
STO/ SL 72hs-TO/SL 72hs-TO/L 120h-TO/SL 120h-TO/L 168h-TO/SL 168h-TO/L
Áre
a IL
-6 P
osi
tiva
(%
)
Grupos
**
50
6 DISCUSSÃO
A relação dos processos inflamatórios com movimentação ortodôntica vem
ganhando a atenção dos cientistas após importantes resultados obtidos por
Sandstedt et al. (1904, 1905) há mais de um século atrás. Embora tenham ocorrido
avanços importantes na elucidação dos mecanismos moleculares envolvendo
inflamação e movimentação ortodôntica, ainda se trata de um assunto não
totalmente entendido.
A laserterapia de baixa intensidade foi vastamente explorada e hoje é
consenso entre os pesquisadores seu papel na otimização da microcirculação,
síntese de ATP e aceleração dos processos biológicos irradiados com laser. Juntos,
propiciam o ganho de qualidade na resposta tissular a inflamação, resultando em
aceleração da fase reparativa (KARU, 1989; GENOVESE, 2000; BRUGNERA
JÚNIOR, 2004; STEIN et al., 2005)
Da mesma forma, a terapia com laser de baixa intensidade é uma área
promissora que tem sido foco de estudos devido ao seu alto potencial terapêutico.
Diversos grupos tem obtidos melhora significativa na qualidade dos tratamentos
ortodônticos. Contudo, mais estudos ainda são necessários para o
estabelecimentos de técnicas padronizadas e protocolos terapêuticos (PEREIRA et
al., 2002)
Neste contexto, esse trabalho inseriu-se na perspectiva de contribuir para os
avanços no conhecimento relacionando inflamação e terapia com LBI. Assim, o
presente trabalho se propôs a investigar a interferência da terapia com laser de
baixa intensidade na movimentação ortodontia em relação aos parâmetros
inflamatórios. Para isso, foi definido como parâmetro de inflamação a interleucina- 6.
Nossos dados apontam um aumento significativo de IL-6 quando
comparado com o controle no tempo zero indicando um aumento do estado
inflamatório. Esses dados são consistentes como os obtidos por outros estudos
quando estudaram marcadores inflamatórios na movimentação ortodôntica.
(MIHARA et al., 2012; KUNII et al., 2013; LIHN et al., 2003)
51
Quando os níveis de IL-6 foram mensurados frente com o LTBI observou-se
diminuição desta interleucina em relação ao mesmo grupo tratado sem laser nos
tempos 5 dias e 7 dias. Destes dados, podemos extrair duas observações
importantes. Primeiramente a laserterapia pode ter contribuído para um efeito
antinflamatório visto que a IL-6, no balanço de suas funções, diminui o processo
inflamatório via efeito inibitório indireto sobre TNF-e IL-10 e IL-1 (BAKKER, 2014).
Como isso, podemos assumir que processos mediados por essas citocinas estariam
suprimidos, resultando em benefícios para o paciente como a diminuição da
sensação de dor.
Além disso, a IL-6 tem papel fundamental na reabsorção óssea através da
ativação de osteoblastos adjacentes ao tecido dentário. De fato, estudo em animais
para IL-6 demonstraram baixa massa óssea, reduzido número de osteoblastos e
retardo na cicatrização de fraturas (BAKKER, 2014). Desta forma, os níveis
menores de IL-6 podem se refletir em aceleração da movimentação ortodôntica e
ela age numa fase adaptativa da remodelação e no aumento de osteoclastos na
área de pressão e tração.
Não obstante, nossos dados sugerem que a TLBI deve ser realizadas em
múltiplas seções visto que só foram constadas diferenças significativas após 5 dias
de tratamento.
Este estudo apontou a importância do protocolo de aplicação e destaca-se
pois a laserterapia é no local da movimentação (Tecido ósseo e LPD) levando
grande vantagem quando comparada a administração drogas sistêmicas que fazem
sua metabolização em diferentes locais para depois chegarem a área de atuação.
Entretanto, trata-se de um estudo pioneiro na investigação entre a
inflamação, movimentação ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade e IL-6.
Considerando a complexidade e a sinergia dos processos biológicos cabe ressaltar
a necessidade de estudos mais profundos para se confirmar os resultados. Assim,
espera-se que este trabalho preliminar inspire outros pesquisadores a fazer estudos
semelhantes avaliando outros marcadores inflamatórios como IL-1 e TNF-maior
tempo de analise para se avaliar o tempo ótimo de TLBI e, quando mais
estabelecido as condições em modelos animais, evoluir para testes em humanos.
52
6.1 Limitações do Estudo
Imuno-histoquimica (IHQ) é definida como um conjunto de técnicas as quais
permitem a identificação de constituintes celulares no próprio corte histológico. Essa
técnica analítica está cada vez mais se difundindo como ferramenta diagnostica. No
entanto, cabe ressaltar algumas limitações intrínsecas ao método.
A sensibilidade do método pode ser afetada pelo método de fixação,
processamento do tecido e metodologia utilizada (clone de anticorpos e sistema de
detecção). Como exemplo, se a fixação não for padronizada ao longo do tecido,
pode resultar em autólise tecidual, com perda de antigenicidade (falso negativo), no
caso de fixação reduzida. No especifico estudo, nossos resultados dos níveis de IL-
6 poderiam ter sido subestimados.
53
7 CONCLUSÃO
A mensuração dos níveis de IL-6 em periodonto de ratos durante o
movimento ortodôntico, com e sem a terapia com laser de baixa intensidade,
confirmam o papel desta interleucina na reabsorção óssea bem como seus
possíveis efeitos na cascata da reação inflamatória. Contudo, mais estudos, com
técnicas mais precisas e avaliando outros parâmetros, são necessários para se
reafirmar os resultados.
54
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59
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
60
ANEXO B – Resultados da análise imuno-histoquímica
Análise imuno-histoquímica para Interleucina (IL-6) - Grupo 3d-MDL
(3 dias)
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 11.07 8.93
L2 6.80
R2 L1 3.05 3.74
L2 4.42
R3 L1 6.14 6.14
L2 6.15
R4 L1 10.72 9.55
L2 8.39
R5 L1 5.42 6.53
L2 7.65
Média 6.98 6.98
Desvio 2.56 2.34
1. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 6 (IL-6) - Grupo Controle 3d-
MDC (3 dias).
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 14.48 13.31
L2 12.13
R2 L1 7.00 5.24
L2 3.48
R3 L1 6.63 6.60
L2 6.57
R4 L1 4.03 3.59
L2 3.14
Média 7.18 7.18
Desvio 4.11 4.26
61
2. Análise imuno-histoquímica para Interleucina (IL-6) - Grupo 5d-MDL (5
dias)
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 6.36 8.20
L2 10.04
R2 L1 11.00 9.37
L2 7.74
R3 L1 7.53 7.84
L2 8.15
R4 L1 7.07 6.74
L2 6.41
R5 L1 7.04 8.21
L2 9.38
Média 8.07 8.07
Desvio 1.57 0.94
3. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 6 (IL-6) - Grupo Controle 5d-
MDC (5 dias).
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R6 L1 11.06 8.06
L2 5.07
R7 L1 21.52 22.98
L2 24.43
R8 L1 16.53 18.31
L2 20.09
R9 L1 42.90 29.47
L2 16.04
R10 L1 20.72 21.18
L2 21.64
Média 20.00 20.00
Desvio 9.89 7.83
62
4. Análise imuno-histoquímica para Interleucina (IL-6) - Grupo 7d-MDL (7
dias)
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 8.96 9.72
L2 10.49
R2 L1 7.41 7.20
L2 6.99
R3 L1 6.20 5.89
L2 5.59
R4 L1 8.47 7.45
L2 6.42
R5 L1 8.26 6.99
L2 5.72
Média 7.45 7.45
Desvio 1.58 1.40
5. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 6 (IL-6) - Grupo Controle 7d-
MDC (7 dias).
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 20.50 20.11
L2 19.71
R2 L1 26.60 23.98
L2 21.36
R3 L1 15.98 15.48
L2 14.98
R4 L1 13.41 14.09
L2 14.77
R5 L1 14.47 21.30
L2 28.13
Média 18.99 18.99
Desvio 5.21 4.12